專利名稱：應(yīng)用嫁接技術(shù)提高轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提高轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。
背景技術(shù)：
大豆遺傳轉(zhuǎn)化目前已成為許多難轉(zhuǎn)化植物的模式植物。目前，大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得較為廣泛認(rèn)可和應(yīng)用的主要有根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其中，子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)較為成熟，目前已經(jīng)商業(yè)化的幾個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品種主要來(lái)源于該系統(tǒng)。胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的分化效率較高，應(yīng)用潛力較大。盡管這兩種系統(tǒng)的分化效率基本可以滿足大豆轉(zhuǎn)基因的需要，但是，這兩套系統(tǒng)經(jīng)過(guò)生根和煉苗兩個(gè)階段后，移栽的成活率非常低，分別為20％和10％左右，這嚴(yán)重制約了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究和發(fā)展。本項(xiàng)發(fā)明的大豆嫁接技術(shù)，可以使大豆轉(zhuǎn)化植株避開生根和煉苗這兩個(gè)階段，顯著地提高轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率。嫁接所需要的基本條件，大豆轉(zhuǎn)化植株基本具備，但是，鑒于大豆轉(zhuǎn)化不定芽比較弱小，選擇劈接法作為大豆嫁接的首選方法。大豆劈接法嫁接的優(yōu)點(diǎn)很明顯，首先，接穗與砧木形成的創(chuàng)面比較大，有利于形成足夠大的接觸面積；其次，接穗與砧木之間可以形成較多的愈傷組織，愈傷組織的細(xì)胞分裂增殖旺盛，易形成的新生維管束使接穗與砧木之間連接貫通，保證嫁接成活。由于嫁接技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，該技術(shù)在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，必將大幅度地提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于建立一套應(yīng)用嫁接技術(shù)提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。
本發(fā)明通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得轉(zhuǎn)化不定芽，這些不定芽不經(jīng)過(guò)生根、煉苗過(guò)程，直接做成接穗，采用劈接法嫁接到大豆實(shí)生苗砧木上，接穗與砧木經(jīng)過(guò)接合期、愈合期、融合期和成活期四個(gè)階段，接穗成功的轉(zhuǎn)化不定芽與砧木形成一個(gè)完整的大豆植株，檢測(cè)從嫁接大豆植株獲得的種子，均為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，保持了轉(zhuǎn)化不定芽的遺傳特征。
本發(fā)明主要技術(shù)方案如下1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)大豆種子進(jìn)行氯氣滅菌，然后接種到發(fā)芽培養(yǎng)基中4-6天，收集子葉節(jié)作為外植體，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染大豆子葉節(jié)，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)階段后，將外植體接種到分化篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)幾次繼代培養(yǎng)后，不定芽長(zhǎng)到1.5-3.0cm時(shí)就可以作為接穗進(jìn)行嫁接；2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)大豆種子進(jìn)行氯氣滅菌，浸泡18-22小時(shí)，收集胚尖，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染大豆胚尖，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)階段后，將外植體接種到分化篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)一次繼代培養(yǎng)后不定芽生長(zhǎng)到2-3cm時(shí)就可以作為接穗進(jìn)行嫁接；3.劈接法嫁接栽種大豆實(shí)生苗作為砧木來(lái)源，待實(shí)生苗的第一片真葉發(fā)生時(shí)，切除真葉，沿軸線切0.5-1.0cm左右的切口，砧木準(zhǔn)備完畢。將獲得的大豆子葉節(jié)和胚尖的轉(zhuǎn)化不定芽術(shù)段造成鍥型創(chuàng)口嫁接到砧木上，綁縛結(jié)實(shí)，嫁接完畢；4.建立嫁接材料的適宜生長(zhǎng)條件嫁接后的植株用黑色袋罩好，每天噴水保濕，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20-23℃，5-7天后嫁接苗成活。
5.提取嫁接大豆植株的嫩葉總DNA和種子總DNA，用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆植株當(dāng)代和T1代種子的轉(zhuǎn)化特征。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下目前大豆是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化作物，制約大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素主要有是大豆的分化效率低和大豆轉(zhuǎn)化植株生根難，煉苗移栽成活率低。以子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為例，前者低于20％，而后者低于10％。目前提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率主要集中在提高大豆的分化效率上，但是大豆分化效率的提高幅度不是很明顯，而針對(duì)大豆轉(zhuǎn)化植株生根困難，移栽成活率低這個(gè)限制因素，目前還沒有好的辦法來(lái)克服。通常只能通過(guò)提高大豆的分化效率來(lái)獲得足夠多的轉(zhuǎn)化植株，以保證轉(zhuǎn)基因大豆的獲得，這無(wú)疑增加了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的工作量。而本項(xiàng)發(fā)明應(yīng)用嫁接技術(shù)將不同來(lái)源的轉(zhuǎn)化不定芽直接嫁接到實(shí)生苗砧木上，獲得了完整的和保持原有遺傳特性的轉(zhuǎn)化植株，成功的克服了大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率低的限制性因素。應(yīng)用嫁接技術(shù)優(yōu)勢(shì)非常明顯，首先，嫁接可以提高轉(zhuǎn)化植株的成活率。嫁接的成活率可以達(dá)到90％以上，這與子葉節(jié)系統(tǒng)低于20％和胚尖系統(tǒng)低于10％的成活率相比較有大幅度的提高；其次，嫁接顯著縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的周期(從農(nóng)桿菌浸染到獲得T1代種子的過(guò)程)。通常，子葉節(jié)轉(zhuǎn)化周期大約要4-5個(gè)月，胚尖轉(zhuǎn)化周期大約要3-4個(gè)月；而采用本發(fā)明的嫁接技術(shù)，子葉節(jié)轉(zhuǎn)化周期只需要3-4個(gè)月，胚尖轉(zhuǎn)化周期只需要2-3個(gè)月?？傊?，應(yīng)用嫁接技術(shù)在很大程度上提高了大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率，這將改變大豆遺傳轉(zhuǎn)化難的現(xiàn)狀，使大豆遺傳轉(zhuǎn)化像模式植物一樣容易，促進(jìn)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一利用子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的不定芽嫁接獲得再生植株1-實(shí)驗(yàn)材料1)材料大豆材料為吉林35和吉林47，購(gòu)于吉林省農(nóng)科院。
2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株EHA105為東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存；轉(zhuǎn)化載體pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重復(fù)序列；pBINHX-1含有角堿篷NHXI基因。
2-不定芽的獲得1)無(wú)菌大豆種子栽種發(fā)芽培養(yǎng)基B5+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8，25℃，弱光培養(yǎng)5天。
2)待子葉變綠時(shí)用手術(shù)刀將其子葉分開，真葉去盡，保留0.5-1cm的下胚軸，然后順著脈絡(luò)方向輕劃5刀，約3-4mm長(zhǎng)，0.5mm深。
3)從農(nóng)桿菌EHA105/pSBHO-3和EHA105/pBINHX-1平板中挑取單菌落接種到3ml YEB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，再取1ml轉(zhuǎn)到50ml的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)到OD＝0.6左右時(shí)，離心4000rpm，10min，收集菌體，待用。
4)收集菌體用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基1/10B5+3.9g/LMES+0.25mg/L GA3+1.67mg/L6-BAP+3％蔗糖+400mg/L Lysteine+154.2mg/LDTT+40mg/L乙酰丁香酮，pH5.4，15mL重懸兩次。
5)取切好的子葉節(jié)外植體在菌液中浸染30min，浸染過(guò)的子葉平放在半固體共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5-7天，溫度為25℃。
6)將共培養(yǎng)后的子葉節(jié)外植體，接種到分化培養(yǎng)基B5+10mg/L6-BAP+0.2mg/LIBA+0.59g/LMES+3％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.7，培養(yǎng)14天后，再此期間要切除先分化出的不定芽。
7)然后將外植體再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Ms鹽+B5有機(jī)+0.5mg/LGA3+1.0mg/L ZT+0.1mg/LIAA+0.59g/LMES+50mg/L Asn+50mg/L Gln+3.0％蔗糖+Cef 300mg+Kanmycin50mg/L，pH5.7，誘導(dǎo)芽的分化，每?jī)芍芾^代一次。培養(yǎng)條件為25℃，18:6光周期。在繼代時(shí)丟棄先出現(xiàn)的不定芽和壞死的外植體。
8)當(dāng)不定芽長(zhǎng)至1.5-3cm時(shí)就可以作為接穗來(lái)進(jìn)行嫁接。
3-嫁接過(guò)程1)吉林35種子或吉林47種子播種在土中，當(dāng)實(shí)生苗長(zhǎng)到3-4cm時(shí)作為砧木。
2)接穗處理用手術(shù)刀將1.5-3.0cm的不定芽切下來(lái)，然后在末端造成鍥型創(chuàng)口，露出接穗的韌皮部。
3)砧木處理用手術(shù)刀將實(shí)生苗的真葉切除，然后沿著軸線將下胚軸切出0.5-1.0cm左右的創(chuàng)口。
4)劈接法嫁接將接穗垂直插進(jìn)砧木的創(chuàng)口中，保證接穗完全被砧木所包圍，然后，用棉線在子葉的下面綁縛結(jié)實(shí)，將接穗固定牢固，再用棉線把子葉綁縛避免創(chuàng)口直接暴露在空氣里導(dǎo)致植株失水過(guò)快。
5)用帶有若干個(gè)小孔的黑塑料袋罩好，暗中煉苗。在此期間噴水保濕，溫度控制在20-23℃。5-7天后，撤去黑塑料袋，嫁接完成，將嫁接苗移至正常生長(zhǎng)條件下，成活率超過(guò)90％。
4-結(jié)果1)本技術(shù)共嫁接了32個(gè)不定芽，獲得了29株轉(zhuǎn)化植株，嫁接成活率為90％。
2)嫁接技術(shù)提高了大豆轉(zhuǎn)化植株成活率，成活率可以達(dá)到90％，這遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的經(jīng)過(guò)生根、煉苗移栽的成活率要高的多，直接提高了大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
3)應(yīng)用嫁接技術(shù)縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化周期，比原來(lái)胚尖轉(zhuǎn)化的4-5個(gè)月，可以縮短到3-4個(gè)月，至少節(jié)省1個(gè)月的時(shí)間。
4)嫁接沒有對(duì)大豆轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生遺傳突變等負(fù)面影響，能夠正常的開花結(jié)實(shí)。
5)大豆轉(zhuǎn)化植株經(jīng)過(guò)嫁接后，T0代植株更接近于實(shí)生苗，獲得的T1代種子結(jié)實(shí)飽滿、種子數(shù)量多，便于對(duì)T1代種子的篩選和分析。
6)提取轉(zhuǎn)化材料嫩葉和T1代種子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步證明外源基因已經(jīng)整合到大豆基因組中。
實(shí)施例二利用胚尖轉(zhuǎn)化的不定芽嫁接獲得再生植株1-實(shí)驗(yàn)材料1)材料大豆材料為吉林35和吉林47，購(gòu)于吉林省農(nóng)科院。
2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株EHA105為東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存；轉(zhuǎn)化載體pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重復(fù)序列；pBINHX-1含有角堿篷NHXI基因。
2-不定芽的獲得1)外植體準(zhǔn)備取滅菌的成熟大豆種子浸泡過(guò)夜20h左右，去掉子葉，將真葉劃盡。收集胚尖，插入到培養(yǎng)基A1/2Ms鹽+1/2B5有機(jī)+3.5mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％瓊脂，pH5.8，預(yù)培養(yǎng)1天，培養(yǎng)條件為25℃，光周期為18/6h。
2)轉(zhuǎn)化菌制備將農(nóng)桿菌EHA105/pSBHO-3生長(zhǎng)到OD＝0.6左右，離心4000rpm×10min，收集菌體。用等體積共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基1/2Ms鹽+1/2B5有機(jī)+6mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％瓊脂+100μM乙酰丁香酮，重懸兩次即可。
3)外植體侵染將預(yù)培養(yǎng)的胚尖外植體放入農(nóng)桿菌菌液中黑暗震蕩培養(yǎng)20h。外植體插入固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5天，溫度為25℃。
4)共培養(yǎng)外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基B1/2MS鹽+1/2B5有機(jī)+加入0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％瓊脂+300mg/LCef，pH5.8，培養(yǎng)5-7天。
5)芽伸長(zhǎng)轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基C1/2M鹽+1/2B5有機(jī)+0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％瓊脂+300mg/Lcef+100mg/LKan，pH5.8，培養(yǎng)24-26天換一批培養(yǎng)基。
6)當(dāng)不定芽長(zhǎng)到2-3m時(shí)就可以作為接穗來(lái)進(jìn)行嫁接。
3-嫁接過(guò)程1)吉林35種子播種在土中，當(dāng)實(shí)生苗長(zhǎng)到3-4cm時(shí)作為砧木。
2)接穗處理用手術(shù)刀將1.5-3.0cm的不定芽切下來(lái)，然后在末端造成鍥型創(chuàng)口，露出接穗的韌皮部。
3)砧木處理用手術(shù)刀將實(shí)生苗的真葉切除，然后沿著軸線將下胚軸切出0.5-1.0cm左右的創(chuàng)口。
4)劈接法嫁接將接穗垂直插進(jìn)砧木的創(chuàng)口中，保證接穗完全被砧木所包圍，然后，用棉線在子葉的下面綁縛結(jié)實(shí)，將接穗固定牢固，再用棉線把子葉綁縛避免創(chuàng)口直接暴露在空氣里導(dǎo)致植株失水過(guò)快。
5)用帶有若干個(gè)小孔的黑塑料袋罩好，黑暗條件下煉苗。在此期間噴水保濕，溫度控制在20-23℃。5-7天后，撤去黑塑料袋，嫁接完成，將嫁接苗移至正常生長(zhǎng)條件下，成活率超過(guò)90％。
4-結(jié)果1)本技術(shù)嫁接了137個(gè)不定芽，獲得了125株轉(zhuǎn)化植株，嫁接成活率為91％。
2)嫁接技術(shù)提高了大豆轉(zhuǎn)化植株成活率，成活率可以達(dá)到90％以上，這遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的經(jīng)過(guò)生根、煉苗移栽的成活率要高的多，直接提高了大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
3)應(yīng)用嫁接技術(shù)縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化周期，比原來(lái)胚尖轉(zhuǎn)化的3-4個(gè)月，可以縮短到2-3個(gè)月，至少節(jié)省1個(gè)月的時(shí)間。
4)嫁接沒有對(duì)大豆轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生遺傳突變等負(fù)面影響，能夠正常的開花結(jié)實(shí)。
5)大豆轉(zhuǎn)化植株經(jīng)過(guò)嫁接后，T0代植株更接近于實(shí)生苗，獲得的T1代種子結(jié)實(shí)飽滿、種子數(shù)量多，便于對(duì)T1代種子的篩選和分析。
6)提取轉(zhuǎn)化材料嫩葉和T1代種子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步證明外源基因已經(jīng)整合到大豆基因組中。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用嫁接技術(shù)提高轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征是主要步驟如下1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)大豆種子進(jìn)行氯氣滅菌，然后接種到發(fā)芽培養(yǎng)基中4-6天，收集子葉節(jié)作為外植體，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染大豆子葉節(jié)，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)階段后，將外植體接種到分化篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)幾次繼代培養(yǎng)后，不定芽長(zhǎng)到1.5-3.0cm時(shí)就可以作為接穗進(jìn)行嫁接；2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)大豆種子進(jìn)行氯氣滅菌，浸泡18-22小時(shí)，收集胚尖，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染大豆胚尖，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)階段后，將外植體接種到分化篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)一次繼代培養(yǎng)后不定芽生長(zhǎng)到2-3cm時(shí)就可以作為接穗進(jìn)行嫁接；3)劈接法嫁接栽種大豆實(shí)生苗作為砧木來(lái)源，待實(shí)生苗的第一片真葉發(fā)生時(shí)，切除真葉，沿軸線切0.5-1.0cm左右的切口，砧木準(zhǔn)備完畢，將獲得的大豆子葉節(jié)和胚尖的轉(zhuǎn)化不定芽末段造成鍥型創(chuàng)口嫁接到砧木上，綁縛結(jié)實(shí)；4)建立嫁接材料的適宜生長(zhǎng)條件嫁接后的植株用黑色袋罩好，每天噴水保濕，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20-23℃，5-7天后嫁接苗成活；5)提取嫁接大豆植株的嫩葉總DNA和種子總DNA，用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆植株當(dāng)代和T1代種子的轉(zhuǎn)化特征；
2.按權(quán)利要求1所述的應(yīng)用嫁接技術(shù)提高轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征是利用子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的不定芽嫁接獲得再生植株，具體步驟如下；應(yīng)用材料1)材料大豆材料為吉林35和吉林47；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株EHA105；轉(zhuǎn)化載體pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重復(fù)序列；pBINHX-1含有角堿篷NHXI基因；不定芽的獲得1)無(wú)菌大豆種子栽種發(fā)芽培養(yǎng)基B5+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8，25℃，弱光培養(yǎng)5天；2)待子葉變綠時(shí)用手術(shù)刀將其子葉分開，真葉去盡，保留0.5-1cm的下胚軸，然后順著脈絡(luò)方向輕劃5刀，約3-4mm長(zhǎng)，0.5mm深；3)從農(nóng)桿菌EHA105/pSBHO-3和EHA105/pBINHX-1平板中挑取單菌落接種到3ml YEB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，再取1ml轉(zhuǎn)到50ml的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)到OD＝0.6左右時(shí)，離心4000rpm，10min，收集菌體，待用；4)收集菌體用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基1/10B5+3.9g/LMES+0.25mg/L GA3+1.67mg/L6-BAP+3％蔗糖+400mg/L Lysteine+154.2mg/LDTT+40mg/L乙酰丁香酮，pH5.4，15mL重懸兩次；5)取切好的子葉節(jié)外植體在菌液中浸染30min，浸染過(guò)的子葉平放在半固體共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5-7天，溫度為25℃；6)將共培養(yǎng)后的子葉節(jié)外植體，接種到分化培養(yǎng)基B5+10mg/L6-BAP+0.2mg/LIBA+0.59g/LMES+3％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.7，培養(yǎng)14天后，再此期間要切除先分化出的不定芽；7)然后將外植體再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基Ms鹽+B5有機(jī)+0.5mg/LGA3+1.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA+0.59g/LMES+50mg/L Asn+50mg/L Gln+3.0％蔗糖+Cef 300mg+Kanmycin 50mg/L，pH5.7，誘導(dǎo)芽的分化，每?jī)芍芾^代一次；培養(yǎng)條件為25℃，18:6光周期，在繼代時(shí)丟棄先出現(xiàn)的不定芽和壞死的外植體；8)當(dāng)不定芽長(zhǎng)至1.5-3cm時(shí)作為接穗來(lái)進(jìn)行嫁接；嫁接過(guò)程1)吉林35種子或吉林47種子播種在土中，當(dāng)實(shí)生苗長(zhǎng)到3-4cm時(shí)作為砧木；2)接穗處理用手術(shù)刀將1.5-3.0cm的不定芽切下來(lái)，然后在末端造成鍥型創(chuàng)口，露出接穗的韌皮部；3)砧木處理用手術(shù)刀將實(shí)生苗的真葉切除，然后沿著軸線將下胚軸切出0.5-1.0cm左右的創(chuàng)口；4)劈接法嫁接將接穗垂直插進(jìn)砧木的創(chuàng)口中，保證接穗完全被砧木所包圍，然后，用線在子葉的下面綁縛結(jié)實(shí)，將按穗固定牢固，再用線把子葉綁縛；5)用帶有若干個(gè)小孔的黑塑料袋罩好，暗中煉苗，在此期間噴水保濕，溫度控制在20-23℃，5-7天后，撤去黑塑料袋，將嫁接苗移至正常生長(zhǎng)條件下。
3.按權(quán)利要求1所述的應(yīng)用嫁接技術(shù)提高轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征是利用利用胚尖轉(zhuǎn)化的不定芽嫁接獲得再生植株，具體步驟如下應(yīng)用材料1)材料大豆材料為吉林35和吉林47；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株EHA105；轉(zhuǎn)化載體pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重復(fù)序列；pBINHX-1含有角堿篷NHXI基因；不定芽的獲得1)外植體準(zhǔn)備取滅菌的成熟大豆種子浸泡過(guò)夜20h左右，去掉子葉，將真葉劃盡。收集胚尖，插入到培養(yǎng)基A1/2Ms鹽+1/2B5有機(jī)+3.5mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％瓊脂，pH5.8，預(yù)培養(yǎng)1天，培養(yǎng)條件為25℃，光周期為18/6h；2)轉(zhuǎn)化菌制備將農(nóng)桿菌EHA105/pSBHO-3生長(zhǎng)到OD＝0.6左右，離心4000rpm×10min，收集菌體，用等體積共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基1/2Ms鹽+1/2B5有機(jī)+6mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％瓊脂+100μM乙酰丁香酮，重懸兩次；3)外植體侵染將預(yù)培養(yǎng)的胚尖外植體放入農(nóng)桿菌菌液中黑暗震蕩培養(yǎng)20h，外植體插入固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5天，溫度為25℃；4)共培養(yǎng)外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基B1/2MS鹽+1/2B5有機(jī)+加入0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％瓊脂+300mg/LCef，pH5.8，培養(yǎng)5-7天；5)芽伸長(zhǎng)轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基C1/2M鹽+1/2B5有機(jī)+0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％瓊脂+300mg/Lcef+100mg/LKan，pH5.8，培養(yǎng)24-26天換一批培養(yǎng)基；6)當(dāng)不定芽長(zhǎng)到2-3m時(shí)就可以作為接穗來(lái)進(jìn)行嫁接；嫁接過(guò)程1)吉林35種子播種在土中，當(dāng)實(shí)生苗長(zhǎng)到3-4cm時(shí)作為砧木；2)接穗處理用手術(shù)刀將1.5-3.0cm的不定芽切下來(lái)，然后在末端造成鍥型創(chuàng)口，露出接穗的韌皮部；3)砧木處理用手術(shù)刀將實(shí)生苗的真葉切除，然后沿著軸線將下胚軸切出0.5-1.0cm左右的創(chuàng)口；4)劈接法嫁接將接穗垂直插進(jìn)砧木的創(chuàng)口中，保證接穗完全被砧木所包圍，然后，用線在子葉的下面綁縛結(jié)實(shí)，將接穗固定牢固，再用線把子葉綁縛；5)用帶有若干個(gè)小孔的黑塑料袋罩好，黑暗條件下煉苗，在此期間噴水保濕，溫度控制在20-23℃，5-7天后，撤去黑塑料袋，將嫁接苗移至正常生長(zhǎng)條件下。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提高轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得轉(zhuǎn)化不定芽，這些不定芽不經(jīng)過(guò)生根、煉苗過(guò)程，直接做成接穗，采用劈接法嫁接到大豆實(shí)生苗砧木上，接穗與砧木經(jīng)過(guò)接合期、愈合期、融合期和成活期四個(gè)階段。成功的克服了大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率低的限制性因素。嫁接可以提高轉(zhuǎn)化植株的成活率，使成活率達(dá)到90％以上，很大程度上提高了大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率，顯著縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的周期，將改變大豆遺傳轉(zhuǎn)化難的現(xiàn)狀，促進(jìn)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
文檔編號(hào)A01G1/06GK1926961SQ20061001710
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月15日
發(fā)明者劉立俠, 李望豐, 王德利, 劉寶, 陳偉, 蔡一榮, 許守民 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)