專利名稱：一種魚類的雄核發(fā)育方法
技術領域：
本發(fā)明涉及魚類的培育，具體涉及魚類的雄核發(fā)育技術。
背景技術：
國內外關于魚類雌核發(fā)育研究已有不少的報道，如鯉魚、泥鰍、鰱魚、虹鱒、羅非魚等魚的雌核發(fā)育均有研究報道，申請?zhí)枮?00510031690.8的發(fā)明專利申請公開了一種魚類的雌核發(fā)育方法，理論上講，如果雌核發(fā)育的母本性別決定類型是同配型(如二倍體XX型或四倍體XXXX型)，則雌核發(fā)育后代中只有雌性個體存在，這樣雌核發(fā)育后代的選育具有一定局限性。然而如果雄核發(fā)育的父本性別決定類型是異配型(如二倍體XY型或四倍體XXYY型)，則雄核發(fā)育后代中會存在雌、雄兩種個體。因此研究雄核發(fā)育技術不但可以大大提高雄核發(fā)育后代的存活率，而且在雄核發(fā)育的后代中有可能存在雌、雄兩性可育的個體。通過對雄核發(fā)育后代的選育并使優(yōu)良的雌雄個體自交來培育新型的改良魚類，這在生物進化和魚類育種應用方面都具有重要的意義。但是目前極少有雌雄兩性可育雄核發(fā)育魚及他們自交形成存活后代的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種魚類的雄核發(fā)育技術，不僅提高后代存活力，改良魚類性狀，而且還能提供二倍體配子資源，以解決魚類雌核發(fā)育技術在后代選育中存在的局限性。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種魚類雄核發(fā)育方法，以四倍體鯽鯉產生的二倍體精子為材料，用經紫外線滅活的金魚的卵子與其混合，混合1～2分鐘后，“受精卵”置于20～21℃水溫條件下孵化，孵化出的魚苗經養(yǎng)殖，獲得雌雄兩性可育的雄核發(fā)育二倍體個體，將達到性成熟的雌、雄核發(fā)育魚產生的精液和卵子混合，以獲得大量的存活后代。
下面結合附圖進一步詳述本發(fā)明


圖1雄核發(fā)育二倍體鯽鯉染色體(2n＝100)圖2雄核發(fā)育二倍體鯽鯉的外形圖3雄核發(fā)育自交后代的染色體(4n＝200)
一般雄核發(fā)育魚的培育是采用魚類單倍體精子與遺傳物質滅活的單倍體卵子混合，再經過染色體的加倍處理，形成主要依靠精子的遺傳物質來發(fā)育的二倍體后代。這種使卵子遺傳失活，是破壞卵核的染色體，而對卵細胞質成分(mRNA、mtDNA及蛋白質)的損傷盡可能的減少，這樣用正常的精子與遺傳滅活的卵子受精得到的后代是核質雜交的個體，這種“核質雜交”對雄核發(fā)育后代可能產生好的作用，通過對核質雜交個體進行選育，可以在雄核發(fā)育后代中獲得遺傳性狀改良的個體。在魚類雄核發(fā)育過程中，用到的精子一般都是單倍體精子，單倍體精子在雄核發(fā)育過程中必需有一個染色體加倍處理的過程，而該處理過程對“受精卵”發(fā)育有不利影響，會大大降低后代的存活率。
本發(fā)明研究一種不經染色體加倍處理過程的雄核發(fā)育方法，可以提高后代的存活力。
四倍體鯽鯉(4n＝200)的原始母本為紅鯽(Carassius auratus red var.)，原始父本為湘江野鯉(Cyprinus carpio)。四倍體鯽鯉的體色為青灰色，其外形上有些特征介入鯉魚與紅鯽之間，如有兩對很短的須(湘江野鯉有2對明顯的須，而紅鯽無須)，雌、雄四倍體鯽鯉能分別產生二倍體卵子和二倍體精子，但是四體倍鯽鯉在抗逆性、生長速度及生殖力等方面有待改良。
本發(fā)明以四倍體鯽鯉產生的二倍體精子為原始材料，與遺傳滅活的金魚的卵子混合，從而啟動雄核發(fā)育的進行。具體方法為擠出達到性成熟的雌性金魚(Carassius auratus)的卵子置于盛有卵巢液的培養(yǎng)皿中，卵巢液剛剛蓋過卵子。把盛有卵子的培養(yǎng)皿放在墊有冰袋的搖床上(旋轉速度為30～40轉/分)，并置于2支功率分別為15瓦的紫外燈下照射處理，紫外燈與卵巢液的距離為10～12厘米，照射時間為3分鐘。卵巢液配方如下4.11g BSA/升，3.8mmol Na2HPO4，118.0mmol NaCl，12.7mmol KCl，0.7mmol MgCl2·6H2O，2.7mmol CaCl2，5.5mmol酪氨酸和5.5mmol甘氨酸，pH值調至8.14。
照射過的卵子與四倍體鯽鯉產生的二倍體精子混合，并用干凈的雞毛充分攪拌精子和卵子，1～2分鐘后把受精卵平鋪到盛有清水的培養(yǎng)皿中，無需染色體加倍處理，胚胎在20～21℃水溫下孵化。孵化出的魚苗在池塘中養(yǎng)殖。通過此方法，獲得大量存活的雄核發(fā)育實驗魚。觀察實驗魚的胚胎發(fā)育情況，并記錄胚胎發(fā)育至原腸胚的百分比和孵化率的情況。用腎細胞直接制片法對二倍體鯽鯉體細胞染色體數(shù)目進行了檢測。腎細胞直接制片法的方法為在18～22℃水溫下培育實驗魚1～3天后，對實驗魚注射PHA 1～3次，每次劑量為2～8μg/克體重，間隔時間為12～24小時，在解剖取材前2～6小時，注射秋水仙素，劑量為2～4μg/克體重。取出腎組織，在生理鹽水下剪碎腎組織，0.075mol/LKCL低滲處理，在20℃溫度下低滲40～60分鐘；用冰醋酸∶甲醇(1∶3)固定腎細胞1～3次；在冰凍載玻片上滴片；Giemsa染液染色。
實驗證明，雄核發(fā)育二倍體鯽鯉的孵化率達到了4.1％，雄核發(fā)育二倍體鯽鯉的成活率到達了69.5～75.0％。腎細胞直接制片法的檢測結果證明雄核發(fā)育二倍體鯽鯉的體細胞染色體數(shù)目為2n＝100(圖1)，這種雄核發(fā)育二倍體鯽鯉的性成熟年齡一般為2年，比其原始父本-雄性四倍體鯽鯉的性成熟年齡(1年)推遲，但在生長速度和抗逆性方面明顯比四倍體鯽鯉要強，雄核發(fā)育二倍體鯽鯉最顯著的繁殖特點在于他們能產生二倍體配子(精子和卵子)，其自交獲得四倍體后代(圖3)，這些二倍體配子可以用來制備新型的四倍體魚和三倍體魚。利用雄核發(fā)育二倍體鯽鯉自交得到的新型四倍體鯽鯉的生長速度比普通四倍體鯽鯉的生長速度要快50％，而且他們的抗病、抗逆能力都明顯比普通四倍體鯽鯉要強。
通過細胞和分子生物學實驗證明，二倍體鯽鯉雜交魚產生二倍體配子的特性可能與早期生殖細胞的核內復制有關。
本發(fā)明方法培育的雄核發(fā)育二倍體鯽鯉生長速度快，抗病力強，繁殖力高，且能產生大量的二倍體配子。雄核發(fā)育二倍體鯽鯉體系的形成創(chuàng)建了一種能夠產生大量二倍體配子的新型二倍體鯽鯉雜交魚品系，為制備新型三倍體魚和四倍體魚提供了重要的二倍體配子資源。由兩性可育的雄核發(fā)育魚自交產生的大量存活的后代在新品種的選育方面具有重要的意義。
權利要求
1.一種魚類的雄核發(fā)育方法，其特征在于以四倍體鯽鯉產生的二倍體精子為材料，用紫外線照射使金魚卵子的核DNA遺傳失活，然后用二倍體精子與遺傳失活的卵子混合，混合1～2分鐘后，將受精卵置于20～21℃水溫條件下孵化，孵化出的魚苗經養(yǎng)殖，獲得雌雄兩性可育的雄核發(fā)育魚，選擇雌、雄性成熟的雄核發(fā)育魚，將其產生的精液和卵子混合，獲得了存活的自交后代。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種魚類的雄核發(fā)育技術。本發(fā)明以四倍體鯽鯉產生的二倍體精子為材料，用紫外線照射失活金魚卵子的核DNA的遺傳活性，然后用二倍體精子與遺傳失活的卵子混合，不經染色體加倍處理，受精卵孵化出的魚苗經飼養(yǎng)，發(fā)育成雌雄兩性可育的雄核發(fā)育魚，雄核發(fā)育魚自交形成了存活的四倍體后代，為改良魚類性狀提供重要的二倍體配子資源。
文檔編號A01K67/027GK1875699SQ200610031790
公開日2006年12月13日 申請日期2006年6月8日 優(yōu)先權日2006年6月8日
發(fā)明者劉少軍, 劉筠, 孫遠東, 羅凱坤, 張純 申請人:湖南師范大學