專利名稱：一種利用淀粉廢水制備的微生物滅蚊劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滅蚊劑，具體地說(shuō)，涉及一種利用淀粉廢水制備的微生物滅蚊劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
淀粉廢水是一種在淀粉加工過(guò)程中產(chǎn)生的高濃度有機(jī)廢水，這些廢水中含有大量的殘余淀粉、葡萄糖、果糖、麥芽糖等碳水化合物、蛋白質(zhì)與有機(jī)酸等，易腐敗發(fā)臭，COD通常在2000-20000mg/L之間，是食品工業(yè)中污染最嚴(yán)重的廢水之一。
淀粉加工的主要原料是玉米(約占80％)、薯類(lèi)、小麥以及其它富含淀粉的植物塊根，廢水主要來(lái)源于浸泡與淀粉分離工段。我國(guó)現(xiàn)有淀粉生產(chǎn)企業(yè)近600多家，廢水年排放量超過(guò)1億噸。淀粉廢水中所含的有機(jī)物大多是可以回收利用的寶貴資源。例如，玉米淀粉廢水一般含有0.3-0.7％的總糖，約2.1％粗蛋白與0.1-0.3％的脂肪酸；目前，國(guó)內(nèi)外常用的淀粉廢水處理方法有生物處理法(包括活性污泥法、生物膜法、生物穩(wěn)定塘與厭氧生物法等)、蛋白分離法(包括重力沉降法、化學(xué)絮凝法、氣浮法與膜分離法等)以及微生物轉(zhuǎn)化法。其中微生物轉(zhuǎn)化法最受青睞，它是利用廢水含有的豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可支持菌體生長(zhǎng)的特點(diǎn)，將之轉(zhuǎn)化成附加值較高的產(chǎn)品。微生物轉(zhuǎn)化法處理淀粉廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的技術(shù)早在上世紀(jì)70年代就被廣泛應(yīng)用，采用的菌種主要有白地霉、假絲酵母、光合細(xì)菌等，產(chǎn)品形式較為單一，主要為單細(xì)胞蛋白(SCP)飼料。這類(lèi)SCP飼料存在一些缺陷如核酸含量高(食用過(guò)多可能會(huì)引起痛風(fēng)等疾病)、無(wú)肉質(zhì)、風(fēng)味不佳而限制了其應(yīng)用范圍。因此，有必要尋找新型微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，開(kāi)發(fā)新型高附加值產(chǎn)品。
球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus，簡(jiǎn)稱Bs)與蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，簡(jiǎn)稱Bti)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛、殺滅蚊幼蟲(chóng)最有效的微生物滅蚊劑。它們對(duì)非靶生物與人畜無(wú)毒(可用于飲用積水)，同時(shí)也不破壞生態(tài)平衡和污染環(huán)境，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦作為防蚊控病的重要手段之一。Bti與Bs主要?dú)⑽没钚猿煞质谴x過(guò)程中產(chǎn)生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼蟲(chóng)吞食后在腸道堿性環(huán)境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻擊蚊幼蟲(chóng)中腸刷狀緣上皮細(xì)胞膜，殺傷這些細(xì)胞，最終導(dǎo)致蚊幼死亡。
Bs與Bti微生物滅蚊劑的主要生產(chǎn)工藝是液體深層發(fā)酵，以黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等為主要原料，原料成本約占總生產(chǎn)成本的20-35％。目前，制約Bti與Bs兩種微生物滅蚊劑大規(guī)模應(yīng)用的主要因素有二一是生產(chǎn)原料昂貴。造成產(chǎn)品價(jià)格較高，抵消了其作為生物滅蚊劑的優(yōu)越性；二是發(fā)酵水平低。這兩種芽孢桿菌，尤其是Bs在發(fā)酵中往往不能同步成熟，發(fā)育同步性能差(普遍報(bào)道抗熱性芽孢的形成率只有48-72％)，導(dǎo)致產(chǎn)品的殺蚊活性不高。
近年來(lái)，有研究者嘗試采用廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品或有機(jī)物含量豐富的有機(jī)廢棄物作為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物滅蚊劑。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工業(yè)產(chǎn)生的有機(jī)廢液(經(jīng)水解預(yù)處理)作為主要培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)Bti滅蚊劑，發(fā)酵罐試驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)24-48h的通氣攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵液中Bti菌數(shù)達(dá)2.5×109個(gè)細(xì)菌/mL，對(duì)埃及伊蚊幼蟲(chóng)(Aedes aegypti)的LC50為0.063ppm，顯著高于常規(guī)的合成培養(yǎng)基。Obeta等(1983)利用豬血、豆科植物種籽和礦質(zhì)鹽制備的幾種培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在這些培養(yǎng)基中Bs 1593菌株都能良好的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢產(chǎn)毒，從而制備Bs滅蚊劑。然而，這些原料比較分散，并且通常需要繁瑣、昂貴的預(yù)處理(如水解、浸提與濃縮處理等)，因而并未得到大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用。
淀粉廢水含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2006年，發(fā)明專利(CN1799363A)公開(kāi)了一種淀粉廢水生產(chǎn)蘇云金桿菌微生物殺蟲(chóng)劑的方法，該專利以蘇云金桿菌為發(fā)酵菌種，所生產(chǎn)的蘇云金桿菌微生物殺蟲(chóng)劑的防治對(duì)象是鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。蚊類(lèi)屬于雙翅目衛(wèi)生害蟲(chóng)，它不僅吸血擾人，而且傳播多種嚴(yán)重疾病。經(jīng)文獻(xiàn)與專利檢索，尚未發(fā)現(xiàn)淀粉廢水制備微生物滅蚊劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種滅蚊效果好，對(duì)環(huán)境安全無(wú)害的微生物滅蚊劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述微生物滅蚊劑的制備方法。在滅蚊劑制備過(guò)程中同時(shí)處理淀粉廢水。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用液體深層發(fā)酵方法，包括如下步驟1)廢水培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)淀粉廢水含固率為2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氫二鉀、0.2-1.0g/L硫酸鎂和1.0-5.0g/L消泡劑，用堿調(diào)pH為7.5-10.0，攪拌均勻后，在種子罐或發(fā)酵罐中經(jīng)15磅壓力與121℃下滅菌30-60分鐘，冷卻至30-35℃?zhèn)溆?。所用的消泡劑是指泡敵、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敵。所用的堿是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是NaOH。
2)搖瓶培養(yǎng)從保藏正常的Bs或Bti斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。條件為溫度28-32℃、轉(zhuǎn)速150-250轉(zhuǎn)/分，三角瓶裝液量20-40％，培養(yǎng)時(shí)間8-12小時(shí)。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來(lái)水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。所用Bs與Bti菌株是WHO推薦或廠家普遍使用的高毒力菌株。具體來(lái)說(shuō)，Bs包括2362、1593、2297、Bs-10等4種，Bti是指蘇云金芽孢桿菌H14血清型，主要是187與1897菌株，上述菌株可在國(guó)內(nèi)微生物保藏機(jī)構(gòu)直接購(gòu)得。
3)種子罐發(fā)酵將Bs或Bti搖瓶菌液移入種子罐，接種量為1.0-3.0％，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1∶1.0-1.5(V/V/分)、攪拌速度200-260轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間8-12小時(shí)。
4)發(fā)酵罐發(fā)酵按1-10％的接種量將Bti或Bs種子液移種到發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1∶1.0-1.5(V/V/分)、攪拌速度180-220轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間30-42小時(shí)，其中Bs菌株的適宜發(fā)酵時(shí)間為30-36小時(shí)，Bti菌株的適宜發(fā)酵時(shí)間為36-42小時(shí)。
5)發(fā)酵液后處理發(fā)酵結(jié)束后，用無(wú)機(jī)酸將發(fā)酵液pH調(diào)為4.0-4.5，然后用高速離心法濃縮發(fā)酵液，濃縮倍數(shù)為2-5倍，濃縮液加入0.2-2g/L防腐劑，攪拌均勻，分裝，得到微生物滅蚊劑液體產(chǎn)品。所述的無(wú)機(jī)酸是指硫酸、鹽酸與硝酸，其中最好是鹽酸；所述的防腐劑是指山梨酸鉀、苯甲酸鈉、二甲苯、尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸鉀。
6)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)產(chǎn)品中抗熱性芽孢的測(cè)定方法采用無(wú)菌操作，將液體產(chǎn)品進(jìn)行梯度稀釋，取適宜稀釋度的菌液于80℃水浴處理15min，然后進(jìn)行涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)，每平板菌落數(shù)30-300個(gè)有效。產(chǎn)品生物毒力效價(jià)測(cè)定方法按照WHO標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，試蟲(chóng)為淡色庫(kù)蚊(Culex pipiens pallens)或白紋伊蚊(Aedesalbopictus)二齡末至三齡初的健康幼蟲(chóng)。合格產(chǎn)品中抗熱芽孢數(shù)≥109個(gè)/毫升，生物測(cè)定毒力效價(jià)≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培養(yǎng)基液體中加入的同標(biāo)物的克數(shù)；％是指每100份質(zhì)量的培養(yǎng)基液體中接入接種物的質(zhì)量份數(shù)；V/V/分是指每分鐘向1份體積的培養(yǎng)基中通入空氣的體積份數(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)原理是以淀粉廢水所含的糖分與蛋白質(zhì)、磷以及微量元素為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在維持適宜pH、溫度與通氣量的條件下，Bs或Bti菌株得以生長(zhǎng)與增殖，形成芽孢與毒素蛋白等殺蟲(chóng)活性物質(zhì)，發(fā)酵液經(jīng)濃縮、防腐制成微生物滅蚊劑產(chǎn)品。
本發(fā)明所制備的滅蚊劑產(chǎn)品為液體劑型，可有效殺滅雙翅目庫(kù)蚊與伊蚊的幼蟲(chóng)，并且對(duì)環(huán)境安全無(wú)害。所述液體劑型中抗熱性芽孢含量不低于109個(gè)/毫升，對(duì)淡色庫(kù)蚊(Culex pipiens pallens)或白紋伊蚊(Aedes albopictus)2-3齡幼蟲(chóng)的生物毒效不低于100ITU/mg。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)為淀粉廢水提供了一條嶄新的資源化處置途徑，同時(shí)降低了微生物滅蚊劑的生產(chǎn)成本。
(2)與現(xiàn)有技術(shù)中的淀粉廢水生物處理法相比，本發(fā)明不僅處理了淀粉廢水，而且可獲得滅蚊劑產(chǎn)品，從而降低了廢水處理成本。
(3)與現(xiàn)有技術(shù)中的蛋白分離法從淀粉廢水中提取飼料蛋白相比，本方法獲得的產(chǎn)品附加值較高。
(4)與現(xiàn)有技術(shù)中的微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料相比，本方法突破了現(xiàn)有技術(shù)中以蛋白飼料為最終發(fā)酵產(chǎn)品的局限性，擴(kuò)大了淀粉廢水的資源化利用途徑。
(5)現(xiàn)有微生物滅蚊劑的生產(chǎn)原料主要是黃豆餅粉、花生餅粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料價(jià)格過(guò)高是其難于普及的主要限制因素。本發(fā)明中Bs或Bti菌株主要依靠淀粉廢水自身的可利用成分(糖分、蛋白質(zhì)與礦質(zhì)鹽等)生長(zhǎng)與增殖，添加的成分較少，大大降低了微生物滅蚊劑的生產(chǎn)成本，從而促進(jìn)環(huán)境友好型生物滅蚊劑的推廣應(yīng)用。
(6)現(xiàn)有微生物滅蚊劑發(fā)酵生產(chǎn)中一個(gè)技術(shù)瓶頸是抗熱性芽孢形成率低(48-72％)，也就是說(shuō)細(xì)菌發(fā)育同步性能差，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的殺蚊活性不高。以淀粉廢水替代黃豆餅粉等常規(guī)原料，可以提高Bs與Bti的發(fā)育同步性，倒罐時(shí)(30-42小時(shí))抗熱芽孢形成率可達(dá)到85％以上。


圖1為Bs 2362菌株在淀粉廢水中培養(yǎng)36小時(shí)的電鏡照片；圖2為Bti 187菌株在淀粉廢水中培養(yǎng)42小時(shí)的電鏡照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1生產(chǎn)Bs滅蚊劑(1)淀粉廢水樣品取北京市某淀粉廠的淀粉廢水，該廠采用玉米為原料生產(chǎn)淀粉，加工工藝流程為玉米→過(guò)篩→浸泡→粉碎→胚芽分離→磨細(xì)→篩分→沉淀分離→淀粉洗滌→脫水→干燥→淀粉。廢水主要來(lái)源為浸泡水與黃漿水。經(jīng)分析，該淀粉廢水中碳水化合物含量為6.8g/L、粗蛋白含量為19.0g/L、含固率8.61％，pH＝4.80。
(2)廢水培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)淀粉廢水含固率為5.0％，加入0.75g/L的磷酸氫二鉀、0.30g/L的硫酸鎂和2.5g/L的泡敵。用NaOH調(diào)pH至9.5，分別在種子罐與發(fā)酵罐中經(jīng)15磅壓力與121℃溫度滅菌60分鐘，冷卻至35℃?zhèn)溆?，滅后pH約為7.3。
(其它消泡劑，如聚丙二醇、豆油、花生油等，分別代替泡敵，其效果相同。)(3)搖瓶培養(yǎng)從Bs 1593菌株斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，500mL三角瓶裝液250mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來(lái)水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。
(4)種子罐發(fā)酵接種3.0％的Bs 1593搖瓶菌液，發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為罐溫32℃、罐壓0.06MPa、通氣量1∶1.0(V/V/分)、攪拌速度260轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間8小時(shí)。
(5)發(fā)酵罐發(fā)酵接種8％的種子液到發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件為罐溫32℃、罐壓0.06MPa、通氣量1∶1.0(V/V/分)、攪拌速度220轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間30小時(shí)。放罐時(shí)發(fā)酵液中Bs1593菌株的活菌數(shù)為6.7×108個(gè)/mL，抗熱性芽孢數(shù)6.0×108個(gè)/mL，芽孢形成率89.6％，均顯著高于常規(guī)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(表2)。
表2.Bs 1593菌株在淀粉廢水培養(yǎng)30小時(shí)的發(fā)酵性狀及其與常規(guī)培養(yǎng)基的比較

(6)發(fā)酵液后處理發(fā)酵結(jié)束后，用稀硫酸將發(fā)酵液pH調(diào)為4.0，經(jīng)高速離心濃縮5倍，加入0.3g/L的防腐劑山梨酸鉀，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指苯甲酸鈉、二甲苯、尼泊金甲酯，代替山梨酸鉀，效果相同。)(7)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)所制備的Bs滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數(shù)為2.25×109個(gè)/毫升，生物測(cè)定表明產(chǎn)品對(duì)淡色庫(kù)蚊2-3齡幼蟲(chóng)的毒力效價(jià)為120ITU/mg實(shí)施例2生產(chǎn)Bs滅蚊劑(1)淀粉廢水樣品淀粉廢水樣品同實(shí)施例1。
(2)廢水培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)淀粉廢水含固率為3.0％，加入0.50g/L的磷酸氫二鉀、0.20g/L的硫酸鎂和5.0g/L的花生油。用Ca(OH)2調(diào)pH至9.0，分別在種子罐與發(fā)酵罐中經(jīng)15磅壓力與121℃溫度滅菌60分鐘，冷卻至35℃?zhèn)溆茫瑴绾髉H約為7.5。
(其它消泡劑，如泡敵、豆油、聚丙二醇等，分別代替花生油，其效果相同。)
(3)搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵菌種由Bs 1593換成Bs 2362菌株，其余同實(shí)施例1。
(4)種子罐發(fā)酵接種1.0％的Bs 2362搖瓶菌液，發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為罐溫30℃、罐壓0.02MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間10小時(shí)。
(5)發(fā)酵罐發(fā)酵接種2.0％的種子液到發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度180轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)。圖1是放罐時(shí)發(fā)酵液中Bs 2362菌株的芽孢形態(tài)(毒素蛋白包裹在芽孢之中)，可以看出基本沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)體存在，發(fā)酵同步性好。此時(shí)發(fā)酵液中Bs 2362菌株的活菌數(shù)為6.6×108個(gè)/mL，抗熱性芽孢數(shù)6.4×108個(gè)/mL，芽孢形成率97.0％。
(6)發(fā)酵液后處理發(fā)酵結(jié)束后，用稀硫酸將發(fā)酵液pH調(diào)為4.0，經(jīng)高速離心濃縮4倍，加入0.2g/L的防腐劑苯甲酸鈉，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指山梨酸鉀、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸鈉，效果相同。)(7)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)所制備的Bs滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數(shù)為2.19×109個(gè)/毫升，生物測(cè)定表明產(chǎn)品對(duì)淡色庫(kù)蚊2-3齡幼蟲(chóng)的毒力效價(jià)為195ITU/mg。
實(shí)施例3生產(chǎn)Bti滅蚊劑(1)淀粉廢水樣品取河北省石家莊市某淀粉廠的淀粉廢水，該廠采用紅薯為原料生產(chǎn)淀粉，加工工藝流程為紅薯→洗滌→磨碎→過(guò)篩→漿液→離心分離→淀粉洗滌→脫水→干燥→淀粉。廢水主要來(lái)源為洗滌水與分離廢水(薯漿廢水及蛋白質(zhì)水)。經(jīng)分析廢水中碳水化合物含量為13.2g/L、粗蛋白含量為6.1g/L、含固率7.10％、pH＝4.45。
(2)廢水培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)淀粉廢水含固率為2.5％，加入礦質(zhì)鹽0.4g/L的磷酸氫二鉀、0.35g/L的硫酸鎂、2.0g/L的消泡劑聚丙二醇。用Ca(OH)2調(diào)pH至9.7，分別在種子罐與發(fā)酵罐中經(jīng)15磅壓力與121℃溫度滅菌60分鐘，冷卻至35℃?zhèn)溆?，滅后pH約為7.5。
(3)搖瓶培養(yǎng)從Bti 1897菌株斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分，500mL三角瓶裝液150mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來(lái)水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。
(4)種子罐發(fā)酵接種2.0％的上述搖瓶菌液，發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為罐溫30℃、罐壓0.04MPa、通氣量1∶1.4(V/V/分)、攪拌速度220轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間12小時(shí)。
(5)發(fā)酵罐發(fā)酵接種2.0％的種子液到發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件為罐溫30℃、罐壓0.04MPa、通氣量1∶1.4(V/V/分)、攪拌速度180轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間38小時(shí)。放罐時(shí)發(fā)酵液中活菌數(shù)為5.5×108個(gè)/mL，抗熱性芽孢數(shù)4.9×108個(gè)/mL，芽孢形成率89％。，均顯著高于常規(guī)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(表3)。
表3.Bti 1897菌株在淀粉廢水培養(yǎng)38小時(shí)的發(fā)酵參數(shù)及其與常規(guī)培養(yǎng)基的比較

(6)發(fā)酵液后處理發(fā)酵結(jié)束后，用稀鹽酸將發(fā)酵液pH調(diào)為4.5，經(jīng)高速離心濃縮5倍，加入0.2g/L的防腐劑苯甲酸鈉，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指山梨酸鉀、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸鈉，效果相同。)(7)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)所制備的Bti生物滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數(shù)為2.24×109個(gè)/毫升，生物測(cè)定表明產(chǎn)品對(duì)白紋伊蚊2-3齡幼蟲(chóng)的毒力效價(jià)為108ITU/mg。
實(shí)施例4生產(chǎn)Bti滅蚊劑(1)淀粉廢水樣品淀粉廢水樣品同實(shí)施例3。
(2)廢水培養(yǎng)基調(diào)理同實(shí)施例3。
(3)搖瓶培養(yǎng)菌株由Bti 1897菌株換成Bti 187菌株，其余同實(shí)施例3。
(4)種子罐發(fā)酵接種1.0％的Bti 187搖瓶菌液，發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度250轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間12小時(shí)。
(5)發(fā)酵罐發(fā)酵接種1.5％的Bti 187種子液到發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間42小時(shí)。圖2是放罐時(shí)發(fā)酵液中Bti 187菌株的芽孢與毒素蛋白的形態(tài)，圖中顯示只有極少數(shù)營(yíng)養(yǎng)體存在，發(fā)酵同步性較好。42小時(shí)放罐時(shí)發(fā)酵液中Bti187菌株的活菌數(shù)為7.5×108個(gè)/mL，抗熱性芽孢數(shù)6.7×108個(gè)/mL，芽孢形成率89.3％。
(6)發(fā)酵液后處理發(fā)酵結(jié)束后，用稀硫酸將發(fā)酵液pH調(diào)為4.2，經(jīng)高速離心濃縮4倍，加入0.4g/L的防腐劑二甲苯，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯，代替二甲苯，效果相同。)(7)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)所制備的Bs生物滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數(shù)為2.19×109個(gè)/毫升，生物測(cè)定表明產(chǎn)品對(duì)淡色庫(kù)蚊2-3齡幼蟲(chóng)的毒力效價(jià)為205ITU/mg。
權(quán)利要求
1.一種利用淀粉廢水制備微生物滅蚊劑的方法，其特性在于包括如下步驟(1)廢水培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)淀粉廢水的含固率為2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氫二鉀、0.2-1.0g/L硫酸鎂和1.0-5.0g/L消泡劑，用堿調(diào)pH為7.5-10.0，攪拌均勻后，滅菌，冷卻至30-35℃?zhèn)溆茫?2)搖瓶培養(yǎng)將Bs或Bti接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28-32℃、轉(zhuǎn)速150-250轉(zhuǎn)/分，瓶裝液量20-40％，培養(yǎng)時(shí)間8-12小時(shí)；(3)種子罐發(fā)酵將Bs或Bti搖瓶菌液移入種子罐，接種量為1-3％，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、每分鐘的通氣量為培養(yǎng)基體積的1.0-1.5倍、攪拌速度200-260轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間8-12小時(shí)；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵按1-10％的接種量將Bs或Bti種子液移種到發(fā)酵罐，培養(yǎng)條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、每分鐘的通氣量為培養(yǎng)基體積的1.0-1.5、攪拌速度180-220轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時(shí)間30-42小時(shí)，其中Bs菌株的發(fā)酵時(shí)間為30-36小時(shí)，Bti菌株的發(fā)酵時(shí)間為36-42小時(shí)；(5)發(fā)酵液后處理發(fā)酵結(jié)束后，用無(wú)機(jī)酸將發(fā)酵液pH調(diào)為4.0-4.5，然后用高速離心法濃縮發(fā)酵液，濃縮倍數(shù)為2-5倍，濃縮液加入0.2-2g/L防腐劑，攪拌均勻，分裝，得到微生物滅蚊劑液體產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的消泡劑為泡敵、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的堿是指KOH、NaOH或Ca(OH)2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的滅菌是指在種子罐或發(fā)酵罐中經(jīng)15磅壓力與121℃下滅菌30-60分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來(lái)水1000mL；pH7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中所述的無(wú)機(jī)酸是硫酸、鹽酸或硝酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中所述防腐劑是山梨酸鉀、苯甲酸鈉、二甲苯或尼泊金甲酯。
8.利用權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述方法得到的微生物滅蚊劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用淀粉廢水制備的微生物滅蚊劑及其制備方法。本發(fā)明的制備方法包括廢水培養(yǎng)基調(diào)理、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、發(fā)酵液后處理與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)。本發(fā)明是一條減輕淀粉廢水對(duì)環(huán)境污染、變廢為寶的有效途徑，同時(shí)可大大降低微生物滅蚊劑的生產(chǎn)成本。本發(fā)明所制備的滅蚊劑產(chǎn)品對(duì)環(huán)境安全無(wú)害，對(duì)淡色庫(kù)蚊或白紋伊蚊2－3齡幼蟲(chóng)的生物毒效不低于100ITU/mg。
文檔編號(hào)A01P7/04GK1915030SQ20061003755
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日
發(fā)明者周順桂, 雷發(fā)懋, 王躍強(qiáng) 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所