專利名稱：菊苣試管苗的高效快繁方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種菊苣組培苗的快繁方法，特別是一種通過離體葉片不定芽的直接發(fā)生方法得到菊苣組培苗的快繁方法，屬生物組培育苗領域。
背景技術：
菊苣Chicory(Cichorium intybus.L)為菊科菊苣屬多年生草本，既是高產(chǎn)優(yōu)質的牧草，更是新興的高檔特色蔬菜，此外菊苣含有菊糖及馬栗樹皮素、馬栗樹皮甙、野萵苣甙、山萵苣素、山萵苣苦素等特殊成分，為咖啡代用品，并有防治黃膽性肝炎、心血管疾病、骨質疏松癥等功效，具有飼用、食用和藥用等方面的開發(fā)潛力。近年來有關菊苣組織培養(yǎng)已有一些報道[(1)Varotts，lucchin M，Parrinip.Immature embryos culture in Italian red chicory.Plan Cell Tissue andOrgan Culture，2000，62(1)75～79；(2)王紹明，張霞，劉彤.菊苣花瓣的組織培養(yǎng).植物生理學通訊，2001，37(3)230；(3)程林梅，高洪文，趙茂林.菊苣組織培養(yǎng)與植株再生的研究.草業(yè)學報，2002，11(4)105～107.]，但都是通過間接的器官發(fā)生途徑再生植株的，即外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織再分化成不定芽，最后不定芽生根成苗。培養(yǎng)周期長，成本高，程序復雜，植株再生頻率低，易發(fā)生變異。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種菊苣組培高效快繁方法，以菊苣葉片為外植體，經(jīng)無菌實生苗的產(chǎn)生、不定芽的直接誘導以及芽苗生根、練苗、移栽等環(huán)節(jié)，獲得組培苗。
本發(fā)明內容如下一種菊苣組培高效快繁方法，以菊苣葉片為外植體，包括如下步驟(1)無菌實生苗的產(chǎn)生菊苣種子經(jīng)滅菌接種于無激素的1/2MS基本培養(yǎng)基MS1上萌發(fā)成無菌實生苗；(2)離體葉片不定芽的直接發(fā)生將20～50d齡的無菌實生苗葉片切塊，接種在不定芽直接誘導培養(yǎng)基MS2上產(chǎn)生綠色的不定芽芽點，繼續(xù)培養(yǎng)15～20d，芽點可發(fā)育成單生和/或簇生的不定芽；(3)不定芽的生根、練苗與移栽切取不定芽轉入MS或1/2MS生根培養(yǎng)基上誘導生根；上述步驟中培養(yǎng)基組分及含量配比如下無菌實生苗培養(yǎng)基MS11/2MS培養(yǎng)基
蔗糖30g/L瓊脂6.5g/LpH值5.8～6.2不定芽直接誘導誘導培養(yǎng)基MS2MS培養(yǎng)基6-BA0.5～2.0mg/LNAA 0.2～1.0mg/LAgNO32～10mg/LVB150～100mg/L脯氨酸 200～300mg/L蔗糖30～60g/L瓊脂6.5g/LpH值5.8～6.2生根培養(yǎng)基MS3MS或1/2MS培養(yǎng)基IBA 0.2～1.0mg/L蔗糖20g/L瓊脂6.5g/LpH值5.8～6.2。
本發(fā)明的方法中無菌實生苗產(chǎn)生是將種子用自來水沖洗，70％乙醇浸搖30s，0.1％HgCl2表面消毒10～15min，無菌水沖洗6次，接種于MS1基本培養(yǎng)基上，每日光照16h，光照強度2000lux，培養(yǎng)溫度25±2℃。
本發(fā)明的方法中離體葉片不定芽的直接發(fā)生是將20～50d齡的菊苣無菌苗葉片沿主脈橫切成葉片基部、中部和頂部三塊，接種在不定芽直接誘導誘導培養(yǎng)基MS2上，25±2℃，2500lux光照培養(yǎng)5～7d，在外植體的表面和切口處陸續(xù)產(chǎn)生綠色的不定芽芽點，15～20d，芽點可發(fā)育成單生和/或簇生的不定芽，每塊葉片形成的不定芽數(shù)量20～40個，繼續(xù)培養(yǎng)不定芽逐漸長高，而且又有新的不定芽不斷產(chǎn)生。
本發(fā)明的方法中不定芽的生根具體為切取2cm以上的不定芽，轉入生根培養(yǎng)基MS3上誘導生根15d左右長出健壯根系。
本發(fā)明的方法中根系發(fā)達，生根健壯的小苗進一步練苗與移栽，具體為敞開瓶蓋練苗5～7d，移栽于盆土(田園土∶腐葉土＝1∶1)中，其上覆蓋塑料膜保濕培養(yǎng)4～7d后，自然光照培養(yǎng)，再生植株成活率為96.7～1 00％。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果本發(fā)明以菊苣無菌苗葉片切塊為外植體，培養(yǎng)15～20d，每個外植體上可直接形成20～40個不定芽，35～40d內可再生30多個健壯的組培苗，一棵具5片葉的無菌實生苗，離體培養(yǎng)30天后可產(chǎn)生500棵左右的優(yōu)質組培苗。與常規(guī)的離體植株再生體系相比，培養(yǎng)周期至少縮短25～30d，培養(yǎng)成本減少一半以上，繁殖系數(shù)增加3～5倍，從而建立了高效快速低成本的菊苣組培苗工廠化生產(chǎn)體系，為常年供應優(yōu)質特色菊苣芽苗蔬菜以及優(yōu)良的菊苣牧草提供了可能及保證，同時為利用細胞工程和基因工程技術對菊苣性狀進行遺傳改良奠定了良好的技術平臺。


圖1為本發(fā)明的菊苣無菌苗20d齡葉片基部直接誘導不定芽。
圖2為本發(fā)明的菊苣無菌苗30d齡葉片中上部直接誘導不定芽。
圖3為本發(fā)明的菊苣不定芽在生根培養(yǎng)基上生根。
具體實施例方式
本發(fā)明使用的縮略語對應的中文名稱如下VB1(維生素B1)CH(水解乳蛋白)6-BA(6-芐基嘌呤)IBA(吲哚丁酸)NAA(α-奈乙酸)MS培養(yǎng)基按照手冊通用方法配制，組成與含量如下MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，KI0.83mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，H3BO36.2mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，肌醇100mg/L，維生素B10.1mg/L，維生素B60.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。
以下通過實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1挑選子粒飽滿的菊苣種子，用自來水沖洗，70％乙醇浸搖30s，0.1％HgCl2表面消毒12min，無菌水沖洗6次，接種于1/2MS基本培養(yǎng)基上，每日光照16h，光照強度20001x，培養(yǎng)溫度25±2℃.
切取培養(yǎng)20d的菊苣無菌苗葉片的基部，接種在附加2.0mg/L6-BA，0.5mg/LNAA，10mg/L AgNO3，100mg/LVB1，300mg/L脯氨酸和4％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，25±2℃，2500lux光照培養(yǎng)7d，外植體的表面和切口處陸續(xù)產(chǎn)生綠色的不定芽芽點，15d后，芽點發(fā)育成簇生的不定芽，每塊葉片形成的不定芽數(shù)最多為44個，平均為36.08個(如圖1所示)。切取2cm以上的不定芽，轉入附加0.5mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上，7d后產(chǎn)生不定根，15d后可形成3條健壯的不定根系(如圖3所示)。將生根的健壯再生植株，敞開瓶蓋練苗5d，移栽于營養(yǎng)盆土(田園土∶腐葉＝1∶1)中，覆蓋PVC薄膜保濕培養(yǎng)5d后，自然光下生長健壯，成活率100％。
經(jīng)過上述培養(yǎng)，在30～40d內，一塊菊苣離體葉片切塊可形成30多棵組培苗，而一棵帶有5片葉的菊苣無菌苗可生產(chǎn)出500多棵優(yōu)質組培苗。
實施例2挑選子粒飽滿的菊苣種子，用自來水沖洗，70％乙醇浸搖30s，0.1％HgCl2表面消毒12min，無菌水沖洗6次，接種于1/2MS基本培養(yǎng)基上，每日光照16h，光照強度20001x，培養(yǎng)溫度25±2℃。
切取培養(yǎng)30d的菊苣無菌苗葉片的中上部，接種在附加1.5mg/L6-BA，0.5mg/L NAA，5mg/L AgNO3，50mg/L VB1，300mg/L脯氨酸和4％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，25±2℃，2500lux光照培養(yǎng)7d，外植體的表面和切口處陸續(xù)產(chǎn)生綠色的不定芽芽點，15d左右，芽點發(fā)育成簇生的不定芽，每塊葉片形成的不定芽數(shù)最多為35個，平均為29.06個(如圖2所示)。切取2cm以上的不定芽，轉入附加0.5mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基上，5～7d產(chǎn)生不定根，15d后可形成3條以上健壯的不定根系。將健壯的再生植株，敞開瓶蓋練苗5d，移栽于營養(yǎng)盆土(田園土∶腐葉土＝1∶1)中，覆蓋PVC薄膜保濕培養(yǎng)5d后，自然光下生長健壯，成活率96.78％。
經(jīng)過上述培養(yǎng)，在30～40d內，一塊菊苣離體葉片切塊能生產(chǎn)出近30棵組培快繁苗，而一棵帶有5片葉的菊苣無菌苗可生產(chǎn)出近500棵優(yōu)質組培苗。
權利要求
1.一種菊苣組培高效快繁方法，以菊苣葉片為外植體，包括如下步驟(1)無菌實生苗的產(chǎn)生菊苣種子經(jīng)滅菌接種于無激素的1/2MS基本培養(yǎng)基MS1上萌發(fā)成無菌實生苗；(2)離體葉片不定芽的直接發(fā)生將20～50d齡的無菌實生苗葉片切塊，接種在不定芽直接誘導培養(yǎng)基MS2上產(chǎn)生綠色的不定芽芽點，繼續(xù)培養(yǎng)15～20d，芽點可發(fā)育成單生和/或簇生的不定芽；(3)不定芽的生根切取不定芽轉入MS或1/2MS生根培養(yǎng)基上誘導生根；上述步驟中培養(yǎng)基組分及含量配比如下無菌實生苗培養(yǎng)基MS11/2MS培養(yǎng)基蔗糖30g/L瓊脂6.5g/LpH值5.8～6.2不定芽直接誘導誘導培養(yǎng)基MS2MS培養(yǎng)基6-BA0.5～2.0mg/LNAA 0.2～1.0mg/LAgNO32～10mg/LVB150～100mg/L脯氨酸 200～300mg/L蔗糖30～60g/L瓊脂6.5g/LpH值5.8～6.2生根培養(yǎng)基MS3MS或1/2MS培養(yǎng)基IBA 0.2～1.0mg/L蔗糖20g/L瓊脂6.5g/LpH值5.8～6.2。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種菊苣組培高效快繁方法，其特征在于無菌實生苗產(chǎn)生是將種子用自來水沖洗，70％乙醇浸搖30s，0.1％HgCl2表面消毒10～15min，無菌水沖洗6次，接種于MS1基本培養(yǎng)基上，每日光照16h，光照強度2000lux，培養(yǎng)溫度25±2℃。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種菊苣組培高效快繁方法，其特征在于離體葉片不定芽的直接發(fā)生是將20～50d齡的菊苣無菌苗葉片沿主脈橫切成葉片基部、中部和頂部三塊，接種在不定芽直接誘導誘導培養(yǎng)基MS2上，25±2℃，2500lux光照培養(yǎng)發(fā)育成單生和/或簇生的不定芽。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種菊苣組培高效快繁方法，其特征在于生根健壯的小苗進一步練苗與移栽，具體為敞開瓶蓋練苗5～7d，移栽于盆土中，其上覆蓋塑料膜保濕培養(yǎng)4～7d后，自然光照培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種菊苣組培苗的快繁方法。其技術特征是以菊苣葉片為外植體，包括如下步驟(1)無菌實生苗的產(chǎn)生；(2)離體葉片不定芽的直接發(fā)生；(3)不定芽的生根、練苗與移栽。本發(fā)明以菊苣無菌苗葉片切塊為外植體，培養(yǎng)15～20d，每個外植體上可直接形成20～40個不定芽，35～40d內可再生30多個健壯的組培苗，一棵具5片葉的無菌實生苗，離體培養(yǎng)30天后可產(chǎn)生500棵左右的優(yōu)質組培苗。與常規(guī)的離體植株再生體系相比，培養(yǎng)周期至少縮短25～30d，培養(yǎng)成本減少一半以上，繁殖系數(shù)增加3～5倍。
文檔編號A01H3/00GK1820584SQ20061004191
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權日2006年3月13日
發(fā)明者韓曉玲, 賈敬芬 申請人:西北大學