專利名稱：屎腸球菌菌株及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種屎腸球菌菌株(Enterococcus faecium)及其用途。
背景技術：
動物腸道中通常有一層微生物或微生物層，在正常情況下即動物處于健康狀況時，并未表現(xiàn)異?；蛑虏‖F(xiàn)象，這一層微生物稱為腸道微生物。它是動物胃腸道中不可缺少的組成部分，對宿主動物絕大多數(shù)是有益無害的。使用無菌或抗生素處理的試驗動物所做的大量試驗證明，由于腸道已經(jīng)存在的微生物與侵入的病原菌競爭腸粘膜上的粘附位點，因此腸道正常菌群可以競爭性排斥外來致病菌在腸道的定植。乳酸菌是人和動物體內的有益微生物之一，是動物腸道的正常定植菌群，其定植在腸粘膜上皮細胞上，并抑制其它病原菌的粘附。在胃腸道400多種厭氧或好氧微生物中，乳酸菌約占10％。研究表現(xiàn)，與下痢豬相比，正常仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量明顯下降，而乳酸桿菌數(shù)大大提高。用乳酸桿菌接種仔豬，發(fā)現(xiàn)與未處理或下痢仔豬相比，處理豬腸組織勻漿液中大腸桿菌數(shù)量明顯降低，而乳酸桿菌數(shù)量大大提高。
乳酸菌的保健功能早在20世紀初就已經(jīng)被指出，但有關乳酸菌微生態(tài)制劑的研究卻開始于20世紀70年代后期。目前，乳酸菌微生態(tài)制劑的保健功能已受到全世界的廣泛關注，其功能及特點主要有以下幾點(1)、調節(jié)動物消化道微生物區(qū)系平衡，阻止病原菌對腸道的入侵和定植。乳酸菌通過自身以及代謝產(chǎn)物與其它微生物之間的相互作用，調整菌群之間的關系，維持和保證微環(huán)境中微生物群最佳優(yōu)勢組合以及這種組合的相對穩(wěn)定。而且乳酸菌與小腸粘膜上皮細胞結合，起占位作用，對有害菌有屏障排除能力。
(2)、抑制病原菌和抗感染，維持腸道的微生態(tài)平衡。乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸等有機酸，顯著降低消化道pH值，使腸內處于酸性環(huán)境。這對于致病菌如痢疾桿菌、傷寒桿菌、付傷寒桿菌、彎曲桿菌、葡萄球菌等致病菌有拮抗作用。而且低pH值能促進腸道蠕動，維持正常生理功能，防止致病菌的定植；乳酸菌還可以產(chǎn)生細菌素、過氧化氫等多種天然物質，其中過氧化氫能夠抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌如假單抱菌屬、大腸桿菌類和沙門氏菌屬等，而細菌素對葡萄球菌、梭狀芽抱桿菌以及沙門氏菌和志賀氏菌有拮抗作用。
(3)、活化免疫系統(tǒng)，增強免疫力。乳酸菌在幼齡動物免疫力的發(fā)展中起重要的作用，特別是針對抗原引起的保護性反應腸道炎癥。Perdigon等研究證明干酪乳桿菌能促進腸道分泌免疫球蛋白IgA，增強宿主腸粘膜的腸道粘膜反應。Lessard和Brisson給斷奶仔豬飼喂乳桿菌后，接種傳染性胃腸炎病毒疫苗，試驗組血清中的特異性抗體IgG水平顯著高于對照組。進一步研究證實乳酸菌及其代謝產(chǎn)物刺激動物機體的免疫系統(tǒng)，其作用與免疫佐劑相似，能誘導動物一些與免疫有關的細胞產(chǎn)生白細胞介素、促進細胞分裂素、干擾素、腫瘤壞死因子等。
(4)、乳酸菌還能產(chǎn)生一些特殊的酶系，如產(chǎn)生有機酸的酶系、合成多糖的酶系、分解乳酸菌生長因子的酶系、分解亞硝胺的酶系、降低膽固醇的酶系、控制內毒素的酶系、分解脂肪的酶系、合成各種維生素的酶系和分解膽酸的酶系等。這些酶能加速乳酸菌的生長，促進機體健康。
(5)、乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的乳酸和其他有機酸，從而使發(fā)酵液pH急劇下降，而在低pH情況下乳酸菌的生長將受到抑制，這對增加菌體生物量是非常不利的，所以在液體培養(yǎng)基中大都添加磷酸緩沖溶液和鈣鹽以降低pH對乳酸菌的危害。通常在發(fā)酵過程中pH控制在5.5-6.0左右。
基于乳酸菌的諸多優(yōu)點，它已成為廣大從事乳酸菌食品添加劑、益生素、開發(fā)新藥、飼料工業(yè)等領域研究人員的研究熱點。其中在飼料工業(yè)上，乳酸菌常和其他益生菌一起制成微生態(tài)制劑用于飼料來促進畜禽特別是幼齡動物的生長發(fā)育，減少發(fā)病率和死亡率。但是，目前乳酸菌最大的缺點就是生命力十分脆弱，無法久存。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌必須在腸道特定部位才能產(chǎn)生功效。而天然乳酸菌不耐飼料制粒時的高溫、胃酸及膽鹽的侵蝕。經(jīng)飼料制粒后大多數(shù)乳酸菌會死亡，在胃里大約三十分鐘后就也會死亡殆盡，安全到達腸道發(fā)揮作用的活菌數(shù)非常低；也無法吸附在腸道粘膜的適當位置，結果只能是隨著糞便排出體外，產(chǎn)生不了任何作用。鑒于此，強耐受力的乳酸菌株的分離和篩選迫在眉睫，這不僅關系到綠色畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和安全動物性產(chǎn)品的生產(chǎn)，也是保證廣大人民的健康生活、保護養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境和我國進入WTO參與國際競爭的必然選擇。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能促進養(yǎng)殖動物的生長性能的屎腸球菌菌株。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種屎腸球菌菌株，該菌株的保藏名稱為屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號CCTCC M206013。
該菌株革蘭氏陽性，橢圓形或球桿狀，無芽孢，無鞭毛；在營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂能生長，出現(xiàn)小于1mm的光滑圓潤的菌落。在血瓊脂平板上可形成約1mm的稍大菌落，光滑、較濕潤、易乳化。在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，也易形成長鏈。該菌株生長溫度為30～40℃，最適生長溫度35～38℃，適宜pH為5.0～7.5。
該菌株對慶大霉素、鏈霉素不敏感，對青霉素、氟霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福平、萬古霉素、氯霉素敏感。能夠利用(陽性)蔗糖、蜜二糖、葡萄糖(產(chǎn)氣)、乳糖、麥芽糖和甘露醇；不能夠利用(陰性)鼠李糖、棉子糖、山梨醇和松三糖。過氧化氫酶呈陰性，木糖精氨酸雙水解酶陰性。
該菌株可在麥麩上生長，在PYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，發(fā)酵液菌數(shù)可達1010cfu/ml以上。該菌株能在6.5％氯化鈉肉湯、pH9.6葡萄糖肉湯、50％膽汁PYG瓊脂斜面，及50℃生長、熱穩(wěn)定性試驗80℃水浴條件下10min存活率85～95％。該菌株發(fā)酵培養(yǎng)可產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乳酸，產(chǎn)生量可達0.5g/L以上。
本發(fā)明還提供了屎腸球菌菌株的用途用于促進養(yǎng)殖動物的生長性能；具體為將該菌株制成微生態(tài)制劑作為畜禽飼料的添加劑，用于促進養(yǎng)殖動物的生長性能。
將本發(fā)明的菌株制成微生態(tài)制劑的方法有如下兩種1、液體發(fā)酵方法以蛋白胨、麩皮和酵母膏為碳源和氮源，35～38℃發(fā)酵培養(yǎng)24～48h。
2、以麩皮和豆粉為主要原料的固體發(fā)酵方法，依次進行以下步驟
(1)、一級種子(試管斜面種子)將原始菌種接種至試管營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，35～38℃培養(yǎng)24～48h；(2)、二級種子(試管液體種子)將一級種子接種至試管營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，35～38℃培養(yǎng)24～48h；(3)、三級種子(三角瓶液體種子)將二級種子接種至含有50～150ml的5～20％麩皮浸出液培養(yǎng)基的三角瓶中，35～38℃培養(yǎng)24～48h；(4)、培養(yǎng)基配制麩皮和豆粉混合原料經(jīng)粉碎后加入等重量比例水，0.11Mpa滅菌50min，冷卻；(5)、發(fā)酵培養(yǎng)基按1～10％的比例接入三級種子，培養(yǎng)基含水量控制在45～50％，發(fā)酵室內相對濕度保持在80％以上，pH范圍為5.0～7.5，溫度維持在35～38℃，通風發(fā)酵36～60h。
將上述培養(yǎng)物在45～50℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包裝即成固態(tài)的微生態(tài)制劑。
本發(fā)明的屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401具有如下優(yōu)點1)菌株ZD-0401以畜禽養(yǎng)殖動物為對象設計并分離和篩選，針對性強；2)耐高溫、耐鹽并對膽汁具有抗性，易于在動物體內存活和定植；可以代謝產(chǎn)生乳酸，兼有乳酸菌的效果，pH適應范圍廣；動物服用后，能安全到達腸道發(fā)揮作用的活菌數(shù)高，因此適宜制成飼料制粒；3)該菌培養(yǎng)方便，生長速度快，能在廉價的原料上生長；4)該菌不產(chǎn)生有害物質，以它制備的微生態(tài)制劑用作畜禽的綠色添加劑，可顯著促進養(yǎng)殖動物的生長性能。
具體實施例方式
實施例1、菌種分離和篩選將健康豬腸道內容物制成懸浮液，經(jīng)營養(yǎng)肉湯富集培養(yǎng)24小時后(35～38℃)，置于80℃水浴鍋中加熱5～10分鐘，殺死不耐高溫的菌體。取出靜置10分鐘，稀釋后用無菌刮鏟將樣品液涂布均勻，用溶化的SBA培養(yǎng)基覆蓋所有的平板，35～38℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取鐵紅色菌落稍加稀釋后顯微鏡下觀察，對于細胞呈橢圓形或球桿狀，順連的方向延伸，直徑0.5～1.0μm，成對或成短鏈狀的形態(tài)的菌落繼續(xù)進行篩選。
對于過氧化氫酶呈陰性，木糖精氨酸雙水解酶陰性的菌株進行進一步劃線分離純化，根據(jù)菌落大小選取生長良好的菌落反復接種篩選，直至得到均勻的單個菌落，命名為ZD-0401。
實施例2、菌種鑒定(1)形態(tài)特征菌株ZD-0401革蘭氏陽性，橢圓形或球桿狀，無芽孢，無鞭毛，在營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂能生長，出現(xiàn)較小(小于1mm)光滑圓潤的菌落。在血瓊脂平板上形成稍大(約1mm)的菌落，光滑、較濕潤、易乳化。在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，也易形成長鏈。
(2)生化特性菌株ZD-0401對慶大霉素、鏈霉素不敏感，對青霉素、氟霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福平、萬古霉素、氯霉素敏感。能夠利用(陽性)蔗糖、蜜二糖、葡糖(產(chǎn)氣)、乳糖、麥芽糖和甘露醇；不能夠利用(陰性)鼠李糖、棉子糖、山梨醇和松三糖。
(3)培養(yǎng)特征菌株ZD-0401在溫度30～40℃均可較好生長，最適生長溫度35～38℃，適宜pH為5.0～7.5，能在6.5％氯化鈉肉湯，pH9.6葡萄糖肉湯、50％膽汁PYG瓊脂斜面、及50℃生長，熱穩(wěn)定性試驗80℃水浴條件下，10min存活率85～95％。菌株ZD-0401在PYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，發(fā)酵液菌數(shù)可達1010cfu/ml以上。菌株ZD-0401發(fā)酵液代謝產(chǎn)物有機酸組分分析參照沈萍等(2004)利用氣相色譜測定(HP6890GC，USA)，結果表明菌株ZD-0401發(fā)酵培養(yǎng)可產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乳酸，產(chǎn)生量可達0.5g/L以上。根據(jù)《Bergey′s Mannual ofDeterminative Bacteriology》(Holt，J.G.，Gibbons，N.E.，1994)和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英等，2001)，通過性態(tài)特征、生化特性和培養(yǎng)特征，確定菌株ZD-0401為屎腸球菌。將該菌株進行保藏，保藏名稱為屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號CCTCC M206013。
實施例3、制作微生態(tài)制劑本實施例中所有的“％”均代表重量比。
方法1、液體發(fā)酵法斜面培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和10％麩皮浸出液，2％瓊脂，自然pH，121℃高壓滅菌30min。
營養(yǎng)鹽溶液的組成(％)KH2PO4，0.05；MgSO4.7H2O，0.05；CaCl2，0.01；NaCl，0.10；FeSO4.7H2O，0.005；MnSO4.H2O，0.001；ZnSO4.7H2O，0.0005；CoCl2，0.0005；其余為水。
培養(yǎng)基在營養(yǎng)鹽溶液中加入5％麩皮浸出液、1％酵母膏，調pH6.5。
培養(yǎng)條件250ml三角瓶裝入培養(yǎng)基100ml，用屎腸球菌ZD-0401懸液接種1.0ml，100r/min旋轉式振搖，在37℃下培養(yǎng)36h。
方法2、固體發(fā)酵法
(1)、一級種子(試管斜面種子)將原菌種接種至試管營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h；(2)、二級種子(試管液體種子)將一級種子接種至營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h；(3)、三級種子(三角瓶液體種子)從二級種子接種至5％麩皮浸出液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h；(4)、培養(yǎng)基配制原料(麩皮∶豆粉＝4∶1)經(jīng)粉碎后加入等重量比例水，0.11Mpa滅菌50min，冷卻至37℃；(5)、發(fā)酵培養(yǎng)基按5％的比例接入三級種子，37℃通風發(fā)酵48h。
(6)、培養(yǎng)物在45℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包裝。
實施例4、應用效果1以1日齡AA商品代混合雛雞160只為試驗動物，分為對照組和試驗組，各80只。每10只放置于一鐵籠中(規(guī)格為100cm×80cm×50cm)，飼喂相同的玉米-豆粕型基礎日量。其中對照組僅飼喂基礎日量，試驗組按照108cfu/kg的濃度添加ZD-0401；兩組雞同樣的24h光照、自由采食和飲水。結果表明在肉雞飼料中添加ZD-0401，具有明顯地促生長和改善飼料利用率的作用。42日齡時，試驗組肉雞平均體重和飼料系數(shù)分別為1.91kg和1.83，而對照組分別為1.82kg和1.98，差異均顯著。進一步研究發(fā)現(xiàn)，添加ZD-0401的試驗組與對照組相比較，腸道中大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌株數(shù)目顯著下降，而乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌株數(shù)目顯著升高。此外，經(jīng)檢測，試驗組肉雞腸道中乳酸和丙酸的數(shù)量也顯著高于對照組。
效果2本試驗選用64頭28±2日齡平均體重為7.5±0.3kg的去勢斷奶“杜長大”三元雜交仔豬，按照胎次一致，品種相同、體重相近、公母各半的分組方法，隨機分為對照組和試驗組，飼喂相同的基礎日糧，試驗組按照108cfu/kg的濃度添加ZD-0401。兩組豬均在試驗前對豬舍進行嚴格消毒，均采用群飼、自由采食和飲水。試驗預飼期7天，正式期45天。結果表明，添加一定濃度的ZD-0401可以顯著提高仔豬的生長性能和防病能力。與對照組相比，試驗組平均日增重提高9.8％，飼料系數(shù)下降了18％，仔豬腹瀉率下降70％。此外，與對照組相比較，試驗組豬腸道中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量也明顯增高，而大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量顯著下降。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種屎腸球菌菌株，其特征在于，該菌株的保藏名稱為屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號CCTCC M206013。
2.根據(jù)權利要求1所述的屎腸球菌菌株，其特征是該菌株革蘭氏陽性，橢圓形或球桿狀，無芽孢，無鞭毛；在營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂能生長，出現(xiàn)小于1mm的光滑圓潤的菌落；在血瓊脂平板上可形成約1mm的稍大菌落，光滑、較濕潤、易乳化；在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，也易形成長鏈；
3.根據(jù)權利要求2所述的屎腸球菌菌株，其特征是該菌株生長溫度為30～40℃，適宜pH為5.0～7.5。
4.如權利要求1～3所述的屎腸球菌菌株的用途用于促進養(yǎng)殖動物的生長性能。
5.根據(jù)權利要求4所述的屎腸球菌菌株的用途將該菌株制成微生態(tài)制劑作為畜禽飼料的添加劑，用于促進養(yǎng)殖動物的生長性能。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屎腸球菌菌株，該菌株的保藏名稱為屎腸球菌(Enterococcus faecium)ZD－0401，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號CCTCC M206013。該菌株的用途是將該菌株制成微生態(tài)制劑作為畜禽飼料的添加劑，用于促進養(yǎng)殖動物的生長性能。
文檔編號A23K1/16GK1831114SQ20061004982
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月14日 優(yōu)先權日2006年3月14日
發(fā)明者李衛(wèi)芬, 周緒霞, 王彥波, 姚江濤, 陸平, 胡春霞, 馬國霞 申請人:浙江大學