專利名稱:對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途。
背景技術(shù):
果樹細菌性根癌病菌(Agrobacterium tumefaciens)引起根癌病分布于世界各地。DeCleene和DeLey曾報道根癌農(nóng)桿菌可侵染93個科331屬643中的雙子葉植物及少數(shù)裸子植物。1980年Kennedy報道美國由原核植物病原菌所造成的作物損失中,果樹和葡萄的根癌病排列為最重要。我國的葡萄根癌病在北方地區(qū)13個省均有不同程度發(fā)生,櫻桃根癌病在山東、大連、河北等地發(fā)生嚴重,桃樹根癌病在江蘇、浙江、福建及上海郊區(qū)普遍發(fā)生,嚴重的果園植株發(fā)病率為90%以上。
根癌病對果樹的危害極大是一種世界性病害,直接影響了果樹產(chǎn)品的生產(chǎn),從而影響了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展。因此,對此病的防治引起了世界各國的關(guān)注,鑒于化學農(nóng)藥對環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞,植物根癌病的生物防治得到了重視,國際上主要應用細菌在其代謝過程中產(chǎn)生的細菌素來對根癌農(nóng)桿菌的生長起到預防和抑制的作用,但其菌株主要是選取不致病的發(fā)根土壤桿菌K84菌株,K84菌株在根癌病的防治中的作用是防非治,是作為一種預防措施使用,并且不能防治所有根癌病,只對含胭脂堿Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌才有效果。雖然分離出的另外一些無致病性的土壤桿菌,如根癌土壤桿菌J73、根癌土壤桿菌D286等能彌補K84菌株之不足,但生防細菌不耐旱,壽命短,必須貯藏和隨制隨用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點而提供的一種對根癌農(nóng)桿菌T-37有抑制作用的拮抗真菌黑曲霉菌株。
本發(fā)明的另一目的在于提供該對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株在抑制根癌農(nóng)桿菌方面的用途。
對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj),其形態(tài)特征xi菌株在查氏(Czapck)培養(yǎng)基上,26℃,培養(yǎng)10天,菌落直徑為4.0cm,菌落表面近碳黑色,孢子頭密集著生,除菌落邊緣沒有分生孢子外,整個菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu),菌落背面無色,不分泌色素,氣生菌絲發(fā)達,從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出,頂端膨大成球形,表面著生兩層分生孢子小梗,次生小梗上著生成串的分生孢子。分生孢子頭為黑色,球形,放射狀,直徑72-220μm;分生孢子梗壁厚而光滑,長600-2100μm,寬12-13μm;頂囊近球形,直徑40.8-42μm;次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm;分生孢子為球形至近球形,表面有突起,直徑2.4-3μm。
該菌種已于2006年3月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國武漢武漢大學),保藏號CCTCC NOM 206021,名稱為黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xi)的分離步驟(1)拮抗菌的分離與純化準確稱取10.0g果樹根系土樣,借助無菌操作技術(shù),將土樣加入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中,振蕩10min,使土樣均勻地分散為稀釋液,再吸取1m土壤稀釋液到9ml無菌水中,充分混勻,成為土壤懸液。采用混菌法接種,吸取1ml懸液于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中,然后傾注已熔化并冷卻到45℃的雙抗馬丁氏培養(yǎng)基,充分混勻,待凝固后倒置,25℃保溫培養(yǎng)5天,挑取真培養(yǎng)基中長出的肉眼可見的大小不同的真菌菌落,移入馬丁氏平板上,恒溫培養(yǎng),直至純化得到單菌落,轉(zhuǎn)移至斜面試管保存;(2)拮抗菌瓊脂柱的制備在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基(厚1cm),用打孔器對已冷卻的PDA培養(yǎng)基進行打孔,將瓊脂柱放置于無菌空培養(yǎng)皿中,用接種環(huán)分別取少量的拮抗菌孢子接在瓊脂柱上,26℃靜置培養(yǎng)3天;(3)拮抗菌的篩選T-37平板制備取長滿根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面試管一只,加入滅過菌的蒸餾水10ml,用槍輕輕吹打并充分混勻,制成細菌菌懸液,取0.1ml接種于平板培養(yǎng)基表面,用L棒均勻涂布;拮抗菌篩選將已制備好的拮抗菌瓊脂柱分別置于T-37平板上,于4℃冰箱倒扣放置12h后,30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h,室溫下觀察結(jié)果,在瓊脂柱周圍有一株真菌產(chǎn)生較明顯的抑菌圈,這一株真菌即為本發(fā)明的黑曲霉菌株xj(Aspergillus niger xj)。
通過對抑菌試驗來說明本發(fā)明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的抑制根癌農(nóng)桿菌的用途(1)發(fā)酵液與菌體提取液的制備將上述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)按10%的接種量接入PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(200ml培養(yǎng)瓶裝入40ml培養(yǎng)基),26℃,140rpm,搖瓶培養(yǎng)9天,將發(fā)酵液與菌絲體一同轉(zhuǎn)入離心管中,2000轉(zhuǎn)/分,離心10min,進行菌液分離,再用蒸餾水重懸菌絲體(加水量為菌絲體5倍),2000轉(zhuǎn)/分再離心10min,反復4次,分別收集上清液和菌絲體。
雙層濾紙過濾上清液,將上清液置于減壓真空干燥箱中50℃濃縮10倍,濃縮后的上清液于紫外燈下照射30分鐘,置于4℃冰箱備用。
菌絲體于減壓真空干燥箱中55℃烘至恒重,再將菌絲研磨成粉,過80目篩,加入20倍無菌水,50℃水浴30min,浸提4次,收集提取液,過濾,濃縮,紫外照射,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
(2)用無菌的圓濾紙片(直徑0.6cm),分別吸取發(fā)酵上清液與菌體提取液,在酒精燈前略微干燥,輕輕放在T-37平板上,倒置于4℃冰箱12h后,30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h,室溫下可分別產(chǎn)生直徑為2.4cm與3.8cm的抑菌圈。
本發(fā)明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)來源可靠,對溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應范圍廣,對不良環(huán)境的耐受力強,能維持生態(tài)平衡,能適應病害生態(tài)系,而且耐突變,容易培養(yǎng)和保存,抑制根癌農(nóng)桿菌效果好,在農(nóng)業(yè)方面有很大的應用前景。該技術(shù)路線合理,可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的中試數(shù)據(jù)和設計依據(jù),實現(xiàn)液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj),為開發(fā)相關(guān)生物制劑奠定基礎。
具體實施例方式
對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的分離步驟(1)供試菌株根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)購于中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所,保存于貴州大學真菌資源研究所;(2)拮抗菌的分離與純化準確稱取10.0g果樹根系土樣,借助無菌操作技術(shù),將土樣加入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中,振蕩10min,使土樣均勻地分散為稀釋液,再吸取1m土壤稀釋液到9ml無菌水中,充分混勻,成為土壤懸液。采用混菌法接種,吸取1ml懸液于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中,然后傾注已熔化并冷卻到45℃的雙抗馬丁氏培養(yǎng)基,充分混勻,待凝固后倒置,25℃保溫培養(yǎng)5天,挑取真培養(yǎng)基中長出的肉眼可見的大小不同的真菌菌落,移入馬丁氏平板上,恒溫培養(yǎng),直至純化得到單菌落,轉(zhuǎn)移至斜面試管保存;(3)拮抗菌瓊脂柱的制備在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基(厚1cm),用打孔器對已冷卻的PDA培養(yǎng)基進行打孔,將瓊脂柱放置于無菌空培養(yǎng)皿中,用接種環(huán)分別取少量的拮抗菌孢子接在瓊脂柱上,26℃靜置培養(yǎng)3天;(4)拮抗菌的篩選T-37平板制備取長滿根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面試管一只,加入滅過菌的蒸餾水10ml,用槍輕輕吹打并充分混勻,制成細菌菌懸液,取0.1ml接種于平板培養(yǎng)基表面,用L棒均勻涂布;拮抗菌篩選將已制備好的拮抗菌瓊脂柱分別置于T-37平板上,于4℃冰箱倒扣放置12h后,30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h,室溫下觀察結(jié)果,在瓊脂柱周圍有一株真菌產(chǎn)生較明顯的抑菌圈,命名為xj。
拮抗菌的鑒定xi菌株在查氏(Czapck)培養(yǎng)基上,26℃,培養(yǎng)10天,菌落直徑為4.0cm,菌落表面近碳黑色,孢子頭密集著生,除菌落邊緣沒有分生孢子外,整個菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu),菌落背面無色,不分泌色素,氣生菌絲發(fā)達,從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出,頂端膨大成球形,表面著生兩層分生孢子小梗,次生小梗上著生成串的分生孢子。分生孢子頭為黑色,球形,放射狀,直徑72-220μm;分生孢子梗壁厚而光滑,長600-2100μm,寬12-13μm;頂囊近球形,直徑40.8-42μm;次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm;分生孢子為球形至近球形,表面有突起,直徑2.4-3μm。
根據(jù)Raper(1965)關(guān)于曲霉屬的分類標準,xi菌株的主要形態(tài)特征與他所描述的黑曲霉(Aspergillus niger V.Tieghen 1867)的標準形態(tài)基本相同,因而認為xj菌株屬于曲霉屬黑曲霉群的一株黑曲霉,記為黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)。
通過對抑菌試驗來說明本發(fā)明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xi)的抑制根癌農(nóng)桿菌的用途(1)發(fā)酵液與菌體提取液的制備將上述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xi)按10%的接種量接入PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(200ml培養(yǎng)瓶裝入40ml培養(yǎng)基),26℃,140rpm,搖瓶培養(yǎng)9天,將發(fā)酵液與菌絲體一同轉(zhuǎn)入離心管中,2000轉(zhuǎn)/分,離心10min,進行菌液分離,再用蒸餾水重懸菌絲體(加水量為菌絲體5倍),2000轉(zhuǎn)/分再離心10min,反復4次,分別收集上清液和菌絲體。
雙層濾紙過濾上清液,將上清液置于減壓真空干燥箱中50℃濃縮10倍,濃縮后的上清液于紫外燈下照射30分鐘,置于4℃冰箱備用。
菌絲體于減壓真空干燥箱中55℃烘至恒重,再將菌絲研磨成粉,過80目篩,加入20倍無菌水,50℃水浴30min,浸提4次,收集提取液,過濾,濃縮,紫外照射,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
(2)用無菌的圓濾紙片(直徑0.6cm),分別吸取發(fā)酵上清液與菌體提取液,在酒精燈前略微干燥,輕輕放在T-37平板上,倒置于4℃冰箱12h后,30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h,室溫下可分別產(chǎn)生直徑為2.4cm與3.8cm的抑菌圈。
權(quán)利要求
1.一種對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj),保藏號CCTCC NOM 206021,其形態(tài)特征xj菌株在查氏培養(yǎng)基上,26℃,培養(yǎng)10天,菌落直徑為4.0cm,菌落表面近碳黑色,孢子頭密集著生,除菌落邊緣沒有分生孢子外,整個菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu),菌落背面無色,不分泌色素,氣生菌絲發(fā)達,從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出,頂端膨大成球形,表面著生兩層分生孢子小梗,次生小梗上著生成串的分生孢子;分生孢子頭為黑色,球形,放射狀,直徑72-220μm;分生孢子梗壁厚而光滑,長600-2100μm,寬12-13μm;頂囊近球形,直徑40.8-42μm;次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm;分生孢子為球形至近球形,表面有突起,直徑2.4-3μm。
2.如權(quán)利要求1所述的對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj),保藏號為CCTCC NOM 206021在抑制根癌農(nóng)桿菌方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj),其形態(tài)特征xj菌株在查氏培養(yǎng)基上,26℃,培養(yǎng)10天,菌落直徑為4.0cm,菌落表面近碳黑色,孢子頭密集著生,除菌落邊緣沒有分生孢子外,整個菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu),菌落背面無色,不分泌色素,氣生菌絲發(fā)達,從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出,頂端膨大成球形,表面著生兩層分生孢子小梗,次生小梗上著生成串的分生孢子;分生孢子頭為黑色,球形,放射狀,直徑72-220μm;分生孢子梗壁厚而光滑,長600-2100μm,寬12-13μm;頂囊近球形,直徑40.8-42μm;次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm;分生孢子為球形至近球形,表面有突起,直徑2.4-3μm。本發(fā)明對自然環(huán)境條件的適應范圍廣,對不良環(huán)境的耐受力強,容易培養(yǎng)和保存及工業(yè)化生產(chǎn),抑制根癌農(nóng)桿菌效果好。
文檔編號A01N63/04GK1847388SQ20061005102
公開日2006年10月18日 申請日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者李祝, 梁宗琦, 肖洋, 周禮紅, 李穎 申請人:貴州大學