專利名稱：一種薰衣草快速再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體為以薰衣草下胚軸為外植體材料建立的快速再生方法。
背景技術(shù)：
薰衣草(Lavender)是唇形科薰衣草屬多年生半陰性亞灌木，有強(qiáng)烈芳香氣味，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，其生長迅速，根系發(fā)達(dá)，喜光耐早，適合在廣袤的干旱地區(qū)種植。薰衣草精油具有安寧鎮(zhèn)靜、潔凈心身、清熱解毒、散淤消腫、超風(fēng)發(fā)汗等功效，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。新疆是我國薰衣草主要的種植基地，其種植面積和薰衣草精油產(chǎn)量均占全國的95％以上，但目前實(shí)際生產(chǎn)中大多采用播種或扦插的方法進(jìn)行繁殖，存在著繁殖速度慢、成活率低、形態(tài)學(xué)和化學(xué)特征易發(fā)生變異等缺點(diǎn)(Plant Cell，Tissue and OrganCulture，1999，56)。此外，在新疆，薰衣草需覆土才能度過最低達(dá)-30℃～-40℃的寒冬，從而使得薰衣草的種植成本較高。因此，為了促進(jìn)薰衣草種植和加工業(yè)的發(fā)展，追求低成本、高品質(zhì)和高效益，開發(fā)新的高頻再生技術(shù)已成為當(dāng)前我國薰衣草種植業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。
利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，通過植物組織培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)薰衣草快速、高效的無性繁殖，不但可以解決播種或扦插繁殖所帶來的問題，而且可以固定雜交優(yōu)勢，保持品種特異性。利用薰衣草外植體在合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，可擺脫植物自然生長對季節(jié)、氣候等因素的依賴，而且可以用少量的個(gè)體原料在較少的空間和時(shí)間內(nèi)獲得大量在遺傳特性上與親本植株完全相同的無菌再生苗。這種新的組培快繁技術(shù)為薰衣草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展開拓了一條有效途徑，其經(jīng)濟(jì)效益和社會效益巨大，但關(guān)鍵在于能否建立合適的高頻再生體系。目前，薰衣草組織培養(yǎng)已有少量報(bào)道，C.Sudria等通過莖尖獲得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Plant Cell，Tissue and OrganCulture，1999，58)；Jordan AM等通過莖段培養(yǎng)獲得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Biotech，1998，73(1))；中國專利CN200410085334X一種薰衣草組織培養(yǎng)方法是將薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)獲得再生植株。本發(fā)明是以薰衣草下胚軸為外植體直接分化出芽獲得再生植株的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以薰衣草下胚軸為外植體材料建立的快速再生體系，為薰衣草大規(guī)模組培快繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。根據(jù)植物細(xì)胞無性繁殖理論，本發(fā)明以薰衣草下胚軸為外植體，在科學(xué)配方的固體再生培養(yǎng)基上直接分化出芽，然后在生根培養(yǎng)基上生根形成完整植株的組培快繁方法。本發(fā)明薰衣草下胚軸的直接出芽率為46.7％，生根率為95％，組培周期為60天左右。與其它組培方法相比，本發(fā)明再生方法越過了外植體愈傷組織誘導(dǎo)階段，因此具有生長速度快、發(fā)芽率高等優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明擴(kuò)繁薰衣草不僅可以大大縮短生產(chǎn)周期，而且可以減小勞動強(qiáng)度從而節(jié)省大量的人力資源，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明所述的一種薰衣草快速再生體系，按下列步驟進(jìn)行a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h，將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗15-30s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉溶液浸泡20-40min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1000-1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％；
b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成3-6mm的小段，橫向放置，接入瓊脂固化MS+IAA 0-1.0mg·L-1+6-BA 1.0-2.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽；c、將不定芽接入瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；d、將組培苗接種于無激素的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株。
所選的薰衣草外植體為具有10-20天苗齡的下胚軸，并將其剪成3-6mm長的小段，橫向放置進(jìn)行接種。
固體再生培養(yǎng)基條件是1000-1500lx日光燈照射，光照12-16h/d，25±1℃下培養(yǎng)，濕度保持55±5％。
固體培養(yǎng)基接種量是100ml三角瓶5-8個(gè)外植體，每瓶40-60ml瓊脂固化培養(yǎng)基。
再生的組培苗長到3-6cm，轉(zhuǎn)接到瓊脂固化的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。
固體培養(yǎng)基需添加3％的蔗糖，0.35％-0.6％的瓊脂，調(diào)節(jié)pH5.90±0.05，121℃滅菌25min。
本發(fā)明提供了一種薰衣草直接分化出芽高效再生體系。本發(fā)明薰衣草下胚軸的直接出芽率為46.7％，生根率為95％，組培周期為60天。與其它組培方法相比，本發(fā)明再生方法越過了外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化階段，培養(yǎng)周期減少了3-4個(gè)月，因此具有生長速度快、發(fā)芽率高等優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明擴(kuò)繁薰衣草不僅可以大大縮短生產(chǎn)周期，而且可以減小勞動強(qiáng)度從而節(jié)省大量的人力資源，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明在固體再生培養(yǎng)基上接種的下胚軸外植體照片；圖2為本發(fā)明所選下胚軸外植體在固體再生培養(yǎng)基上直接分化的不定芽照片；圖3為本發(fā)明在固體生根培養(yǎng)基上獲得的完整小植株照片；圖4為本發(fā)明獲得的移栽成功的薰衣草植株照片。
本發(fā)明要建立薰衣草下胚軸直接分化出芽再生系統(tǒng)，必須先獲得下胚軸；挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h。將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗15-30s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉(優(yōu)氯凈)溶液浸泡20-40min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％，選擇10-20天苗齡的由薰衣草種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸為外植體材料(圖1)；將選擇的下胚軸材料剪成3-6mm的小段，橫向放置，接入瓊脂固化MS+IAA 0-1.0mg·L-1+6-BA 1.0-2.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽(圖2)；將不定芽接入瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗(圖3)；將組培苗接種于瓊脂固化的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株，生根苗取蓋煉苗2-3天，即可移栽到室內(nèi)花盆中，注意保濕，成活率可達(dá)100％，半個(gè)月可長出新葉，表明移栽成活(圖4)；固體培養(yǎng)的條件是光照時(shí)間12-16h·d-1，溫度25±1℃，光照強(qiáng)度為1000-1500lx，濕度保持55±5％。
固體培養(yǎng)基需添加3％的蔗糖，0.35％-0.6％的瓊脂，調(diào)節(jié)pH(5.90±0.05)，121℃滅菌25min。
具體實(shí)施例方式
下面用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，但不能解釋為本發(fā)明被下述實(shí)施例所限制。
實(shí)施例1薰衣草下胚軸外植體的獲得a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h，將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗25s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉(優(yōu)氯凈)溶液浸泡20min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于0.4％瓊脂固化的MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx。15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％。
薰衣草下胚軸外植體直接分化不定芽b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成5mm左右的小段，橫向放置，接入0.5％瓊脂固化MS+6-BA 1.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率為33.3％。
薰衣草分化不定芽生根與移栽c、將不定芽接入0.5％瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；d、將組培苗接種于0.5％瓊脂固化的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株，生根率為95％。生根苗取蓋煉苗2-3天，即可移栽到室內(nèi)花盆中，注意保濕，成活率可達(dá)100％，半個(gè)月可長出新葉，表明移栽成活。
實(shí)施例2薰衣草下胚軸外植體的獲得a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h，將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗25s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉(優(yōu)氯凈)溶液浸泡20min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于0.4％瓊脂固化的MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％。
薰衣草下胚軸外植體直接分化不定芽b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成5mm左右的小段，橫向放置，接入0.5％瓊脂固化MS+IAA 0.1mg·L-1+6-BA 1.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率為36.7％。
薰衣草分化不定芽生根與移栽c、將不定芽接入0.5％瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；d、將組培苗接種于0.5％瓊脂固化的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株，生根率為95％。生根苗取蓋煉苗2～3天，即可移栽到室內(nèi)花盆中，注意保濕，成活率可達(dá)100％，半個(gè)月可長出新葉，表明移栽成活。
實(shí)施例3薰衣草下胚軸外植體的獲得a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h。將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗25s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉(優(yōu)氯凈)溶液浸泡20min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于0.4％瓊脂固化的MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％。
薰衣草下胚軸外植體直接分化不定芽b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成5mm左右的小段，橫向放置，接入0.5％瓊脂固化MS+IAA 0.1mg·L-1+6-BA 2.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率為16.7％。
薰衣草分化不定芽生根與移栽
c、將不定芽接入0.5％瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；d、將組培苗接種于0.5％瓊脂固化的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株，生根率為95％。生根苗取蓋煉苗2-3天，即可移栽到室內(nèi)花盆中，注意保濕，成活率可達(dá)100％，半個(gè)月可長出新葉，表明移栽成活。
實(shí)施例4薰衣草下胚軸外植體的獲得a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h，將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗25s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉(優(yōu)氯凈)溶液浸泡20min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于0.4％瓊脂固化的MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％。
薰衣草下胚軸外植體直接分化不定芽b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成5mm左右的小段，橫向放置，接入0.5％瓊脂固化MS+IAA 0.5mg·L-1+6-BA 2.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率為46.7％。
薰衣草分化不定芽生根與移栽c、將不定芽接入0.5％瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；d、將組培苗接種于0.5％瓊脂固化的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株，生根率為95％。生根苗取蓋煉苗2-3天，即可移栽到室內(nèi)花盆中，注意保濕，成活率可達(dá)100％，半個(gè)月可長出新葉，表明移栽成活。
實(shí)施例5
薰衣草下胚軸外植體的獲得a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h，將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗25s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉(優(yōu)氯凈)溶液浸泡20min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于0.4％瓊脂固化的MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％。
薰衣草下胚軸外植體直接分化不定芽b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成5mm左右的小段，橫向放置，接入0.5％瓊脂固化MS+IAA 1.0mg·L-1+6-BA 2.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率為30％。
薰衣草分化不定芽生根與移栽c、將不定芽接入0.5％瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗。
d、將組培苗接種于0.5％瓊脂固化的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株，生根率為95％。生根苗取蓋煉苗2-3天，即可移栽到室內(nèi)花盆中，注意保濕，成活率可達(dá)100％，半個(gè)月可長出新葉，表明移栽成活。
本發(fā)明提供了一種薰衣草直接分化出芽高效再生體系，本發(fā)明薰衣草下胚軸的直接出芽率為46.7％，生根率為95％，組培周期為60天。與其它組培方法相比，本發(fā)明再生方法越過了外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化階段，培養(yǎng)周期減少了3-4個(gè)月，因此具有生長速度快、發(fā)芽率高等優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明擴(kuò)繁薰衣草不僅可以大大縮短生產(chǎn)周期，而且可以減小勞動強(qiáng)度從而節(jié)省大量的人力資源，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種薰衣草快速再生方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行a、挑取飽滿的薰衣草種子，40℃溫水浸泡，水涼后繼續(xù)浸泡24h，將經(jīng)過浸泡的薰衣草種子流水沖洗30min，75％的乙醇漂洗15-30s，無菌水沖洗1次后，用0.2％的二氯異氰尿酸鈉溶液浸泡20-40min，然后用無菌水沖洗4-5次，將種子接種于MS固體培養(yǎng)基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1000-1500lx，15-20天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為53％；b、取經(jīng)過種子萌發(fā)的無菌苗的下胚軸剪成3-6mm的小段，橫向放置，接入瓊脂固化MS+IAA 0-1.0mg·L-1+6-BA 1.0-2.0mg·L-1的直接分化出芽培養(yǎng)基，15-20天后得到薰衣草不定芽；c、將不定芽接入瓊脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；d、將組培苗接種于無激素的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10-15天形成生根的小植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草快速再生方法，其特征是所選的薰衣草外植體為具有10-20天苗齡的下胚軸，并將其剪成3-6mm長的小段，橫向放置進(jìn)行接種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草快速再生方法，其特征是固體再生培養(yǎng)基條件是1000-1500lx日光燈照射，光照12-16h/d，25±1℃下培養(yǎng)，濕度保持55±5％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草快速再生方法，其特征是固體培養(yǎng)基接種量是100ml三角瓶5-8個(gè)外植體，每瓶40-60ml瓊脂固化培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草快速再生方法，其特征是再生的組培苗長到3-6cm，轉(zhuǎn)接到瓊脂固化的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的一種薰衣草快速再生方法，其特征是固體培養(yǎng)基需添加0.35-0.6％的瓊脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種薰衣草快速再生方法，本發(fā)明選擇經(jīng)薰衣草種子萌發(fā)后的下胚軸為外植體在固體再生培養(yǎng)基上可以直接分化不定芽，然后在固體生根培養(yǎng)基上生根，并最終形成完整植株。本發(fā)明薰衣草下胚軸的直接出芽率為46.7％，生根率為95％，組培周期為60天。與愈傷組織再生系統(tǒng)相比，本發(fā)明可以越過外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化的階段，培養(yǎng)周期減少了3－4個(gè)月，因此具有生長速度快、發(fā)芽率高等優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明擴(kuò)繁薰衣草不僅可以大大縮短生產(chǎn)周期，而且可以減小勞動強(qiáng)度從而節(jié)省大量的人力資源，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，為薰衣草規(guī)?；M培快繁提供了技術(shù)保障。
文檔編號A01C1/00GK1817112SQ200610059350
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者邢文超, 貟強(qiáng), 趙民安, 曹旭 申請人:中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所