專利名稱：一種控制哺乳動物性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制哺乳動物性別的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的性別控制有兩種方式，即受精之前控制和受精之后控制。前者是指受精之前，對精子進(jìn)行人為干預(yù)，在受精之時(shí)就決定了后代的性別；后者是指對受精卵進(jìn)行性別鑒定，使其獲得所需性別的后代。這兩種性別控制方式存在缺點(diǎn)是1、資源浪費(fèi)。X和Y精子分離有一半的精子被淘汰掉，由此造成資源浪費(fèi)。胚胎性別鑒定需要將受精后發(fā)育到囊胚或桑椹胚的可移植胚胎取下少量細(xì)胞，進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增，獲取雌雄信息，從而達(dá)到控制后代性別的一項(xiàng)技術(shù)，如果按著自然的雌雄分配比例計(jì)算，有50％的胚胎被淘汰掉，又一次的造成資源和經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)。
2、數(shù)量受限。①體內(nèi)受精一年只能獲得一頭良種后代；②體外受精雖然可以獲得多數(shù)已知性別的胚胎，但是由于受母性遺傳基因的影響，很難得到良種后代，因?yàn)轶w外受精過程需要到屠宰場取母牛的卵巢，在屠宰場里取來的卵巢基本上是淘汰母?；蛄淤|(zhì)母牛，所以做出的體外受精后代的遺傳基因受到很大影響；③通過超排獲得的性別鑒定胚胎數(shù)量有限。
3、價(jià)格貴不易被老百姓接受。經(jīng)過XY精子分離獲得的性控精液或性控胚胎一般比自然生產(chǎn)的高出二倍的價(jià)格，在生產(chǎn)中不易被老百姓接受。
哺乳動物體細(xì)胞克隆技術(shù)(mammalian somatic cell cloning)又稱體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer)，是指通過特殊的人工手段，即以顯微操作、電融合、復(fù)合活性化處理等技術(shù)為主線，將體細(xì)胞作為核供體，移入到成熟的、去核的、未受精的卵母細(xì)胞中，進(jìn)行體外重構(gòu)、體外培養(yǎng)、胚胎移植，從而達(dá)到擴(kuò)繁同種基因型哺乳動物種群的目的。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)，最初是由Friedenstein發(fā)現(xiàn)的一類易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面的細(xì)胞，后來的研究證實(shí)在不同的誘導(dǎo)條件下，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞分化的能力，如向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及支持造血的基質(zhì)細(xì)胞等分化的能力。常用的MSCs分離與培養(yǎng)方法有1、密度梯度離心法根據(jù)MSCs與其它細(xì)胞的密度不同而采用Percoll分層液將其分離出來；2、貼壁篩選法根據(jù)MSC具有在塑料組織培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性對其進(jìn)行分離，一般以4-12小時(shí)貼壁細(xì)胞為宜；3、流式細(xì)胞儀分選法根據(jù)MSCs細(xì)胞體積小，相對缺少顆粒的特性利用流式細(xì)胞儀對MSCs進(jìn)行分選；4、免疫磁珠分選法可以根據(jù)MSCs表達(dá)的某些細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行富集或根據(jù)其表面負(fù)表達(dá)的抗原進(jìn)行負(fù)分選，其效率和純度較高。
卵母細(xì)胞的去核是體細(xì)胞核移植技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。McGrath(McGrath，SolterD.Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion.[J]Science.1983.2201300-1302)，報(bào)道了一步去核法，即在注入核供體細(xì)胞的同時(shí)將細(xì)胞核吸引除去，此操作只需要一個(gè)顯微操作管。Shiga(Shiga K，F(xiàn)ujite T，Hirose K.Production of calves by transfer of nuclei from cultured somaticcells obtained from Japanese black bulls.[J].j Theriogenology.1999，52527-535)，建立的一步擠壓除核法，是用顯微切割針在第一極體附近，將卵母細(xì)胞透明帶切開1/3(周長的1/3)，調(diào)準(zhǔn)切口，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細(xì)胞，調(diào)節(jié)顯微切割針，將切割針橫壓在卵母細(xì)胞的直徑部位，垂直向下微微輕壓，除去第一極體連同下面的一小部分細(xì)胞質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種控制哺乳動物性別的方法。
本發(fā)明所提供的控制哺乳動物性別的方法，是將哺乳動物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，移入到成熟的、未受精的、去核的哺乳動物卵母細(xì)胞中，進(jìn)行體外重構(gòu)、體外培養(yǎng)、胚胎移植，控制子代的性別。
所述哺乳動物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀分選法或免疫磁珠分選法進(jìn)行分離，最好通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離。
所述哺乳動物卵母細(xì)胞可來自于牛、羊、貓、狗和兔等動物。
所述哺乳動物卵母細(xì)胞優(yōu)選來自于牛，其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過以下密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法方法獲得將牛骨髓單細(xì)胞懸液加入密度為1.082的Percoll細(xì)胞分離液中進(jìn)行離心，取液面交界處的云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，接種于塑料容器中進(jìn)行培養(yǎng)，去掉非貼壁細(xì)胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
所述牛骨髓單細(xì)胞懸液與密度為1.082的Percoll細(xì)胞分離液的體積比為1∶1。所述牛骨髓單細(xì)胞懸液為不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液。所述離心條件為80g離心30min。所述接種密度為1×105個(gè)-1×107個(gè)細(xì)胞/cm2，優(yōu)選為1×107個(gè)細(xì)胞/cm2。
所述成熟的、去核的、未受精的哺乳動物卵母細(xì)胞可通過一步去核法McGrath(McGrath，Solter D.Nuclear transplantation in the mouse embryo bymicrosurgery and cell fusion.[J]Science.1983.2201300-1302)、擠壓除核法Shiga(Shiga K，F(xiàn)ujite T，Hirose K.Production of calves by transferof nuclei from cultured somatic cells obtained from Japanese blackbulls.[J].j Theriogenology.1999，52527-535)獲得，還可通過如下點(diǎn)擊去核法獲得將剛放出第一極體的哺乳動物卵母細(xì)胞的裸卵的透明帶，在第一極體處切開1/3，再點(diǎn)擊透明帶，除去第一極體連同下面的核物質(zhì)；所述1/3是透明帶周長的1/3。
所述點(diǎn)擊透明帶的位置在調(diào)準(zhǔn)卵母細(xì)胞第一極體位置后用固定管固定卵母細(xì)胞，點(diǎn)擊透明帶3點(diǎn)鐘的位置，參照圖5點(diǎn)擊去核法去核照片。
所述剛放出第一極體的牛卵母細(xì)胞可按照以下方法獲得將牛的卵母細(xì)胞在CR2aa+10％SCS+0.01mg/ml FSH+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中成熟培養(yǎng)18-22小時(shí)，得到剛放出第一極體的卵母細(xì)胞。
本發(fā)明的控制哺乳動物性別的方法中所采用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞、原始生殖脊干細(xì)胞和體內(nèi)其他部位的成體干細(xì)胞如胰腺干細(xì)胞等相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對培養(yǎng)條件要求不高，不需要添加多種細(xì)胞因子，擴(kuò)增迅速容易分離純化；采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法篩選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，相對于流式細(xì)胞儀分選法對細(xì)胞的損傷較小，相對于免疫磁珠分選法更經(jīng)濟(jì)實(shí)用相對于全骨髓法純度更高；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞克隆獲得的168h囊胚，在體外繼續(xù)培養(yǎng)體系中，50％的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可以完全脫離透明帶，極顯著高于體細(xì)胞克隆囊胚在繼續(xù)培養(yǎng)中只有2-6％的囊胚可完全脫離透明帶。本發(fā)明利用牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核移植技術(shù)，控制良種牛性別，可降低性別控制成本，提高良種牛的生產(chǎn)性牛，可操作性強(qiáng)，為良種產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支撐。


圖1a為分離篩選的高純度MSCs集落(×200)圖1b為形成集落的MSCs原代培養(yǎng)細(xì)胞的瑞士-姬姆薩復(fù)合染色照片(×200)圖2a為第2代牛MSCs(×100)照片圖2b為第10代的牛MSCs細(xì)胞集落融合后形成水紋狀(200×)
圖2c為第10代接近融合的牛MSCs，細(xì)胞處于生長旺盛期，胞漿飽滿，多個(gè)核仁(×400)照片圖2d為照片第15代的牛MSCs形成的集落染色照片(×200)圖3為作為核供體細(xì)胞的牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第12代的多細(xì)胞集落(100×)照片圖4為第12代牛MSCs細(xì)胞的吉姆薩染色鑒定的MSCs為單核細(xì)胞(100×)照片圖5為點(diǎn)擊去核法去核照片圖6為體外培養(yǎng)168h骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核移植囊胚(200×)照片圖7為體外培養(yǎng)198h的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脫出透明帶的克隆囊胚(200×)照片具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、利用牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞控制牛的性別一、牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其原代(第一代)培養(yǎng)無菌條件下分離出牛(2～6月齡)股骨骨髓，使用帶有4號針頭的5ml注射器沖出骨髓，置于消毒的大培養(yǎng)皿中，將骨髓液依次經(jīng)7號和4號針頭輕輕吹打，過200目濾網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液用不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS-)沖洗3次，重新懸浮后將細(xì)胞懸液以1∶1的體積比輕輕加入4℃預(yù)冷的密度為1.082的Percoll細(xì)胞分離液(購自美國Sigma公司，配方Percoll原液25.65mL+1.5moL/L NaCl溶液24.35mL)的試管中，80g離心30min取中間(液面交界處)的云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，以PBS清洗2次準(zhǔn)備接種。
將細(xì)胞懸液以1×107個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于裝有完全培養(yǎng)基的直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿。每個(gè)培養(yǎng)皿加1.5ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。在接種后48小時(shí)和72小時(shí)分別連續(xù)2次全量更換培養(yǎng)基，去掉非貼壁細(xì)胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。以后每2d～3d半量換液1次。在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)11至13天，獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。其中，采用的完全培養(yǎng)基為L-DMEM+25％(體積百分含量)馬血清+10％(體積百分含量)條件培養(yǎng)液+1％(質(zhì)量百分含量)L-谷氨酰胺+1μmol/L的氫化可的松。其中，條件培養(yǎng)液按照如下方法配制無菌分離犢牛股骨骨髓5ml，加入10mL含有20％(體積百分含量)的胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺的L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2d～3d，收集培養(yǎng)液，離心取上清液制成條件培養(yǎng)液。
上述細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，剛接種時(shí)，骨髓細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈圓形，大小不一，不能辨認(rèn)細(xì)胞核，接種后第1天至第3天，可見形態(tài)相對均一的折光性較強(qiáng)紡錘形細(xì)胞，以及少量的成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞，以后細(xì)胞逐漸增多，接種后第4天至第5天細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞生長較快；接種后第11天至第13天細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增減慢，并開始出現(xiàn)融合，而且細(xì)胞逐漸出現(xiàn)多種形態(tài)，成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞開始增加，可見少量大而扁平的細(xì)胞。牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞極易發(fā)生分化，接種密度低更不利于其生長，所以原代培養(yǎng)細(xì)胞密度適中(1×107個(gè)細(xì)胞/cm2)，接種后第3天至第4天形成典型集落，集落的細(xì)胞在50-100個(gè)左右(圖1a)，同時(shí)可見一些微克隆。對形成集落的原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行瑞士-姬姆薩復(fù)合染色，光鏡觀察，細(xì)胞形態(tài)呈梭形狀，胞核著粉紅色，胞漿不著色，未見纖維絲等結(jié)構(gòu)，各代之間形態(tài)較一致，細(xì)胞核有1-2個(gè)核仁，呈圓形(圖1b)。
2、牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)接種后第11天至第13天，原代(第一代)培養(yǎng)細(xì)胞生長融合后，用0.25％(質(zhì)量百分含量)胰蛋白酶和0.1mmol/L的EDTA消化(消化前預(yù)熱消化液，PBS沖洗細(xì)胞3次，以去除死細(xì)胞)，在倒置顯微鏡下觀察，大約1min，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞之間間隙增大，細(xì)胞接近圓形時(shí)，輕輕吹打平皿底壁，制成細(xì)胞懸液。80g離心6min棄上清液后，1∶2傳代(由一個(gè)35mm平皿牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)消化離心洗滌后，傳代接種到2個(gè)35mm塑料平皿)，置于體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行第二代細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)5-7天后，再按照上述方法進(jìn)行傳代、培養(yǎng)第三代細(xì)胞，第三代細(xì)胞培養(yǎng)3-4天后，再按照上述方法進(jìn)行傳代、培養(yǎng)第四代細(xì)胞。第四代細(xì)胞培養(yǎng)3-4天后，再按照上述方法進(jìn)行傳代、培養(yǎng)直至第十五代細(xì)胞。第十二代細(xì)胞以后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變得不均一，細(xì)胞突起增多，大量多角形細(xì)胞出現(xiàn)，并且增殖能力逐漸減弱，4-6天才可達(dá)到完全融合。其中，所用的傳代培養(yǎng)基為L-DMEM培養(yǎng)液+120mL/L FBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL鏈霉素。
傳代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，牛MSCs原代細(xì)胞一經(jīng)傳代小圓形細(xì)胞均不見，第二代細(xì)胞主要為梭形、多角形(圖2a)，呈現(xiàn)很多集落樣細(xì)胞并融合成片，但是細(xì)胞間存在接觸抑制，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞呈集落生長并融合成片，第二代牛MSCs形成的集落染色為單核，細(xì)胞呈梭形圓形和三角形，傳至第10代的牛MSCs細(xì)胞集落融合形成水紋狀(圖2b)。原代培養(yǎng)接種密度適宜，雖然只見少數(shù)50-100個(gè)細(xì)胞組合的小集落，傳代培養(yǎng)中可見大量集落形成并融合成片，第10代的細(xì)胞純度高達(dá)98％，第10代細(xì)胞培養(yǎng)17天后發(fā)生融合的牛MSCs細(xì)胞成長旺盛，胞漿飽滿，多個(gè)核仁(圖2c)，第15代的牛MSCs細(xì)胞形成的集落染色結(jié)果如圖2d。
細(xì)胞傳到第12代以后，培養(yǎng)4-6天后，形成多細(xì)胞集落(圖3)，第12代牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)吉姆薩染色鑒定為單核細(xì)胞(圖4)，純度達(dá)98％。
將培養(yǎng)4-6天后的第十二代牛MSCs細(xì)胞作為核供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，同時(shí)以胎兒成纖維細(xì)胞作為對照。
二、去除牛卵母細(xì)胞細(xì)胞核將采集的牛卵巢，從滅菌的35℃生理鹽水中取出，放在持有滅菌紙巾的左手上，選擇直徑為2-6mm的卵泡，用接有18G針頭的5ml注射器吸取卵泡液，將抽取的含有卵母細(xì)胞的卵泡液注入15ml的離心管中，置于35℃保溫水浴槽內(nèi)，待沉淀后棄掉上清液，洗滌2次，將沉淀物移入到中央劃有方格的平皿中，在實(shí)體顯微鏡下，選擇有卵丘細(xì)胞附著，細(xì)胞質(zhì)亮度均一，形態(tài)良好的卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌2次后，移入4孔培養(yǎng)皿，置于39℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行22小時(shí)的成熟培養(yǎng)。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液采用CR2aa+10％SCS(Superovulated Cow Serum)+0.01mg/ml FSH(Follicle Stimulating Hormone)+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素。將成熟培養(yǎng)22h的在含有0.1％透明質(zhì)酸酶(Sigma制)，不含Ca2+、Mg2+的HSOF液，即HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中，吹打除掉卵丘細(xì)胞，裸卵以放出第一極體的位置，作為顯微操作去核的標(biāo)志。
表1HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液的組成


注濃度列中的“-”表示不含該物質(zhì)。
表2、CR2aaEmbryo Culture medium

將經(jīng)過22h成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞裸卵洗凈，每20個(gè)為一組移入7.5μg/ml的細(xì)胞松馳素B(CB)100μl微滴中，以顯微操作儀的左手油壓側(cè)控制顯微固定細(xì)管和右手側(cè)控制顯微切割針，在第一極體附近，將卵母細(xì)胞透明帶切開1/3(周長的1/3)，調(diào)準(zhǔn)切口，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細(xì)胞，在調(diào)準(zhǔn)卵母細(xì)胞第一極體位置后用固定管固定卵母細(xì)胞，用顯微針點(diǎn)擊透明帶3點(diǎn)鐘的位置，參照圖5的點(diǎn)擊去核法去核照片(箭頭所指方向?yàn)榈谝粯O體)，或?qū)⑶懈钺槈涸谂c卵母細(xì)胞透明帶切口垂直方向(擠壓法)或用微管吸引(吸引法)，除去第一極體連同下面的一小部分細(xì)胞質(zhì)(核物質(zhì))。將除掉的這一小部分細(xì)胞質(zhì)，放入載有2.5μg/ml Hoechst 33342液滴的載玻片上，10分鐘后壓片，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)藍(lán)色熒光的為去掉的DNA核。
三、移核配制2.5％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液+10％FBS+2.5％蔗糖)，作成100μl的微滴，將除核后的受核胞質(zhì)，20個(gè)一組移入該液中，靜置5分鐘后，再將其移到同種液體的顯微操作液微滴(100μl)中，同時(shí)將洗滌好的核供體細(xì)胞，也移到此液滴中。此時(shí)，核供體細(xì)胞和受核卵母細(xì)胞質(zhì)均處于脫水狀態(tài)，體積變小。將核供體細(xì)胞用微細(xì)吸管經(jīng)切口處注入受核卵母細(xì)胞卵周隙，抽出顯微移核細(xì)管，輕壓透明帶，使其切口閉合。
四、電融合及復(fù)合活性化處理將移核重構(gòu)胚，移入0.25％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液+10％FBS+0.25％蔗糖中，靜置5分鐘使其復(fù)水，然后用0.25％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液洗滌2次，使其核質(zhì)完全復(fù)原之后，用ECM2001(BTX)融合儀、1mm間隔的融合室、含有0.05％BSA的融合液(0.3M Manitol+0.5mM HEPES+0.05mMCa(C2H3O2)2+0.1mM Mg(C2H3O2)2+0.05％BSA)采用1.025kv/cm的電場強(qiáng)度進(jìn)行直流電脈沖處理，脈沖寬度為50μs，連續(xù)2次的融合條件進(jìn)行電融合，將電融合處理后的移核重構(gòu)胚洗滌2次，移入0.25％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中，放入38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2、100％濕度的常壓CO2培養(yǎng)箱中，2小時(shí)后，觀察融合狀態(tài)，選擇融合的重構(gòu)胚，以5μl/10ml Ca-離子載體HSOF(+Ca2+、+Mg2+)液(其組成為1mg Calcium ionophore+0.191ml DMSO為儲存液，5μl儲存液+10ml HSOF(+Ca2+、+Mg2+)，在避光下處理4分鐘，然后移入6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)SOF(+Ca2+、+Mg2+)液(其組成為2mM 6-DMAP+SOF(+Ca2+、+Mg2+)+10％FBS)中，放入38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2、100％濕度的常壓CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時(shí)，進(jìn)行復(fù)合活性化處理。其中，HSOF(+Ca2+、+Mg2+)的組成為在表1的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中加入1.17mM CaCl2和0.49mM MgCl2；SOF(+Ca2+、+Mg2+)的組成如表3。
表3、SOF(+Ca2+、+Mg2+)的組成


注濃度列中的“-”表示不含該物質(zhì)。
五、移核重構(gòu)胚的體外發(fā)育培養(yǎng)及細(xì)胞計(jì)數(shù)將復(fù)合活性化處理后的移核重構(gòu)胚，移入預(yù)先放入培養(yǎng)箱預(yù)熱平衡2h、每孔加有500μl CR2aa發(fā)育培養(yǎng)液(表2)的4孔培養(yǎng)皿中，覆蓋礦物油，放入38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2、100％濕度的常壓CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行7d的發(fā)育培養(yǎng)，觀察體外培養(yǎng)環(huán)境條件下的重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育情況。結(jié)果如表4所示，本試驗(yàn)采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞，進(jìn)行核移植試驗(yàn)，結(jié)果表明32h時(shí)2-cell期的卵裂率前者為70％(326/464)極顯著低于后者的84.5％(300/355)(P＜0.01)；44h時(shí)4-cell期率兩者間差異不顯著；98-144小時(shí)桑椹胚發(fā)育率和144-168小時(shí)囊胚發(fā)育率前者分別為40.5％(188/464)和17.2％(80/464)極顯著高于后者的31.6％(112/355)和9.3％(33/355)(P＜0.01)；體外培養(yǎng)168h骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核移植囊胚，前者有一半的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)從切口脫出透明帶，形態(tài)學(xué)上克隆囊胚為長形(圖6)，體外培養(yǎng)168小時(shí)的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)完全脫離透明帶能力前者(50％)極顯著高于后者(6.1％)；體外培養(yǎng)198h的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞克隆囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)完全脫離透明帶，脫離透明帶之后，形態(tài)學(xué)上發(fā)生很大變化，由長形變成圓形(圖7)。
表4不同核供體細(xì)胞的核移植重構(gòu)胚的體外發(fā)育及囊胚脫離透明帶的形成

注a-bP＜0.0權(quán)利要求
1.一種控制哺乳動物性別的方法，是將哺乳動物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，移入到成熟的、去核的、未受精的哺乳動物卵母細(xì)胞中，進(jìn)行體外重構(gòu)、體外培養(yǎng)、胚胎移植，控制子代的性別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳動物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠分選法或密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述哺乳動物卵母細(xì)胞來自于牛、羊、兔、貓或狗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述哺乳動物卵母細(xì)胞來自于牛。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過以下密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法方法獲得將牛骨髓單細(xì)胞懸液加入密度為1.082的Percoll細(xì)胞分離液中進(jìn)行離心，取液面交界處的云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，接種于塑料容器中進(jìn)行培養(yǎng)，去掉非貼壁細(xì)胞，得到牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述牛骨髓單細(xì)胞懸液與密度為1.082的Percoll細(xì)胞分離液的體積比為1∶1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述離心條件為80g離心30min。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述接種密度為1×105個(gè)細(xì)胞-1×107個(gè)細(xì)胞/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述接種密度為1×107個(gè)細(xì)胞/cm2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述成熟的、去核的、未受精的哺乳動物卵母細(xì)胞通過一步去核法、擠壓除核法或點(diǎn)擊去核法獲得；所述點(diǎn)擊去核法是將剛放出第一極體的哺乳動物卵母細(xì)胞的裸卵的透明帶，在第一極體處切開透明帶周長的1/3，再點(diǎn)擊透明帶，除去第一極體連同下面的核物質(zhì)；所述1/3是透明帶周長的1/3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制哺乳動物性別的方法。本發(fā)明所提供的控制哺乳動物性別的方法，是將哺乳動物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，移入到成熟的、去核的、未受精的哺乳動物卵母細(xì)胞中，進(jìn)行體外重構(gòu)、體外培養(yǎng)、胚胎移植，控制子代的性別。本發(fā)明用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞克隆獲得的168h囊胚，在體外繼續(xù)培養(yǎng)體系中，50％的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可以完全脫離透明帶，極顯著高于體細(xì)胞克隆囊胚在繼續(xù)培養(yǎng)中只有2－6％的囊胚可完全脫離透明帶。本發(fā)明利用牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核移植技術(shù)，控制良種牛性別，可降低性別控制成本，提高良種牛的生產(chǎn)性牛，可操作性強(qiáng)，為良種產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支撐。
文檔編號A61D19/00GK1908163SQ20061011264
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月28日
發(fā)明者董雅娟, 趙興, 封紀(jì)武, 柏學(xué)進(jìn), 胡亮 申請人:萊陽農(nóng)學(xué)院