專利名稱：：黑色素細(xì)胞懸浮液的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明關(guān)于一種粘附性細(xì)胞懸浮液的保存方法，更具體地，關(guān)于一種黑色素細(xì)胞懸浮液的保存方法。
背景技術(shù)：
：白化癥(Leukoderma)中的白斑病(Viti1igo)為一種斑狀色素缺失疾病，約發(fā)生在1%2%的人口中，其臨床癥狀為皮膚或黏膜上出現(xiàn)不規(guī)則的白色斑塊，白斑病患部上的黑色素細(xì)胞幾乎全數(shù)缺失。在白斑病的治療方面，除了利用染劑或化妝品的染色與遮蓋方式夕卜，也可利用局部涂抹類固醇制劑，或植皮的方式治療，然而這些方法除了不適用于大面積之外，也可能會產(chǎn)生皮膚萎縮等副作用。目前治療白斑最常使用的方法為口服或外用的感光劑(如Psoralen)與長波長紫外光(UVA)的合并治療，或是窄頻UVB治療。但這些治療方式療程冗長，一般需要100到250次治療，為時(shí)l到2年。此外，經(jīng)過此冗長的療程后，大約只有50%的病人能得到明顯療效。另一種較新穎的治療方式是藉由黑色素細(xì)胞的移植來進(jìn)行治療，此種黑色素細(xì)胞移植治療法與前述口服、照光等相比，僅需數(shù)次門診，且?guī)字苤畠?nèi)就可看到色素再現(xiàn)，療效迅速而明顯。由于黑色素細(xì)胞為粘附性細(xì)胞，故在培養(yǎng)此類型細(xì)胞時(shí)必須有可粘附的基材與適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。因此，在臨床上使用培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞來治療皮膚白化病灶時(shí)，須考濾培養(yǎng)基的去除及粘附基材的處理等因素。其中，關(guān)于粘附基材的處理方式可以有下列三種方式第一，將細(xì)胞與所粘附的基材一同覆蓋到病灶上，然而此方式需要考濾生物兼容性/生物可分解性等因素而開發(fā)適合的粘附基材，技術(shù)上較復(fù)雜困難；第二，將細(xì)胞從粘附基材上分離后，與水膠混合再覆蓋到病灶上，此方式成本較昂貴，且多一道處理步驟；第三，將細(xì)胞從粘附基材上分離，和生理兼容液體混合(也即制成細(xì)胞懸浮液)，再移植到病灶上。此三種方式相較，以第三種方式(制成細(xì)胞懸浮液)較易于進(jìn)行，也較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。然而當(dāng)粘附性細(xì)胞(例如黑色素細(xì)胞)一旦被制成細(xì)胞懸浮液時(shí)，由于失去細(xì)胞粘附分子的訊號傳遞，往往在短時(shí)間內(nèi)即死亡；此外，該細(xì)胞也容易聚集沉降，難以打散，若將此聚集細(xì)胞團(tuán)移植到要治療的無色素病灶上(例如白斑癥)，則會因細(xì)胞分布不均而形成色素斑點(diǎn)；再者，若要作后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)，聚集細(xì)胞團(tuán)不能均勻分布于培養(yǎng)皿，也會妨礙培養(yǎng)效果。因此，如何制備并保存該細(xì)胞懸浮液是一個(gè)重要課題。傳統(tǒng)上，細(xì)胞的保存多以低溫冷凍(例如儲存于液態(tài)氮)的方式進(jìn)行，以達(dá)到長期保存的效果。但是對于需立即使用，而不需再經(jīng)處理的細(xì)胞(例如運(yùn)送到醫(yī)院供病人治療用的細(xì)胞)，則并不適合以上述的低溫冷凍方式保存。因?yàn)槔鋬黾?xì)胞時(shí)需加入特殊試劑，例如DMSO來防止冷凍對細(xì)胞造成傷害，而這些試劑無法直接用于臨床上。再者，低溫冷凍的細(xì)胞運(yùn)送保存時(shí)需用干冰或液態(tài)氮或其它方式來維持低溫狀態(tài)，造成運(yùn)送保存困難。此外，冷凍細(xì)胞的使用需一定的解凍程序，故也存在使用便利性的問題。臨床應(yīng)用的細(xì)胞懸浮液，一般是以非冷凍的方式保存于室溫下。科學(xué)上一般將室溫視為25°C。然而細(xì)胞對溫度非常敏感，不同的環(huán)境溫度會對細(xì)胞生理有不同的影響，如果要達(dá)到好的保存效果，必須找出最適的保存溫度范圍，而室溫未必是最適合的保存溫度。一個(gè)非冷凍、且溫度低于最適合細(xì)胞生長的環(huán)境，或許能降低細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)及代謝速率，進(jìn)而延長細(xì)胞壽命。但該低溫環(huán)境也可能造成細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞生長周期變慢，甚至是使酵素功能喪失等，進(jìn)而造成細(xì)胞的死亡。此外，當(dāng)細(xì)胞回溫使用時(shí)，也常會引發(fā)不良的熱休克反應(yīng)(heatshock),造成細(xì)胞的再度損傷。因此，尋找合適的低溫環(huán)境，使之同時(shí)滿足降低代謝速率而延長細(xì)胞壽命及最低的細(xì)胞傷害是一個(gè)重要的課題。然而，目前關(guān)于非冷凍保存方式對于細(xì)胞影響的了解很有限，其中關(guān)于低溫環(huán)境對粘附性細(xì)胞影響的研究，僅限于粘附于培養(yǎng)皿上的粘附性細(xì)胞，并未對制備成懸浮液的粘附性細(xì)胞作研究。而且，溫度因子對特定細(xì)胞的影響，例如低溫對黑色素細(xì)胞的影響，更是付之闕如。綜合上述，當(dāng)粘附性細(xì)胞，尤其是黑色素細(xì)胞，被制成細(xì)胞懸浮液商品化時(shí)，其運(yùn)送過程及臨床手術(shù)前存放的保存條件皆足以影響到該細(xì)胞的活性、存活率及細(xì)胞在溶液中分布的均勻性。因此，粘附性細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液的最佳化保存條件已經(jīng)成為研究目標(biāo)。因此，本發(fā)明關(guān)于粘附性細(xì)胞懸浮液的保存，尤其是黑色素細(xì)胞懸浮液的保存，特別是以非冷凍的方式保存黑色素細(xì)胞懸浮液，使細(xì)胞活性和存活率受到最佳保護(hù)，同時(shí)避免細(xì)胞聚集。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種黑色素細(xì)胞的保存方法，先將黑色素細(xì)胞制備成懸浮液，較佳以漢氏培養(yǎng)液(Ham'sNutrientMixtureF-12，Ham'sF12)配制，再分別于約4-22.5°C溫度范圍下，保存該黑色素細(xì)胞懸浮液，其中成人黑色素細(xì)胞懸浮液較佳的保存溫度范圍約為10-22.5t之間，于此溫度范圍，24小時(shí)后成人黑色素細(xì)胞仍保有約72。/。以上的活性及存活率，并且細(xì)胞無聚集現(xiàn)象。而新生兒黑色素細(xì)胞懸浮液較佳的保存溫度范圍約為4-15t之間，于此溫度范圍下，48小時(shí)后新生兒黑色素細(xì)胞仍保有約71%以上的活性及存活率。依照本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例，黑色素細(xì)胞的懸浮液也可由杜貝可最低基本培養(yǎng)液(Dulbecco，sModifiedEaglemedia，DMEM)、最低基本培養(yǎng)液(MinimalEssentialMedium,MEM)、磷酸生理食鹽7jC(phosphatebufferedsaline,PBS)、羅斯威爾帕克纟己念機(jī)構(gòu)1640培養(yǎng)液(RoswellParkMemorialInstitute1640Medium,RPMI1640Medium)、一般生理食鹽水(normalsaline)或其它生理兼容溶液所配制。本發(fā)明還提供一種黑色素細(xì)胞懸浮液的保存方法，該黑色素細(xì)胞懸浮液用于治療缺乏黑色素細(xì)胞疾病，該方法包含制備黑色素細(xì)胞懸浮液，于約4-22.5'C溫度范圍內(nèi)保存黑色素細(xì)胞懸浮液。與傳統(tǒng)低溫保存方式相比，本發(fā)明是利用懸浮液的方式，不需低溫冷凍即可保存黑色素細(xì)胞，且本發(fā)明的黑色素細(xì)胞懸浮液可保存至少24小時(shí)，對于遠(yuǎn)距離運(yùn)送而言，24小時(shí)的運(yùn)送時(shí)間已相當(dāng)充裕，無論是否馬上使用或?qū)⒑谏丶?xì)胞懸浮液暫存于前述適合的保存溫度，對于黑色素細(xì)胞的活性及存活率的影響差異不大，同時(shí)也降低細(xì)胞聚集的情形。由于傳統(tǒng)懸浮液的治療方式，被黑色素細(xì)胞的保存所局限，因此，本發(fā)明在醫(yī)療用途上或?qū)τ诤谏丶?xì)胞的商品化具有極為顯著的效益。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，對附圖的詳細(xì)說明如下圖1是依照本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的黑色素細(xì)胞保存條件實(shí)驗(yàn)的概括流程圖；圖2是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的黑色素細(xì)胞懸浮液的制備流程圖；圖3是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的新生兒黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)的流程圖；圖4是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的成人黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)的流程圖-,圖5是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的新生兒黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)長條圖；圖6是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的成人黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)長條圖；圖7A至圖7G顯示本發(fā)胞于不同溫度下的聚集情形圖8A至圖8D顯示本發(fā)胞保存在DMEM、于不同溫度圖9A至圖9D顯示本發(fā)胞保存在MEM、于不同溫度下的聚集情形。圖IOA至圖10D顯示本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，成人黑色素細(xì)胞保存在PBS、于不同溫度下的聚集情形。明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，成人黑色素細(xì)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，成人黑色素細(xì)下的聚集情形。明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，成人黑色素細(xì)圖IIA至圖11D顯示本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，成人黑色素細(xì)胞保存在RPMImedium1640、于不同溫度下的聚集情形。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)流程圖1是依據(jù)本發(fā)明較佳實(shí)施例的黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)的概括流程。為了測試保存溫度及時(shí)間對黑色素細(xì)胞活性及存活率的影響，先從新生兒的包皮或是成人表皮組織，取得并培養(yǎng)皮膚黑色素細(xì)胞(dermalmelanocyte)后，制備成懸浮液(步驟102)。接著，分別于不同的溫度下保存一段時(shí)間后(步驟104)，進(jìn)行細(xì)胞活性及存活率測試(步驟106)，并觀察細(xì)胞聚集情形。此實(shí)施例中分別使用四氮唑鹽(Thiazolylblue)比色法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行測試。四氮唑鹽比色法是一種生物學(xué)上常用以測定細(xì)胞存活率或增殖作用的方法，其主要依賴活細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸去氫酶的作用，將四氮唑鹽的四唑(tetrazolium)轉(zhuǎn)為藍(lán)色甲瓚(forraazan)產(chǎn)物，并堆積于細(xì)胞中。當(dāng)加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide;DMSO)將其溶解后，則可利用吸光值(opticaldensity;OD)的測定得知細(xì)胞的還原能力(甲瓚產(chǎn)量)，此吸光值代表了線粒體的活性，即細(xì)胞活性，故四氮唑鹽比色法可用作細(xì)胞存活率的指針。而細(xì)胞計(jì)數(shù)則是利用錐蟲藍(lán)(TrypanBlue)對細(xì)胞進(jìn)行染色來計(jì)數(shù)。由于錐蟲藍(lán)無法穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，但是當(dāng)細(xì)胞受傷或死亡，其細(xì)胞膜會破損，則錐蟲藍(lán)可以通透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞染成藍(lán)黑色。利用這一特點(diǎn)，配合血球計(jì)數(shù)器的使用，則可以在顯微鏡底下，分辨出細(xì)胞樣本中的活細(xì)胞與死細(xì)胞，以方便細(xì)胞計(jì)數(shù)。本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程及其結(jié)果詳述如下。(一)制備成人黑色素細(xì)胞懸浮液參照圖2，首先，利用水泡吸附法取得成人的表皮組織(步驟201)。在此步驟中，以酒精將皮膚消毒后，將針筒放置于皮膚上，以200-300毫米汞柱的吸力吸附皮膚長達(dá)60-120分鐘，使皮膚形成水泡，再將表皮組織剪下，一般而言，表皮組織上含有約86-90%的角質(zhì)細(xì)胞及5-7%的黑色素細(xì)胞。接著，將剪下的表皮組織切碎后(步驟202)，先以胰蛋白溶液浸泡(步驟203)，再移入胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)溶液中(步驟204)，使黑色素細(xì)胞從表皮組織分離，最后以離心的方式收集表皮細(xì)胞(g卩，角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞)(步驟205)，并于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(步驟206)。其中角質(zhì)細(xì)胞因無法生長而迅速減少，黑色素細(xì)胞則持續(xù)增生，而得到接近純黑色素細(xì)胞的細(xì)胞族群。由于黑色素細(xì)胞屬于粘附型細(xì)胞(adherentcell)，因此需利用胰蛋白酶(Trypsin)分解細(xì)胞與培養(yǎng)皿間的附著蛋白(步驟207)，讓黑色素細(xì)胞脫落下來，這是收集粘附型細(xì)胞常用的方法。接著，洗滌取得的黑色素細(xì)胞(步驟208)。之后，以約1.2-1.5X107ml的密度，將黑色素細(xì)胞重新懸浮于漢氏培養(yǎng)液(Ham'sF12)中(步驟209)。漢氏培養(yǎng)液(Ham，sFl2)為常見的市售培養(yǎng)液，內(nèi)含氨基酸、糖類、脂肪酸、鹽類等基本細(xì)胞生長必須物質(zhì)。除了漢氏培養(yǎng)液(Hara'sF12)外，也可采用杜貝可最低基本培養(yǎng)液(DMEM)、最低基本培養(yǎng)液(MEM)、磷酸生理食鹽水(PBS)、羅斯威爾帕克紀(jì)念機(jī)構(gòu)1640培養(yǎng)液(RoswellParkMemorialInstitute1640Medium,RPMI1640Medium)、一般生理食鹽水(normalsaline)或其它生理兼容溶液來配制。最后，將黑色素細(xì)胞懸浮液分裝入試管中(步驟210),以進(jìn)行下述的實(shí)驗(yàn)。(二)新生兒黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)首先，為了模擬在運(yùn)送過程中，時(shí)間及溫度對黑色素細(xì)胞活性及存活率的影響，因此，將取得的新生兒黑色素細(xì)胞分兩階段儲存。如圖3所示，先將存有新生兒黑色素細(xì)胞的試管分別保存于保冷箱中，時(shí)間由0小時(shí)至24小時(shí)不等(步驟301)，此階段保冷箱的溫度仿照運(yùn)送過程中的溫度，其約為1-15T:之間。接著，于第二階段中，再將存于保冷箱的試管置入4'C冰箱內(nèi)(步驟302)，此過程模擬黑色素細(xì)胞運(yùn)抵治療機(jī)構(gòu)后，存放于4'C冰箱內(nèi)的狀況，同樣地，時(shí)間也由0小時(shí)至48小時(shí)不等。最后，將新生兒黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中于37。C下恢復(fù)5天后(步驟303)，以四氮唑鹽比色法(步驟304)及細(xì)胞計(jì)數(shù)(步驟305)的方式測試細(xì)胞活性及存活率。表一顯示此實(shí)施例中，新生兒黑色素細(xì)胞的兩階段保存條件200610121539.8說明書第7/12頁(a)未經(jīng)保存階段，即直接分析；(b)4'C保存4小時(shí)；(c)^C保存24小時(shí)；(d)4。C保存48小時(shí)；(e)保冷箱保存8小時(shí)、4'C保存16小時(shí)，低溫保存共24小時(shí)；(f)保冷箱保存24小時(shí)；(g)保冷箱保存24小時(shí)、4°C保存24小時(shí)，低溫保存共48小時(shí)。表一新生兒黑色素細(xì)胞兩階段保存條件標(biāo)示保冷箱(1-15'C)的保存時(shí)數(shù)(小時(shí))4t;冰箱的保存時(shí)數(shù)(小時(shí))保存總時(shí)數(shù)(小時(shí))000b044c02424d0484881624f24024g242448(三)成人黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)由于已于上述實(shí)驗(yàn)(二)新生兒黑色素細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)中，模擬運(yùn)送過程溫度及時(shí)間對黑色素細(xì)胞的影響。因此，于此實(shí)驗(yàn)中，僅就成人黑色素細(xì)胞的最佳保存溫度及時(shí)間作測試，而不分兩階段儲存。參照圖4，取得成人黑色素細(xì)胞后，分別于0°C、4°C、l(TC、15°C、22.5°C、32.5°C、37°C下，保存24小時(shí)或48小時(shí)(步驟401)。接著，將成人黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中于37'C下恢復(fù)5天(步驟402)，以四氮唑鹽比色法(步驟403)及細(xì)胞計(jì)數(shù)(步驟404)的方式測試細(xì)胞活性及存活率。并觀察不同溫度下細(xì)胞聚集的情形(步驟405)。表二則顯示實(shí)施例中，成人黑色素細(xì)胞的保存溫度及時(shí)間(h)未經(jīng)保存階段，直接分析；(i)4。C保存24小時(shí)；(j)10。C保存24小時(shí)；(k)15。C保存24小時(shí)；(1)22.5"保存24小時(shí)；(m)32.5。C保存24小時(shí)；(n)37。C保存24小時(shí)；(0)4。C保存48小時(shí)；(p)l(TC保存48小時(shí)；(q)15。C保存48小時(shí)；(r)22.5°C保存48小時(shí)；(s)32.5°C保存48小時(shí)；(t)37t:保存48小時(shí)。表二成人黑色素細(xì)胞保存條件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果與討論(A)新生兒黑色素細(xì)胞的保存條件表三顯示了新生兒黑色素細(xì)胞于不同溫度及時(shí)間下，活性及存活率測試結(jié)果。表三新生兒黑色素細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果新生兒黑色素細(xì)胞實(shí)驗(yàn)四氮唑鹽比色法細(xì)胞數(shù)保冷箱/4i:冰箱保存時(shí)數(shù)(小時(shí))百分比(%)標(biāo)準(zhǔn)差百分比(%)標(biāo)準(zhǔn)差<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>圖5為表三的統(tǒng)計(jì)長條圖。白色部份代表四氮唑鹽比色法所測試出的保存后細(xì)胞存活率，而斜線部份則為所計(jì)算出的保存后細(xì)胞個(gè)數(shù)，上述兩者的計(jì)算基準(zhǔn)為(a)未經(jīng)保存階段的新生兒黑色素細(xì)胞。參見圖5，a至d代表將新生兒黑色素細(xì)胞分別保存于4'C冰箱中，0小時(shí)至48小時(shí)后，讓細(xì)胞在37°C中恢復(fù)5天，所測試到的細(xì)胞活性與存活率。其結(jié)果與未經(jīng)保存階段的細(xì)胞相比，差異不大，仍保有82%以上的細(xì)胞活性和存活率。由此可知，將新生兒黑色素細(xì)胞制成懸浮液后可保存于4"的冰箱中近48小時(shí)，直至需使用為止。依據(jù)圖5中的e至g，說明新生兒黑色素細(xì)胞在保冷箱保存數(shù)小時(shí)后，再移入4'C冰箱儲存一段時(shí)間，于37r下恢復(fù)5天的測試結(jié)果。其顯示盡管將新生兒黑色素細(xì)胞儲存于保冷箱長達(dá)8小時(shí)(e)或24小時(shí)(f、g)，無論是否轉(zhuǎn)移至4'C冰箱，仍然保有良好的活性與存活率，與未經(jīng)低溫保存的新生兒細(xì)胞相較，也保有71%以上的存活率。由此可知，若為遠(yuǎn)距離的運(yùn)送，24小時(shí)的運(yùn)送時(shí)間已相當(dāng)充裕，無論是否馬上使用或?qū)⒑谏丶?xì)胞懸浮液暫存于4t:冰箱，對于黑色素細(xì)胞的活性及存活率的影響差異不大。依據(jù)上述可知，新生兒黑色素細(xì)胞較佳的保存溫度范圍為4-15"，以此溫度保存48小時(shí)后，仍可保有至少71%以上的細(xì)胞存活率及活性。而此415°C的溫度范圍，遠(yuǎn)低于公知常用的室溫范圍。(三)成人黑色素細(xì)胞的保存條件經(jīng)由上述實(shí)驗(yàn)(二)的結(jié)果可知，新生兒黑色素細(xì)胞于4-15°C下，保存48小時(shí)，仍保有71%以上的細(xì)胞存活率及活性。實(shí)驗(yàn)(三)則擴(kuò)大此溫度范圍，測試成人黑色素細(xì)胞的最佳保存溫度及時(shí)間。表四為成人黑色素細(xì)胞的活性及存活率測試結(jié)果。表四成人黑色素細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖6為表四的統(tǒng)計(jì)長條圖，其顯示于0-37'C之間，保存24小時(shí)或48小時(shí)后，成人黑色素細(xì)胞活性及存活率，h至n分別代表于0°C、4°C、10°C、15°C、22.5°C、32.5°C及37°C下，保存24小時(shí)后的測試結(jié)果，而o至t則為分別4°C、10°C、15°C、22.5°C、32.5°C及37t:下，保存48小時(shí)后的測試結(jié)果。同樣地，上述兩者的計(jì)算基準(zhǔn)為(h)未經(jīng)保存階段，即直接分析的成人黑色素細(xì)胞。顯然地，無論是24小時(shí)或48小時(shí)，保存在10-22.5。C之間的成人黑色素細(xì)胞，皆有較高的細(xì)胞活性及存活率，若以4'C以下或22.5°C以上的溫度保存，則明顯傷害細(xì)胞的活性及存活率。此外，以10-22.5'C保存24小時(shí)的成人黑色素細(xì)胞(圖6j、k、1)，甚至仍保有72%以上的細(xì)胞活性及存活率。然而，隨著時(shí)間的增加，48小時(shí)后(圖6o至t)，細(xì)胞活性及存活率比未經(jīng)低溫保存的細(xì)胞降低許多。圖7A至圖7G分別顯示成人黑色素細(xì)胞于4°C、l(TC、15°C、22.5°C、25°C、32.5°C及37°C下，以Ham，sF12培養(yǎng)液保存24小時(shí)后，所觀測到的細(xì)胞聚集情形。由圖7A至圖7C可知，保存在15°C或更低溫度下的黑色素細(xì)胞無明顯聚集，以22.5t;保存的細(xì)胞則輕微聚集，隨著溫度上升，細(xì)胞聚集的情形則更為嚴(yán)重。此外，為了探討當(dāng)黑色素細(xì)胞以其它生理兼容溶液保存時(shí)，此最佳保存溫度范圍是否仍具優(yōu)越性，故先將黑色素細(xì)胞保存于4種不同的生理兼容溶液中，再分別置于15°C、22.5°C、25'C及37'C下24小時(shí)后，恢復(fù)5天后，最后觀察細(xì)胞聚集情形。此4種溶液為DMEM、MEM、PBS以及RPMImedium1640，實(shí)驗(yàn)結(jié)果貝lj依序顯示于圖8A-8D、圖9A—9D、圖10A-10D以及圖11A-11D中，由15°C、22.5°C、25°C至37'C排列。如圖所示，于15度下，細(xì)胞均無聚集現(xiàn)象。保存于22.5度時(shí)，細(xì)胞略有聚集現(xiàn)象。然而，隨著溫度的上升，于25度和37度下的細(xì)胞則有嚴(yán)重的聚集現(xiàn)象。綜合細(xì)胞活性、存活率和聚集結(jié)果判斷，成人黑色素細(xì)胞的較佳保存溫度為10-22.5°C，以此溫度范圍保存24小時(shí)后，依然具有72%以上的存活率與活性。此外，上述的黑色素細(xì)胞懸浮液可用以治療缺乏黑色素細(xì)胞疾病，例如白斑癥(Vitiligo)或白化癥(Leukoderma)。由于此類型病癥是因患部黑色素細(xì)胞缺乏所致，因而呈現(xiàn)白色，利用涂抹懸浮液的方式將黑色素細(xì)胞移植于患部上，可改善病征。此外，本發(fā)明也可應(yīng)用于任何缺乏黑色素細(xì)胞的情形，例如白發(fā)現(xiàn)象，可利用此黑色素細(xì)胞懸浮液加以治療。由于人體的發(fā)色亦是由皮膚上的黑色素細(xì)胞所提供，可知白發(fā)的產(chǎn)生原因之一可為黑色素細(xì)胞供給的短缺所致。因此可將本發(fā)明的黑色素細(xì)胞懸浮液注射于頭皮中，進(jìn)而將黑色素細(xì)胞植入皮膚里，改善黑色素細(xì)胞的缺乏情形，使黑色素細(xì)胞對毛發(fā)提供色素，達(dá)到治療的效果。黑色素細(xì)胞在治療上的應(yīng)用會為其保存條件所局限，然而，本發(fā)明的黑色素細(xì)胞懸浮液的保存條件，可使細(xì)胞在至少24小時(shí)以內(nèi)，還保持良好的活性與存活率，也無嚴(yán)重細(xì)胞聚集現(xiàn)象，應(yīng)用于臨床治療時(shí)，細(xì)胞可發(fā)揮功能，也不會有因?yàn)榧?xì)胞聚集而產(chǎn)生的皮膚呈色不均勻的重大缺點(diǎn)。對于遠(yuǎn)距離運(yùn)送而言，24小時(shí)的運(yùn)送時(shí)間己相當(dāng)充裕，無論是否馬上使用或?qū)⒑谏丶?xì)胞懸浮液暫存于適當(dāng)溫度的冰箱，都可有良好使用效果。在醫(yī)療用途上或?qū)τ诤谏丶?xì)胞商品化具有極為顯著的效益。雖然本發(fā)明已經(jīng)以較佳實(shí)施例揭示如上，但是其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作各種的更動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)視所附的權(quán)利要求所界定的為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種黑色素細(xì)胞懸浮液的保存方法，其特征在于，以非室溫(25℃)條件進(jìn)行保存處理，包含制備黑色素細(xì)胞懸浮液；于約4-22.5℃溫度范圍內(nèi)，保存該黑色素細(xì)胞懸浮液。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，該黑色素細(xì)胞懸浮液以漢氏培養(yǎng)液、杜貝可最低基本培養(yǎng)液、最低基本培養(yǎng)液、磷酸生理食鹽水、羅斯威爾帕克紀(jì)念機(jī)構(gòu)1640培養(yǎng)液、一般生理食鹽水或其它生理兼容溶液所配制。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，該黑色素細(xì)胞為成人黑色素細(xì)胞。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該溫度范圍約為10-22.5""C之間。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，該黑色素細(xì)胞為新生兒黑色素細(xì)胞。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該溫度范圍約為4-15。C之間。7.—種成人黑色素細(xì)胞懸浮液的保存方法，其特征在于，以非室溫(25。C)條件進(jìn)行保存，其包含制備一成人黑色素細(xì)胞懸浮液，其中該成人黑色素細(xì)胞懸浮液是以選自于由漢氏培養(yǎng)液、杜貝可最低基本培養(yǎng)液、最低基本培養(yǎng)液、磷酸生理食鹽水、羅斯威爾帕克紀(jì)念機(jī)構(gòu)1640培養(yǎng)液、一般生理食鹽水或其它生理兼容溶液所組成的一族群配制而得；于約10-22.5'C溫度范圍，保存該懸浮液。8.—種新生兒黑色素細(xì)胞懸浮液的保存方法，其特征在于，以非室溫(25°C)條件進(jìn)行保存，其包含制備一新生兒黑色素細(xì)胞懸浮液，其中該新生兒黑色素細(xì)胞懸浮液是以選自于由漢氏培養(yǎng)液、杜貝可最低基本培養(yǎng)液、最低基本培養(yǎng)液、磷酸生理食鹽水、羅斯威爾帕克紀(jì)念機(jī)構(gòu)1640培養(yǎng)液、一般生理食鹽水或其它生理兼容溶液所組成的一族群配制而得；于約4-15"C溫度范圍，保存該懸浮液。全文摘要本發(fā)明關(guān)于一種黑色素細(xì)胞的保存方法。將黑色素細(xì)胞制成懸浮液后可保存于4-22.5℃的溫度范圍內(nèi)，其中新生兒黑色素細(xì)胞懸浮液的保存溫度較佳為4-15℃間，保存48小時(shí)后仍然保持71％以上的細(xì)胞存活率和活性。成人黑色素細(xì)胞的保存溫度較佳約為10-22.5℃間，保存24小時(shí)后亦保有72％以上的細(xì)胞存活率和活性。同時(shí)，于此溫度范圍下，可避免黑色素細(xì)胞聚集(aggregate)的情形產(chǎn)生。該黑色素細(xì)胞懸浮液可用以治療皮膚白化癥(leukoderma)，及其它黑色素細(xì)胞缺乏的癥狀。文檔編號A01N1/02GK101126079SQ200610121539公開日2008年2月20日申請日期2006年8月18日優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日發(fā)明者吳怡萍,廖智菁,施冰如,楊瑩蓉,申屠子萍申請人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院