專利名稱：篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法及該方法獲得的啟動子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法及該方法獲得的啟動子。
背景技術：
干旱和鹽漬土是當今世界上嚴重影響農(nóng)作物生產(chǎn)的兩個主要因素。為了提高受影響區(qū)域的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，不管是傳統(tǒng)育種還是農(nóng)作物基因工程都在設法提高作物的耐旱性和抗高鹽性。了解植物逆境壓力在基因水平上的反應可為將來的育種和基因工程提供必要的基礎。
最近在對擬南芥干旱和高鹽壓力反應的研究暗示了很大比例的基因牽涉到對干旱或高鹽壓力的反應。在一些案例中，顯示出單個基因表達水平的改變會在很大程度上影響植物對干旱和高鹽壓力的反應。對受干旱和高鹽條件控制的基因的鑒定有極大的意義；另外，它還有助于對逆境誘導啟動子和組織特異性啟動子的鑒定，對農(nóng)作物基因工程的運用都起著重要的作用。
DNA微陣列提供了對基因表達分析進行大批量處理的手段，已經(jīng)被運用于幾種植物種類對干旱和高鹽壓力的反應的基因表達的圖形進行研究。最初，利用一個摘自擬南芥的含有1300個全長型cDNA克隆的微列陣對干旱壓力和冷壓力的基因表達進行研究。這個研究分別鑒定出44和19個cDNA克隆，它們都是干旱和冷可誘導基因。其他研究采用一個擬南芥的含有大約7000個全長型cDNA克隆的微列陣去描繪對于abscisic acid(ABA)處理，還有冷、干旱、高鹽壓力反應的基因表達。還有的研究采用了一個含有大約8100個擬南芥基因的Affymetrix GeneChip來臨控基因表達在鹽、滲透和冷壓力下的變化；這個研究揭示了根基因表達的變化和葉基因表達的變化有很顯著的不同，僅有微小的重疊。類似的研究，還有利用一個含有1463個DNA元件的微列陣來評估大麥對干旱、高鹽反應的基因表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法及該方法獲得的啟動子。
本發(fā)明所提供的篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法，是將環(huán)境脅迫處理前后的目的植物的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將所述cDNA作為探針與所述目的植物基因表達微陣列進行雜交；將與環(huán)境脅迫處理前相比雜交信號增加2倍或2倍以上的cDNA探針所結(jié)合的所述目的植物基因表達微陣列上的核苷酸序列，與所述目的植物的基因組DNA進行分析，得到環(huán)境脅迫誘導型啟動子。
所述目的植物基因表達微陣列(芯片)可從商業(yè)途徑獲得，如安捷倫(Agilent)科技有限公司公司、Affymetrix出售包括水稻、擬南芥等在內(nèi)的多種植物的基因表達微陣列；所述目的植物基因表達微陣列也可按照常規(guī)方法構(gòu)建，如文獻《DNA芯片實驗操作指南》(韓金祥，等編譯.山東大學出版社，2001)等。
其中，所述環(huán)境脅迫包括干旱脅迫、鹽脅迫和冷脅迫等由環(huán)境因素引起的水分脅迫。
所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，如農(nóng)作物水稻、小麥、玉米、煙草、矮牽牛、茄子、番茄、曼陀羅、西瓜、甜瓜、黃瓜、黃豆、綠豆、豌豆、豇豆和紫藤等。
所述目的植物的總RNA可來源于脅迫處理前或脅迫處理后植物材料的RNA。
所述目的植物的總RNA可為相同或不同組織和/或器官的總RNA。
所述方法中還可包括將得到的環(huán)境脅迫誘導型啟動子轉(zhuǎn)化到植物中進行報告基因表達鑒定的步驟。
本發(fā)明所提供的利用上述方法篩選到的啟動子，其核苷酸序列是如下1)、2)、3)、4)或5)1)序列表中的序列1或在嚴格條件下與所述序列表中的序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)序列表中的序列2或在嚴格條件下與所述序列表中的序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)序列表中的序列3或在嚴格條件下與所述序列表中的序列3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中的序列4或在嚴格條件下與所述序列表中的序列4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；5)序列表中的序列5或在嚴格條件下與所述序列表中的序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述嚴格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。
序列表中的序列1由1301個脫氧核苷酸組成，該啟動子的名稱為DF2。序列表中的序列2由1301個脫氧核苷酸組成，該啟動子的名稱為DF15。序列表中的序列3由1244個脫氧核苷酸組成，該啟動子的名稱為DFL4。序列表中的序列4由1304個脫氧核苷酸組成，該啟動子的名稱為DL2。序列表中的序列5由1300個脫氧核苷酸組成，該啟動子的名稱為DL5。
本發(fā)明篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法流程如圖1A所示，該方法首先采用微陣列法(Microarray)取得在指定壓力條件下的特定組織的基因表達概貌，選取候選啟動子，然后對候選啟動子進行植物轉(zhuǎn)化和基因表達鑒定。傳統(tǒng)的分離環(huán)境脅迫誘導性啟動子的方法流程如圖1B所示。本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法相比具有以下優(yōu)點1、結(jié)合了微陣列法進行啟動子的分離首次將微陣列法用于啟動子的分離。人們一般只用微陣列法研究基因的表達情況，研究環(huán)境脅迫引起基因表達的差異性，研究基因表達的組織特異性，未有人將微陣列法用于環(huán)境脅迫誘導性啟動子的分離。2、啟動子分離的高通量性本發(fā)明方法一次可以分離上百個受環(huán)境脅迫誘導的啟動子。由于微陣列法研究基因表達的高效性，一次可以對上萬個基因表達情況進行研究，從中發(fā)現(xiàn)數(shù)百甚至上千個受環(huán)境脅迫誘導的基因，因此可以一次分離幾十個或上百個候選的環(huán)境脅迫誘導的啟動子。3、啟動子分離的高效性由于微陣列法的儀器化程度很高，所以雜交用時很短也很方便，所以用新方法分離啟動子很方便快捷。3、與組織特異性啟動子分離相結(jié)合由于微陣列法不僅提供了基因表達的誘導性情況，同時也提供了基因表達組織特異性信息，所以用本發(fā)明方法分離的啟動子不僅是環(huán)境脅迫(如干旱或高鹽)誘導的，而且還可以知道啟動子的組織特異性。
利用本發(fā)明的方法篩選到的干旱誘導啟動子DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5，其中DL2在普通葉具有明顯的誘導現(xiàn)象；DFL4和DF2在普通葉具有明顯的誘導現(xiàn)象；DF15和DL5在普通和旗葉中都有明顯的誘導現(xiàn)象。
本發(fā)明以水稻為實例證實了本發(fā)明篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法的可行性、高通量和實用性。利用本發(fā)明篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法成功地從水稻中克隆了包括DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5在內(nèi)的誘導型啟動子96個。


圖1A為本發(fā)明篩選組織特異性啟動子的方法流程圖；圖1B為傳統(tǒng)的分離干旱和高鹽誘導性啟動子的方法流程圖；圖2為干旱處理植株D1、D2和D3期的照片；圖3為秈稻品種明恢63的旗葉、普通葉和小穗的cDNA探針與微陣列的雜交情況；圖4為重組載體pCAMBIA1303/inducible promoter T-DNA區(qū)的圖譜；圖5為干旱誘導啟動子的RT-PCR電泳圖譜；具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
本發(fā)明的篩選組織特異性啟動子的方法，可用于篩選各種啟動子，下面以水稻為例闡明新的高通量分離干旱誘導性啟動子的方法實施例1、從水稻中篩選干旱誘導組織特異性啟動子本實施例中采用了一個覆蓋36，926單一基因或基因模型的70mer寡聚體水稻基因表達微陣列，來測試水稻葉在干旱壓力環(huán)境下基因表達的變化。該水稻基因表達微陣列按照文獻《Conservation and divergence of light-regulated genomeexpression patterns during seedling development in rice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，and Deng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)和《A microarray analysis of the rice transcriptome and its comparison toArabidopsis》(Ma，L.G.，et al.(2005)，Genome Res.15，1274-1283)中描述的方法制備?；趯@些基因概貌的分析，已經(jīng)克隆了96個候選啟動子，已經(jīng)對其中的5個進行了驗證。
1、候選干旱誘導組織特異性啟動子的篩選(1)植物材料和壓力處理用于和上述水稻基因表達微陣列雜交的植物材料為秈稻品種明恢63(OryzaSativa L.ssp.indica cv.Minghui 63，購自中國水稻所)。芽樣品取自4分蘗階段(營養(yǎng)期)旗葉和普通葉(除旗葉以外的其它葉片)，圓錐花序樣品取自抽穗前的一個星期(生殖期)。用于取芽樣品的植物生長在半濃度的霍格蘭溶液中至四葉期，然后生長在土壤中直到生殖期。
干旱處理的材料和樣品在以下階段收集期1(D1)葉輕微卷，相對含水量(RWC)在90％-95％；期2(D2)葉半卷，相對含水量(RWC)在80％-85％；期3(D3)葉完全卷，相對含水量在70％-75％(圖2)。圖2中，D1、D2和D3代表干旱處理的三個階段。復水后的樣品取自第一批經(jīng)干旱處理葉完全卷曲的植株(D3)給水48小時后。對每個處理階段，取樣三份。采樣完畢，樣品立即用液氮冷凍保存于-80℃。
(2)微陣列雜交和數(shù)據(jù)分析按照文獻《A microarray analysis of the rice transcriptome and itscomparison to Arabidopsis》(Ma，L.G.，et al.(2005)，Genome Res.15，1274-1283)中描述的方法配制和使用RNAwiz試劑提取經(jīng)過步驟(1)處理的樣品的總RNA。每份總RNA的提取物經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一條鏈經(jīng)Cy3或Cy5熒光標記后作為探針。其中，第一鏈cDNA的合成及其熒光標記按照文獻《Conservation anddivergence of light-regulated genome expression patterns during seedlingdevelopment in rice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，andDeng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)中描述的方法進行。所有的cDNA探針與上述水稻基因表達微陣列按照文獻《Conservation and divergence oflight-regulated genome expression patterns during seedling development inrice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，and Deng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)中描述的方法進微陣列雜交、洗滌和掃描。其中，用Axon GenePix 4000B掃描儀對雜交微陣列玻片進行掃描，圖像保存為TIFF格式的Cy3和Cy5兩種，用于后續(xù)的分析。每個實驗記錄五組重復的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)來自獨立的樣品。
數(shù)據(jù)質(zhì)量控制以及標準化方法按照文獻《Conservation and divergence oflight-regulated genome expression patterns during seedling development inrice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，and Deng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)和《A microarray analysis of the rice transcriptomeand its comparison to Arabidopsis》(Ma，L.G.，et al.(2005)，Genome Res.15，1274-1283)中描述的方法進行。檢測干旱和高鹽壓力下的差異表達的基因采用LimmaR軟件包按照文獻Smyth，G.K.(2005)LimmaLinear models for microarray data.In Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R andBioconductor，R.Gentleman，V.Carey，S.Dudoit，R.Irizarry，W.Huber，eds(New YorkSpringer)，pp.397-420中描述的方法進行，即通過表達的數(shù)據(jù)構(gòu)建線性模型而實施空假設檢驗。在干旱或高鹽處理過的樣品和對照樣品(未經(jīng)干旱和高鹽處理)的配對比較中，中度的t-值統(tǒng)計方法采用經(jīng)驗的Bayes方法計算，收縮基因的樣品變量指向一個共同的值(myth，G.K.(2005)LimmaLinear models formicroarray data.In Bioinformatics and Computational Biology Solutions usingR and Bioconductor，R.Gentleman，V.Carey，S.Dudoit，R.Irizarry，W.Huber，eds(New YorkSpringer)，pp.397-420)，并且記錄計算不同水平的轉(zhuǎn)化強度比。用Benjamini和Hochberg方法(Benjamini，Y.，and Hochberg，Y.(2000).Theadaptive control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing.J.Behav.Educ.Statist.25，60-83；Reiner，A.，Yekutieli，D，and Benjiamini，Y.(2003)Identifying differentially expressed genes using false discoveryrate controlling procedures.Bioinformatics 19，368-375)的P值調(diào)節(jié)用于控制多重實驗的錯誤率。若P值小于0.05，則說明基因有明顯的不同，進一步采用三倍嚴格的標準以避免假陽性的出現(xiàn)。未經(jīng)干旱和高鹽處理、經(jīng)干旱或高鹽處理的秈稻品種明恢63(Oryza Sativa L.ssp.indica cv.Minghui 63，購自中國水稻所)的旗葉、普通葉和小穗的cDNA探針與微陣列的雜交結(jié)果如圖3所示，表明經(jīng)過經(jīng)干旱或高鹽處理的旗葉、普通葉和小穗中表達的基因總數(shù)要比未經(jīng)干旱和高鹽處理的多。圖3的縱坐標為有雜交信號的基因表達微陣列上的核苷酸序列數(shù)，干旱誘導(drought induced)表示基因表達微陣列上與來源于干旱處理植株的cDNA探針有雜交信號的的核苷酸序列數(shù)，鹽誘導(salt induced)表示基因表達微陣列上與來源于高鹽處理植株的cDNA探針有雜交信號的的核苷酸序列數(shù)，Common表示基因表達微陣列上與來源于未經(jīng)干旱和高鹽處理的cDNA探針有雜交信號的核苷酸序列數(shù)。從基因表達微陣列上與處理前相比雜交信號增加2倍或2倍以上的cDNA探針所結(jié)合的基因表達微陣列上，在旗葉、幼苗和花序中，分別有582、1257和614個干旱正調(diào)節(jié)基因，從這些核苷酸序列中，選擇如表1所示的5個核苷酸序列(基因)與水稻基因組DNA進行比較分析，從表1的工作ID分別為DF2、DF15、DFL4、DL2和DL5的5個基因翻譯起始位點前1.0-2Kb中選擇候選啟動子，其名稱分別為DF2、DF15、DFL4、DL2和DL5。DF2的核苷酸序列是序列表中的序列1，由1301個脫氧核苷酸組成。DF15的核苷酸序列是序列表中的序列2，由1301個脫氧核苷酸組成。DFL4的核苷酸序列是序列表中的序列3，由1244個脫氧核苷酸組成。DL2的核苷酸序列是序列表中的序列4，由1304個脫氧核苷酸組成。DL5的核苷酸序列是序列表中的序列5，由1300個脫氧核苷酸組成。
其中，基因表達微陣列上5個受干旱誘導的基因數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表1所示。表1中的比值為該基因干旱誘導后的雜交信號值與干旱誘導前的雜交信號值的比值，D1、D2和D3比值表明基因表達在D1、D2和D3期三個時間點比干旱誘導前增加的倍數(shù)。
表1 5個受干旱誘導的基因表達微陣列數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3、干旱誘導組織特異性啟動子的鑒定(1)候選干旱和高鹽誘導啟動子的選擇和引物設計根據(jù)微陣列和原始數(shù)據(jù)的分析的結(jié)果，選擇了5個可能的干旱誘導啟動子進行分離(表1)。啟動子的選擇為基因翻譯起始位點前1.0-2Kb，用計算機輔助設計引物進行啟動子的分離(表2)。
表2 可能的受干旱誘導的啟動子引物設計

(2)侯選啟動子的擴增和pCAMBIA1303/inducible promoter載體的構(gòu)建利用天為時代生物公司植物基因組提取試劑盒提取日本晴的基因組DNA。
PCR所用試劑為TaKaRa公司的EXTaq試劑盒；PCR的模板為日本晴的基因組DNA。PCR引物如表2。PCR程序為先94℃5分鐘進行預變性；然后進行如下35個循環(huán)94℃40秒進行變性，55℃1分鐘進行退火，72℃2分鐘進行延伸；最后72℃10分鐘。然后在1.2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。PCR產(chǎn)物回收后，用BsaI酶切后回收啟動子片段，pCAMBIA1303(購自CAMBIA實驗室，見www.cambia.com)用HindIII和NcoI酶切后回收載體片段，然后與BsaI酶切片段連接轉(zhuǎn)化，陽性克隆送至擎科生物有限公司進行測序，測序引物為R5’ATCCAGACTGAATGCCCACA3’和F5’GCACCCCAGGCTTTACACTT3’，將含有核苷酸序列分別是序列1、2、3、4和5的啟動子的重組載體pCAMBIA1303/inducible promoter分別命名為pCAMBIA1303-DF2、pCAMBIA1303-DF15、pCAMBIA1303-DFL4、pCAMBIA1303-DL2和pCAMBIA1303-DL5。上述內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶和轉(zhuǎn)化所用感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自天為時代生物公司，方法均按照試劑盒中所述。
重組載體pCAMBIA1303/inducible promoter的T-DNA區(qū)圖譜如圖4所示，LB和RB分別為T-DNA的左臂和右臂；hpt潮霉素抗性基因；CaMV35S花椰菜花葉病毒啟動子；inducible promoter通過微列陣數(shù)據(jù)分析出的候選干旱誘導啟動子；GUS-GFPgus和GFP融合蛋白基因；HindIII和NcoI內(nèi)切酶HindIII和NcoI的酶切位點。
按照文獻《Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DAN.》(Hiei Y，Ohta S，Komari T et al.Plant J 1994，6271-282.)中描述的方法將pCAMBIA1303-DF2、pCAMBIA1303-DF15、pCAMBIA1303-DFL4、pCAMBIA1303-DL2和pCAMBIA1303-DL5分別通過根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404的介導轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織、進行植株再生，得到轉(zhuǎn)基因植株(T0代)。將T0代得到的種子經(jīng)過50mg/L的潮霉素發(fā)苗篩選后種植到土壤中，培育至抽穗期。將正處抽穗期的植株，在不破壞根系的情況下進行失水處理至D2期葉半卷，相對含水量(RWC)在80％-85％。轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303-DF2、pCAMBIA1303-DF15、pCAMBIA1303-DFL4、pCAMBIA1303-DL2或pCAMBIA1303-DL5的植株每個取4個獨立株系，每個株系在失水前后各取6株，然后RT-PCR檢測干旱處理前和失水處理至D2期植株的旗葉和普通葉中GUS-GFP基因的表達。
按照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等，第三版，黃培堂等譯，科學出版社518-522)中描述的方法提取干旱處理前和失水處理至D2期植株的旗葉和普通葉的RNA。利用上海申能博彩生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈作為模板，進行PCR擴增，從而檢測GUS-GFP基因和actin基因在旗葉和普通葉中的表達actin兩條引物分別為5-TCCGTGACATCAAGGAAAAG-3’和5’-GATATCAACATCGCACTTCATG-3’；GUS-GFP基因的兩條引物分別為5’AACTGCATCAGCCGATTATCATC 3’和5’GCATTGAACACCATAAGAGAAAGT 3’；PCR所用試劑為TaKaRa公司的EXTaq試劑盒；PCR程序為先94℃ 5分鐘進行預變性；然后進行如下29個循環(huán)94℃40秒進行變性，55℃1分鐘進行退火，72℃1分鐘進行延伸；最后72℃10分鐘。然后在1.2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，紫外凝膠成像儀掃描成像，然后利用LabWorksTM 4.0.08軟件進行灰度分析，計算GUS-GFP基因的在誘導后和誘導在前普通葉和旗葉中的比值。
其中，4株轉(zhuǎn)入每種啟動子的干旱處理前和失水處理至D2期植株的旗葉和普通葉的RT-PCR電泳結(jié)果如圖5所示，表明DF2、DF15、DFL4、DL2和DL5均可啟動GUS-GFP基因表達。圖4中KT00219，KT00228，KT00234，KT00236和KT00264分別為DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5的編號?！癉0”和“D2”分別為處理前和相對含水量為(relative water content，RWC)80％-85％；“L”水稻普通葉；“FL”水稻的旗葉；“1”、“2”、“3”和“4”分別指獨立來源的轉(zhuǎn)基因水稻；“gus”為GUS-GFP基因的擴增產(chǎn)物；“actin”為水稻actin基因的擴增產(chǎn)物。
按照上述RT-PCR方法檢測了20株未轉(zhuǎn)基因的日本晴植株(空白對照)中的GUS-GFP基因表達情況，結(jié)果表明未轉(zhuǎn)基因的日本晴植株均無GUS-GFP基因表達。
干旱誘導后與誘導前普通葉和旗葉中的GUS-GFP基因表達量比值結(jié)果如表3所示，表明DL2在普通葉具有明顯的誘導現(xiàn)象；DFL4在普通葉具有明顯的誘導現(xiàn)象；DF2、DF15和DL5在普通葉和旗葉中都有明顯的誘導現(xiàn)象。
表3 GUS基因的在誘導后和誘導在前普通葉和旗葉中的比值

表3中，“1L”、“2L”、“3L”和“4L”分別為獨立來源的4個轉(zhuǎn)基因水稻株系的普通葉；“1FL”、“2FL”、“3FL”和“4FL”分別為相應獨立來源的4個轉(zhuǎn)基因水稻株系的旗葉；“/”指誘導前后都沒有表達。
序列表<160>5<210>1<211>1301<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1gatgcaggag tgcgattaag ttgcgtcagc ggcaagggat tattatccct ttctatatcc 60ggcggcggcg cgctcccggc cggttggagg cggccatgga cagcctgcta cgccacgaaa 120gcatcattat atctgcccag atgattcata cacatatatg atctcaaaag gcgatcgatg 180tgcgcacgta catacaggtc acaactggtc atgcctacga tagatatgcc gtgcaacatg 240cgttgctcgg agcacttcaa ttaagataga gggaacaaat gttataagaa agattttcat 300cggtagtcga ctgttgagaa aagatgtgca ttctatgtat aaacacaagc tactgaactg 360aaagccgagt gccaaaccgg ttattggtat tattcatgat cattcccaga ttattctgtt 420ttaaccagtc gtgggaacta ttggccaact atgctggatc ctatgactcc tccctggtcc 480tgagtttctt ggaagcctta tctacaggtt caatgcacgc acgcacgatt gacgacgacc 540tgaacgactc ttccggtcaa taatgccagc ccatgtggtc ctccgcagtc cgcactgtgc 600aagtgtgcag cgtccacttg aaaatccaca gaagccacca ttcttcagag cctccctccc 660tgcttcttca atacacttcc agaactaggg gcatgttcga tttagcctgg tgtagttgga 720gaaaattttt aattttagtt atcatatcgg atatacagat atatatttgg agtattaaat 780gtagtctaat aacaaaacaa attacagatt ccgtcagaaa actacaagac gaatttatta 840agtctaatta atccatcatt agcaaatgtt tactgtagca ctatattgtc aaattatggc 900ataattaggc ttaaacgatt cgtctcacaa tttacacgta atctgtgtaa ttggtttttt 960ttcctacatt taatactcca tacatgtatt caaacattcg atatgacggc acgaaaattt1020ttgttttggg aactaaatag ggtcttagag gaaaagtaaa gaatttggat ttctcaggat1080taatttctat atgagttatt cgatttgtta aaataaagta tgagaaagcc aaaacaatat1140tttctttcct acaagttgca tagagaaaaa aaaatccact caaacctcta attttttttc1200tatagattga tatgtacata tatttctatc ccttcacttt tcctattctt ttccgcatga1260agaaaaaaaa gagaactttt ctaaccatct ctgcacttcc g1301<210>2<211>1301<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2
cggagatcaa acaggaaaca atctcaccat cacaaccgac ctagcaggcg attacagcga 60tggaatcacg cttaccgcga gcgaatcgga tcaaaacgga ggggctcgag cggagggagg 120gaatgcttct tcggttcgtc tcgtctcgtc gcatcgcgtt cgcctctgga gttttggatt 180ctaccgctct agaagcttcc ggacgagccc cgaatcggca cgggagagcg cacacgcgtg 240gcggcgcctg aaggcctttt atgatgggga cgcgtggcgt gttggccgtc ggatcgtgac 300acgtgtccac gagatgacgc ggttggacgg tgcgagtggc gacgtcgttg tgtgggccgc 360gaagtttgtc atcggctcgt gggcctagcc ttttctcggc cctgaaaggt aggaaaccga 420ggcctttcca tccattttct tctctttttc ctgttctatt attgatgttg tattgggtga 480ttttgaaacc cttttgaaag aaattttggg taatttttgt tcattgaatt cttgaatttg 540atctcctcct aagtaagttg aataaatgga tttgtggatt gtgagaagct gacctaagac 600aaaagatttt ttgcagtagt agtacattaa aaaagcaggc attgcattcc atccctcttc 660aagggctaag gcttatctac ctaacatttt ttcttgtttc ctgcacacga tgataacatt 720tcctttctgt tgatctgtca ttcgtgattt gagtagctat atgtaaatag gtttgatgtt 780gtttgacaat atcaccagca tagctattct catgcttaca gttcatctaa ccagctttcc 840tgatcagggt tcagaggtta tatccaaagt tttattcaga agaacgcaaa aggaacattc 900aagattagca tccataatat ttatgagtag tacgactagt acattaaaca agctctagat 960taggatcaac acaagtgatc aaagtgatgg ggatgagaaa gccctggaat ggtccgaacc1020caatgtgtgt aatccaccga ttggccttag ctgattgtga ctccgttcat gtttgatgtg1080ctagtaccaa ccacctgtgc cactatctgt cctccacatg tacactccat aggcgtatgg1140acgtatggaa caaaagataa gatacaaaga tgcatggaga agattatagt taaaactgaa1200agctgtacat cactatcatt tggtaattca gaattcagaa gtgaatatgg acatggaatc1260tgcagtacta cttgtgcggt agcagtcact gacaagtggg t1301<210>3<211>1244<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>3aagcaagtcc gaagaccatt actcctctta ctcctctcct ctgtttcata ttataaatcg 60tttaaccttt ttcctagtta aagttcgcta tgtttgacta aatttataaa ataaattagt 120aacatctata acaccaaatt agttttatta aattcaacat tgaatatatt ttgataatat 180gtttgttttg tattgaaaga ttattatatt tttctacaaa tttggtaaaa cttaaagatg 240tttgattaag aacataaatc aaacgactta taatacgaaa cggacgaagt agctagctag 300caggctatat attgatctac tagctacctc tgttttttta gtaatcgaca gtaaataata 360ttgaataaac acacaaaatt taaccactaa tttttttcct tcagaattta taaaaacatg 420tgattctgca ccactgcatt aaaataaaat tcaaaatgat tctaacagta tgtgctttag 480tgtacaaaat agaataaatt agtgttcata aaagtttgga taggagaatc ctctgttttc 540aaatagtcag tgatttataa ttaatgcaag tgttaatatt tgcattgtga aaaatatcat 600tttgtttgtt gtagaaacaa tacaatgatg catgcaatat taaggacaat ttaaatgcag 660
gagtaaaatt tttattaaag acaaagttat atgaaggaaa ataaaatggt aggggatcaa 720aaaccatttt tatgccatta tatttttaat aactttaagg aatacacagt attaaaaaat 780aattatcaaa tgttattgtt tcccatgtta gatatgtcta gaacgactac taagatagta 840ttaaatacag agatataaag gaagtctcca aactttttgt ttgaattaca aacccaaggg 900ctaaagttta ttacctgcat gttaattgaa ggaaaaatat ctgcctcgta ctgcactgat 960aacgtacagt ggattgagaa aatattaatt ttggattcat ctactagatt tactagctct1020tacaagagga ttttcagtaa taagttagca ctggtactta actagcgaat aacttcgcaa1080aattctgcta gtttaattta ttttcaaaca aggattctct ctccaacttg tcaacaaaat1140agcactatat agctgacgaa ctcttacgtt acaacattat agtcgcaggg tcatcttctt1200cttttcccct ttcgaaggca ttgtcacttt gtcagccttc tgct 1244<210>4<211>1304<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>4cagtacgtcg cctatcacca taacgcatcc gacgcgagtg ctgcctgtcc cagctacttg 60tgtcctagct gcctgtgtcc cagggtcccg gttacttgtg tcgtacccac ccacgctgcc 120agcaaccaca tgtaggtgta gaaccaacta accaaaatgt gtttaattag ctatattcta 180ttgaaaaact agggtagtgg ccggggcaaa aattttttag tcactccagt gatcaagatt 240taaaatttaa attccttagg ttctgttgcc aatttttttt ggggaatgtt gccaaaaata 300tttcttcaaa cggagagagt aatattatat atattgacgc tggatgatgc actgcttgtg 360ttgctggtgt gcaagcttcc ctgccaagtg ccaaacggaa tcaaatcctc tcatgtgaac 420ttccacttga cgtggtcact gacaggtggg cccgtgagcg gtggagcccg catgtcagtc 480accacgttcc tctgacttca cgtcagagga ttctaatccg tgccaaactg ccaacttgtg 540gtcggtgcct gcaagcatcc cgcgtgagtg ctgcctaccc tcgccaaagc ccgcgtcttc 600aacacagccg cgtggatttt tttatttttt tagacttttt tatgctttat tattagacca 660ttcaaaaaag tatttccgaa aactgaacct tttggccacg tctgcagtgg tgacgtgata 720agaggctggc gtggcagggc aacgctacca caccagctac ccgtggtgtg atagagttat 780ttggtcacca ggctggataa aaggttcata tttaaaattt tttttggaaa tcgtcaatta 840ataaaattaa aacataaaaa agttactacc attctgcggt aaaaaagtta ctgcacttcc 900ctgacaaaaa tatcaaatat ctacaattcg ttttttgacc ggtggagtgg cgcaaatgta 960gatcactcct acaaattaaa taatctgaac ggataagata agaaatttta attttaactc1020gtgatgacag tttactcttt aaatgagagt aattaacttt ctactctaaa tttctgaatg1080ggatgcggag aacgggaagg aaaaccagag aataactttt tctttctttt ttgagaagaa1140cggcagtacg gtataggaaa gggaataata ataacaatat atgttttcgt gtagttatat1200ttaacgtcat ttataaacat atactagata ctagtaataa cggaatatat gtcaataata1260caagacgtga aaaccaaaaa tgacgaatgg agtgatcgag tagc 1304
<210>5<211>1300<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>5tggacagcag gctacagatt tatagccagc tgtagcacgg actttaagat gcatatgtat 60atgacagatg agaccagata ttaattatgt agtatatgtt tatatgtaac tactgtatga 120attgactatt aaattgacta tagatgattt ggagtccgca gttagcttta ctactaaact 180tgctcttaat ggaatgttcc atcccaaagt tcatcattct gtttggttag cattagagca 240ggtacaatag cagactatta accagctata aacatatttt aatgagataa aaagataaga 300aaaaagagca gcgggctata aatctgcagc cggttgtagc acggactcta agatgcaatg 360tgtgtataat agataggact atatactaat agtatagtaa acaattattg tataaattag 420ctattagatt agctatagat gaattagagt tagtagtggg ctatactatt aaacttgctc 480ttagcatgcg gttagagtga cagcaacatc ggttcatcga tcaagagtag attatgagtg 540gattataagt tgtaatagct tactagtgaa aaatatttta cgagtaaaac ttttatatat 600acacatccat aaatttttat aatttttaaa ataaatgcat taatgatacc taaaatccac 660ttaaaattaa gttttaaaat ttaaactttg acgtcgatta atttgttata cgtcaatcaa 720taagaccctt tagctattgc acctaccgta tttttcctgg atataaagta agatcctggg 780atcaaagaaa gcttcgcaat cacatgttga gaaaaggagt gggctttcag aagcaggagc 840agaaaatgat gtatgataga ctagttcggt actgcagtta ggtgcccata aagaagatct 900tccggtgatt gcattgggaa tgttcggttg catttggagc tagtatttgg ctatagtatt 960atactagtat tgaacttgct ttaacagatt tcttcagctt aataatttac tgtttgaatt1020tgttctacat tttgagcagc tttgatggtt tctttgtgta gttttttcaa gtataaacca1080actcgatcaa agttaggaac agtacagata gaaggcaaca atgtcatatc agaggagaga1140atcattcctg tgttacgtgg agtataaaca atctgcaata ctctggtcat tgctacatct1200gacaaaagtc gttgtgttac cacttaccac catgtcgttc aagcagagct ggagaatctt1260ttcctcaatt ttctgttcgg ttttcagttc caccttgcct 1300
權(quán)利要求
1.一種篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法，是將環(huán)境脅迫處理前后的目的植物的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將所述cDNA作為探針與所述目的植物基因表達微陣列進行雜交；將與環(huán)境脅迫處理前相比雜交信號增加2倍或2倍以上的cDNA探針所結(jié)合的所述目的植物基因表達微陣列上的核苷酸序列，與所述目的植物的基因組DNA進行分析，得到環(huán)境脅迫誘導型啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述環(huán)境脅迫包括干旱脅迫、鹽脅迫和冷脅迫等由環(huán)境因素引起的水分脅迫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述目的植物為水稻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物的總RNA為相同或不同組織和/或器官的總RNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物的總RNA可來源于脅迫處理前或脅迫處理后植物材料的RNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將得到的環(huán)境脅迫誘導型啟動子轉(zhuǎn)化到植物中進行報告基因表達鑒定的步驟。
8.利用權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的方法篩選得到的啟動子，其核苷酸序列是如下1)、2)、3)、4)或5)
1)序列表中的序列1或在嚴格條件下與所述序列表中的序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)序列表中的序列2或在嚴格條件下與所述序列表中的序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)序列表中的序列3或在嚴格條件下與所述序列表中的序列3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中的序列4或在嚴格條件下與所述序列表中的序列4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；5)序列表中的序列5或在嚴格條件下與所述序列表中的序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法及該方法獲得的啟動子。本發(fā)明所提供的篩選環(huán)境脅迫誘導型啟動子的方法，是將環(huán)境脅迫處理前后的目的植物的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將所述cDNA作為探針與所述目的植物基因表達微陣列進行雜交；將與環(huán)境脅迫處理前相比雜交信號增加2倍或2倍以上的cDNA探針所結(jié)合的所述目的植物基因表達微陣列上的核苷酸序列，與所述目的植物的基因組DNA進行分析，得到環(huán)境脅迫誘導型啟動子。利用該方法成功地從水稻中克隆了包括DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5在內(nèi)的誘導型啟動子96個。
文檔編號A01H1/00GK1970794SQ20061014438
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日
發(fā)明者鄧興旺, 夏勉, 王喜萍, 翟晨光, 劉敏 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術有限公司