專利名稱：蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病原真菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法及其用途。
背景技術(shù)：
稗草是全球最難防除的雜草之一，目前主要依靠化學(xué)除草劑來防治。然而化學(xué)除草劑的長期使用使稗草的抗(耐)藥性問題及環(huán)境污染問題越來越嚴(yán)重。開發(fā)安全高效的生物除草劑符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求，雖然目前生物除草劑還不能完全替代化學(xué)除草劑，但它能有效減少化學(xué)除草劑的使用劑量，從而減少對(duì)環(huán)境的污染。
水稻紋枯病是由土壤真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的一類嚴(yán)重制約水稻生產(chǎn)的全球性水稻病害。發(fā)病嚴(yán)重的區(qū)域水稻減產(chǎn)可達(dá)50％。由于缺少抗紋枯病的供體，目前世界上尚未育出真正意義上的抗紋枯病的水稻品種，因此開發(fā)高效安全的殺菌劑，尤其是生物來源的殺菌劑尤為重要。國內(nèi)防治水稻紋枯病主要利用井岡霉素，雖然井岡霉素是一種低毒的抗生素類生物農(nóng)藥，但是井岡霉素已經(jīng)使用了幾十年，品種單一老化，而且需要多次用藥才能達(dá)到預(yù)期的防治效果，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明目的在于提供一種蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法的技術(shù)方案，其培養(yǎng)物具有防治雜草和水稻病害的用途。
蟋蟀草平臍蠕孢菌，拉丁名稱Bipolaris eleusines，其有性態(tài)為Cochliobolus eleusines。是從農(nóng)田自然感病的稗草上分離到的植物病原真菌，可以從浙江中稻高科技種業(yè)有限公司購買得到，其商品名稱為克草霉；也可以從中國水稻研究所雜草控制和利用實(shí)驗(yàn)室購買得到。
蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下工藝步驟1)蟋蟀草平臍蠕孢菌菌種的分離純化采集的感病稗草標(biāo)樣，用無菌紙袋帶回，取感病稗草葉片，用自來水沖洗后，剪成小片狀，用70％酒精消毒，置于PDA培養(yǎng)基上，室溫(25-30℃)下保濕培養(yǎng)，3～4天后解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取只含一個(gè)孢子的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接到PDA斜面上培養(yǎng)成單孢系，然后轉(zhuǎn)接到稗草種子上培養(yǎng)9-11天后分裝于無菌的Eppendorf離心管中，3-5℃保藏菌種；2)蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種于新鮮PDA平板上，27-29℃黑暗培養(yǎng)6-8天后，取直徑6-8mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫25-30℃靜置培養(yǎng)13-15天獲得發(fā)酵液。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PDA培養(yǎng)基含有馬鈴薯180-220g/L、葡萄糖18-22g/L和瓊脂15-20g/L。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為稗草基質(zhì)培養(yǎng)基，即采集于孕穗期的稗草植株，切成1-2cm長小段，60℃烘干備用，使用時(shí)加水高壓滅菌。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PDB液體培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)中用火焰滅菌的解剖針挑出，涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)中轉(zhuǎn)接到稗草種子上的培養(yǎng)時(shí)間為10天，菌種保藏溫度為4℃。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)中長有菌絲及孢子的稗草種子接種于新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)7天后，取直徑7mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫28℃靜置培養(yǎng)14天。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PDA培養(yǎng)基含有馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的pH值為6-7。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發(fā)酵液在生物除草劑和防治水稻紋枯病的抑菌劑中的應(yīng)用。
蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物ophiobolin A在培養(yǎng)皿生測法中對(duì)稗草種子胚根生長有較強(qiáng)抑制作用，其IC50值為7.5μM，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)稗草對(duì)ophiobolin A敏感，對(duì)水稻安全。它可以單獨(dú)使用，也可以與化學(xué)除草劑同時(shí)使用從而減少化學(xué)除草劑使用劑量并且達(dá)到良好的除草效果。同時(shí)Ophiobolin A對(duì)水稻紋枯病菌有極好的抑菌作用，其抑菌效果明顯優(yōu)于目前常用的井岡霉素，它在25μg/mL濃度下就有100％抑制作用，而5％井岡霉素在有效成分濃度為200μg/mL時(shí)只能達(dá)到45.2％的抑制率。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例及試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
取感病稗草葉片，用自來水沖洗后，將葉片剪成適當(dāng)大小，用70％酒精消毒，置于PDA培養(yǎng)基上，室溫28℃下保濕培養(yǎng)，4天后解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，取只含一個(gè)孢子的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接到PDA斜面上培養(yǎng)成單孢系，然后轉(zhuǎn)接到稗草種子上培養(yǎng)10天后分裝于無菌的1.5mL Eppendorf離心管中，4℃保藏菌種。
取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種于新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)7天后，取直徑7mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫28℃靜置培養(yǎng)14天。
主要培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，稗草基質(zhì)培養(yǎng)基。
PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L；稗草基質(zhì)培養(yǎng)基稗草植株，采集于孕穗期，切成1-2cm長小段，60℃烘干備用，使用時(shí)稱取2g上述制備好的稗草，加20ml水高壓滅菌。
(1)培養(yǎng)特性蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)要求不高，在普通的PDA培養(yǎng)基上室溫(28-30℃)、pH6-7下生長良好，生長狀態(tài)用顯微鏡連續(xù)觀察如下1-1.5h成熟孢子從兩端或一端開始萌發(fā)；3h未成熟的孢子(分隔4個(gè)以下的孢子)開始萌發(fā)，早期萌發(fā)的孢子處于菌絲生長的旺盛階段，菌絲分枝成直角或近似直角，菌絲無隔，細(xì)胞核清晰；4.5h有的菌絲開始變粗；6h膨大的菌絲出現(xiàn)環(huán)痕狀的隔；9h膨大的菌絲頂端開始有乳突狀的小孢子出現(xiàn)；12h有小的分生孢子出現(xiàn)；24h新生的分生孢子不成熟，沒有明顯的分隔；
54h培養(yǎng)基底部變黑。
66h新生的分生孢子已成熟并萌發(fā)；(2)生理特性不同溫度下蟋蟀草平臍蠕孢菌生長速度和孢子產(chǎn)量明顯不同，28℃生長最快，產(chǎn)孢最多。溫度高于30℃菌生長和產(chǎn)孢受嚴(yán)重抑制，溫度低于25℃，菌生長速度明顯減慢。
蟋蟀草平臍蠕孢菌可在一個(gè)較寬的pH范圍內(nèi)生長，pH6-10之間菌落直徑生長速率沒有顯著差異，pH6-7時(shí)產(chǎn)孢量最多，在pH低于5和高于11之外生長緩慢。
光照可影響蟋蟀草平臍蠕孢菌的生長和產(chǎn)孢。在12h光照/12h黑暗交替條件下菌落生長稍快，連續(xù)光照條件下次之，而連續(xù)黑暗條件下較慢。在連續(xù)黑暗條件下產(chǎn)孢量最多，連續(xù)光照條件下產(chǎn)孢量最少。
氧氣對(duì)孢子產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用。
(3)代謝特性蟋蟀草平臍蠕孢菌在PDB培養(yǎng)基內(nèi)黑暗靜置培養(yǎng)14d后，培養(yǎng)物中可產(chǎn)生倍半萜類毒素，該毒素具有殺草和抑菌活性。
(4)菌種安全性評(píng)價(jià)供試作物為水稻(秀水11、嘉育293、協(xié)優(yōu)46)、玉米、高粱、大麥、小麥、大豆、蠶豆、豇豆和油菜，供試雜草為無芒稗，分別在小塑料盒(15×10×10厘米)中育苗。利用稗草基質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，無菌水制備孢子懸液(含0.05％吐溫20)，在禾本科植物1葉1心和雙子葉植物1片真葉時(shí)噴施孢子懸液；28℃保濕24h，14d后調(diào)查發(fā)病情況。
試驗(yàn)結(jié)果顯示蟋蟀草平臍蠕孢菌對(duì)水稻安全，對(duì)高粱和大麥輕度致病，對(duì)稗草高度致病。
表1蟋蟀草平臍蠕孢菌安全性評(píng)價(jià)

孢子懸液濃度為2.5×105個(gè)/mL，噴霧量為200mL/m2；NS表示不感?。籐S表示輕度感?。籋S表示高度感病。
(4)孢子殺草活性a.蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子對(duì)不同類型稗草的殺草活性將無芒稗、光頭稗、稗(稗子)、硬稃稗(臺(tái)灣稗)分別播種在小塑料盒中，在2.0葉期間苗，拔除長勢弱的，每盒保留15株健壯、生長一致的稗苗。2.5-3.0葉期用蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子懸液噴霧接種。蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子用0.05％吐溫20液洗下，調(diào)濃度至孢子5×106個(gè)孢子/mL，每平方米接種孢子數(shù)5×107個(gè)。以噴0.05％吐溫20液做對(duì)照，接種后置生長箱，28±0.5℃黑暗保濕(RH95％)培養(yǎng)24h，然后移入28±2℃的溫室，前2d噴術(shù)保濕。接種14d后調(diào)查發(fā)病情況。每個(gè)處理重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果表明蟋蟀草平臍蠕孢菌對(duì)硬稃稗、光頭稗和無芒稗100％感病，但對(duì)稗子致病力稍差。接種后保持露珠期24h(在人工接種箱中一直細(xì)霧噴霧)，移入溫室后保持RH95％以上7天，溫度25-30℃的條件下，蟋蟀草平臍蠕孢菌可殺死大部分稗草。
表2蟋蟀草平臍蠕孢菌對(duì)不同稗草的致病性

注0-3表示病級(jí)，0＝無病斑，1＝不擴(kuò)展小型病斑，2＝輕到中等擴(kuò)展病斑，3＝大型病斑。
b.蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子不同劑量對(duì)稗草的殺草活性供試雜草為無芒稗，用無菌水配制孢子懸液(含0.05％吐溫20)，以不含孢子的0.05％吐溫20作為對(duì)照，對(duì)2-3葉期無芒稗進(jìn)行葉面噴施，28℃保濕24h，14d后進(jìn)行稗草株高、鮮重、干重、死亡率調(diào)查。按下式計(jì)算抑制率抑制率＝(對(duì)照調(diào)查值-處理調(diào)查值)/對(duì)照調(diào)查值×100％，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)噴霧較高劑量孢子懸液時(shí)，蟋蟀草平臍蠕孢菌殺草活性較高，稗草鮮重抑制率38.3％，株高抑制率27.6％，死亡率達(dá)53.9％。
表3蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子不同劑量下殺草活性比較

(5)蟋蟀草平臍蠕孢菌發(fā)酵液對(duì)紋枯病菌的抑菌活性取已活化直徑為7mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，25～28℃黑暗靜置培養(yǎng)14d，4層滅菌紗布過濾得到發(fā)酵液，再用0.22μm微孔濾膜過濾得到無菌發(fā)酵液。用熔化并冷卻到45～50℃的PDA培養(yǎng)基將無菌發(fā)酵液稀釋5×，10×，20×，40×，80×，160×，在直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)加入20mL含發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基制成平板，對(duì)照為空白PDA平板。從培養(yǎng)2d的紋枯病菌落邊緣取直徑7mm菌塊接種于上述平板中央，28℃培養(yǎng)24h，用十字交叉法測菌落直徑，并按下式計(jì)算發(fā)酵液對(duì)紋枯病菌的抑制率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵液對(duì)紋枯病菌有較強(qiáng)的抑制作用，5X稀釋的發(fā)酵液的抑菌率可達(dá)84.1％，隨著稀釋倍數(shù)增加，抑制作用下降，10×，20×，40×，80×稀釋的發(fā)酵液的抑菌率分別為79.5％、69.3％、63.0％、46.0％，160X稀釋后仍有32.9％的抑菌率。
權(quán)利要求
1.蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下工藝步驟1)蟋蟀草平臍蠕孢菌菌種的分離純化采集的感病稗草標(biāo)樣，用無菌紙袋帶回，取感病稗草葉片，用自來水沖洗后，剪成小片狀，用70％酒精消毒，置于PDA培養(yǎng)基上，室溫(25-30℃)下保濕培養(yǎng)，3～4天后解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取只含一個(gè)孢子的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接到PDA斜面上培養(yǎng)成單孢系，然后轉(zhuǎn)接到稗草種子上培養(yǎng)9-11天后分裝于無菌的Eppendorf離心管中，3-5℃保藏菌種；2)蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種于新鮮PDA平板上，27-29℃黑暗培養(yǎng)6-8天后，取直徑6-8mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫25-30℃靜置培養(yǎng)13-15天獲得發(fā)酵液。
2.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PDA培養(yǎng)基含有馬鈴薯180-220g/L、葡萄糖18-22g/L和瓊脂15-20g/L。
3.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為稗草基質(zhì)培養(yǎng)基，即采集于孕穗期的稗草植株，切成1-2cm長小段，60℃烘干備用，使用時(shí)加水高壓滅菌。
4.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PDB液體培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)中用火焰滅菌的解剖針挑出，涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。
6.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)中轉(zhuǎn)接到稗草種子上的培養(yǎng)時(shí)間為10天，菌種保藏溫度為4℃。
7.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)中長有菌絲及孢子的稗草種子接種于新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)7天后，取直徑7mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫28℃靜置培養(yǎng)14天。
8.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PDA培養(yǎng)基含有馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L。
9.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的pH值為6-7。
10.如權(quán)利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發(fā)酵液在生物除草劑和防治水稻紋枯病的抑菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)方法及其用途，屬于植物病原真菌技術(shù)領(lǐng)域。采集的感病稗草標(biāo)樣消毒處理后，置于PDA培養(yǎng)基上，室溫(25－30℃)下保濕培養(yǎng)，3～4天后解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，涂在PDA培養(yǎng)基上，取只含一個(gè)孢子的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接到PDA斜面上培養(yǎng)成單孢系，然后轉(zhuǎn)接到稗草種子上培養(yǎng)10天后分裝于無菌的Eppendorf離心管中，4℃保藏菌種；取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種于新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)7天后，取直徑7mm菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫28℃靜置培養(yǎng)14天。蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發(fā)酵液可用于制備生物除草劑和防治水稻紋枯病的抑菌劑。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1986772SQ20061015540
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者張建萍, 余柳青 申請(qǐng)人:中國水稻研究所