專利名稱：不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的制作方法
不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物
本發(fā)明涉及不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體(transplastomic)植物、獲得
這種植物的方法和所用載體。
植物轉(zhuǎn)基因由將源自各種生物(細(xì)菌、病毒、昆蟲(chóng)、植物)的一種或多 種基因引入植物組成，其目的是為該植物提供新特性或提高某些農(nóng)業(yè)或食 品質(zhì)量。隨著常規(guī)基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，大量的各種基因已經(jīng)導(dǎo)致新的植 物品種的產(chǎn)生。在某些情況下，由于引入了產(chǎn)生除草劑抗性、病原體抗性 或各種應(yīng)激抗性的特征，可有利于農(nóng)作物生產(chǎn)并提高產(chǎn)量。在其它情況下， 可提高該植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和某些基礎(chǔ)化合物的含量。
許多用于獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)包括將外來(lái)基因引入該植物 的核基因組。然而，整合入宿主植物核染色體的外來(lái)基因可通過(guò)花粉散布 給野生種類。因此，降低轉(zhuǎn)基因散布到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)的方法是非常有益的。
獲得轉(zhuǎn)基因植物的另一種方式是直接轉(zhuǎn)化質(zhì)體。具體說(shuō)，質(zhì)體轉(zhuǎn)化有 許多優(yōu)點(diǎn)，其中可注意
-通過(guò)雙同源重組將基因插入各個(gè)細(xì)胞中存在的一個(gè)或多個(gè)拷貝的環(huán) 狀質(zhì)體基因組(或質(zhì)體組)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有通過(guò)位于轉(zhuǎn)化載體中轉(zhuǎn)基因任一 側(cè)的質(zhì)體序列將感興趣的基因精確靶向至質(zhì)體組中所需區(qū)域的優(yōu)點(diǎn)。這種 精確耙向避免了核轉(zhuǎn)基因過(guò)程中通常所觀察到的"位置"效應(yīng)。
-每個(gè)細(xì)胞獲得非常大量拷貝的轉(zhuǎn)基因。具體說(shuō)，根據(jù)發(fā)育階段，葉 片細(xì)胞可含有高達(dá)10000個(gè)拷貝的120-160千堿基的小環(huán)狀基因組，每個(gè) 分子攜帶一個(gè)大的重復(fù)序列。隨后可操作植物細(xì)胞，以使其含有高達(dá)20 000 個(gè)拷貝的感興趣基因。
這導(dǎo)致高水平表達(dá)；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可能占總可溶性蛋白質(zhì)的40%以上 (DeCosa等，2001)。
-質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有其它優(yōu)點(diǎn)，它能大大限制轉(zhuǎn)基因散布到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)。 由于質(zhì)體中所編碼的特征通常不能通過(guò)花粉傳播，限制了轉(zhuǎn)基因傳播給野 生物種的潛在風(fēng)險(xiǎn)。McBride等(1994)的文章；美國(guó)專利號(hào)5,451,513; 5,545,817; 5,545,818 和5,576,198以及國(guó)際專利申請(qǐng)WO 95/16783和WO 97/32977描述了質(zhì)體 轉(zhuǎn)化技術(shù)。最初在單細(xì)胞藻類萊茵衣藻(C/7/flmj^omomw re/"Aa^"/)中用生 物射彈進(jìn)行質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Boynton等，1988)，此方法已經(jīng)延伸至煙草(Svab等， 1990)。
常規(guī)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)包括用連接有DNA的微粒轟擊葉片(Svab等， 1993)。
目前，僅在煙草植物普通煙草(M to&ram)中進(jìn)行高等植物質(zhì)體的穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化(Svab和Maliga， 1990; Svab等，1993)。然而近年來(lái)，水稻(Khan 和Maligna, 1999)、擬南芥(Jra6Zt/o/w^ Afl/&"a)(Sikdar等，1998)、馬鈴 薯(Sidorov等，1999)、油菜籽(Chaudhuri等，1999)和番茄(Ruf等，2001)
的質(zhì)體轉(zhuǎn)化取得了一些進(jìn)展。獲得了煙草、番茄、馬鈴薯和大豆的可繁殖 的轉(zhuǎn)質(zhì)體植株(WO 04/053133)。
直接質(zhì)體轉(zhuǎn)化已經(jīng)用于獲得對(duì)除草劑具有良好耐受水平或?qū)ハx(chóng)的 抗性，或者產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)。因此，煙草質(zhì)體組的除草劑如草甘膦(Daniell， 1998; WO 99/10513; Ye等，2000; WO 01/04331， WO 01/04327)或草胺 膦(Basta) (Lutz等，2001)的耐受基因過(guò)度表達(dá)產(chǎn)生了對(duì)這些除草劑出色的 耐受性。其它應(yīng)用導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)昆蟲(chóng)耐受或過(guò)量產(chǎn)生治療性蛋白的轉(zhuǎn)質(zhì)體植 物(McBride等，1995;美國(guó)專利5,451,513; Staub等(2000); WO 99/10513)。
然而，如常規(guī)進(jìn)行的高等植物質(zhì)體的直接轉(zhuǎn)化的一個(gè)主要缺點(diǎn)是采用 抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。
通常用于選擇轉(zhuǎn)質(zhì)體品系的選擇性標(biāo)記是細(xì)菌基因^W，它在質(zhì)體 調(diào)控元件的控制下表達(dá)(Svab等，1993; Staub等，1993)。編碼氨基糖苷3'-腺苷轉(zhuǎn)移酶的""^4基因的表達(dá)產(chǎn)生兩種抗生素抗性，即壯觀霉素和鏈霉 素抗性。afl^L4基因產(chǎn)物防止壯觀霉素(或鏈霉素)結(jié)合于質(zhì)體核糖體30S亞 基的部件16S RNA(參與識(shí)別翻譯起始密碼子)，從而防止了抑制質(zhì)體內(nèi)的 翻譯。僅有含有表達(dá)基因產(chǎn)物的質(zhì)體的細(xì)胞能夠繼續(xù)在體外最優(yōu)地 生長(zhǎng)并保持綠色。另一種選擇性標(biāo)記是具有點(diǎn)突變的16SRNA序列，此點(diǎn) 突變使其對(duì)壯觀霉素不敏感。
不幸的是，這種抗生素也控制人和動(dòng)物中的細(xì)菌感染。因此，轉(zhuǎn)基因
作物中抗生素抗性基因的存在所伴隨的健康和環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)引起了大 量憂慮。因此，人們主要關(guān)心可以清除選擇性標(biāo)記基因，特別是抗生素標(biāo) 記基因，同時(shí)將感興趣的基因保持在轉(zhuǎn)基因植物中的方法。
已經(jīng)對(duì)一定數(shù)量的復(fù)雜程度或高或低的技術(shù)進(jìn)行了描述，以用于清除 整合入染色體的選擇性標(biāo)記基因。如果標(biāo)記基因未遺傳連接于感興趣基 因，人們可以希望通過(guò)雜交和后代分析清除該基因。當(dāng)選擇性標(biāo)記為遺傳
連接時(shí)，可采用其它技術(shù)，如基于釆用轉(zhuǎn)座因子(PCT/US91/04679; Yoder 等，1993)或采用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)如Pl噬菌體的c //ox系統(tǒng)或酵母 FLP/FRT系統(tǒng)(FliPase重組酶；Lyzrik等，1997)的技術(shù)。
通過(guò)其轉(zhuǎn)運(yùn)肽將編碼靶向葉綠體的CRE蛋白的第二種轉(zhuǎn)基因引入該 植物的核基因組中(EP1218488)，位點(diǎn)特異性重組也已應(yīng)用于清除轉(zhuǎn)質(zhì)體標(biāo) 記基因，。
在萊茵衣藻中，基于光合突變體的選擇方法使得不用抗生素選擇性標(biāo) 記基因如aa^L4將感興趣的外來(lái)基因引入質(zhì)體基因組成為可能。然而，這 些方法不可用于高等植物，因?yàn)樗鼈兓诠夂贤蛔凅w的存在。
作為質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)的雙同源重組現(xiàn)象也可用于隨后清除部分 轉(zhuǎn)基因，尤其是選擇性標(biāo)記。描述了衣藻(Fischer等，1996)和煙草(WO 01/81600)中這種清除的原理。所用技術(shù)由用含有取向相同的感興趣基因和 其邊界是兩個(gè)相同DNA序列的選擇性標(biāo)記基因的核酸序列轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因 組組成，所述兩個(gè)相同DNA序列的長(zhǎng)度足以激活同源重組系統(tǒng)。通過(guò)在 對(duì)應(yīng)于所用選擇性標(biāo)記基因的第一種選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行 選擇。在選擇培養(yǎng)基中增殖愈傷組織，以獲得所有質(zhì)體基因組含有選擇性 標(biāo)記基因和感興趣基因的同質(zhì)植物。隨后在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物及 其后代，以消除選擇性標(biāo)記基因。
在擬南芥中已經(jīng)使用了對(duì)己經(jīng)清除標(biāo)記基因的植株進(jìn)行選擇的系統(tǒng)， 但它涉及核基因組的轉(zhuǎn)化(WO 01/96583)。在這種方法中，用在陽(yáng)性選擇性 標(biāo)記基因和陰性選擇性標(biāo)記基因周圍含有取向相同的兩個(gè)拷貝的感興趣 基因的載體轉(zhuǎn)化植物。陽(yáng)性選擇性標(biāo)記基因能夠選擇將轉(zhuǎn)基因摻入其基因 組的事件。存在兩個(gè)拷貝的感興趣基因使得可能通過(guò)同源重組清除這兩種 (陽(yáng)性和陰性)選擇性標(biāo)記基因，同時(shí)清除兩個(gè)拷貝感興趣基因中的一個(gè)拷 貝。然后，通過(guò)在陰性選擇性標(biāo)記上培養(yǎng)選擇已經(jīng)經(jīng)過(guò)這種同源重組的事 件，陰性選擇性標(biāo)記能阻止仍然含有相應(yīng)選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞生長(zhǎng)。這 種陰性選擇性標(biāo)記基因的例子是CooL4(大腸桿菌(&c/zen'cWa co/0胞嘧啶脫 氨酶)，它使5-氟胞嘧啶(非毒性)脫氨形成有毒的5-氟尿嘧啶。
在本申請(qǐng)內(nèi)容中，作者成功開(kāi)發(fā)了一種方法，其包括在質(zhì)體轉(zhuǎn)化過(guò)程 中選擇已清除標(biāo)記基因的植株。此方法能夠可靠地獲得存在感興趣基因和 不存在選擇性標(biāo)記(特別是抗生素選擇性標(biāo)記)的同質(zhì)事件。該方法也具 有以下優(yōu)點(diǎn)感興趣基因的表達(dá)與標(biāo)記基因的清除有關(guān)并依賴于標(biāo)記基因 的清除，以及這種清除在重組期間除了感興趣基因以外不會(huì)留下任何其它 外源性DNA。該方法也有以下顯著優(yōu)點(diǎn)當(dāng)感興趣基因的表達(dá)提供了選擇 性特征時(shí)，促進(jìn)或加速感興趣基因存在同質(zhì)植物的生產(chǎn)。例如，當(dāng)感興趣 的基因是耐受除草劑如異嚼唑草酮、草甘膦或草胺膦(Basta)的基因時(shí)，就 是這種情況。


圖1:質(zhì)粒pCLT146的圖譜 發(fā)明詳述
本發(fā)明主題是獲得不含選擇性標(biāo)記，特別是抗生素選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì) 體植物的方法，所述方法至少包括以下步驟
a) 用適合轉(zhuǎn)化質(zhì)體的載體轉(zhuǎn)化至少一個(gè)植物細(xì)胞，所述載體在轉(zhuǎn)錄方
向上包含對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含編碼對(duì)選擇劑
產(chǎn)生抗性的選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因(ii)、與序列(i)的3'部分相同的n 個(gè)核苷酸的片段(iii)、對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv);
b) 在含有選擇劑的第一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)包含轉(zhuǎn)化質(zhì)體的細(xì)胞；
c) 在不含選擇劑的第二種培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞。
應(yīng)理解，按照本發(fā)明，上述方法的步驟a)所用載體不包含完整形式的 感興趣的嵌合基因。
術(shù)語(yǔ)"完整形式的感興趣的嵌合基因"或"完整的感興趣的嵌合基因" 指感興趣的基因的非截短序列。
在具體實(shí)施方式
中，n代表至少25個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少30個(gè)，優(yōu)選 至少50個(gè)核苷酸。
術(shù)語(yǔ)"適用于轉(zhuǎn)化植物的載體"可以指(例如)包含用于與植物質(zhì)體組同 源重組的兩個(gè)區(qū)域的轉(zhuǎn)化載體，這兩個(gè)區(qū)域形成如本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建 物或構(gòu)建物的邊界。
定位于所述基礎(chǔ)嵌合基因上游(LHRR)和下游(RHRR)的這些區(qū)域，能 夠與含毗連LHRR和RHRR區(qū)的質(zhì)體組的基因間區(qū)進(jìn)行雙同源重組。
優(yōu)選地，本發(fā)明的兩個(gè)同源重組區(qū)對(duì)應(yīng)于能夠?qū)⑶逗匣蛘先胭|(zhì)體 組基因間區(qū)的毗連序列。在具體實(shí)施方式
中，此區(qū)域?qū)?yīng)于質(zhì)體組核糖體 RNA操縱子的區(qū)域。在另一具體實(shí)施方式
中，此基因間區(qū)包括編碼Rubisco 大亞基的rbcL基因的3，末端和包括編碼乙?；?CoA-羧化酶的亞基的accD 基因的5'末端的另一個(gè)同源序列。此外，更具體說(shuō)，此基因間區(qū)包括對(duì)應(yīng) 于普通煙草Petit Havana變種(W. to6acwm cv. Petit Havana)質(zhì)體組的核苷酸 57755-59297的編碼Rubisco大亞基的r6cL基因的3，末端，，另一同源序列 包括對(duì)應(yīng)于普通煙草Petit Havana變種質(zhì)體組的核苷酸59298-60526的 accD基因的5'末端，。
術(shù)語(yǔ)"感興趣嵌合基因的其余3'部分"指序列(i)和序列(iv)在轉(zhuǎn)錄方向 上并列重建了整個(gè)感興趣的嵌合基因。
術(shù)語(yǔ)"感興趣的嵌合基因"指一種核苷酸序列，其包含在質(zhì)體中有功能 的調(diào)控啟動(dòng)子序列、編碼感興趣蛋白的序列和在植物細(xì)胞質(zhì)體中有功能的 終止子，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄方向上彼此功能性連接。
術(shù)語(yǔ)"包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因"指一種核苷酸序列，其 包含在質(zhì)體中有功能的調(diào)控啟動(dòng)子序列、編碼選擇性標(biāo)記的序列和在植物 細(xì)胞質(zhì)體中有功能的終止子，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄方向上彼此功能性連接。
術(shù)語(yǔ)"嵌合基因"通常指其中某些元件不存在于天然基因中，但取代了 天然基因中存在的元件或加入了某些元件的基因。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"嵌合基因"也可對(duì)應(yīng)于天然基因中存在所有基因元 件的情況，或者，術(shù)語(yǔ)"基因"可對(duì)應(yīng)于嵌合基因。
也可存在其作用在于提高轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)或功能的其它元件，如內(nèi)含
子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化序列和衍生物，以提高基因表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)"彼此功能性連接"指所述嵌合基因元件以彼此相連的方式使它 們的功能協(xié)調(diào)且能表達(dá)編碼序列。例如，當(dāng)能確保所述編碼序列表達(dá)時(shí)， 將啟動(dòng)子與編碼序列功能性連接。構(gòu)建本發(fā)明嵌合基因和其各種元件的裝
配可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)完成，具體如Sambrook等(1989,《分 子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Nolan C. 編輯,，New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述技術(shù)。組成嵌合 基因的調(diào)控元件的選擇主要取決于它們必須在其中起作用的植物和質(zhì)體 的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇在給定植物中起作用的調(diào)控元件D
在植物細(xì)胞的質(zhì)體中有功能和可用于實(shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子中，可以提 及(例如)編碼PSII的Dl蛋白的基因的啟動(dòng)子(Staub等，1993，EMBO Journal 12(2): 601-606)或核糖體RNA操縱子Prrn的組成性啟動(dòng)子(Staub 等，1992， PlantCell 4: 39-45)或與煙草r^L基因5'非翻譯區(qū)的5'部分結(jié) 合的煙草Prrn啟動(dòng)子(Svab等，1993，尸roc. AW/. Jcad 90: 913-917)。 通常，衍生自植物質(zhì)體組基因或細(xì)菌基因的任何啟動(dòng)子都合適，本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠在可獲得的各種啟動(dòng)子中作出合適的選擇，以獲得所需表達(dá)方 法(組成型或誘導(dǎo)型)。
在植物細(xì)胞的質(zhì)體中有功能的終止子中，可以提及(例如)戸W基因的 終止子、編碼Rubisco大亞基的AcL基因或編碼煙草核糖體蛋白的 基因(Shinozaki等，1986; Staub等，1993)。
包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因可用于選擇有效轉(zhuǎn)化的質(zhì)體 和細(xì)胞，即將嵌合基因摻入其質(zhì)體組的質(zhì)體和細(xì)胞。通過(guò)在含有選擇劑的 培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織選擇轉(zhuǎn)化子。
常用的選擇性標(biāo)記基因包括編碼對(duì)抗生素、除草劑或其它化合物有抗 性的基因的基因，這些物質(zhì)可能對(duì)不表達(dá)抗性基因或等位基因的細(xì)胞、細(xì) 胞器或組織是致命的。那么，選擇劑是相應(yīng)的抗生素、除草劑或選擇性化 合物。如果所述物質(zhì)對(duì)細(xì)胞是致命的，那么在這種培養(yǎng)基上只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞 能存活并發(fā)展，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞會(huì)死亡。如果選擇劑對(duì)細(xì)胞不致命，就根據(jù) 可能顯示出的不同行為區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
選擇性標(biāo)記可能在細(xì)胞水平不致命，但在細(xì)胞器水平致命。例如，抗 生素壯觀霉素在質(zhì)體中，而非胞質(zhì)中抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。含有非抗
性質(zhì)體的組織會(huì)發(fā)白，而含有抗性質(zhì)體的組織為綠色。在含有轉(zhuǎn)化質(zhì)體和 非轉(zhuǎn)化質(zhì)體的分裂細(xì)胞中，對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)體有利的是，在選擇壓力下非轉(zhuǎn)化質(zhì) 體會(huì)消失，可獲得僅含轉(zhuǎn)化質(zhì)體的細(xì)胞群體。
術(shù)語(yǔ)"選擇性標(biāo)記基因"指編碼選擇性標(biāo)記的基因，或編碼選擇性標(biāo)記 的嵌合基因。
在可采用的編碼選擇性標(biāo)記的基因中，可以提及抗生素壯觀霉素-鏈 霉素和卡那霉素的抗性基因，例如，編碼氨基糖苷3"-腺苷轉(zhuǎn)移酶的嵌合 基因^W(Svab等，1993)和編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的"eo(Carrer等，1993)， 還有甜菜醛耐受基因，如編碼甜菜醛脫氫酶的基因(Daniell等，2001)，還 有除草劑耐受基因，如雙丙氨膦耐受基因bar基因(White等，19卯，Nucleic Acids Res. 18(4):1062)，或草甘膦耐受基因基因(美國(guó)5,188,642)。 也可采用編碼易于鑒定的酶如GUS酶((3-葡糖醛酸糖苷酶)(Staub等，1993) 或GFP(綠色熒光蛋白)(Sidorov等，1999)的報(bào)道基因，或編碼色素或在轉(zhuǎn) 化細(xì)胞中調(diào)節(jié)色素產(chǎn)生的酶的基因。專利申請(qǐng)WO 91/02071 、 WO 95/06128、 WO 96/38567、 WO 97/04103和WO 01/64023中具體描述了這 些基因。
優(yōu)選地，編碼選擇性標(biāo)記的基因是抗生素抗性基因。編碼選擇性標(biāo)記 的優(yōu)選基因是編碼對(duì)鏈霉素和壯觀霉素產(chǎn)生抗性的氨基糖苷3"-腺苷轉(zhuǎn)移 酶的flflt/j基因(Svab等，1993)。
根據(jù)本發(fā)明，包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因的任一側(cè)與同一 感興趣嵌合基因的兩個(gè)片段相接，使得這兩個(gè)片段在轉(zhuǎn)錄方向上的并列重 建了感興趣的嵌合基因。這兩個(gè)片段是對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的5'部分的 序列(i)和對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)。此外，與序列(i) 的3'部分相同的n個(gè)核苷酸的片段存在于包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌 合基因(ii)和對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)之間。此n個(gè) 核苷酸的片段對(duì)應(yīng)于感興趣基因的第一個(gè)片段的3'端，其側(cè)接于包含編碼 選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因的5'端，且此片段在感興趣基因的第二個(gè)片 段的5'端上重復(fù)，其側(cè)接于包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因的3， 端。依此方式，感興趣基因的n個(gè)核苷酸的直接重復(fù)序列框定了包
化側(cè)接于編碼選擇性標(biāo)記的嵌合基因的兩個(gè)相同片段間同源重組系統(tǒng)的 大小。這兩個(gè)相同片段之間的同源重組引起包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的
嵌合基因的切除，和n個(gè)核苷酸的兩個(gè)相同片段之一的切除，并引起感興
趣的完整和功能性嵌合基因的重建，隨后該嵌合基因可在細(xì)胞中表達(dá)。 可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明構(gòu)建，具體說(shuō)，如
Sambrook等(1卿，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)， Nolan C.編，New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press)所述。也可用常規(guī)化學(xué)合成技術(shù)完全或部分地合成或產(chǎn)生。
直接重復(fù)序列是重復(fù)的核酸序列，其重復(fù)序列與原始序列的取向相 同，而不是反向。
優(yōu)選地，在包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因任一側(cè)的重復(fù)序列 是至少有50個(gè)核苷酸的序列，更優(yōu)選至少有100個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)質(zhì)體植物"t旨將質(zhì)體，特別是葉綠體中有功能的 嵌合基因穩(wěn)定整合入其質(zhì)體組的植物。質(zhì)體組由除核以外的細(xì)胞器的基因 組，特別是葉綠體基因組組成。
可通過(guò)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的任何方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在可用于獲得本發(fā)明轉(zhuǎn)化 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法中， 一種方法由將待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織與聚乙二醇 (PEG)和轉(zhuǎn)化載體相接觸組成(Chang禾B Cohen， 1979， Mo/. Gew. 168(1)， 111-115; Mercenier和Chassy， 1988， Biochimie 70(4)， 503-517)。 電穿孔是另一種方法，它由將電場(chǎng)施加于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織組成 (Andreason禾口 Evans ， 1988， 說(shuō)'ofcc/2m々we51 6(7)， 650-660; Shigekawa禾口 Dower， 1989， Aust， J.胸ec/wo/. 3(1)， 56-62)。另一種方法由直接通過(guò) 顯微注射將載體注射入細(xì)胞或組織組成(Gordon和Ruddle， 1985， Gene 33(2)， 121-136)。也可通過(guò)土壤桿菌G4gra6flcto7'ww)種的細(xì)菌進(jìn)行植物細(xì) 胞或組織的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選用經(jīng)遺傳修飾的根癌土壤桿菌(A ^me,c,era)(Knopf， 1979， Sw6ce〃.說(shuō)'oc/ze肌6， 143-173; Shaw等，1983， Gene 23(3):315-330)或毛根土壤桿菌04. W2/z0ge"e力(Bevan和Chilton， 1982， Gen". 16:357-384; Tepfer禾口 Casse陽(yáng)Delbart， 1987， A//cra6,o/. Sc/. 4(1)， 24-28)感染所述植物的細(xì)胞或組織，從而允許T-DNA特異性耙向質(zhì) 體。優(yōu)選地，按照Ishida等所述方法(1996， 5/Wec/z"o/. 14(6)， 745-750)用根癌土壤桿菌(^gro6acten^w ^we/ac/era)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式，將采用稱為粒子轟擊或生物射彈法 的方法。該方法由用吸附有本發(fā)明載體的顆粒轟擊組織組成(Bruce等， 1989，扁.Jcfld園86(24)， 9692-9696; Klein等，1992， 所otec/z"o/ogy 10(3)， 286-291;美國(guó)專利號(hào)4,945,050)。
轉(zhuǎn)化后，用含有對(duì)應(yīng)于所用選擇性標(biāo)記基因的選擇劑的第一培養(yǎng)基進(jìn) 行選擇步驟，該步驟能夠選擇將外源性DNA整合入質(zhì)體基因組的轉(zhuǎn)化事 件。例如，如果基因用作選擇性標(biāo)記基因，所用的選擇培養(yǎng)基將含 有壯觀霉素和/或鏈霉素。在維持此壯觀霉素和/或鏈霉素選擇的情況下， 能夠在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的物質(zhì)會(huì)增殖和/或再生，從而獲得在所有質(zhì)體基因 組中含有外源性DNA的組織或植物。
在后續(xù)步驟中，將第一培養(yǎng)基上選擇的細(xì)胞或組織置入稱為非選擇性 培養(yǎng)基的第二培養(yǎng)基中，從而能夠清除編碼選擇性標(biāo)記的基因并通過(guò)重復(fù) 序列之間的重組獲得感興趣的完整的功能性基因?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)選擇 劑的敏感性，和/或檢測(cè)感興趣基因的表達(dá)，和/或采用分子生物學(xué)技術(shù)如 Southern印跡型雜交和PCR技術(shù)來(lái)證明是否清除了選擇性標(biāo)記。
術(shù)語(yǔ)"非選擇性培養(yǎng)基"指不含選擇劑的培養(yǎng)基。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所用的培養(yǎng)基，尤其是Gamborg等(1968， Exptl Cell Res 50， 151陽(yáng)158)和Murashige等(1962， Physiologia Plantarum 15，
473-497)所述的培養(yǎng)基。
"感興趣的完整的功能性基因"指能夠表達(dá)并編碼肽或功能性蛋白質(zhì) 的感興趣基因。此外，根據(jù)本發(fā)明，它是通過(guò)同源重組切除編碼選擇性標(biāo) 記的基因后重建的基因。
感興趣基因可以是引入植物的任何基因，從而賦予其具體優(yōu)勢(shì)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，感興趣基因編碼產(chǎn)生不同于選擇性標(biāo)記 所提供特征的選擇性特征的肽或蛋白質(zhì)。
在此具體實(shí)施方式
中，通過(guò)在含有對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的選擇劑的 培養(yǎng)基上進(jìn)行額外選擇的步驟，可有益地改進(jìn)獲得本發(fā)明轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方 法。
額外選擇步驟可與本發(fā)明方法的步驟c)一起進(jìn)行，然后在不含對(duì)應(yīng)于 選擇性標(biāo)記的選擇劑和含有對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的選擇劑的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)細(xì)胞。
或者，在不含對(duì)應(yīng)于選擇性標(biāo)記的選擇劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)步驟之 后，在含有對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的選擇劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇步驟。
在所有情況下，這種在含有對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的選擇劑的培養(yǎng)基 上的額外選擇步驟是在含有對(duì)應(yīng)于選擇性標(biāo)記的選擇劑的第一培養(yǎng)基上 的選擇步驟(b)之后進(jìn)行的。
在此具體實(shí)施方式
中，獲得不含選擇性標(biāo)記，尤其是抗生素選擇性標(biāo) 記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方法至少包括以下步驟
a) 用適合轉(zhuǎn)化質(zhì)體的載體轉(zhuǎn)化至少一個(gè)植物細(xì)胞，所述載體在轉(zhuǎn)錄方 向上包含對(duì)應(yīng)于產(chǎn)生不同于選擇性標(biāo)記所提供特征的選擇性特征的感興 趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含編碼對(duì)選擇劑產(chǎn)生抗性的選擇性標(biāo)記 的序列的嵌合基因(ii)、與序列(i)的3'部分相同的n個(gè)核苷酸的片段(iii)、
對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv);
b) 在含有對(duì)應(yīng)于選擇性標(biāo)記的選擇劑的第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)包含轉(zhuǎn)化
質(zhì)體的細(xì)胞；
c) 在不含對(duì)應(yīng)于選擇性標(biāo)記的選擇劑和含有對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因
的選擇劑的第二培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞。
應(yīng)理解，按照本發(fā)明，上述方法步驟a)所用的載體不含完整形式的感 興趣嵌合基因。
在另一具體實(shí)施方式
中，在步驟b)和步驟c)之間進(jìn)行步驟b')，此步 驟b')由在既不含對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的選擇劑、也不含對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因 的選擇劑的第三種培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞組成。
術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)生選擇特征的感興趣嵌合基因"指編碼產(chǎn)生特定特征的肽或 蛋白質(zhì)的感興趣基因，使得能夠通過(guò)對(duì)應(yīng)于此特定特征的選擇劑的方式選 擇表達(dá)此肽或此特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞或質(zhì)體。這種基因通常是對(duì)植物細(xì)胞致 命的化合物的抗性基因。
通常，可采用能夠在植物細(xì)胞上對(duì)所述植物細(xì)胞的致命性化合物產(chǎn)生 抗性的任何基因或基因類群。此外，對(duì)所述化合物的抗性可由通過(guò)修飾其 結(jié)構(gòu)使所述化合物解毒組成，所述修飾導(dǎo)致所述化合物致命作用的消除。
在這種情況下，感興趣基因通常編碼解毒酶。解毒酶的例子是對(duì)溴苯腈或
basta耐受的酶(EP242 236， EP337 899)?？剐砸部捎蓪?duì)所述化合物的耙點(diǎn) 脫敏而產(chǎn)生的抗性組成。在這種情況下，感興趣基因通常編碼修飾的功能 靶點(diǎn)，通過(guò)突變、添加或缺失特定氨基酸的方式修飾其肽結(jié)構(gòu)使其對(duì)所述 化合物不敏感。對(duì)除草劑或其活性代謝物敏感性較低的功能酶的例子是草 甘膦-耐受酶(EP293 356， Padgette S.R.等，J. S/(9丄.， 266,33， 1991; FR 2 736 926)?？剐砸部捎擅舾忻傅倪^(guò)度表達(dá)組成，從而使得從此酶對(duì)除 草劑的動(dòng)力學(xué)常數(shù)來(lái)看在植物中產(chǎn)生足量的靶酶，，從而具有足量的功能 酶，盡管存在抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，產(chǎn)生選擇性特征的感興趣嵌合基因是除 草劑抗性基因。
更優(yōu)選地，產(chǎn)生選擇性特征的感興趣嵌合基因編碼羥基苯基丙酮酸雙 加氧酶(HPPD)。
羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)是催化對(duì)羥基苯基丙酮酸(HPP)轉(zhuǎn)化 為尿黑酸的反應(yīng)的酶(CrouchN.R等，Tetrahedron, 53， 20， 6993-7010， 1997)。
術(shù)語(yǔ)"HPPD"指具有HPPD活性的任何天然、突變或嵌合的HPPD酶。 文獻(xiàn)中描述了許多HPPD，具體是細(xì)菌如假單胞菌(i^^fow朋ay)(Riietschi 等，五""腸cAem.， 205， 459-466， 1992， WO 96/38567)、植物如擬南芥 (WO 96/38567， Genebank AF047834)或胡蘿卜(WO 96/38567， Genebank 87257)、 Cocc/co咖(Genebank COITRP)或哺乳動(dòng)物如人、小鼠或豬的 HPPD。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"突變的HPPD"指與對(duì)應(yīng)天然HPPD相比通過(guò)突變獲 得耐受HPPD-抑制性除草劑的特性更高的HPPD。突變的HPPD宜為C末 端部分突變的HPPD，如專利申請(qǐng)WO 99/24585所述。突變的HPPD宜包 含突變W336，如專利申請(qǐng)WO 99/24585所述。
術(shù)語(yǔ)"嵌合HPPD"指含有來(lái)自各種HPPD的元件的HPPD，具體是專 利申請(qǐng)WO 99/24586所述的嵌合HPPD。
HPPD宜為熒光假單胞菌(尸化wc/omo"oy ^/7womsce"力HPPD (WO 96/38567)。
而且，抑制此酶的某些分子(連接于該酶以抑制HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸)
是已知的。 一些這種分子可用作除草劑，它們抑制植物中的反應(yīng)，導(dǎo)致所 處理植物的葉被漂白、所述植物死亡(Pallett K.E.等，1997尸e幼'c. 50 83-84)。本領(lǐng)域所述的這種以HPPD為耙點(diǎn)的除草劑尤其是異嗯唑(EP418 175、 EP 470 856、 EP 487 352、 EP 527 036、 EP 560 482、 EP 682 659、 US 5 424 276)，具體是對(duì)玉米有選擇性的除草劑異惡唑草酮(IFT); 二酮腈 (diketonitrile)或DKN(EP 496 630， EP 496 631),具體是2-氰基-3-環(huán)丙基 -l-(2-S02CH3-4-CF3苯基)丙垸-1,3- 二酮禾卩2-氰基-3-環(huán)丙基 -l-(2-S02CH3-4-2,3-Cl2-苯基)丙垸-l,3-二酮；三酮(EP 625 505， EP 625 508， US 5,506,195)，具體是磺草酮或甲基磺草酮；或者吡唑啉酸(pyrazolinates)。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式，產(chǎn)生選擇性特征的感興趣嵌合基因 編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。
EPSPS是參與莽草酸生物合成途徑的質(zhì)體酶，導(dǎo)致合成芳族氨基酸。 已知EPSPS是膦酰基甲基甘氨酸類型的膦酸家族的除草劑的耙酶。
己知編碼在天然情況下耐受膦?；谆拾彼峒易宄輨?具體是草 甘膦)或以此形式使用的EPSPS的序列。例如，編碼耐受性EPSPS酶的基 因，可以提及鼠傷寒沙門(mén)菌(Sa/mo"e〃a (y/^/mw/"m)的」ra^基因的序列 (Comai等，1983， Science 221， 370-371)、 土壤桿菌04grakzcfe〃'wm)的C尸4 基因的序歹i」(WO 92/04449)或編碼矮牽牛花(Shah等，1986， Sc/ee 233， 478-481)、番茄(Gasser等，1988， /5z'o/. C7zem. 263， 4280-4289)或牛筋草 (WO 01/66704)的EPSPS的基因序列。
也已知編碼經(jīng)過(guò)突變對(duì)草甘膦耐受的EPSPS的序列。例如，可以提 及編碼細(xì)菌來(lái)源(Stalker等，1985， J說(shuō)o/. Ozem. 260(8)， 4724-4728)或植 物來(lái)源(EP 0293358; Ruff等，1991，尸/滅96(S), Abstract 592; WO 91/04323; WO 92/06201; EP 0837944)的突變EPSPS的基因序列。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式，產(chǎn)生選擇性特征的感興趣嵌合基因是 ter基因，它產(chǎn)生對(duì)除草劑如草胺膦(Basta)的抗性(Lutz等，2001)。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)重組切除選擇性標(biāo)記基因，這種切除可以重建完整 的感興趣嵌合基因，隨后該基因可表達(dá)并產(chǎn)生有功能的感興趣蛋白質(zhì)。在 含有能使此肽或此蛋白的產(chǎn)生賦予選擇性優(yōu)勢(shì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞或組織，從而選擇表達(dá)感興趣基因的質(zhì)體。在細(xì)胞分裂時(shí)，未切 除選擇性標(biāo)記的質(zhì)體在選擇壓力下將消失，有利于(選擇)切除了選擇性標(biāo) 記的質(zhì)體，與不進(jìn)行基于感興趣基因的重建而選擇時(shí)相比，可以更迅速地 獲得存在感興趣基因和不存在選擇性標(biāo)記的同質(zhì)細(xì)胞群體。
術(shù)語(yǔ)"同質(zhì)植物、細(xì)胞或組織"指僅含轉(zhuǎn)化質(zhì)體組的植物、細(xì)胞或組織， 即不含任何野生型質(zhì)體的植物、細(xì)胞或組織。
本發(fā)明也涉及在轉(zhuǎn)錄方向上包含以下部分的遺傳構(gòu)建或構(gòu)建物
對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的5'部分的序列(i)，
包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因(ii)，
與序列(i)的3'部分相同的n個(gè)核苷酸的片段(iii)，
對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)。
應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建或構(gòu)建物不含完整的感興趣嵌合基 因。切除包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因后重建此完整的感興趣嵌 合基因。
本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)錄方向上包含以下部分的遺傳構(gòu)建或構(gòu)建物對(duì)應(yīng)于
感興趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基 因(ii)、與序列(i)的3'部分相同的n個(gè)核苷酸的片段(iii)、對(duì)應(yīng)于感興趣嵌 合基因的其余3'部分的序列(iv)，序列(ii)的位置5'中不存在所述序列(iv)。 根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
，構(gòu)建物在轉(zhuǎn)錄方向上包含，對(duì)應(yīng)于編碼產(chǎn) 生不同于選擇性標(biāo)記所提供特征的選擇性特征的肽或蛋白質(zhì)的感興趣嵌 合基因的5'部分的序列(i)、包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因(ii)、與 序列(i)的3'部分相同的n個(gè)核苷酸的片段(iii)，和對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因 的其余3'部分的序列(iv)。
應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明，所述構(gòu)建物不含完整的感興趣嵌合基因。 實(shí)際上，序列(iv)因此對(duì)應(yīng)于編碼產(chǎn)生不同于選擇性標(biāo)記所提供特征 的選擇性特征的肽或蛋白質(zhì)的感興趣嵌合基因的其余3'部分。序列(i加勺5， 位置中不存在序列(iv)。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，感興趣基因是除草劑抗性基因。 更優(yōu)選地，感興趣嵌合基因編碼羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)，編 碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，或編碼基因。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生構(gòu)建物的方法，所述方法至少包括以下步驟 a) 將含有編碼選擇性標(biāo)記的嵌合基因的序列(ii)引入編碼感興趣嵌合
基因的序列，
b) 在對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)的5'位置中復(fù)制 位于對(duì)應(yīng)于位于序列(ii)5'位置的感興趣嵌合基因5'部分的序列(i)的3'位置 的n個(gè)核苷酸片段(iii)。
本發(fā)明也涉及可通過(guò)上述方法獲得的構(gòu)建物。
本發(fā)明也涉及適用于轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體的轉(zhuǎn)化載體，其特征是它包含本發(fā) 明構(gòu)建物。
本發(fā)明主題也是可通過(guò)上述方法之一獲得的含有感興趣基因且不含 抗生素選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞。
本發(fā)明主題也是可通過(guò)上述方法之一獲得的含有感興趣基因且不含 抗生素選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物或這些植物的一部分，以及這些植物的后 代。
分子生物學(xué)技術(shù)參見(jiàn)Ausubel(編)，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》 (C群e"f尸ratoco/s M /ecw/or傷o/ogy)， John Wiley & Sons Inc. (1994): Maniatis T.， Fritsch E.F.和Sambrook J,《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor,NY (1989)。用Perkin Elmer GeneAmp PCR系統(tǒng)9600裝置進(jìn)行PCR 反應(yīng)。用30個(gè)循環(huán)的過(guò)程進(jìn)行各個(gè)樣品的擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括以下 步驟變性步驟94°C l分鐘，配對(duì)步驟50-60°C45秒(取決于所用引物)， 延伸步驟72°C l-2分鐘(取決于所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的大小)。這些循環(huán)之 前是94'C持續(xù)5分鐘的變性步驟，之后是最終延伸步驟72'C5分鐘。30 個(gè)循環(huán)后4'C保存。用瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物。
按照Shinozki等1986提出并在Genebank登錄號(hào)Z00044下重復(fù)的編 號(hào)方法表示衍生自普通煙草(McW/a"fl totoci/m)質(zhì)體組的各種DNA片段的 位置。
通過(guò)下面的實(shí)施例更具體地說(shuō)明了本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例沒(méi)有 限制性。
實(shí)施例l:用于清除標(biāo)記基因的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
質(zhì)粒pCLT146含有嵌合基因AADA-146和兩個(gè)不完整的嵌合 HPPD-146基因，其邊界是兩個(gè)DNA片段一"RHRR"(右側(cè)同源重組區(qū))禾口 "LHRR"(左側(cè)同源重組區(qū))，這有利于將這些盒整合入煙草質(zhì)體基因組的 n^L-flccZ)區(qū)。LHRR片段對(duì)應(yīng)于編碼Rubisco大亞基的Ac丄基因的3，端， RHRR片段對(duì)應(yīng)于accD基因的5'端，專利FR 2848568-A1中對(duì)它們進(jìn)行 了描述。
質(zhì)粒pCLT146在轉(zhuǎn)錄方向上包含對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因/^;7J的5， 部分的序列(i)HPPD-146a，包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因 (ii)AADA-146，包含與序列(i)3'部分相同的序列(iii)的片段HPPD-146b和 對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因/2/7/^的其余3'部分的序列(iv)。
自5'-3'來(lái)看，嵌合基因AADA-146由核糖體RNA操縱子的啟動(dòng)子 ("尸/777"，普通煙草質(zhì)體組的核苷酸102 564-102 680)、 Ac丄基因的5'轉(zhuǎn)錄 和非翻譯區(qū)的一部分("5Wci:"，普通煙草質(zhì)體組的核苷酸57 577-57 594)、 其產(chǎn)物能產(chǎn)生壯觀霉素抗性的a"fl^基因的編碼序列(Svab和Maliga， 1993) 和r戸M基因終止子('Tr戸76"，普通煙草質(zhì)體組的核苷酸4930-50卯)組成。 其兩側(cè)側(cè)接有兩個(gè)不完整的嵌合基因HPPD-146a和HPPD-146b。 HPPD-146a位于AADA-146的5'端，在5'-3'方向上包含戸M基因啟動(dòng)子 ("尸/wW， FR 2848568-Al)和熒光假單胞菌的/7p/^基因的5'端(W0 98/02562;序列1;核苷酸l-579)(圖1)。 HPPD-146b位于AADA-146的3， 端，在5，-3'方向上包含與HPPD-146a的3'端相同且對(duì)應(yīng)于/zp/^基因編碼 區(qū)的核苷酸177-579的序列(iii)，和對(duì)應(yīng)于/^;%/基因編碼序列的其余3'部 分(核苷酸580-1077)和；^v^基因終止子('？'/75M"， FR 2848568-Al)的序 歹U(iv)。 AADA-146盒兩側(cè)作為直接重復(fù)存在的相同序列(iii)使得能夠通過(guò) 同源重組清除嵌合標(biāo)記基因AADA-146和重建完整的感興趣嵌合基因 HPPD國(guó)146。
實(shí)施例2:用生物射彈法轉(zhuǎn)化煙草質(zhì)體基因組
在無(wú)菌條件下在添加維生素Gamborg B5 (Kalys M231-l)和蔗糖(30 g/1) 的MS培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog R ， 1962)上培育普通煙草Petit Havana 變種。按照Finer等(1992)所述技術(shù)用"PIG"(顆粒流入槍)在下表面上轟擊 3-5 cm的葉片。在存在CaCl2(0.8-l M)和亞精胺(14-16 mM)的條件下將金
微粒(0.6pm的微粒)與DNA(5嗎/發(fā)射)復(fù)合。然后放下轟擊的葉片，使轟 擊的下表面位于補(bǔ)充有0.05 mg/1 a-萘乙酸(NAA; Sigma)、 2 mg/1 6-節(jié)基氨 基嘌呤(BAP; Sigma)、 30 g/1蔗糖和7 g/1植物瓊脂的MS培養(yǎng)基(MS 0.05-2 培養(yǎng)基)上。轟擊后2-3天，將轟擊的葉片切成5 mm見(jiàn)方的方塊(如專利 FR2848568-A1所述)，仍然以下表面朝下的方式放在含有500 mg/1 二鹽酸 壯觀霉素的MS 0.05-2培養(yǎng)基上。在相同培養(yǎng)基上再生對(duì)壯觀霉素有抗性 的愈傷組織和芽，使其在含有1/2 MS、 15 g/1蔗糖和500 mg/1壯觀霉素的 培養(yǎng)基上生根，以獲得TO植株(對(duì)應(yīng)于第一個(gè)再生循環(huán)，稱為R1)。為了 促進(jìn)清除過(guò)程，在不含選擇劑的MS 0.05-2培養(yǎng)基上進(jìn)行第二個(gè)再生循環(huán)。 使再生芽(稱為R2事件)在含有WMS、 15 g/1蔗糖和各種濃度的DKN的培 養(yǎng)基上生根。將TORI和T0R2植株轉(zhuǎn)移到溫室中。第一代種子(獲自TORI 或T0R2植株)是T1代。
實(shí)施例3: CLT146轉(zhuǎn)質(zhì)體品系的產(chǎn)生和分子分析
在實(shí)施例2所述的實(shí)驗(yàn)條件下用pCLT146質(zhì)粒轟擊普通煙草(Petit Havana變種)葉片。最初在壯觀霉素(500 mg/l)上進(jìn)行轉(zhuǎn)化的愈傷組織的選 擇的第一個(gè)步驟(參見(jiàn)實(shí)施例2)。在20次發(fā)射的實(shí)驗(yàn)后獲得13個(gè)壯觀霉素 耐受事件(CLT146-1至-13)。
用PCR在13個(gè)耐受事件中鑒定轉(zhuǎn)質(zhì)體品系，通過(guò)設(shè)計(jì)特定引物鑒定 嵌合基因AADA-146和HPPD-146是否整合入質(zhì)體組。經(jīng)過(guò)選擇，使一條 引物與整合點(diǎn)鄰近的天然質(zhì)體基因組雜交，而另一條引物與嵌合基因雜 交。選擇以下引物ORBCL52(5，-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3')和 psbA176R(5，-catcagggactcccaagcacactag -3，)，它們分別與質(zhì)f本組上的Ac丄 基因(核苷酸57595-57620)和嵌合基因HPPD-146的尸，M啟動(dòng)子雜交。僅 在轉(zhuǎn)質(zhì)體品系中觀察到大小對(duì)應(yīng)于預(yù)計(jì)片段的PCR產(chǎn)物，在非轟擊野生型 煙草植株中沒(méi)有觀察到這種產(chǎn)物。通過(guò)pCLT146轉(zhuǎn)化獲得的這13個(gè)壯觀 霉素耐受事件都顯示出，嵌合基因插入了煙草質(zhì)體組。
通過(guò)PCR分析驗(yàn)證轉(zhuǎn)質(zhì)體事件中存在兩個(gè)嵌合基因。分別雜交于 aaW 基因編碼區(qū)的 5'禾B 3' 端的引物 OAAN5(5，-gaagcttccatggcagaagcggtgatcgccgaag-3，) 禾口 OAAXba3(5，-actagttctagattatttgccgactaccttggtgatctcgcc-3')"(吏個(gè)尋會(huì)巨夠在所有CLT146轉(zhuǎn)質(zhì)體事件中擴(kuò)增784 bp PCR產(chǎn)物。雜交于恰好在序列(iii)上游的 序列(i)的HPPD+(5 ，-caacagcatcgcctcctactttgcg-3')和雜交于序列(iii)的3 ，端 的HPPD-(5'-ttcacggaagttgaacaatttctcg-3，)的引物對(duì)能夠從總DNA中擴(kuò)增兩 種預(yù)計(jì)的PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于含有被嵌合基因AADA-146打斷的嵌合基因 HPPD-146的轉(zhuǎn)質(zhì)體組的1876 bp的DNA片段和對(duì)應(yīng)于序列(iii)的373 bp 的PCR產(chǎn)物。
可通過(guò)PCR用分別結(jié)合于P;wW啟動(dòng)子和3'"M終止子的寡核苷酸 對(duì) psbA230F(5，-tttgtagaaaactagtgtgcttggg國(guó)3，) 禾n 3'psbA
(5，-ttgctcctttcttttcaaaacctcc-3，)證明同源重組產(chǎn)生的標(biāo)記基因清除現(xiàn)象。觀察 到兩種PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于含有被AADA-146基因打斷的嵌合基因 HPPD-146的轉(zhuǎn)質(zhì)體組的2689 bp的DNA片段和對(duì)應(yīng)于可能通過(guò)同源重組 清除了嵌合基因AADA-146并重建/^;^基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體組的1186 bp的PCR 產(chǎn)物。
實(shí)施例4:清除CLT146轉(zhuǎn)質(zhì)體品系中的選擇性標(biāo)記基因并評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)質(zhì) 體品系的體外DKN耐受
在含有壯觀霉素的培養(yǎng)基上初步選擇整合有嵌合基因AADA-146的 轉(zhuǎn)質(zhì)體事件。將壯觀霉素上再生的各T0R1轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的葉片切碎，放置 在不含選擇劑的MS 0.05-2再生培養(yǎng)基上大約一個(gè)月。后一步驟能夠再生 不僅在細(xì)胞分裂過(guò)程中通過(guò)同源重組清除了轉(zhuǎn)基因質(zhì)體組AADA-146,而 且獲得重建和有功能的嵌合/z;;/^基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物(T0R2)。然后通過(guò)移植 在含有1 ppm DKN的生根培養(yǎng)基上對(duì)各種品系的T0R2轉(zhuǎn)質(zhì)體小植株的耐 受性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。對(duì)于所測(cè)試的各轉(zhuǎn)質(zhì)體品系而言，不像野生型植株， 一些小植株對(duì)1 ppmDKN完全耐受。這些植株保持綠色、能夠生長(zhǎng)并正常 生根。沒(méi)有觀察到植物毒性癥狀。
實(shí)施例5: TORI轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的Tl后代對(duì)DKN的耐受
從自花授粉的TORI轉(zhuǎn)質(zhì)體植物收集約500粒對(duì)應(yīng)于Tl代的 CLT146-1、 -2、 -3事件的種子，將其種在含有10 ppm DKN的MSI/21/2 萌發(fā)培養(yǎng)基中。獲得具有正常綠色表型的小植株并因此獲得其中嵌合基因 AADA-146已被清除的質(zhì)體。
實(shí)施例6: CLT146轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的Western印跡分析出于檢測(cè)清除后重建的HPPD蛋白的目的，在變性條件下用丙烯酰胺
凝膠分離獲自野生型以及CLT146-1和-2轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草植株(TO)的葉片的蛋 白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與熒光假單胞菌HPPD特異性單克 隆抗-HPPD第一抗體一起孵育。Western印跡分析顯示出CLT146提取物中 存在一個(gè)大約40 kDa的條帶，此大小與純化的參比HPPD蛋白相同，在 野生型煙草蛋白質(zhì)提取物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此條帶。
Western印跡分析和DKN-耐受測(cè)試證明，通過(guò)同源重組，已經(jīng)清楚地 發(fā)生了 aflcM標(biāo)記基因的清除，導(dǎo)致在CLT146轉(zhuǎn)質(zhì)體品系中產(chǎn)生重建和有 功能的HPPD蛋白。
實(shí)施例7: TO和Tl代的CLT146轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的Southern印跡分析
總基因組DNA分離自野生型煙草、TO代的CLT146事件(CLT146-1 和CLT146-2)、衍生自CLT146-1和146-2的Tl代植株的葉片，這些植株 是在體外根據(jù)它們對(duì)除草劑DKN的良好耐受性選擇的(T1S la、 lb、 lc、 2a、 2b和2c)，總基因組DNA也分離自衍生自CLT146-1和CLT146-2的 Tl代植株(T1SR)，這些植株是在體外根據(jù)它們對(duì)除草劑DKN的良好耐受 性選擇，然后在存在所述除草劑的條件下下第二次再生的。
用Sacl和Xhol酶消化基因組DNA，在瓊脂糖凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移 到硝酸纖維素膜上。然后，用覆蓋在aadA基因選擇盒兩側(cè)重復(fù)的hppd重 復(fù)區(qū)(核苷酸177-579)的P32-標(biāo)記的放射性探針雜交此膜。
放射性自顯影照片顯示，正如所料，野生型煙草提取物沒(méi)有信號(hào)。對(duì) 于TO代的2個(gè)事件(CLT146-1和CLT146-2)，觀察到兩條主要條帶(2.5 kb 和4.7 kb)，對(duì)應(yīng)于所有構(gòu)建物元件整合入重組質(zhì)體組時(shí)所預(yù)計(jì)的兩個(gè)片 段。此時(shí)還觀察到一條強(qiáng)度較弱的條帶(5.7 kb)，它對(duì)應(yīng)于兩個(gè)重復(fù)hppd 片段的重組。在某些Tl代植株(如CLT146-2b和CLT146-2d)中，僅在除草 劑DKN存在下第二次再生的植物(T1SR)中觀察到存在P1探針檢測(cè)到的單 一條帶。這對(duì)應(yīng)于在所述除草劑存在下在體外第二次再生的植物中已完全 清除標(biāo)記基因，它來(lái)自Tl代。
實(shí)施例8: T1和T2代植株的分子分析以及T2代植株的表型分析
提取由野生型煙草、CLT146-2事件(T0代)以及CLT146-2d和 CLT146-2c植株(TlSR代；體外再生的植株)的幼苗產(chǎn)生的10-20株小植株
的DNA，并用PCR分析，以采用最靈敏的方法驗(yàn)證可能殘留的aadA標(biāo)記 基因拷貝。所用弓l物(5，-gaagcttccatggcagaagcggtgatcgccgaag-3，禾口 5'-ttatttgccgactaccttggtgatctcgcc-3，)使其能夠在aadA基因存在的條件下擴(kuò)增 784 bp片段。
此分析明確顯示出CLT-146-2事件的后代中存在aadA基因。另一方 面，在CLT146-2c和CLT146-2d植株后代中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，這表明T2 代中完全清除了標(biāo)記基因。
體外表型分析顯示，由CLT146-2b、 CLT146-2c和CLT146-2d植株后 代獲得的小植株100%對(duì)壯觀霉素敏感，并且100%對(duì)除草劑DKN有抗性。
這些結(jié)果顯示了從T2代或者甚至是T1代中完全和迅速地有效清除標(biāo) 記基因。
參考文獻(xiàn)
*Andreason和Evans,歷她c/zm々^y (5(7」(1988), 650-660
*Bevan和Chilton, J朋w. Wev. (1982), 357-384
*Boynton J.E., Gillham N.W., Harris E.H., Hosier J.R， Jones A.R., Randolph-Anderson B丄.，Robertson D., Klein T.M.,禾口 Shark K.B. Sc/e匿廁 (1988), 1534-1538
*Bruce等，尸rac. TVa". Jcad S《24), (1989) 9692-9696
*Carrer H.等，7^fo/. Ge". 24/: (1993), 49-56
*Chang和Cohen,淑Ge". Ge威/6柳(1979), 111-115
*Chaudhuri S. (1999). WO 00/39313
*Comai等，5We臟"六(1983)， 370-371
*Crouch等，r"ra/zet/TO", (1997)， 53, 20, 6993-7010
*Daniell H., Datta R., Va腿S., Gray S.，禾卩Lee S.B.淑.倫&c/wo/. /6 雄(1998) 345-348
*Daniell H.等,0#r Ge威39: (2001) 109-116
*De Cosa B., Moar W., Lee S.B.， Miller M.,禾PDaniell H.胸.胸ec/mo/. 79 (7」(2001). 71-74
*Fischer N., Stampacchia O., Redding K.,禾口 Rochaix J.D. A/o/. Ge". G匿[Z5/: (1996). 373-380*Gasser等，J 5z.o/. C/zew., 263: (1988), 4280-4289
*Gamborg等，Ce〃 b 50, (1968), 151 -158
*Gordon和Ruddle,Bf2人(1985), 121-136
*Ishida等，Ato.歷ofec/wo/. /"6」，(1996), 745-750
*Khan M.S.禾卩Maliga R Ato.歷o&c/z"o/. 77, (1999). 910-915
*Klein等，70(3」，(1992), 286-291
*Knopf, ^^ce〃. (5, (1979), 143-173
*Lutz K.A., Knapp J.E.,禾卩Maliga P.尸/aW P/z;^'o/. /25(V」(2001), 1585-1590
*McBride K.E., Svab Z., Schaaf D丄，Hogan P.S., Stalker D.M.，和Maliga P.歷otec/zw/ogy "p」(1995). 362-365
*Murashige等，尸—'o/og/a尸/awtor畫(huà)75, (1962), 473-497 *Mercenier禾口 Chassy,歷oc/z/m/e 7C^"， (1988), 503-517 *Padgette S.R.等， /C7zem.' 266: (1991), 33 *Pallett等,戸fc. 50: (1997), 83-84 *RUetschi等，￡J腸c/z簡(jiǎn).205, (1992), 459-466 *Ruf等，尸/aW尸/2^/。/. 96向(1991)，摘要592
*Ruf S., Hermann M.， Berger I丄，Carrer H.,禾卩Bock R. Ato.歷otec/z朋/. /， (2001). 870-875
*Shah等，Sc/e匿233: (1986), 478-481
*Shaw等，Gem "(3」(1983), 315-330
*Shigekawa禾口 Dower,加z1. /腸&c/zw /.柳，(1989), 56-62
*Shinozaki K., Ohme M., Tanaka M., Wakasugi T., Hayashida N.， Matsubayashi T., Zaita N., Chunwongse J., Obokata J.， Yamaguchi陽(yáng)Shinozaki K., Ohto C., Torasawa K., Meng B.Y., Sugita M., Deno H., Kamogashira T., Yamada K., Kusuda J., Takaiwa F., Kato A., Tohdoh N., Shimada H.,禾口 SuguiaraM. 5: (1986). 2043-2049
*Sidorov V.A., Kasten D., Pang S.Z., Hajdukiewicz RT.， Staub J.M.,禾口 NehraN.S.尸/"W乂 790: (1999). 209-216
*Sikdar S.R.等，尸/ Ce〃/ e; orty (1998), 20-24
*Stalker等，J.Biol.Chem. 260(8, (1985)， 4724-4728
*Staub等，Plant Cell4:(1992), 39-45
*Staub等，EMBOJowma Journal 12(2):(1993), 601-606
*Staub J.M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P.T., Hunter R, Nehra N., Paradkar V" Schlitter M., Carroll J.A., Spatola L, Ward D., Ye G，和 Russell D.A.Nat.Biotechnol.18(3):(2000). 333-338
*Svab Z., Hajdukiewicz P.,和MaligaP.Prac. nATL.Acad.Sci.USA87(21):(1990). 8526-8530
*Svab等，Prac.Natl. Acad.Sci.90:(1993), 913-917
*Tepfer和Casse-Delbart, Mfcrabiol.Sci.4(1)，(1987), 24-28
White等，Nucleic Acid Res.18(4)(1990), 1062
*Ye G.N., Hajdukiewicz RT., Broyles D., Rodriguez D., Xu C.W., Nehra N.,和Staub J.M.Plant J. 25(3):(2001). 261-270
*Yoder等，1993
*Lyzrik等，199權(quán)利要求
1.一種獲得不含選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方法，所述方法包括以下步驟a)用適合轉(zhuǎn)化質(zhì)體的載體轉(zhuǎn)化至少一個(gè)植物細(xì)胞，所述載體在轉(zhuǎn)錄方向上包含對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的5’部分的序列(i)，包含編碼對(duì)選擇劑產(chǎn)生抗性的選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因(ii)，與序列(i)的3’部分相同的n個(gè)核苷酸的片段(iii)，對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3’部分的序列(iv)；b)在含有所述選擇劑的第一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)包含轉(zhuǎn)化質(zhì)體的細(xì)胞；c)在不含所述選擇劑的第二種培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述獲得不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方法，其特征在 于，所述序列(i)對(duì)應(yīng)于產(chǎn)生不同于選擇性標(biāo)記所提供特征的選擇性特征的感興趣嵌 合基因的5'部分，并且其中步驟c)中所用的第二種培養(yǎng)基還含有對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合 基因的選擇劑。
3. 如權(quán)利要求2所述獲得不含選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方法，其特征在于， 所述方法在步驟b)和步驟c)之間包括一個(gè)額外步驟，所述步驟由在既不含對(duì)應(yīng)于選 擇性標(biāo)記的選擇劑、也不含對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的選擇劑的第三種培養(yǎng)基上培養(yǎng) 包含轉(zhuǎn)化質(zhì)體的細(xì)胞組成。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法 生抗生素抗性。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法 碼氨基糖苷3-腺苷轉(zhuǎn)移酶。
6. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法 生甜菜醛抗性。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法 生除草劑抗性的蛋白質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法 基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)。
9. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法 烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。
10. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因是6w其特征在于，所述選擇性標(biāo)記基因產(chǎn) 其特征在于，所述選擇性標(biāo)記基因編 其特征在于，所述選擇性標(biāo)記基因產(chǎn) 其特征在于，所述感興趣基因編碼產(chǎn) 其特征在于，所述感興趣基因編碼羥 其特征在于，所述感興趣基因編碼5- 基因。
11. 一種構(gòu)建物，其在轉(zhuǎn)錄方向上包含 對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的5'部分的序列(i)，包含編碼選擇性標(biāo)記的序列的嵌合基因(ii)， 與序列(i)的3'部分相同的n個(gè)核苷酸的片段(iii)， 對(duì)應(yīng)于感興趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)。
12. 如權(quán)利要求ll所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述序列(i)對(duì)應(yīng)于編碼產(chǎn)生不 同于選擇性標(biāo)記所提供特征的選擇性特征的蛋白質(zhì)或肽的感興趣嵌合基因的5，部 分。
13. —種適合轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體的轉(zhuǎn)化載體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化載體包含權(quán)利 要求11或12所述的構(gòu)建物。
14. 一種含有感興趣基因且不含選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞，所述細(xì)胞可通 過(guò)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
15. —種含有感興趣基因且不含選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物或此植物的一部分以 及此植物的后代，其可通過(guò)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物、獲得這種植物的方法和所用載體。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101098966SQ200680001710
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2006年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
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