專(zhuān)利名稱(chēng)：：攜帶低水平豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的豬及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及篩選和保持?jǐn)y帶低拷貝豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的豬種群的方法，并且涉及這些豬作為這些異種移植適用的細(xì)胞、組織和/或器官的來(lái)源的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從這些豬篩選適合在異種移植中使用的細(xì)胞、組織和/或器官的方法。
背景技術(shù)：
：器官移植對(duì)于晚期器官衰竭是一個(gè)有效的治療，但是嚴(yán)重受限于供體器官的短缺。每年大量的人在等待器官的時(shí)候死去。除了得到供體器官的困難外，器官移植的費(fèi)用也限制了器官移植手術(shù)實(shí)施的數(shù)量。動(dòng)物能夠提供器官和組織的可選擇的供體來(lái)源已經(jīng)激起了許多爭(zhēng)論。由于供體器官的短缺，異種移植明顯具有減少痛苦和死亡的潛力，然而關(guān)于這個(gè)程序還是有些安全方面的擔(dān)心。擔(dān)心包括異種移植的受體和接觸這些受體的人以及相繼的廣大公眾受傳染的風(fēng)險(xiǎn)。最嚴(yán)重?fù)?dān)心的是從異種移植傳播給受體包括微生物的有傳染性的因子的可能性，并且隨之出現(xiàn)新的人的傳染病和可能疾病的潛在可能性。豬被認(rèn)為是除了非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)外優(yōu)選的供體動(dòng)物的一個(gè)主要原因是可以減少它們所攜帶的微生物負(fù)荷的風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)當(dāng)指出，傳播微生物的風(fēng)險(xiǎn)并非是異種移植獨(dú)有。很多在同種移植(allotransplantation)中造成生物體傳播從而弓I起疾病的例子已經(jīng)被證明。然而，當(dāng)與物種內(nèi)傳播相比時(shí)對(duì)于物種間交叉感染(人畜共患病(zoonosis))要給予特殊的關(guān)注，這是因?yàn)橛袀魅拘缘纳矬w在異源宿主中的行為不能通過(guò)它在天然宿主中的致病性來(lái)預(yù)測(cè)。在它們天然宿主中是良性的生物體可在人畜共患病的情況下導(dǎo)致明顯的發(fā)病率。例證包括人感染后有潛在致命性的豬尼帕病毒(Nipahvirus)、靈長(zhǎng)類(lèi)皰疹病毒和嚙齒類(lèi)動(dòng)物漢坦病毒(hantavirus)(1)。由于異種移植的受體通常是處于免疫抑制狀態(tài)的，所以也增強(qiáng)了交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。可以隨著器官、組織或細(xì)胞群被轉(zhuǎn)移的微生物改變潛能并在受體體內(nèi)建立感染。病毒諸如豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒(PLHV)、豬巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)(PCMV)和豬環(huán)行病毒(circovirus)(PCV)，所有的這些都是在豬種群中高度流行的(參看例如2)，其都能夠建立持久的感染并且被認(rèn)為具有潛在的致癌性。關(guān)于巨細(xì)胞病毒在豬到靈長(zhǎng)類(lèi)器官移植中激活的數(shù)據(jù)顯示豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)可能是免疫抑制的異種移植受體的一個(gè)重要的病原體(3)。已經(jīng)有報(bào)道，豬環(huán)行病毒2型可在體外感染人的細(xì)胞(4)。然而，最大的風(fēng)險(xiǎn)可能來(lái)自于那些生物體，其在器官中無(wú)癥狀潛伏時(shí)仍有傳播的能力。這些生物體包括內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)和皰疹病毒。當(dāng)有報(bào)道稱(chēng)三個(gè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中的兩個(gè)可以在體外感染人的細(xì)胞時(shí)(5)，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERVs)就已經(jīng)成為焦慮的主要來(lái)源并可能成為對(duì)于異種移植最重要的安全擔(dān)心。并不象豬攜帶的其它有傳染性的生物體一樣，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)不在動(dòng)物間作為有傳染性的因子傳播而是被所有動(dòng)物作為它們生殖細(xì)胞DNA的一部分而遺傳。這樣，病毒形成了部分基因組從而出現(xiàn)在每個(gè)細(xì)胞中。在豬之間病毒出現(xiàn)的數(shù)量不同，但據(jù)稱(chēng)每個(gè)細(xì)胞平均有大約50個(gè)拷貝的病毒并且傳統(tǒng)飼養(yǎng)技術(shù)不能從豬群中除去這些病毒(6)。因此，傳染性生物體的存在，尤其是豬細(xì)胞中的PERV病毒在異種移植的應(yīng)用前景中是一個(gè)潛在的障礙。因此現(xiàn)在需要產(chǎn)生適合異種移植的豬細(xì)胞、組織和/或器官并且要顯著的減少可能傳播給受體的生物體，因而顯著降低人畜共患病感染的風(fēng)險(xiǎn)的方法。更特別的是需要產(chǎn)生攜帶低拷貝數(shù)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)以用于異種移植的豬的細(xì)胞、組織和/或器官，從而把異種移植受體被傳染的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。本發(fā)明的目的是在某種程度上得到這些必需之物和/或給公眾提供有用的選擇。
發(fā)明內(nèi)容令人驚奇的是奧克蘭島豬種群在內(nèi)源性微生物方面相比其它品種的豬具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。特別是這種豬包含一個(gè)新的動(dòng)物亞群，該亞群攜帶的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)異乎尋常的低。因而可以預(yù)期選擇性飼養(yǎng)這些動(dòng)物所產(chǎn)生的后代將會(huì)攜帶更低水平的微生物，包括豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的拷貝數(shù)。因此，這種豬特別適合于異種移植。因此，在本發(fā)明的第一方面提供了飼養(yǎng)無(wú)傳染性微生物的豬的方法，并且這些豬的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在030之間。所述的方法包括以下步驟(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性的奧克蘭島豬，(b)使步驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的具有有益微生物譜并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在030之間的后代。因此，在步驟(c)中篩選的后代適合于異種移植。步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代攜帶的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)優(yōu)選在025之間、0~20之間、0~18之間、016之間、014之間、0~12之間、0~10之間、08之間、07之間或者06之間；最優(yōu)選拷貝數(shù)在05之間。步驟(a)和(c)的有益微生物譜包括不可檢測(cè)到的皰疹病毒、豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒(PLHV)、豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬環(huán)行病毒(PCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、弓形蟲(chóng)(Toxoplasma)、附紅細(xì)胞體(eperythrozoon)、布魯氏菌(brucella)、李斯特菌(Usteria)、分枝桿菌(mycobacterium)TB、鉤端螺菌(leptospirillum)、豬嗜血桿菌(Haemophilussuis)，任何引起豬繁殖與呼吸綜合征的病毒、任何引起狂犬病的病毒、任何引起偽狂犬病(pseudorabies)的病毒、細(xì)小病毒(parvovirus)、腦心肌病毒(encephalomyocarditusvirus)、任何弓1起豬水皰病(swinevesiculardisease)的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)，任何引起使腦心肌紅細(xì)胞〗疑集(hemagglutinatingencephalomyocarditus)的病毒、豬A型》究感病毒、腺病毒、傳染性腸胃炎病毒和水皰性口炎病毒。在步驟(c)中篩選出來(lái)的雄性和雌性后代可在步驟(b)中交配以產(chǎn)生可用于異種移植的次下一代以保持種群。這個(gè)方法可能根據(jù)需要的包括對(duì)特定血型的額外篩選，以使其與潛在的異種移植受體匹配，或者與體外培養(yǎng)所用血清的抗原譜相匹配以減少免疫反應(yīng)引起的組織排異和/或細(xì)胞損傷。優(yōu)選的是，在步驟(a)中篩選的豬和更優(yōu)選的在步驟(c)中篩選的后代是o型血。優(yōu)選的是，在步驟(a)中篩選的豬和更優(yōu)選的在步驟(c)中篩選的后代是不攜帶豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒一C(PERV-C)。更優(yōu)選的是，在步驟(a)中篩選的豬和仍然更優(yōu)選在步驟(c)中篩選的的后代是O型血并且不攜帶豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒一C(PERV-C)。這個(gè)方法可以根據(jù)需要包括對(duì)在細(xì)胞表面的免疫原性抗原的額外篩選，例如MHCI類(lèi)抗原，這可再次減少體內(nèi)或體外的器官、組織或細(xì)胞的排異或損傷。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)或更多用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的豬。在第二方面，本發(fā)明提供了一個(gè)或更多的不攜帶傳染性微生物的豬，并且這些豬的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在0到30之間。其中所述的一個(gè)或更多豬是用包含下列歩驟的方法生產(chǎn)的(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性?shī)W克蘭島豬，(b)使步驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)歩驟(b)產(chǎn)生的具有有益微生物譜并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在030之間的后代。在第三方面，本發(fā)明提供了一個(gè)或更多的不攜帶傳染性微生物的豬，這些豬的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在0到30之間并且為O型血和/或不攜帶豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒一C(PERV-C)。其中所述的一個(gè)或更多豬是用包含下列步驟的方法生產(chǎn)的(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性?shī)W克蘭島豬，(b)使步驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的具有有益微生物譜并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在030之間的后代。在另一方面，本發(fā)明提供了從用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的一個(gè)或更多豬中分離所得的器官、組織或細(xì)胞，所述的器官、組織或細(xì)胞是不攜帶傳染性微生物的，并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在0~30之間，而且特別適合移植到異基因受試者中，包括人。優(yōu)選的是，一個(gè)或多個(gè)器官、組織和細(xì)胞分離自一個(gè)或多個(gè)豬，其中所述的一個(gè)或多個(gè)豬是7到21天齡的新生豬。器官、組織和細(xì)胞可以選自或分離自肝、肺、心臟、腦、胰、肌肉、血、骨、睪丸或卵巢。優(yōu)選的是，用于整體器官異種移植的器官是選自肝、肺和心臟。優(yōu)選的是，用于異種移植的組織和細(xì)胞是選自胰島、肝細(xì)胞、肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞、膽囊內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、膽管內(nèi)皮細(xì)胞、肝管上皮細(xì)胞、肝管內(nèi)皮細(xì)胞、竇細(xì)胞(sinusoidcells)、脈絡(luò)叢細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、塞爾托利細(xì)胞(Sertolicells)、腎上腺嗜鉻細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。本發(fā)明也提供了一個(gè)可移植的組合物包括至少一個(gè)本發(fā)明的分離的豬的器官、組織或細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體。組合物可進(jìn)一步包括從通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的豬分離到的飼養(yǎng)細(xì)胞如纖維原細(xì)胞或塞爾托利細(xì)胞(Sertolicels)。在用于治療正遭受或傾向于得病、紊亂或器官功能缺陷或喪失相關(guān)疾病的患者的可移植組合物或設(shè)備的準(zhǔn)備中，本發(fā)明進(jìn)一步提供至少一個(gè)從通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)豬中分離得到的器官、組織或細(xì)胞的使用。所述的器官、組織或細(xì)胞不攜帶傳染性的微生物且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在030之間。優(yōu)選的是，至少一個(gè)分離的器官、組織或細(xì)胞是分離自7到21天齡的新生豬。按照本發(fā)明的另一方面，提供了一個(gè)治療正在遭受或傾向于得病、紊亂或器官組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)疾病的患者的方法，包含給患者進(jìn)行其所要的從通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)從豬分離的器官、組織或細(xì)胞的移植。按照本發(fā)明的另一方面，提供一個(gè)治療正在遭受或傾向于得病、紊亂或器官功能缺陷或喪失相關(guān)疾病的有需求的患者的方法，其包含給予有效數(shù)量的一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的可移植組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的缺陷或喪失是肝功能的缺陷或喪失，并且可移植組合物包括肝細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞、膽囊細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝管細(xì)胞或竇細(xì)胞(sinusoidcells)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述的缺陷或喪失是胰臟功能的缺陷或喪失，并且可移植組合物包括胰島細(xì)胞。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述的缺陷或喪失是神經(jīng)功能的缺陷或喪失，并且可移植組合物包括脈絡(luò)叢細(xì)胞。本發(fā)明也可被認(rèn)為廣泛的存在于在申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中所指或暗示的部分、要素和特性，個(gè)別地或整體地，以及任何或全部所述的任何兩個(gè)或多個(gè)部分、要素或特性組合，并且這里所提到的特定整體是與在本領(lǐng)域與本發(fā)明中相關(guān)的已知替換物，如同單獨(dú)提出一樣，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這些己知替換物在此也被提及了。圖1描述了一個(gè)在豬中鑒定病毒的方法和按照本發(fā)明選擇合適的雌性和雄性豬來(lái)伺養(yǎng)并維持豬的種群的方法的簡(jiǎn)圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及篩選不攜帶傳染性微生物并且特別是豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在0到30之間(優(yōu)選的是0到5之間)的豬供體。這種豬尤其適合作為異種移植的器官、組織和細(xì)胞來(lái)源。在先曾有提供適合異種移植的豬的嘗試。如US6,867,347(6)公開(kāi)報(bào)道缺乏豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的傳播的近交的豬種群。然而，這種豬的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的平均拷貝數(shù)是高的，據(jù)報(bào)道在每個(gè)細(xì)胞中大約有50個(gè)拷貝。此外，這種豬種群攜帶傳染性微生物的狀態(tài)沒(méi)有被揭示，是否這些豬不攜帶每種普通豬所含的病毒諸如PCMV、PLHV、EMCV、HEV和PCV1型禾Q2型呢？類(lèi)似的，US6,469,229(7)揭示近交(inbred)小型豬的主要組織相容性復(fù)合體單倍型是純合子。然而，再次發(fā)現(xiàn)這種豬的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的平均拷貝數(shù)是高的，并且這種豬攜帶傳染性微生物的狀態(tài)沒(méi)有被揭示，也沒(méi)有確定這些豬是否不攜帶上述普通豬所攜帶的病毒。另人驚訝的是，申請(qǐng)人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)新西蘭自交系(inbredstrain)的豬有令人驚奇的低拷貝數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒(豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV))。這個(gè)品系的豬也不攜帶普通豬的傳染性病毒包括PCMV、PLHV、EMCV、HEV和PCV。這個(gè)品系的豬居住在遙遠(yuǎn)的奧克蘭島(新西蘭的南部亞南極島群(sub-Antarcticislandgroup))實(shí)際上在200年前就已經(jīng)分離出來(lái)了，在這里稱(chēng)為AI豬。據(jù)報(bào)道，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)是每個(gè)被檢測(cè)的脊椎動(dòng)物包括豬和人的正常DNA的一部分。正常的逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期包括穩(wěn)定整合逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。如果宿主細(xì)胞是生殖細(xì)胞，則病毒核酸物質(zhì)(或前病毒)將隨之以任何其他的孟德?tīng)柣虻牡湫头绞絺鹘o所有子代。提議如果一個(gè)特定的前病毒存在于生殖細(xì)胞系并給了子代有選擇的缺陷，那么它將不能通過(guò)進(jìn)化的考驗(yàn)并且這個(gè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)就不會(huì)出現(xiàn)在正在形成的基因庫(kù)中。存在于現(xiàn)今動(dòng)物的生殖細(xì)胞系的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)對(duì)于它們自己的種屬不會(huì)是致病性的。單個(gè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)基因座由于他們基因組存在的突變也傾向于復(fù)制缺陷。然而，進(jìn)一步提出存在有單個(gè)有缺陷基因座通過(guò)互補(bǔ)和重組形成有傳染性的病毒的潛在可能性。然而內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)可能對(duì)于它們天然的宿主不具有致病性，當(dāng)物種間傳播時(shí)完全相似的病毒能夠改變它們的致病性。據(jù)宣稱(chēng)所有豬的細(xì)胞包括從NIH迷你豬、尤卡坦半島(Yucatan)、多島品種(multiplelandbreeds)和目前被用于臨床試驗(yàn)的動(dòng)物分離出來(lái)的豬細(xì)胞(但除外ST-IOWA細(xì)胞系)看來(lái)可產(chǎn)生具在人細(xì)胞內(nèi)有傳染性并能復(fù)制的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)(6)。最近，來(lái)源于不同類(lèi)型豬的細(xì)胞已經(jīng)被評(píng)估傳染性豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)顆粒的存在，而鑒定的幾例并沒(méi)有包含傳染性豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)顆粒，參見(jiàn)例子，如下表1所示。表I不同品種的豬中傳染性PERV的存在<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>大白豬/蘭德瑞斯豬胰島細(xì)胞+小型豬PBMC+大白豬胰島細(xì)胞一約克夏豬(Yorkshire)PBMC胎兒神經(jīng)細(xì)胞-小型豬D/DPBMC-Cambrough豬PBMC，塞爾托利細(xì)胞、胰島細(xì)胞PBMO外周血單個(gè)核細(xì)胞更進(jìn)一步宣稱(chēng)使用不攜帶特定病原體(SPF)的飼養(yǎng)方法將消除大多數(shù)可能在異種移植中被傳播的病原體，但是通過(guò)生殖細(xì)胞傳播的病原體如PERV不會(huì)被消除，因而使用豬器官的潛在風(fēng)險(xiǎn)之一就是這種病原體的傳播(6)。主要的是，申請(qǐng)人現(xiàn)在已經(jīng)確定這里描述的AI豬很罕見(jiàn)的攜帶低拷貝數(shù)的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)，而且低于任何以前的報(bào)道。更進(jìn)一歩，當(dāng)應(yīng)用通過(guò)本發(fā)明的方法篩選得到的細(xì)胞時(shí)，這里描述的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有證據(jù)顯示傳染性PERV顆粒產(chǎn)生，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)體外共培養(yǎng)的PERV傳遞和體內(nèi)向異種移植受體的傳遞。因此，在本發(fā)明的第一方面提供了一個(gè)飼養(yǎng)無(wú)傳染性微生物豬的方法，并且這些豬的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在0~30之間。所述的方法包括以下步驟(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性的奧克蘭島豬，(b)使步驟(a)中的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的具有有益微生物譜并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)拷貝數(shù)在030之間的后代。因此，在步驟(c)中篩選的后代適合于異種移植。PERV存在三個(gè)種類(lèi)PERV-A、PERV-B和PERV-C。這些種類(lèi)的區(qū)別在于PERV的包膜區(qū)。宿主的范圍主要由病毒的包膜決定，包膜對(duì)于感染是必須的。豬逆轉(zhuǎn)錄病毒的兩個(gè)主要類(lèi)型(PERV-A和PERV-B)在豬的不同品種中廣泛分布(8)。PERV-A和PERV-B比起PERV-C的宿主范圍要更廣泛，包括幾個(gè)人的細(xì)胞系，而PERV-C僅感染兩個(gè)豬的細(xì)胞系(9)。近來(lái)，據(jù)報(bào)道PERV-A和PERV-C可重組并形成具有新傳染特性的變異體(IO)。供體豬需要不攜帶PERV-C，這樣可以阻止與已存在的PERV-A發(fā)生任何可能的重組。優(yōu)選地，篩選過(guò)程要包括飼養(yǎng)不攜帶PERV-C變異體的豬和/或篩選不攜帶PERV-C變異體的供體后代。豬不攜帶傳染性微生物并且通過(guò)在畜牧業(yè)領(lǐng)域已知的方法把潛在病原體的進(jìn)入減少到最小以維持這種狀態(tài)。這樣的方法包括隔離飼養(yǎng)(barrierhusbandry)和隔離，除了專(zhuān)門(mén)育種技術(shù)如在適合的容器中的子宮切開(kāi)導(dǎo)出(hysterotomyderivation)。優(yōu)選地，保持種群的不攜帶傳染性微生物的狀態(tài)包括定期監(jiān)測(cè)種群的傳染性微生物。確定是否含傳染性微生物的方法是本領(lǐng)域所共知的，包括免疫學(xué)分析和核酸檢測(cè)分析(如以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法)。檢測(cè)是否含有傳染性微生物的方法可用于檢測(cè)動(dòng)物的微生物譜使其可以用來(lái)評(píng)估，例如它是否適合包含在本發(fā)明的繁育技術(shù)中或是否可以用作異種移植的供體。步驟(a)和(c)的有益微生物譜包含未達(dá)到檢測(cè)水平的皰疹病毒、豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒(PLHV)、豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬環(huán)行病毒(PCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、弓形蟲(chóng)(Toxoplasma)、附紅細(xì)胞體(eperythrozoon)、布魯氏菌(brucella)、李斯特菌(listeria)、分枝桿菌(mycobacterium)TB、鉤端螺菌(leptospirillum)、豬嗜血桿菌(Haemophilussuis)，任何引起豬繁殖與呼吸綜合征的病毒、任何引起狂犬病的病毒、任何引起偽狂犬病(pseudorabies)的病毒、細(xì)小病毒(parvovirus)、腦心月幾病毒(encephalomyocarditusvirus)、任何弓I起豬7JC皰病(swinevesiculardisease)的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)，任何引起使腦心肌紅細(xì)胞凝集(hemagglutinatingencephalomyocarditus)的病毒、豬A型流感病毒、腺病毒、傳染性腸胃炎病毒和水皰性口炎病毒。圖1顯示了一個(gè)示例性的用于檢測(cè)潛在的供體種群是否適于異種移植的方法。這個(gè)示例性的方法包括檢測(cè)病原體是否存在于發(fā)源地，并且如果是這樣，是否是存在于原始種群。如果確是存在于原始種群中，就要檢測(cè)供體特別是要移植的器官、組織和細(xì)胞中是否存在病原體。確定病原體是否可以傳播給受體細(xì)胞(如人的細(xì)胞)和受體(如人)也是重要的。使用篩選的動(dòng)物特別是這些品系的后代來(lái)作為異種移植供體來(lái)源的種群就要優(yōu)選攜帶低拷貝PERV且缺乏可傳播的PERV的動(dòng)物，這比使用更高拷貝數(shù)的PERV的供體要更安全。不希望受任何理論的束縛，申請(qǐng)人相信通過(guò)使用本發(fā)明的繁育方法如以一個(gè)循環(huán)往復(fù)的方式可能從每個(gè)連續(xù)世代繁育和篩選出具有更低的PERV的后代。再次不希望受任何理論的束縛，申請(qǐng)人更進(jìn)一步相信用這樣的方式有可能繁育和篩選出在它們的基因組不攜帶PERV拷貝的后代。這里所描述的AI豬不攜帶許多已經(jīng)報(bào)道的地方的或廣泛的在全世界豬的種群中存在的豬病毒。例如，豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)是P皰疹病毒(皰疹病毒科(//^p^v/n^foe力并且它被認(rèn)為是一個(gè)被報(bào)道在英國(guó)至少98%檢測(cè)的豬都感染的廣泛存在的病毒(ll)。已經(jīng)從豬的呼吸道分離出PCMV并且可能它與萎縮性鼻炎或豬萎縮性鼻炎包涵體(inclusionbodyrhinitis)有關(guān)，豬萎縮性鼻炎是影響剛斷奶豬的一種常見(jiàn)的疾病綜合征。斷奶后打噴嚏和輕微鼻炎在新西蘭豬中據(jù)說(shuō)是很常見(jiàn)的。異種移植受體感染人巨細(xì)胞病毒(CMV)的重要性引起了對(duì)豬巨細(xì)胞病毒在異種移植中可能具有相似行為的關(guān)注(12)。重要地，申請(qǐng)人已經(jīng)確定這里所描述的AI種群不攜帶PCMV。因此，不可能出現(xiàn)PCMV從來(lái)自于AI種群供體的器官、組織或細(xì)胞傳播給一個(gè)異種移植受體的情況。在另一個(gè)實(shí)施例中，隨著在商業(yè)種群豬中病毒的出現(xiàn)，有報(bào)道顯示豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒(PLHV)感染是地方性的(13)。PLHV屬于Y皰疹病毒科(//erpMWnWae))的亞科。還不確定的這些皰疹病毒的基本特性包括對(duì)其它物種的傳染性。它們據(jù)稱(chēng)在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上和綿羊和牛嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒關(guān)系相近，其可引起它們宿主的淋巴增殖性疾病(14)。重要地，申請(qǐng)人已經(jīng)確定這里所描述的AI種群不攜帶PLHV。因此，不可能出現(xiàn)PLHV從來(lái)自于AI種群供體的器官、組織或細(xì)胞傳播給一個(gè)異種移植受體的情況。腦心肌炎病毒(EMCV)(t微)小核糖核酸病毒(P/cowav/W^^)J屬于心病毒屬(CaW/ov/n^A是一個(gè)廣泛分布的病毒。EMCV存在種間傳染已被認(rèn)可，豬腦心肌炎病毒可感染人心肌細(xì)胞(15)。據(jù)報(bào)道EMCV存在于新西蘭(16)。申請(qǐng)人已經(jīng)確定這里所描述的AI種群不攜帶EMCV。因此，不可能出現(xiàn)EMCV從來(lái)自于AI種群供體的器官、組織或細(xì)胞傳播給一個(gè)異種移植受體的情況。最近已經(jīng)將戊型肝炎病毒(HEV)從杯狀病毒科(Caliciviridae)中去除，目前沒(méi)有被分類(lèi)。不斷有證據(jù)顯示豬戊型肝炎病毒可人畜共患。因此，用于異種移植的組織必須排除這個(gè)病毒。申請(qǐng)人己經(jīng)確定這里所描述的AI種群不攜帶HEV。因此，不可能出現(xiàn)HEV從來(lái)自于AI種群供體的器官、組織或細(xì)胞傳播給一個(gè)異種移植受體的情況。豬環(huán)行病毒(PCV)屬于C/rc/Wn'^^家族。豬環(huán)行病毒第一次是在連續(xù)的豬腎細(xì)胞系PK15中作為一種污染物被發(fā)現(xiàn)的(17)，隨后對(duì)來(lái)自德國(guó)、加拿大、新西蘭、英國(guó)、北愛(ài)爾蘭和美國(guó)的豬血清的血清學(xué)研究則報(bào)道在正被養(yǎng)肥的和成年豬中PCV1抗體的陽(yáng)性率為25%到98%(18)。這暗示PCV的感染是在全世界廣泛存在的。沒(méi)有鑒定到相關(guān)疾病。然而，有些關(guān)于豬環(huán)行病毒是人畜共患的反面報(bào)道。能和豬環(huán)行病毒1型反應(yīng)的抗體在人、小鼠和牛中都有報(bào)道(18)。據(jù)報(bào)道在德國(guó)大約20%的健康成人、30%的醫(yī)院患者和加拿大24%的醫(yī)院患者的PCV樣抗原血清學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性。然而，除了豬以外任何哺乳動(dòng)物物種都檢測(cè)不到病毒或病毒基因組。故推測(cè)在人和其它物種中發(fā)現(xiàn)的PCV1抗體反應(yīng)可能是非特異的。在患有斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征(PMWS)的豬中發(fā)現(xiàn)豬環(huán)行病毒的一個(gè)新品系，命名為2型豬環(huán)行病毒(19)。PMWS最經(jīng)常影響5到12周的小豬，進(jìn)行性的體重減輕、黃疸和呼吸癥狀作為診斷的依據(jù)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PCV2和死產(chǎn)小豬的心肌炎有關(guān)(20)。很清楚需要更進(jìn)一步的依據(jù)來(lái)闡明豬中PCV2相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理。據(jù)報(bào)道PCV2在體外可感染人的細(xì)胞(21)和感染實(shí)驗(yàn)中的BALB/c小鼠(22)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于異種移植和相關(guān)的感染風(fēng)險(xiǎn)具有特殊的重要性。申請(qǐng)人已經(jīng)確定這里所描述的AI種群不攜帶PCV1和PCV2。因此，不可能出現(xiàn)PCV1和PCV2從來(lái)自于AI種群供體的器官、組織或細(xì)胞傳播給一個(gè)異種移植受體的情況。除大約45種不同病原體(其中大部分是在獸醫(yī)實(shí)踐中的常見(jiàn)問(wèn)題)外，申請(qǐng)人已經(jīng)確定這里所描述的AI豬沒(méi)有患影響豬的傳染性水泡疾病(口蹄疫、皰疹性口炎、水皰疹(vesicularexanthema)和豬水皰病)、狂犬病、布魯氏菌病、豬霍亂、偽狂犬病和海綿狀腦病。因此很明顯這里所描述的AI豬具有能被篩選出來(lái)從而特別適合用來(lái)作為異種移植的供體來(lái)源種群的特性。測(cè)定或觀察PERV拷貝數(shù)的方法包括多種基因組掃描的方法和本領(lǐng)域已知的其它適合于檢測(cè)或觀察器官基因組中特定的核酸序列拷貝數(shù)的方法。在實(shí)施例中提出了這些方法的實(shí)施例。本發(fā)明進(jìn)一步提供了從通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)豬中分離到的器官、組織和細(xì)胞，所述的器官、組織或細(xì)胞不攜帶傳染性微生物且PERV拷貝數(shù)在0到30之間，特別適合于移植到異基因體包括人體。所述的一個(gè)或多個(gè)豬不攜帶包括感染人的病原體在內(nèi)的傳染性微生物，這些微生物包括但不限于來(lái)自下列病原體種類(lèi)的一個(gè)或多個(gè)病原體寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、支原體和病毒。該豬可不攜帶如寄生蟲(chóng)(如弓形蟲(chóng)、附紅細(xì)胞體)或支原體(如肺炎支原體)M.hyopneumonia。該豬不攜帶的細(xì)菌如布魯氏菌、李斯特菌、分枝桿菌TB、鉤端螺菌、豬嗜血桿菌。此外，豬不攜帶的病毒如人畜共患病病毒、可穿過(guò)懷孕母豬的胎盤(pán)的病毒和嗜神經(jīng)病毒。人畜共患病病毒包括如狂犬病病毒屬的病毒、引起偽狂犬病的皰疹樣病毒、encephalomyocarditus病毒、豬流感病毒A型、可傳播的胃腸道病毒、副流感病毒3和水泡性口膜炎病毒?？纱┻^(guò)胎盤(pán)的病毒包括如引起豬繁殖與呼吸綜合征的病毒、狂犬病病毒屬的病毒、引起偽狂犬病的皰疹樣病毒、細(xì)小病毒、引起豬水皰病的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)、引起腦心肌紅細(xì)胞凝集病毒(hemagglutinatingencephalomyocarditus)、巨細(xì)胞病毒、豬痘病毒、豬A型流感病毒。嗜神經(jīng)病毒包括如狂犬病病毒屬的病毒、引起偽狂犬病的皰疹樣病毒、細(xì)小病毒、腦心肌病毒、引起豬水皰病的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)、引起腦心肌紅細(xì)胞凝集病毒、腺病毒、副流感病毒3。豬所不攜帶的病毒的特例包括能引起(或?qū)е?豬繁殖與呼吸綜合征的病毒、狂犬病病毒屬的病毒、引起偽狂犬病的皰疹樣病毒、細(xì)小病毒、月畝心肌病毒(encephalomyocarditusvirus)、引起豬水皰病的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)、能引起腦心肌紅細(xì)胞凝集的病毒(hemagglutinatingencephalomyocarditus)、巨細(xì)胞病毒、豬A型流感病毒、腺病毒、傳染性腸胃炎病毒、能引起牛病毒性腹瀉的病毒和水泡性口膜炎病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的一個(gè)或多個(gè)豬不攜帶下列生物體皰疹病毒、弓形蟲(chóng)，附紅細(xì)胞體(eperythrozoon)、布魯氏菌、李斯特菌、分枝桿菌TB、鉤端螺菌(leptospirillum)、豬嗜血桿菌(Haemophilussuis)，任何引起豬繁殖與呼吸綜合征的病毒、任何引起狂犬病的病毒、任何引起偽狂犬病的病毒、細(xì)小病毒、腦心月幾病毒(encephalomyocarditusvirus)、任何引起豬水皰病的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)，任何引起使腦心月幾紅細(xì)胞7疑集(hemagglutinatingencephalomyocarditus)的病毒、豬痘病毒屬、豬A型流感病毒、腺病毒、傳染性腸胃炎病毒和水皰性口炎病毒。分離自所述的一個(gè)或多個(gè)豬的器官、組織或細(xì)胞可來(lái)自胚胎(也就是胎兒)，新生豬(嬰兒豬)和成年豬。在大多數(shù)情況下，豬的器官是異種移植的受試者，一個(gè)成年器官由于它更大的體積使之更易于分離、處理和移植將，這使其更多被利用。新生組織或細(xì)胞在異種移植時(shí)一般是優(yōu)選的，因?yàn)榉蛛x它們比它們的胎兒副本帶來(lái)的問(wèn)題要少，同時(shí)分離后的存活要好。例如，在組織培養(yǎng)或隨后的異種移植中一般要優(yōu)于成年組織或細(xì)胞。對(duì)于豬而言，新生期一般指出生后的第7到21天。新生器官相對(duì)于它們的胎兒副本由于它們的分離產(chǎn)生問(wèn)題更少而一般在異種移植中優(yōu)選。一般地，有選擇的在孕期階段分離胚胎豬器官、組織或細(xì)胞。例如，當(dāng)細(xì)胞、組織或器官可被識(shí)別或當(dāng)細(xì)胞、組織或器官的生長(zhǎng)程度和/或分化適合應(yīng)用需要時(shí)，器官、組織或細(xì)胞可以從處于胚胎發(fā)展某一階段的胎豬中分離。例如，從懷孕和出生約20到25天之間的豬中分離器官、組織或細(xì)胞。本發(fā)明分離的細(xì)胞可作為功能上可行的細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)維持。本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)下面介紹的方法培養(yǎng)如WO01/52871(23)、WO02/32437(24)、WO2004/113516(25)、WO03/027270(26)、WO00/66188(27)和/或NZ532057/532059/535131(28)，這里把它們整體并入本發(fā)明。用于支持豬細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，例如Dulbecco氏最低要求培養(yǎng)基(DMEM)和最低要求培養(yǎng)基(MEM)。培養(yǎng)基可是無(wú)血清的但優(yōu)選添加動(dòng)物血清如胎牛血清或更優(yōu)選豬血清(即自體血清)。分離自供體豬的本發(fā)明的細(xì)胞可保持它們的表型和/或能夠履行它們的功能。例如，本發(fā)明的豬肝細(xì)胞具有增殖、分泌血漿蛋白如白蛋白和因子VIII、表達(dá)低密度脂蛋白受體從而結(jié)合低密度脂蛋白的功能。優(yōu)選地，分離的細(xì)胞可以在體外和體內(nèi)維持分化的功能，并且附著在基質(zhì)例如培養(yǎng)皿上。優(yōu)選地，所述的一個(gè)或多個(gè)豬是一個(gè)血型，這不會(huì)引起或在移植物移植入受體時(shí)由補(bǔ)體介導(dǎo)的體液排斥減小到最小。豬有兩種血型A和0。血型A抗原的存在并且針對(duì)該抗原的抗體缺乏表示血型為A。缺乏血型A抗原并且存在針對(duì)該抗原的抗體表示血型為O。申請(qǐng)人已經(jīng)確定AI種群顯示了血型A和含糖的表面抗原的多態(tài)性。優(yōu)選地，用于異種移植的器官、組織或細(xì)胞是來(lái)自于O型血的供體。在以下幾種交配形式中，0血型的表型是孟德?tīng)栯[性遺傳。AAxAA的豬的子代血型100°/。為A;AAxAO的豬的子代血型100%為A(50°/。的可能性是AO型雜合子)；AAxOO的豬的子代血型100%為A(AO型)；AOxAO的豬的子代75%的可能性血型為A(25%的AA型和50%的AO型)且25%的可能性血型為O(OO型)；OOxAO的豬的子代50%可能性血型為A(AO型)和50°/。的可能性血型為O(OO型)；參OOxOO的豬的子代血型100%為o型。.優(yōu)選地，本發(fā)明的有選擇的繁育方法產(chǎn)生的后代除有低的PERV拷貝之外，還有包含不引起或能把受體中的補(bǔ)體介導(dǎo)的排斥減小到最小的表面抗原的細(xì)胞。例如，本發(fā)明的有選擇的繁育方法優(yōu)選產(chǎn)生血型為O型的后代。為了產(chǎn)生O型血的后代，因此交配的豬都必須要攜帶O等位基因。優(yōu)選地，至少一個(gè)交配的和更優(yōu)選的是交配的兩只豬都是O型血(O等位基因的純合子)。參見(jiàn)本申請(qǐng)的實(shí)施例4。檢測(cè)哺乳動(dòng)物血型的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，這里在實(shí)施例中介紹了適合檢測(cè)豬血型的代表性方法。從所述的一個(gè)或多個(gè)豬中得到的器官、組織或細(xì)胞就象這里所描述的那樣可以包括在內(nèi)(encapsulated)隔離于受體的免疫系統(tǒng)以抑制一旦異種移植到受體中的組織或細(xì)胞的排斥。免疫抑制，例如應(yīng)用在本領(lǐng)域中眾所周知的免疫抑制藥物，比如在US6,610,288(29)(這里把它整體并入本發(fā)明)中所描述的那樣也被典型地用在移植豬的器官的情況中。在導(dǎo)入受試者前，組織或細(xì)胞能被修飾以抑制免疫排斥，例如象(29)所描述的那樣。因而，本發(fā)明提供了可移植組合物，其包含至少一個(gè)本發(fā)明分離的豬的器官、組織或細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的組合物能夠裝入一個(gè)遞送裝置，以方便細(xì)胞和/或組合物進(jìn)入受試者。這些遞送裝置包括管子，比如用于灌注或注射細(xì)胞和液體進(jìn)入受體身體的導(dǎo)管。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些管子還有針，比如可以用來(lái)將本發(fā)明中的細(xì)胞注射進(jìn)受體受試者的所需要的部位的注射器。本發(fā)明的組合物能夠裝入這樣一個(gè)遞送裝置，比如不同形式的注射器、注射器泵。例如當(dāng)包含在這樣一個(gè)遞送裝置中的時(shí)候，細(xì)胞能夠懸浮在溶液中或者植入支持介質(zhì)中。這里用到的術(shù)語(yǔ)"溶液"包括一個(gè)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，并且本發(fā)明的細(xì)胞是可以處于這些溶液中的。藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑包含消毒的鹽和水緩沖溶液。這些載體和稀釋劑在本領(lǐng)域中的使用是眾所周知的。溶液優(yōu)選的是消毒的和液體的，以利于注射。優(yōu)選的，溶液在操作和儲(chǔ)存和保存時(shí)是穩(wěn)定的，并且通過(guò)羥基苯甲酸酯類(lèi)、三氯丁醇、苯酚、抗壞血酸維生素C、硫柳汞和類(lèi)似物的使用來(lái)防止諸如細(xì)菌和真菌等微生物的污染。本發(fā)明的溶液能夠?qū)⑦@里描述的豬細(xì)胞制備在藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑中，如果必要，以上提到的其它成分可以，然后進(jìn)行過(guò)濾除菌。包括本申請(qǐng)器官、組織或細(xì)胞的適合于移植的本申請(qǐng)的組合物和裝置促進(jìn)移植后的細(xì)胞的存活。在異種移植細(xì)胞的情況中，通過(guò)防止細(xì)胞暴露于受體的免疫系統(tǒng)中而通常將達(dá)到此目的。特別地，本申請(qǐng)涉及在如下情況中的使用的組合物和裝置■藻酸鹽囊(J&/te-ewcff/w/"^/>>形式-為了對(duì)移植的豬細(xì)胞提供額外的免疫保護(hù)。在(23)中陳述了微囊化豬新生胰島細(xì)胞和移植此細(xì)胞的方法。這種藻酸鹽微囊化包裝為異種移植提供有效的、安全的和功能性的方法?！銎は乱浦惭b置——其導(dǎo)致了用于放置豬細(xì)胞組合物的前血管形成同種膠原儲(chǔ)存器(reservoir)的發(fā)展。優(yōu)選的，移植的裝置是細(xì)胞非滲透的，而蛋白質(zhì)或分泌因子可滲透的，比如可獲得的"TheraCyte"裝置(TheraCyte，Inc.,Irvine,Calfornia)?！龌|(zhì)準(zhǔn)備——在基質(zhì)里的豬細(xì)胞組合物被培養(yǎng)在含有天然炭水化合物聚合體的明膠、膠原和/或其它輔助基質(zhì)上?！鲅獫{凝血酶凝塊——異源(allogeneic)血漿凝塊采用作為生物相容性容納裝置(biocompatiblecontainmentdevice)的異源凝血酶產(chǎn)生。本發(fā)明的組合物和裝置可能利用將豬細(xì)胞并入或植入其中的支持基質(zhì)，這些基質(zhì)是受體相容的并且降解為對(duì)受體無(wú)害的產(chǎn)物。天然的和/或合成的可生物降解的基質(zhì)是這些基質(zhì)的示例。天然的生物可降解基質(zhì)包括膠原基質(zhì)。合成的生物可降解基質(zhì)包括合成的聚合體，比如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。這些基質(zhì)在體內(nèi)為細(xì)胞提供了支持和保護(hù)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一個(gè)治療正在遭受或傾向于得病、紊亂或與器官功能缺陷或喪失的患者相關(guān)的疾病的方法，包含向需要的患者給予一個(gè)有效數(shù)量的一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的可移植組合物。本發(fā)明也提供一個(gè)治療正在遭受或傾向于得病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失的患者相關(guān)的疾病的方法，包含給需要的患者進(jìn)行從通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)從豬分離的器官、組織或細(xì)胞的移植。本發(fā)明的這些治療方法優(yōu)選的能夠在異種移植受體內(nèi)恢復(fù)或增加細(xì)胞、組織或器官的功能，同時(shí)把包括PERV在內(nèi)的人畜共患傳染因子的傳播風(fēng)險(xiǎn)降到最低。移植所需的細(xì)胞數(shù)量或組織數(shù)量、恢復(fù)或增加器官、組織或細(xì)胞功能所需的移植頻率是為熟知本技術(shù)方法的技術(shù)人員所了解的。本發(fā)明的器官、組織、細(xì)胞、組合物和治療方法可以用于長(zhǎng)期的器官、組織和細(xì)胞功能的生理性響應(yīng)的補(bǔ)充，其是基于器官、組織和所有剩余的活性和分泌的必須生物學(xué)因子的存在。本發(fā)明的組織、細(xì)胞、組合物和治療方法由于不攜帶人畜共患病傳染因子并具有低水平PERV病毒，所以尤其適合異種移植。細(xì)胞移植治療優(yōu)于傳統(tǒng)的器官移植治療，因?yàn)檫m合于移植的細(xì)胞的可用性不受限制，但是適合的器官只能來(lái)源于尸體或活體器官供體。另外，用于移植的細(xì)胞可能對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)是外來(lái)物，與此同時(shí)已經(jīng)發(fā)展了不同的方法來(lái)防止宿主免疫系統(tǒng)攻擊以及由此引起的移植細(xì)胞的死亡，比如例如將細(xì)胞置于一個(gè)聚集體或裝置中以提供一個(gè)在細(xì)胞和宿主免疫系統(tǒng)之間的物理屏障((23),(24)，(25),(26)，(27)和(28》。因此，本發(fā)明提供適合于異種受體的給予的分離的豬器官、組織或細(xì)胞。這些器官、組織或細(xì)胞能用來(lái)治療器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失的疾病。這里用到的術(shù)語(yǔ)"分離的"指得是器官、組織或細(xì)胞從它們天然的環(huán)境中分割出來(lái)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包含從天然環(huán)境中整體的物理分割，例如從供體動(dòng)物移除，和器官、組織或細(xì)胞與其鄰近的有直接聯(lián)系的細(xì)胞關(guān)系的改變，比如分離。這里使用的不同的"豬"的術(shù)語(yǔ)可以互換使用，指得是豬科的哺乳動(dòng)物。這些動(dòng)物包括全部和部分天生的豬，優(yōu)選的是這里描述的那些奧克蘭島豬。這里使用的術(shù)語(yǔ)"治療"包含減少或減輕至少一個(gè)疾病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病的不利效應(yīng)或癥狀。例如在疾病、紊亂或與胰臟功能的缺陷或喪失相關(guān)的疾病時(shí)，不利效應(yīng)或癥狀的例子包含高血糖、肥胖、異常的葡萄糖敏感和/或不敏感、異常的胰島素水平、糖尿病微血管和大血管疾病、異常的脂肪酶分泌、異常的分泌素水平、異常的腸促胰酶肽水平、脂肪瀉、異常的胃泌素水平和異常的類(lèi)膽堿和/或腎上腺功能。因此，本發(fā)明的組織、細(xì)胞或組合物移植給一個(gè)正在遭受或傾向于得病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病的患者一定量的這些以至少部分的減少或減輕疾病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病的狀態(tài)的至少一個(gè)不利效應(yīng)或癥狀。這里提到的術(shù)語(yǔ)"給予"、"引入"和"移植"可以互換使用，指得是將本發(fā)明的器官、組織、細(xì)胞或組合物放置于受試者中，例如異種受試者，通過(guò)一定方法或途徑使本發(fā)明的器官、組織、細(xì)胞或組合物在所需要的位置定位。本發(fā)明的器官、組織、細(xì)胞或組合物能夠通過(guò)任何適當(dāng)?shù)目梢赃f送細(xì)胞至受體中需要的位置的途徑給予受體受試者，并使得至少使其一部分細(xì)胞存活的。優(yōu)選的至少約5%，優(yōu)選的至少約10%，更優(yōu)選的至少約20%，仍然更優(yōu)選的至少約30%，仍然更優(yōu)選的至少約40%和最優(yōu)選的至少約50%或更多細(xì)胞在給予受體之后可以存活。移植給受體之后，細(xì)胞的存活周期可能是例如24小時(shí)的若干小時(shí)至若干天，更長(zhǎng)到若干周至若干月。移植本發(fā)明的器官、組織、細(xì)胞或組合物的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。細(xì)胞能夠放在一個(gè)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中被移植。這里使用的術(shù)語(yǔ)"受體"指得是哺乳動(dòng)物，尤其是正在遭受或傾向于得病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病的人。術(shù)語(yǔ)"受體"也包含被同種或異種細(xì)胞引發(fā)免疫反應(yīng)的哺乳動(dòng)物。受體的實(shí)施例包含靈長(zhǎng)類(lèi)(例如人和猴子)。這里使用的"異種受體"(這里也指"受體受試者""受試者")是將其它物種的細(xì)胞移植或?qū)⒁浦步o其的受體。這里使用的語(yǔ)言"疾病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病"包含有異常器官功能的紊亂。這種異常器官功能包含正常器官功能的損害或喪失或異常器官功能的存在。本發(fā)明存在于前述內(nèi)容之中，也存在于下述的僅用作解釋并不限定其范圍的實(shí)施例。實(shí)施例I這個(gè)實(shí)施例詳述了低拷貝豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的AI豬種群的病毒狀態(tài)的特性。材料和方法核酸提取豬的材料包括組織、外周血、單核細(xì)胞、血漿和糞便。從組織提取用于RNA提取的30mg組織樣品均質(zhì)溶解在lmlTRIZOL試齊U(GIBCO/BRL，Ga池erburg，MD)中，或者用QiagenRneasyKit(Qiagen)試劑盒提供的裂解緩沖液在玻璃均質(zhì)器(Wheaton)中裂解。RNA用QiagenRneasyKit(Qiagen)試劑盒或TRIZOL試劑提取(GIBCO/BRL,Gaitherburg，MD)。組織DNA用PuregeneDNAIsolationKit(Gentra)試劑盒提取，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。從血細(xì)胞提取用PurogeneIsolationKit(Gentra)試劑盒從外周血單核細(xì)胞(PBMCs)提取DNA。用TRIZOL試劑(GIBCO/BRL,Gaitherburg,MD)從PBMCs中提取RNA。從糞便中提取用RIZOL試劑(GIBCO/BRL，Gaitherburg,MD)從糞便中提取RNA，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)所有聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)應(yīng)用PerkinElmerGeneAmpPCRSystem2400熱循環(huán)儀進(jìn)行。PCMVPCR:我們采用Hamel建立的PCMVPCR(30)。通過(guò)從被感染豬的PBMC(外周血單核細(xì)胞)中提取的細(xì)胞DNA來(lái)評(píng)估PCR和嵌套PCR的敏感度。通過(guò)有限稀釋使每個(gè)反應(yīng)中的DNA為10g來(lái)確定敏感度。PLHVPCR:由Ehlers建立的PCR(31)被用來(lái)進(jìn)行PLHV的鑒定。通過(guò)有限稀釋從被感染豬的PBMC中提取的DNA來(lái)評(píng)估PLHVPCR的敏感度。用每個(gè)反應(yīng)中10—、gDNA來(lái)評(píng)估PLHVPCR的敏感度。EMCVRT—PCR:由Vanderhallen&Koenen建立的PCR(32)被用來(lái)進(jìn)行病毒的鑒定。通過(guò)有限稀釋從感染EMCV的細(xì)胞中提取的RNA來(lái)確定RT—PCR的敏感度。用每個(gè)反應(yīng)中10—VgRNA來(lái)評(píng)估敏感度。PCVPCR:由Larochelle設(shè)計(jì)的PCR(33)被用來(lái)進(jìn)行病毒的鑒定。我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了嵌套PCR的引物正向引物5'-TGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAA-3，，反向引物5，-CAAGGCTACCACAGTCACAAC-3，。通過(guò)有限稀釋被感染豬的組織DNA(肺、肝)DNA來(lái)評(píng)估PCVPCR的敏感度。用每個(gè)反應(yīng)中10'VgDNA來(lái)評(píng)估PCVPCR的敏感度。HEV逆轉(zhuǎn)錄和PCR:由Erker設(shè)計(jì)的PCR(34)被用來(lái)進(jìn)行病毒的鑒定。通過(guò)有限稀釋從感染豬糞便中提取的RNA來(lái)確定RT—PCR的敏感度。用每個(gè)反應(yīng)中10—、gRNA來(lái)評(píng)估敏感度。PCR產(chǎn)物的序列分析為了檢測(cè)一個(gè)特定PCR的特異性，用HighPurePCRProductPurificationKit(Boehringer)試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；然后用ABI373A測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(基因技術(shù)中心，奧克蘭大學(xué))。用BLASTN和DNASTAR程序進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。ELISA檢測(cè)HEV抗體豬IgGHEV抗體用ELISA試劑盒測(cè)定，以重組GST-ORF2.1作為固定相包被抗原?？梢赃x擇，IgGHEV抗體可用以前有報(bào)道(13)的酶免疫(EIA)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。動(dòng)物和組織用于實(shí)驗(yàn)的豬來(lái)源于新西蘭商業(yè)種群(大白豬(LargeWhite)和Cambrough豬品種)、高健康狀況種群(high-health-status(HHS))(Cambrough品種)和在遙遠(yuǎn)的奧克蘭島居住的野豬(AI種群)。用于分析的豬組織包括從1周齡小豬來(lái)源的血液、肝臟、脾臟、胰腺、肺和心臟。從較年長(zhǎng)的豬來(lái)源的糞便、血液和外周血單核細(xì)胞(PBMC)也被分析。所有組織通過(guò)外科手術(shù)獲取，并立刻速凍于液氮中，然后保存在一7(TC中。通過(guò)心臟穿剌從1周齡小豬獲取血液，5ml血液保存在預(yù)裝檸檬酸葡萄糖(ACD)或EDTA的試管中。通過(guò)頸靜脈取血得到20周齡的小豬和大母豬的血液并保存在預(yù)裝EDTA的試管中。豬的糞便收集在消毒容器中，并放置在冰上。在收集的當(dāng)天要處理糞便。兩份公豬精液樣品進(jìn)行PCV檢測(cè)。所用動(dòng)物處理均符合動(dòng)物福利制度規(guī)貝ll(Institutionalanimalwelfarerules)。對(duì)于關(guān)注的每一個(gè)病毒，都要在不同年齡段的豬的一系列組織中檢領(lǐng)!j。結(jié)果豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)對(duì)15只HHS種群的20周齡豬與母豬和20只AI豬的PBMC進(jìn)行PCMV分析。10只HHS種群1周齡小豬和5只AI小豬的肺、肝臟和脾臟也被分析。從母豬和20周齡小豬來(lái)源的PBMC樣品，70%是陽(yáng)性。在1周齡小豬來(lái)源的PBMC、肺、肝臟和脾臟以及提取的胰島細(xì)胞中，PCMVDNA全部為陰性(表11)。所有檢測(cè)的AI豬全部為病毒陰性。表II.PCMV檢測(cè)結(jié)果豬年齡豬數(shù)量種群來(lái)源分析的組織結(jié)果1周10HHS肺、肝臟、脾臟PBMC未檢測(cè)到1周5AI肺、肝臟、脾臟PBMC未檢測(cè)到>20周15HHSPBMC70%陽(yáng)性>6個(gè)月20AIPBMC未檢測(cè)到豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒(PLHV)5只1周齡和10只20周齡HHS種群豬，以及20只6月齡的AI豬和10只大于6月齡的商品化種群豬的PBMC用來(lái)分析PLHV。10只1周齡HHS種群小豬和5只1周齡AI小豬的肺、肝臟、PBMC和脾臟也被分析。在起始實(shí)驗(yàn)中，故意省略陽(yáng)性對(duì)照來(lái)避免任何污染的可能性。在HHS種群中，95X的20周齡豬的PBMC中病毒DNA陽(yáng)性(表III)。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示擴(kuò)增子與PLHVII型有100%相似性(2)。沒(méi)有PLHVI型的相關(guān)證據(jù)顯示。1周齡小豬的病毒DNA為陰性。AI豬的PLHV病毒為陰性。200680012602.2說(shuō)明書(shū)第22/33頁(yè)表III.PLHV檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>腦心肌炎病毒(EMCV)用HHS和AI種群小豬進(jìn)行EMCV分析。HHS種群20只1周齡小豬的心肌組織和11只10—12周齡的小豬的糞便被檢測(cè)。AI種群3只1周齡小豬的心肌組織和10只12—14周齡豬的糞便被檢測(cè)。在1周齡小豬的心肌組織或者斷奶后豬的糞便中沒(méi)有檢測(cè)到EMCV(表IV)。表IV.ECMV檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>豬環(huán)行病毒I型和II型(PCV)如下組織被檢測(cè)HHS種群14只14_16周齡豬的糞便樣品，4例肺組織和4例1周齡豬的糞便樣品。商品化種群14只14一16周齡豬的糞便樣品。AI種群IO只成年豬的糞便樣品。PCV2DNA從14一16周齡豬的糞便樣品中擴(kuò)增得到(表V)。14_16周齡的商品化和HHS種群豬的糞便樣品中病毒100%陽(yáng)性。4只1周齡豬中有3只的肺組織和全部糞便樣品中PCV2病毒陽(yáng)性。經(jīng)過(guò)測(cè)序產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示這些病毒與己經(jīng)有報(bào)道的PCV2菌株(U49186)有98%的同源性。在AI豬中沒(méi)有檢測(cè)到這種病毒。表V.PCV2檢測(cè)結(jié)果豬年齡~~"^11~~種群來(lái)源~~分析的組織iS~~14-關(guān)~~HSS14-16周14商品化糞便陽(yáng)性1周4HHS糞便、肺陽(yáng)性>6月10AI糞便未檢測(cè)到戊型肝炎病毒(HEV)對(duì)HHS種群中24只母豬、23只1周齡小豬、25只20周齡豬的血清，商品化種群中22只豬的66份血清，和AI種群中6只6月齡豬的血清樣品進(jìn)行了HEV抗體檢測(cè)。對(duì)商品化種群和HHS種群的21只10周齡、7只12周齡與17只7周齡小豬的糞便樣品進(jìn)行HEVRNA檢測(cè)。在HHS種群中HEV存在，而且在12周齡小豬中占優(yōu)勢(shì)。病毒的測(cè)序顯示新西蘭豬品系病毒與來(lái)源于非疫區(qū)人類(lèi)品系HEV不同。AI豬沒(méi)有這類(lèi)病毒檢測(cè)出。實(shí)施例2這個(gè)實(shí)施例描述了奧克蘭島種群的示例的PERV拷貝數(shù)量的確定。方法兩種技術(shù)用來(lái)計(jì)算豬基因組中PERV前病毒的數(shù)量LightCycler(Roche)和使用QUALITY計(jì)算分析的PCR有限稀釋檢驗(yàn)(PCRlimitingdilutionassay(PLDA))(Rodrigo等，ubik.microbiol.washington.edu/computing)。結(jié)果兩種技術(shù)對(duì)于前病毒插入數(shù)量有很好的一致性。應(yīng)用LightCycler和PLDA分析，AI種群的平均拷貝數(shù)分別為14或19。AI種群中個(gè)體豬之間PERV拷貝數(shù)的差異性也己確定。通過(guò)LightCycler分析，PERV拷貝數(shù)在3—37之間變化(37、16、10、4、12、16、20、3、14);通過(guò)PLDA分析，在4—30之間變化。所有三類(lèi)PERV(PERV-A，-B，-C)在AI種群中均存在。存在于每一種品種的豬的基因組中。通常每一個(gè)細(xì)胞中有約50拷貝的病毒(6)。上述數(shù)據(jù)是和存在于HHS和商品化種群豬中的PERV拷貝進(jìn)行比較的。HHS種群中的平均拷貝是43(30,56)，商品化種群中平均拷貝是30。因此，繁育攜帶最低PERV拷貝數(shù)雄性和雌性豬將提供一個(gè)具有異常低PERV拷貝數(shù)的供體豬種群，加之其無(wú)傳染性微生物的后代，使得它們非常適合于異種移植。實(shí)施例3這個(gè)實(shí)施例描述了奧克蘭島種群示例者的血型分析。方法兩種技術(shù)用來(lái)進(jìn)行豬的血型分析。第一種方法利用單克隆抗體檢測(cè)存在于示例者的頰組織樣品中的血型抗原。購(gòu)自DiagnosticScotlandALBA-done的小鼠抗A和抗B單克隆抗體作為一抗。這些一抗用熒光標(biāo)記的抗小鼠IgFITC二抗檢測(cè)。第二種方法檢測(cè)血清樣品中可以和胎豬細(xì)胞表面合成血型抗原反應(yīng)的抗體的存在。用具有表面血型A合成分子(Ap)或合成B分子(Bp)或無(wú)任何抗原分子(Op)胎豬細(xì)胞針對(duì)65只AI豬的血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)。與Ap細(xì)胞不反應(yīng)的那些豬血清被認(rèn)為是A型，與Ap細(xì)胞反應(yīng)的血清是O型(reactedagainstApcellsweredeemedtobegroupO)。結(jié)果原位雜交下表VI顯示了用抗A和抗B單克隆抗體進(jìn)行原位雜交獲得的結(jié)果。熒光染色顯示一抗存在，指示了樣品中相應(yīng)抗原的存在。表VI.頰組織樣品中血型抗原的原位雜交切片一抗圖像編號(hào)熒光值A(chǔ)BO血型p-A40，2+，3+,1-2+Ap-B2O，O172-A3l-2+,l-2+，l-2+A172-B40，0,0,0，184-A30，0，0，O184-B20,0凝集試驗(yàn)下表VIII顯示了凝集試驗(yàn)的結(jié)果。凝集指示了血清樣品中和細(xì)胞表面相應(yīng)血型抗原交叉反應(yīng)的抗體的存在。六個(gè)分級(jí)的凝集如下4=強(qiáng)凝集；3=中等強(qiáng)凝集；2=中等凝集；1=弱凝集；W二非常弱凝集;0=無(wú)凝集。針對(duì)Ap細(xì)胞的凝集存在指示為O型血。表VIII.針對(duì)血型抗原的抗體的凝集反應(yīng)結(jié)果樣品Ap22CBpOp結(jié)4000A000A謹(jǐn)l睡纖l000A麗圖鬮000A10000A曙園圖000A,l纖釀圖000Al麵豳?lài)?guó)i000Af咖醫(yī),鬮000A18000A19000A22000A23000A33000A34000A35000A36000A44000A誦國(guó)籮國(guó),謹(jǐn)l000A62000A國(guó)釀100O,1200O,國(guó)300O24i薩薩400O28謹(jǐn),200Ol國(guó)圜l圖霾300O40國(guó)謹(jǐn)200O63薩鬮300O64l謹(jǐn)200O65400O結(jié)果這個(gè)實(shí)施例顯示了約60%的被檢測(cè)AI豬中可指示A型血的含碳水化合物的表面抗原陽(yáng)性。O型血AI豬的篩選將有利于它們與潛在異種移植受體的相容性，并可減少移植排異的危險(xiǎn)。另外，O型血AI豬的篩選將使培養(yǎng)在含有這些篩選出的豬的血清(O型)中的細(xì)胞和組織產(chǎn)生很低的免疫損傷。實(shí)施例4這個(gè)實(shí)施例描述了奧克蘭島豬種群中篩選出的成員交配產(chǎn)生的后代的血型分析。方法將確定血型的一只雄性和一只雌性AI豬進(jìn)行交配。A型血的公豬(AO)和O型血的母豬(OO)交配。然后確定后代的血型。結(jié)果這種交配產(chǎn)生4個(gè)后代小豬#232(00)，小豬#233(AO)，小豬#234(OO)和小豬#235(OO)。在這個(gè)交配實(shí)驗(yàn)中，后代75%為O型血，結(jié)果好于理論預(yù)期的50%。實(shí)施例5這個(gè)實(shí)施例描述了從奧克蘭種群供體豬分離出的細(xì)胞中PERV體外傳播的特性。方法AI種群中PERV傳播特性采用體外共培養(yǎng)來(lái)研究。分離新生小豬的胰島細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞(PBMC)，用PHA/PMA刺激，并和作為靶細(xì)胞的人HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)。細(xì)胞增殖和RT活性分析作為刺激的證據(jù)。分析血漿中PERVRNA的存在。用PCR檢測(cè)PERV是否傳播至靶細(xì)胞。結(jié)果共培養(yǎng)18—20周之后，在靶細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到PERV或豬細(xì)胞標(biāo)記分子(細(xì)胞色素氧化酶亞單位II)的存在。實(shí)施例6這個(gè)實(shí)施例描述了從奧克蘭種群供體豬分離出的細(xì)胞中PERV體內(nèi)傳播的特性。方法從新生的具有低拷貝PERV供體豬中分離得到胰島細(xì)胞，并包在藻酸鹽中，再移植至非洲綠猴(cynomolgousmonkeys)體內(nèi)。然后分析PERV的傳播。結(jié)果沒(méi)有證據(jù)顯示，在移植6個(gè)月的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有PERV的傳播。實(shí)施例7這個(gè)實(shí)施例描述了奧克蘭島豬種群中篩選出的成員交配產(chǎn)生的后代的PERV拷貝數(shù)分析方法將具有低拷貝數(shù)PERV的一只AI公豬和一只母豬交配。親本和后代中的PERV拷貝數(shù)用實(shí)施例2中描述的方法測(cè)定。交配的公豬和母豬中的PERV拷貝數(shù)用PLDA法檢測(cè)。小豬中的拷貝數(shù)用實(shí)施例2中描述的LightCycler法檢測(cè)。檢測(cè)拷貝數(shù)的兩種方法可以互相比較。結(jié)果交配產(chǎn)生5個(gè)后代，含有的PERV拷貝數(shù)見(jiàn)下表IX。表IX.在親本和后代中的PERV拷貝數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>因此，低拷貝數(shù)PERV公豬和母豬交配可以產(chǎn)生PERV低拷貝數(shù)的后代。實(shí)施例8這個(gè)實(shí)施例描述了在奧克蘭島種群示例中的PERV類(lèi)型的確定。這里描述的，將有利于獲取不攜帶PERV-C的供體豬。方法PERV分類(lèi)采用這里描述的確定PERV拷貝數(shù)的方法來(lái)確定(見(jiàn)實(shí)施例2)。PERV拷貝數(shù)用針對(duì)前病毒pol區(qū)域的特異引物來(lái)確定。這個(gè)方法能夠檢測(cè)不同PERV類(lèi)型(A、B和C)的前病毒拷貝。結(jié)果兩只AI豬(豬#102和弁212)PERV-C陰性。更有利的是，豬#102也是O型血，因此是一個(gè)極好的供體候選者。結(jié)論用本發(fā)明的繁育方法產(chǎn)生的豬特別適合作為異種移植的供體。從這種豬能夠分離得到優(yōu)選的沒(méi)有傳染性微生物，有很低拷貝數(shù)的PERV，不攜帶PERV-C，并且是O型血的器官、組織或細(xì)胞。這些細(xì)胞有望特別適合異種移植，至少是由于其具有最低的傳染性因子傳播和/或免疫排異的潛在風(fēng)險(xiǎn)。出版物1.MillsJN，等，1999.EmergInfectDis,5:135-42.2.AllanGM.,&JAEllis.,2000.Porcinecircoviruses:綜述.J.Vet.Diagn.Investig.12:3—14.3.MuellerNJ,等，2002.Activationofcytomegalovirusinpig-to-primateorgantransplantation.J.Virol.76:4734-4740.4.HattermannK,等，2004.Infectionstudiesonhumancelllineswithporcinecircovirustype1andporcinecircovirustype2.Xenotransplantation11:284~294.5.PatienceC,等,1997.Infectionofhumancellsbyanendogenousretrovirusofpigs.Nat.Med.3:282—286.6.US6,867,3477.US6,469,2298.LeTissierP.J等,1997.Twosetsofhuman-tropicpigretrovirus.Nature,389:681-682.9.TakeuchiY等,1998.HostvrangeandinterferencesstudiesofthreeclassesofpigendogenousretrovirusJVirol,72:9986-9991.10.GemenianoM等，Theinfectivityandhostrangeoftheecotopicporcineendogenousretrovirus,PERV畫(huà)C,ismodulatedbyresiduesintheC-terminalregionofitssurfaceenvelopeprotein.2006.Virology346(l):108-17.11.EdingtonN，1999.Cytomegalovirus.In:StrawBE,D'AllaireS,MengelingWL，TaylorDJ，editors.Diseasesofswine(8edition).Ames,Iowa:IowaStateUniversityPress,p125-131.12.HoM,&DrummerJS，1995.Infectionsintransplantrecipients.In:MandellL,BennettJE,DolinR,editors.Mandell,DouglasandBennett'sprinciplesandpracticeofinfectiousdiseases.NewYork:ChurchillLivingstone,p.35-107.13.GarkavenkoO，等，2004.MonitoringforPotentiallyXenozoonoticVirusesinNewZealandPigs.JMedVirol.72:338-344.14.UlrichS，等，1999.CharacterisationoftheDNApolymeraselociofthenovelporcinelymphotropicherpesviruses1and2indomesticandferalpigs.JGenVirol80(12):3199-3205.15.BrewerLA，等,2001.Porcineencephalomyocarditisviruspersistsinpigmyocardiumandinfectshumanmyocardialcells.JVirology75(23):11621-11629.16.HomerQ1991.PigcircovirusantibodiespresentinNewZealandpigs.SurveyWellington18:23.17.TischerI,等，1974.Characterisationofpapovavirus-andpicornavirus畫(huà)likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines.ZentralblattfUrBacteriologieMicrobiologieundHygieneseresA226:153-167.18.TischerI,等,1995.Presenceofantibodiesreactingwithporcinecircovirusinseraofhumans,mice,andcattle.ArchVirol140:1427-1439.19.Rodrigez-ArriojaGM，等，1999.Aujeszky,sdiseasevirusinfectionconcurrentwithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigs.VetRec144:152-153.20.O'ConnorB,等,2001.Multipleporcinecircovirus2-associatedabortionsandreproductivefailureinamultisiteswineproductionunit.CanVetJ42:551-553.21.HattermanK,&MankertzA.,2002.Infectionstudiesonhumancell-lineswithporcinecircovirustype1andtype2.TheWorldofMicrobes:Paris,27thJuly—1stAugust2002，V-385:132.22.KiupelM,等,2001.ViralreplicationandlesionsinBALB/cmiceexperimentallyinoculatedwithporcinecircovirusisolatedfromapigwithpostweaningmultisystemicwastingdisease.VetPathol38:74-82.23.WO01/5287124.WO02/3243725.WO2004/11351626.WO03/02727027.WO00/6618828.NZ532057/532059/53513129.US661028830.HamelAL,等,1999.PCRassayfordetectingporcinecytomegalovirus.JClinMicrobiol37:3767-3768.31.EhlersB,等,1999.Detectionoftwonovelporcineherpesviruseswithhighsimilaritytogammaherpesviruses.JGenVirol80:971-978.32.VanderhallenH，&KoenenF,1998.Identificationofencephalomyocarditisvirusinclinicalsamplesbyreversetranscription-PCRfollowedbygenetictypingusingsequenceanalysis.JClinMicrobiol36:3463-3467.33.LarochelleR,等，1999.TypingofporcinecircovirusinclinicalspecimensbymultiplexPCR.JVirolMethods80:69-75.34.ErkerJC,等，1999.RapiddetectionofhepatitisEvirusRNAbyreversetranscription-polymerasechainreactionusinguniversaloligonucleotideprimers.JVirolMethods81:109-113.承承承在這里參考或提到的所有專(zhuān)利、出版物、科學(xué)論文、其它文獻(xiàn)和材料可以反應(yīng)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且這里每一個(gè)參考文獻(xiàn)和材料以引用的方式并入本文中，如同被整體引用作為具體的或者在這里整體給出的文獻(xiàn)作為參考。申請(qǐng)人保留合并這個(gè)說(shuō)明書(shū)和出自任何這類(lèi)專(zhuān)利、出版物、科學(xué)論文、網(wǎng)站、可用的電子版信息和其它參考材料或文獻(xiàn)的任何和所有材料和信息的權(quán)利。這里描述的特定的方法和組合物代表不同的實(shí)施方案或優(yōu)選的實(shí)施方案，其僅為示例而并非用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說(shuō)明書(shū)考慮到的其它受試者、方面、實(shí)施例和實(shí)施方案包括在本發(fā)明權(quán)利要求要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。很顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易對(duì)本發(fā)明進(jìn)行未超出本發(fā)明范疇的改換的代替和修飾。這里描述的說(shuō)明性的發(fā)明可能在沒(méi)有象重要者一樣進(jìn)行特意描述的任何元素或多個(gè)元素，限制或多個(gè)限制缺乏時(shí)是可行的。因此，例如在這里的每個(gè)例子中，在本發(fā)明的實(shí)施方案或?qū)嵤├?，術(shù)語(yǔ)"包含"、"基本由......組成"和"組成"中的任何一個(gè)可能被本說(shuō)明書(shū)中其它兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中任何一個(gè)替代。而且，術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"、"含有"等具有廣泛的應(yīng)用而沒(méi)有限制。這里描述的說(shuō)明性的方法和過(guò)程可以不同的步驟順序進(jìn)行，它們不必限制在權(quán)利要求中指示的步驟順序。在這里和附加的權(quán)利要求中使用到的單數(shù)形式"a""an,"和"the"包括復(fù)數(shù)形式，除非在其它方面明確指出。因此，例如"宿主細(xì)胞"這樣的引用包括這類(lèi)宿主細(xì)胞的復(fù)數(shù)(例如培養(yǎng)群體)，等等。無(wú)論如何，本專(zhuān)利不被認(rèn)為是限于這里揭示的特定實(shí)施例或?qū)嵤┓桨富蚍椒āo(wú)論如何，本專(zhuān)利不被認(rèn)為是受限于由任何審査者或?qū)＠蜕虡?biāo)局的其它官員或雇員所發(fā)表的聲明，除非這個(gè)聲明是有資格的或在申請(qǐng)人答復(fù)的文件中被釆用的。己經(jīng)利用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)是被用作不受限制的描述術(shù)語(yǔ)，并且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)時(shí)，除了顯示或描述的特色或其一部分的任何等同者之外，是沒(méi)有目的性的；但是，在本發(fā)明范圍中所主張的可能的多種修飾是可以認(rèn)可的。因此，可以理解雖然本發(fā)明被采取的優(yōu)選的實(shí)施方案所公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員所做的可選擇的特征、修飾與概念的改變，但是這些修飾和改變包含在被附加的權(quán)利主張定義的本發(fā)明的范圍。本發(fā)明是廣泛的和一般性的描述。屬于上位公開(kāi)的每個(gè)窄的物種和亞群也形成本發(fā)明的部分。不管指定的材料是否是這里特定提到的，只要沒(méi)有脫離該類(lèi)的主題包括在本發(fā)明公開(kāi)的上位描述中。其它實(shí)施方案也在下述權(quán)利主張中。另外，本發(fā)明的特色或方面按照Markush組描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認(rèn)可按照Markush組的其它具體成員或小組成員進(jìn)行本發(fā)明的描述(權(quán)利要求1.一種繁育不攜帶傳染性微生物且PERV的拷貝數(shù)在0到30之間的豬種群的方法，所述的方法包括以下步驟(a)篩選具有有益的微生物譜的雄性和雌性的奧克蘭島豬，(b)使步驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的攜帶有益微生物譜且PERV的拷貝數(shù)在0～30之間的后代；由此，通過(guò)步驟(c)篩選的后代適合用于異種移植。2.—種繁育具有不攜帶傳染性微生物和PERV拷貝數(shù)在0和30之間和血型為O型和/或不攜帶PERV-C的豬的種群的方法，所述方法包括下列步驟(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性?shī)W克蘭島豬，(b)使步驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的后代，其具有有益微生物譜和PERV的拷貝數(shù)在030之間和血型為O型和/或不攜帶PERV-C;由此，通過(guò)歩驟(c)篩選的后代適合用于異種移植。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(b)中的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代具有PERV拷貝數(shù)在0到25之間。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在0到20之間。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在O到18之間。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在O到16之間。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在0到14之間。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在O到12之間。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步驟(b)中的雄性和/或雌性豬和/或在步驟(c)后代中的PERV拷貝數(shù)在O到IO之間。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中步驟(b)中的雄性和/或雌性豬和/或歩驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在0到8之間。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或歩驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在0到7之間。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中歩驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或歩驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在0到6之間。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中步驟(b)的雄性和/或雌性豬和/或步驟(c)的后代的PERV拷貝數(shù)在0到5之間。14.根據(jù)權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和步驟(c)的有益微生物譜包含未達(dá)到可檢測(cè)水平的皰疹病毒、豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒(PLHV)、豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬環(huán)行病毒(PCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、弓形蟲(chóng)、附紅細(xì)胞體、布魯氏菌、李斯特菌、分枝桿菌TB、鉤端螺菌、豬嗜血桿菌，任何引起豬繁殖與呼吸綜合征的病毒、任何引起狂犬病的病毒、任何引起偽狂犬病的病毒、細(xì)小病毒、腦心肌病毒、任何引起豬水皰病的病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒(techen)，任何引起使腦心肌紅細(xì)胞凝集的病毒、豬A型流感病毒、腺病毒、傳染性腸胃炎病毒和水皰性口炎病毒。15.根據(jù)權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的方法，其中為保持種群，在步驟(C)中篩選出來(lái)的雄性和雌性后代可在步驟(b)中交配以產(chǎn)生可用于異種移植的次下一代。16.根據(jù)權(quán)利要求1到15任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括對(duì)特定血型的進(jìn)一步篩選以或者與潛在的異種移植受體匹配，或者與體外培養(yǎng)所用血清的抗原譜匹配，以便減少免疫反應(yīng)引起的組織排異和/或細(xì)胞損傷。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中步驟(a)中篩選的豬是O型血。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中步驟(a)中篩選的豬不攜帶PERV-C。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中步驟(a)中篩選的豬是O型血且不攜帶PERV-C。20.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中歩驟(c)中篩選的后代是O型血。21.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中步驟(c)中篩選的后代不攜帶PERV-C。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中步驟(c)中篩選的后代是O型血且不攜帶PERV-C。23.根據(jù)權(quán)利要求1到22任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括對(duì)提呈在細(xì)胞表面的免疫原性抗原的進(jìn)一步篩選以減少對(duì)體內(nèi)或體外的器官、組織或細(xì)胞的排異或損傷。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的免疫原性抗原是MHC分子。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述MHC分子是MHCI類(lèi)抗原。26.由根據(jù)權(quán)利要求1到25任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)豬。27.—個(gè)或多個(gè)不攜帶傳染性微生物且PERV的拷貝數(shù)在0到30之間的豬，其中所述一個(gè)或多個(gè)豬是通過(guò)包含下列步驟的方法產(chǎn)生.-(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性?shī)W克蘭島豬，(b)使步驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的具有有益微生物譜且PERV的拷貝數(shù)在030之間的后代。28.—個(gè)或多個(gè)不攜帶傳染性微生物且PERV的拷貝數(shù)在0到30之間和血型為O型和/或不攜帶PERV-C的豬，其中所述的一個(gè)或多個(gè)豬是通過(guò)包含下列步驟的方法產(chǎn)生(a)篩選具有有益微生物譜的雄性和雌性?shī)W克蘭島豬，(b)使歩驟(a)中篩選的雄性和雌性豬進(jìn)行交配，(c)篩選通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的具有有益微生物譜且PERV的拷貝數(shù)在030之間的后代。29.—個(gè)或多個(gè)分離自通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1到25的任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)豬的器官、組織或細(xì)胞，其中所述器官、組織或細(xì)胞是不攜帶傳染性微生物并且PERV的拷貝數(shù)在0到30之間，并且特別適合移植到異基因受試者中，包括人體。30.根據(jù)權(quán)利要求29的分離自一個(gè)或多個(gè)豬的一個(gè)或多個(gè)器官、組織和細(xì)胞，其中所述的一個(gè)或多個(gè)豬是7到21天齡的新生豬。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的一個(gè)或多個(gè)器官、組織和細(xì)胞篩選自或分離自肝、肺、心臟、腦、胰腺、肌肉、血、骨、睪丸或卵巢。32.根據(jù)權(quán)利要求31的一個(gè)或多個(gè)器官，其所述一個(gè)或多個(gè)器官適合于整體器官的異體移植并且是選自肝、肺或心臟。33.根據(jù)權(quán)利要求29或30的一個(gè)或多個(gè)組織或細(xì)胞是選自胰島、肝細(xì)胞、肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞、膽囊內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、膽管內(nèi)皮細(xì)胞、肝管上皮細(xì)胞、肝管內(nèi)皮細(xì)胞、竇細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、塞爾托利細(xì)胞、腎上腺嗜鉻細(xì)胞或肌肉細(xì)胞。34.可移植的組合物，包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求29到33任一項(xiàng)的分離的豬的器官、組織或細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。35.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物進(jìn)一步包含分離自通過(guò)權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)豬的飼養(yǎng)細(xì)胞，如纖維原細(xì)胞或塞爾托利細(xì)胞。36.從根據(jù)權(quán)利要求1到25中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)豬中分離的至少一個(gè)器官、組織或細(xì)胞在制備用于治療正遭受或傾向于得病、紊亂或與器官功能缺陷或喪失有關(guān)的疾病的患者的可移植組合物或設(shè)備中的用途，所述器官、組織或細(xì)胞不攜帶傳染性微生物且PERV的拷貝數(shù)在030之間。37.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中至少一個(gè)分離的器官、組織或細(xì)胞是分離自7到21天齡的新生豬。38.—種治療正遭受或傾向于得病、紊亂或與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病的的患者的方法，包括移植給患者其需要的分離自根據(jù)權(quán)利要求1到25任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)豬的器官、組織或細(xì)胞。39.—種治療正遭受或傾向于得病、紊亂或與器官功能缺陷或喪失有關(guān)的疾病的患者的方法，包含給予患者所需要的有效量的一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求34或35的可移植組合物。40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的方法，其中所述缺陷或喪失是肝功能內(nèi)或肝功能的缺陷或喪失，并且可移植組合物包括肝細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞、膽囊細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝血管細(xì)胞或竇細(xì)胞。41.根據(jù)權(quán)利要求38或39的方法，其中所述缺陷或喪失是胰腺功能內(nèi)或者胰腺功能的缺陷或喪失，并且可移植組合物包括胰島細(xì)胞。42.根據(jù)權(quán)利要求38或39的方法，其中所述缺陷或喪失是神經(jīng)功能內(nèi)或神經(jīng)功能的缺陷或喪失，并且可移植組合物包括脈絡(luò)叢細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及篩選和保持?jǐn)y帶低拷貝豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒豬種群的方法以及這種豬作為適合異種移植的細(xì)胞、組織和/或器官的來(lái)源的用途。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及從這種豬中篩選適合用于異種移植的細(xì)胞、組織或器官的方法。文檔編號(hào)A01K67/02GK101160044SQ200680012602公開(kāi)日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年4月13日優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日發(fā)明者A·B·弗格森,O·加爾卡文科,R·B·埃利奧特申請(qǐng)人:生命細(xì)胞產(chǎn)品有限公司