專利名稱：新聚合物材料和方法
新聚合物材料和方法本專利申請(qǐng)要求我們的實(shí)審中美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其序號(hào)
為60/656,743,是2005年2月25日提交的。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明的領(lǐng)域是雜聚合物，尤其肽和糖構(gòu)成其主鏈的雜聚合物。
背景技術(shù)：
許多天然和合成的雜聚合物類化合物是業(yè)內(nèi)已知的。例如，糖肽常見于大多數(shù)真核細(xì)胞中和細(xì)胞膜上。在大多數(shù)情況下，糖肽是在細(xì)胞中酶促地和后轉(zhuǎn)譯地合成的。因此，從結(jié)構(gòu)觀點(diǎn)來看，這樣的分子的主鏈?zhǔn)且环N有共價(jià)地附著到多肽主鏈的側(cè)鏈R基團(tuán)上的糖基側(cè)鏈的多肽。同
樣，已知許多天然多糖攜帶一種或多種氨基酸。例如，胞壁質(zhì)(即一種包含N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的聚合物)典型地是用一種五肽衍生的，該五肽共價(jià)地偶合到該胞壁質(zhì)中的N-乙酰胞壁酸上，充當(dāng)2條或多條多糖鏈之間的交聯(lián)劑。再一次從結(jié)構(gòu)觀點(diǎn)來看，這樣的分子的主鏈也是一種有寡肽作為側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)地與其鍵合的多糖。
值得注意的是，盡管可以得到許多碳水化合物和氨基酸結(jié)構(gòu)單元，但一般地說，除相對(duì)少數(shù)和有選擇的分子外，尚無關(guān)于其中碳水化合物和肽構(gòu)成雜聚合物主鏈的雜聚合物的報(bào)告。例如，在Biochem Pharmacol.2005 Nov 1; 70(9):1277-87中報(bào)告了由DNA和PNA部分組成的混合主鏈雜聚合物。在這篇論文中，2個(gè)DNA部分的糖磷酸酯主鏈連接到一個(gè)PNA部分的肽主鏈上。類似地，Zhang等在Bioorg. Med. Chem. Letter2001 May 21; 11(10):1269-72中描述了 PNA (肽核酸)和乳糖構(gòu)成其主鏈的某些嵌合體分子。雖然這樣的聚合物有關(guān)于核酸雜化方面的理想性能，但各種缺點(diǎn)可能依舊。除其它方面外，在其主鏈包括DNA部分的情況下，由于主鏈中的璘酸根，在生理pH時(shí)典型地存在負(fù)電荷。
美國(guó)專利No.6，740,310中描述了其它官能化聚酯接枝共聚物，其組成為一種有至少一種氨基酸根摻入其中的線型a-羥基酸聚酯主鏈和至少一條從該聚酯中的氨基酸根延伸出來的聚(氨基酸)側(cè)鏈。在又進(jìn)一
4步實(shí)例中，在又進(jìn)一步實(shí)例中， 一種透明質(zhì)酸聚合物和一種要么非離子型聚合物、要么聚合物膠、要么其組合的第二聚合物組合生成某些雜聚
合物，如以前在美國(guó)專利申請(qǐng)No.2005/0084537中所述的。雖然這樣的聚合物可以提供某些優(yōu)點(diǎn)，但受控和高產(chǎn)率合成往往是困難的。進(jìn)而，這樣的合成聚合物中很多當(dāng)植入時(shí)可能在動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)。
因此，雖然雜聚合物的許多組合物和方法是業(yè)內(nèi)已知的，但它們?nèi)炕驇缀跞坷_于一種或多種缺點(diǎn)。最顯箸的是，在除含PNA化合物外的化合物中氨基酸和糖構(gòu)成其主鏈的混合主鏈雜聚合物并不是已知的。因此，目前仍有提供改進(jìn)的雜聚合物之需要，尤其有氨基酸-碳水化合物混合主鏈的雜聚合物。
發(fā)明概要
本發(fā)明涉及雜聚合物組合物和方法，其中至少一種碳水化合物片斷和至少一種氨基酸片斷構(gòu)成該聚合物的主鏈。
在本發(fā)明主題的一個(gè)方面， 一種嵌合體聚合物有按照下式的結(jié)構(gòu)[(M)xl(N)yl]zl[(M)x2(N)y2]22，式中M獨(dú)立地是一種碳水化合物片斷，且N獨(dú)立地是一種氨基酸，式中xl、 x2、 yl、 y2、 zl、和z2獨(dú)立地是1-10000(含1和10000)的整數(shù)，式中xl當(dāng)y2大于或等于1時(shí)任選地為零，且式中y2當(dāng)xl大于或等于1時(shí)任選地為零，且式中該碳水化合物片斷和該氨基酸彼此偶合，使得該碳水化合物片斷和該氨基酸單元構(gòu)成該聚合物的主鏈。
最好，xl和x2中至少一個(gè)是2 20的整數(shù)，和/或yl和y2中至少一個(gè)是2 20的整數(shù)。典型地，該氨基酸是經(jīng)由該a氨基與該a羧基之間的共價(jià)鍵而成為該主鏈的一部分的，和/或該碳水化合物是經(jīng)由酰胺鍵偶合到該氨基酸上的。在又進(jìn)一步的期待方面，該碳水化合物片斷中至少一個(gè)包含一種環(huán)狀糖，和/或包含至少一種非天然存在的糖。當(dāng)希望時(shí)，在所期待聚合物中M和N中至少一個(gè)包含一種交聯(lián)性官能度，其中該交聯(lián)性官能度較好共價(jià)地鍵合到另 一種嵌合體聚合物的另 一種交聯(lián)性官能度上，從而生成一種交聯(lián)聚合物。在又進(jìn)一步的較好方面，該交聯(lián)聚合物是一種任選地包括醫(yī)藥劑和細(xì)胞中至少一種的水凝膠，且該聚合物是配制成一種適合于植入、注射、和經(jīng)口給藥中至少一種的配方的。
因此，在本發(fā)明主題的另一個(gè)方面，期待包含權(quán)利要求1的嵌合體
5聚合物和醫(yī)藥活性劑的醫(yī)藥組合物。當(dāng)希望時(shí)，該醫(yī)藥活性劑是封裝于可生物降解聚合物中或共價(jià)地附著到該聚合物上的。替而代之，或此
外，該醫(yī)藥活性劑是一種多肽，且(N)y!和(N)y2中至少一個(gè)包含該醫(yī)藥活性劑。在至少一些情況下，較好的是，該聚合物有適合于降解的組成，從而能釋放出該醫(yī)藥活性劑。在替代的方面，所期待的聚合物也可以一種能發(fā)生生物侵蝕和/或受控釋放的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明主題的又另 一方面，含細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以包括所期待的嵌合體聚合物，或可以從所期待的嵌合體聚合物構(gòu)建。較好，這樣的結(jié)構(gòu)中的嵌合體聚合物是與至少 一種其它嵌合體聚合物交聯(lián)的，且最好與其它嵌合體聚合物形成一種水凝膠。除其它構(gòu)型外，這樣的結(jié)構(gòu)尤其適合于離體細(xì)胞生長(zhǎng)、甚至適合于活體細(xì)胞生長(zhǎng)(例如，呈一種含細(xì)胞植入物的形式)。例如，這樣的聚合物可以用來生長(zhǎng)和/或擴(kuò)大千細(xì)胞，后者可以誘發(fā)到也可以不誘發(fā)到在該聚合物中或上的分化。此外，或替而代之，所期的聚合物可以用來作為所植入器件(可以包括也可以不包括細(xì)胞)的涂料。
從本發(fā)明的較好實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的、特色、形態(tài)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加顯而易見。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是使用有對(duì)照化合物和所期待化合物的DNA多叢的各種瓊脂糖凝膠電泳照片。
圖2A是一幅圖，說明與對(duì)照的和本文中提供的各種嵌合體聚合物DNA制劑接觸的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
圖2B是一幅圖，說明用對(duì)照的和本文中提供的各種嵌合體聚合物培育的細(xì)胞的生存性。
圖3是一幅圖，說明對(duì)某些嵌合體聚合體的免疫反應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)的ELISA結(jié)果。
圖4A是一幅圖，說明使用枯草桿菌蛋白酶A和二賴氨酸聚合物(Poly 1 )的降解研究的結(jié)果。
圖4B是一幅圖，說明使用枯草桿菌蛋白酶A和三賴氨酸聚合物(Poly 2)的降解研究的結(jié)果。
圖4C是一幅圖，說明使用胰蛋白酶和二賴氨酸聚合物(Poly)的降解研究的結(jié)果。詳細(xì)描述
本發(fā)明者總體上期待雜聚合物的組合物和方法，其中至少一種碳水化合物片斷和至少一種氨基酸片斷構(gòu)成該雜聚合物的主鏈。最好，所期待的雜聚合物將包括與一個(gè)或多個(gè)寡肽或多肽部分共價(jià)偶合的一個(gè)或
多個(gè)單糖、寡糖、或多糖或有取代多醇(widesupra)部分。最典型地，較好是所期待的雜聚合物將包括多個(gè)且交替的寡糖和/或多糖和寡肽和/或多肽部分，如以下結(jié)構(gòu)I中示意地說明的。然而，其它排列地視為適合于本文中使用。
t
糖肽雜共聚物結(jié)構(gòu) /
-使用這樣的總體思路，應(yīng)當(dāng)知道的是，該氨基酸/肽部分和該糖部分中至少一種可以是支化的，或提供可以用于支化的反應(yīng)性基團(tuán)(例如，使用進(jìn)一步的肽和/或糖部分，或其它基團(tuán))或其它共價(jià)的或非共價(jià)的相互作用。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，按照本發(fā)明主題的雜聚合物可以制備成線型的、支化的、超支化的、或樹枝狀的分子，如以下結(jié)構(gòu)II中例示性說明的。樹枝狀聚合物
結(jié)構(gòu)
除其它所期待的方案外， 一般較好的是，糖部分與氨基酸和/或肽部分的共價(jià)偶合將是使用業(yè)內(nèi)眾所周知的合成程序經(jīng)由酰胺鍵形成進(jìn)行的，然而，許多其它共價(jià)鍵也可能是合適的，包括酯鍵、醚鍵、仲胺鍵、或酰亞胺鍵。例如，酰胺鍵可以通過使該糖部分的活化糖酸基與氨基酸
或肽部分的氨基反應(yīng)(例如使用酰氯與氨基，或使用DCCD或其它試劑使羧基活化)、經(jīng)由開環(huán)聚合反應(yīng)(例如使用糖內(nèi)酯與氨基)、經(jīng)由Click型反應(yīng)(例如使用糖氮化物與乙炔改性肽)、經(jīng)由N-烷基羥胺與ct-酮酸的縮合(例如使用糖酸與羥胺肽)等生成。在以下實(shí)驗(yàn)部分提供了這樣的合成路線的代表性實(shí)例。
替而代之，也期待的是，按照本發(fā)明主題的化合物可以通過各自端基使用第三類化合物的交聯(lián)制備。然后，這樣的交聯(lián)劑可以例如使用反應(yīng)性基團(tuán)以如上所述方式反應(yīng)，生成相應(yīng)酰胺鍵。無論所采取的實(shí)際合成路線如何，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，合成一般地將遵循成熟的路線和程序，而且可以容易地調(diào)制，從而達(dá)到實(shí)際上數(shù)目無限的組合。進(jìn)而，這些嵌合體聚合物可以通過二硫化物鍵、氨基陽(yáng)離子(-NH3+)與羧酸根陰離子(-COO—)之間的離子型相互作用、極性基團(tuán)(羥基、氨基、硫代、酰胺基、羧基等)之間的氫鍵鍵合和疏水的范德化相互作用交聯(lián)。
期待的碳水化合物
一般來說，所期待的是，本文中陳述的嵌合體聚合物中適用的碳水化合物包括單糖(即單一糖)、寡糖(即以線型或支化方式彼此共價(jià)偶
合的2 20個(gè)糖)、和多糖(即以線型或支化方式彼此共價(jià)偶合的21~00000 (甚至更多)個(gè)糖)。在該碳水化合物是一種寡糖或多糖的情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，這些糖可以是相同的也可以是化學(xué)上各異的。也要理解的是，碳水化合物，糖(sugar)和糖(saccharide)這些術(shù)語(yǔ)在此是可互換地使用的，而且有相同的含義。進(jìn)而，碳水化合物這一術(shù)語(yǔ)也包括下式的開鏈多醇
RB-[CHOH]n-RT
有可多達(dá)12個(gè)碳原子，其端基Rb和Rt逸自CHO、N3、 CH2OH、 COOH、COCl、 co-o-烷基(烯基)，或末端羧基可以與丫羥基化合生成一種雙
內(nèi)酯。諸如多醇二羧酸的羥基可以衍生成為丙酮化合物或有各種其它基團(tuán)，包括烷基。也包括的是這樣的分子，其中一個(gè)或多個(gè)羥基由氨基或乙酰胺基置換。進(jìn)而，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到該開鏈碳水化合物可以呈醛糖或酮糖形式。
進(jìn)而，關(guān)于該碳水化合物的來源，期待的是，該碳水化合物可以是天然存在的或合成的碳水化合物，所述碳水化合物可以進(jìn)一步加工要不然化學(xué)改性成一種預(yù)定結(jié)構(gòu)和/或分子量。例如，天然存在的碳水化合物包括淀粉、糖原、直鏈淀粉、p-葡聚糖等，這些可以酶促地、化學(xué)地、和/或機(jī)械地加工成一種特定尺寸。此外或替而代之，該碳水化合物可以化學(xué)地或酶促地改性得能包括一個(gè)或多個(gè)所希望的側(cè)基和/或取代基?？捎糜诒景l(fā)明主題的聚合物的合成碳水化合物可以使用酶促程序或合成程序制備，特別好的是，這樣的合成碳水化合物已經(jīng)包括隨后與氨基酸和/或肽偶合所需要的反應(yīng)性基團(tuán)和保護(hù)基團(tuán)。然而，無論該碳水化合物的來源如何，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，反應(yīng)性基團(tuán)和/或保護(hù)基團(tuán)可以使用業(yè)內(nèi)眾所周知的方法和方案導(dǎo)入該碳水化合物中。
進(jìn)一步期待的例示性碳水化合物包括這樣的碳水化合物，其中該糖
的環(huán)狀部分中的雜原子是一種除氧外的原子(例如^fu、碳、或氮)類似
物，而其它替代糖可以不是環(huán)狀的，但可以呈線型(開鏈)形式。所期的糖可以是氧化的或還原的碳水化合物。適用的糖也可以包括一個(gè)或多個(gè)雙鍵。又進(jìn)一步具體期待的替代糖包括那些有一個(gè)或多個(gè)非羥基的取
代基者，且特別期待的取代基包括一、二、和三磷酸酯(較好Cs酯)、烷基、烷氧基、卣素、氨基、酰胺基和烷胺基、含疏取代基等。還進(jìn)一步期待的是，有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的碳水化合物中所有期待的取代基(幾基取代
基和非羥基取代基)均可在a-或(3-構(gòu)型中涉及。
所期待的糖和糖類似物中許多是商業(yè)上可得的。然而，在所期待的糖不是商業(yè)上可得的情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，業(yè)內(nèi)有各種不同的已知方法來合成這才豐的糖。例如，適用的實(shí) -瞼方案可以參閱"ModernMethods
3718659212)， in U.S. Pat Nos. 4,880,782 和3,817,982, in WO88/00050,或m EP199,45。以下
說明進(jìn)一步期待的糖和糖類似物的一個(gè)例示性集合，其中例示性糖均可呈D-或L-構(gòu)型，且其中端基差向異構(gòu)體碳上的取代基中至少一個(gè)可以進(jìn)一步呈要么a要么(3取向。單糖、寡糖、和多糖大多數(shù)表示為五員環(huán)(呋喃糖)或六員環(huán)(吡喃糖)。以下說明一種例示性吡喃糖，其中R獨(dú)立地如以上定義。最好，R中至少一個(gè)是OH、 NH2、 NH-?；騂，且雜原子選自O(shè)、 S、 Se、和N-R組成的一組。關(guān)于適用六員環(huán)糖的立體化學(xué)，適用與以上對(duì)五員環(huán)糖相同的考慮。
特別期待的一類糖包含以上糖的寡糖形式，其中構(gòu)成主鏈的一部分的糖分子數(shù)目在1 100之間、更典型地在2 50之間。在該糖呈環(huán)狀形式的情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，該偶合可以采用該糖上任何可供利用基團(tuán)，包括端基差向異構(gòu)體碳原子(例如，生成1,6或1,4連接分子)。端基差向異構(gòu)體碳上的偶合可以是a或P。然而，其它共價(jià)偶合也認(rèn)為是適用的。
類似地，所期待的線型糖最好經(jīng)由各自的末端官能團(tuán)偶合到相鄰分子(例如糖和/或氨基酸)上。例如，在該糖呈醛糖形式的情況下，與相鄰分子的偶合典型地采用末端/伯羥基。該羥基中一個(gè)或多個(gè)氧化成相應(yīng)的醛、酮或羥酸基也是所期待的，因而偶合也可以包括縮醛、縮酮、酯、^琉代酯、亞胺、胺、和酰胺等。
H. Khan (Gordoi》& Breach Science Pub; ISBN:所期待的肽和氨基酸
總體上期待的是，本文中陳述的嵌合體聚合物中使用的氨基酸和肽可以獨(dú)立地以許多形式和結(jié)構(gòu)排列存在。例如，所期待的聚合物包括單
一氨基酸(例如，天然存在的、蛋白原的、或其它的)、寡肽(即2~20個(gè)以線型或支化方式彼此共價(jià)偶合的氨基酸)、和多肽(即20 100000(甚至更多)個(gè)以線型或支化方式彼此共價(jià)偶合的氨基酸)。當(dāng)然，在該肽是一種寡肽或一種多肽的情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，該氨基酸可以是相同或化學(xué)上各異的，和/或該肽可以是線型的或支化的。關(guān)于該肽和/或氨基酸的來源，期待的是，這些化合物可以是天然存在的或合成的，而且它們可以進(jìn)一步加工要不然化學(xué)改性成預(yù)定結(jié)構(gòu)和/或分子量。例如，天然存在的氨基酸和肽包括所有蛋白原氨基酸、呈D-和L-構(gòu)型的各種天然和合成的a-氨基酸(及其混合物)、結(jié)構(gòu)性多肽(例如角蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、膠原蛋白等)、催化活性肽(例如氧化還原酶、脫氫酶等)、結(jié)合肽(例如清蛋白、各種球蛋白等)等，且這些當(dāng)中每一種都可以酶促地、化學(xué)地、和/或機(jī)械地加工成某一特定尺寸。
序和/口或合成程序(例:固-目或溶液相)制i:而且特別好的是，這樣的合成肽已經(jīng)包括隨后與碳水化合物偶合所需要的反應(yīng)性基團(tuán)和/或保護(hù)基團(tuán)。然而，不管該氨基酸和/或肽的來源如何，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，反應(yīng)性基團(tuán)和/或保護(hù)基團(tuán)也可以使用業(yè)內(nèi)眾所周知的方法和方案導(dǎo)入該化合物中。此外或替而代之，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，適用的肽可以化學(xué)改性和/或酶促改性得包括一個(gè)或多個(gè)所希望的官能團(tuán)或取代基，然后可以執(zhí)行特定的所希望功能和/或提供經(jīng)調(diào)整的物理化學(xué)性能。例如，天然的和/或合成的肽可以進(jìn)行酶促消化，以提供所希望的分子量(分布)或特定的化學(xué)組成。在其它實(shí)例中，該肽也可以進(jìn)行糖基化或其它改性，較好使用該肽主鏈以外的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)。
在本發(fā)明主題的一個(gè)方面，適用的氨基酸較好有式CR-tR2(CCV)(NH3+),式中R和R2獨(dú)立地是H、芳基、雜芳基、芳烷基、烷基、烯基、炔基、和環(huán)烷基，任選地有OH、 SH、 SCH3、 COOH、 NH2、CONH2、咪唑基、呋喃基、瘞吩基、或吲哚基取代(以上烴基中每一個(gè)都可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)雜原子[例如O、 S、 Se、 N、 P]),且其
ii中Ri和R2也可以形成一個(gè)環(huán)(任選地有NH2，從而生成一種脯氨酸或 脯氨酸樣氨基酸)。在R,和R2不相同的情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該氨基 酸會(huì)有一個(gè)或多個(gè)手性中心，而且所有對(duì)映體、非對(duì)映體、外消旋物及 其混合物均認(rèn)為是適當(dāng)?shù)?。因此，在所期待的氨基酸?dāng)中，所有合成(非 天然)的和天然存在的氨基酸、尤其蛋原氨基酸均可期待在本文中使 用。相對(duì)于羧基而言，該氨基可以在a位、p位、rf立、S位、和e位。在 不太好的方面，將該氨基酸改性得包括一種雜環(huán)堿。因此，至少在一些 情況下，將這樣的化合物從本發(fā)明主題的范圍排除出去，其中該氨基酸 改性得包括腺噤呤、鳥噤呤、胞嘧啶、胸苷、和/或尿嘧啶(或能發(fā)生 Watson-Crick雜化的其它核堿)。
在較好的方面，所期待的氨基酸彼此偶合生成一種寡肽或多肽，最 好在一種氨基酸的氨基與第二種氨基酸的羧基之間生成至少一個(gè)酰胺 鍵。然而，應(yīng)當(dāng)知道的是，也可以生成許多替代鍵來供價(jià)地偶合2種氨 基酸，且2種氨基酸之間的特定鍵會(huì)至少部分地取決于第一種氨基酸和 第二種氨基酸的化學(xué)組成。最典型地，包含氨基酸的主鏈部分將由2種 或多種oc-氨基酸之間的酰胺鍵構(gòu)成。替而代之，主鏈也可以包括在a-氨 基酸與P-或Y-氨基酸之間生成的鍵、 一種諸如與賴氨酸的s-氨基偶合的a-氨基酸的羧基或非酰胺鍵(例如酯鍵、酰亞胺鍵、疏代酯鍵、醚鍵、二 硫化物鍵等)。
本文中使用的"烷基"這一術(shù)語(yǔ)系指飽和烴基，呈直鏈、支化、手 性或非手性、或環(huán)狀構(gòu)型(也簡(jiǎn)稱為環(huán)烷基，見下文)，特別期待的烷 基包括低級(jí)烷基(即有6個(gè)或更少碳原子的烷基)。例示性烷基是曱基、 乙基、丙基、2-丙基、丁基、2-丁基、2-曱基丙基、2,2-二甲基乙基、戊 基、2-甲基丁基、己基等。
本文中使用的"烯基"系指直鏈或支化、手性或非手性、有至少一 個(gè)雙鍵的不飽和烴基。因此，特別期待的烯基包括直鏈或支化、有2~6 個(gè)碳原子的基團(tuán)(例如乙烯基、l-丙烯基、2-丙烯基、l-丁烯基、2-戊烯 基等)。
類似地，本文中使用的"炔基，，這一術(shù)語(yǔ)系指有至少一個(gè)三鍵的不 飽和烴基。特別期待的炔基包括直鏈或支化、有合計(jì)2 6個(gè)碳原子的炔 (例如乙炔基、1-丙炔基(炔丙基)、2-丁炔基、2-戊炔基等)。
本文中使用的"環(huán)烷基"這一術(shù)語(yǔ)系指環(huán)狀烴基(即其中烴的碳原
12子鏈構(gòu)成一個(gè)環(huán))，較好包括3 8個(gè)碳原子。因此，例示性環(huán)烷基包括 環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步知道 的是，環(huán)烷基也可以包括雙鍵(稱為環(huán)烯基)，例如環(huán)己烯基。
本文中使用的"芳基"這一術(shù)語(yǔ)系指芳香族烴環(huán)，該環(huán)可以進(jìn)一步 包括一個(gè)或多個(gè)雜原子(因而也簡(jiǎn)稱為雜芳基)。因此，例示性芳基包 括苯基、萘基等，而且所期待的雜芳基包括2-和3-吡啶基、2-和3-瘞吩 基、3-吲哚基、4-咪唑基等。
所期待的芳烷基包括千基和苯乙基。
本文中使用的"烷氧基"這一術(shù)語(yǔ)系指直鏈或支化鏈烷氧化物，其 中烴部分可以有任何數(shù)目的》友原子(而且可以進(jìn)一步包括雙4定或三 鍵)。例如，適用的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、2-丙氧基等。
類似地，"烷疏基"這一術(shù)語(yǔ)系指與硫原子連接的直鏈或支化烷基， 其中烴部分可以有任何數(shù)目的碳原子(而且可以進(jìn)一步包括雙鍵或三 鍵)。例如，所期待的烷硫基包括甲硫基(MeS)、乙硫基、丙硫基等。 "烷胺基"這一術(shù)語(yǔ)系指與NH基連接的直鏈或支化烷基，其中烴 部分可以有任何數(shù)目的碳原子(而且可以進(jìn)一步包^"雙4走或三4建，或可 以是環(huán)狀的)。進(jìn)而，該烷胺基的NH的氫可以有另一個(gè)烷基取代，導(dǎo) 致一種二烷胺基，其中2個(gè)烷基可以相同也可以不同。這些烷基中的一 個(gè)或兩個(gè)可以任選地有OH基取代。因此，例示性烷胺基和二烷胺基包 括甲胺基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、2-丙胺基、2-羥基乙胺基等。
本文中使用的"鹵素"這一術(shù)語(yǔ)系指氟、氯、溴、和碘。
也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上定義的基團(tuán)全部或幾乎全部可以有一個(gè)或多個(gè) 取代基取代，該取代基也還可以有取代。例如，在烷基中的氫原子有氨 基取代的情況下，該氨基上的一個(gè)或兩個(gè)氫原子可以有另外的基團(tuán)(例 如烷基或烯基)取代。
本文中使用的"取代，，這一術(shù)語(yǔ)系指一種原子或一種官能團(tuán)(例如 H、 NH2、或OH)用另一種原子或官能團(tuán)置換，特別期待的官能團(tuán)包括 -NH2， -OH， -SH， COOH， COOR,芳基，芳烷基，烷基，烯基，炔基， -NH3+,卣素，NHCOR， NHCONH2， NHCSNH2, 0(CH2)i. 4COOH, OCH2COMH2, OCH2CONHR， OC(Me)2COOH, OC(Me)2CONH2, NHCH2COOH, NHCH2CONH2, NHSOzK NHS02CF3, OCHr雜環(huán)' P03H, S03H, (CH2)wCOOH, ch-chcooh,nhcoch2ch(oh〉cooh,ch(P03h)2',nhcho,i r是烷基。期待的主鏈和連接鍵
總體上較好的是，本文中所期待的化合物的主鏈將包括至少一個(gè)碳 水化合物片斷和至少一個(gè)氨基酸片斷，甚至更好的是，這兩種片斷是獨(dú) 立地重復(fù)的。因此，該主鏈的一般結(jié)構(gòu)或子結(jié)構(gòu)可以用式I表示
式中M獨(dú)立地是一種碳水化合物片斷(例如單糖或類似物)，N獨(dú) 立地是一種氨基酸，且xl、 x2、 yl、 y2、和zl、 z2獨(dú)立地是1與若千 萬(wàn)之間的整數(shù)，其中xl當(dāng)y2大于或等于1時(shí)任選地為零，且其中y2 當(dāng)x大于或等于1時(shí)任選地為零。應(yīng)當(dāng)說明的是，在xl和/或x2大于1 的情況下，該碳水化合物片斷典型地(例如經(jīng)由縮合或糖苷鍵)共價(jià)地 偶合在一起。類似地，在yl和/或y2大于1的情況下，該氨基酸典型地 (例如經(jīng)由酰胺鍵)共價(jià)地偶合在一起。本文中使用"主鏈"這一術(shù)語(yǔ) 系指共價(jià)結(jié)合原子(例如碳、氧、或氮原子)或片斷(例如氨基酸或單 糖)的連續(xù)鏈，其中該原子或片斷中任何一個(gè)的脫除都會(huì)導(dǎo)致鏈的斷 裂。
因此，除各種其它主鏈外，特別好的主鏈包括那些包括多個(gè)、任選 地各異的肽部分者，而這些肽部分有多個(gè)、任選地各異的碳水化合物部 分分開。最好，該肽部分將包含合成的或天然存在的寡肽或多肽，該寡 肽或多肽是如此制備或改性的，以致該氨基酸線型序列的兩端都有至少
雖然該肽的一端可以是有一個(gè)a-氨基的N-末端，但該肽的另一端(即C-末端)可以由一種堿性氨基酸(例如賴氨酸或精氨酸)生成，反之亦然， 這在一個(gè)除a-位置外的位置上(例如賴氨酸的s位)提供了該氨基。肽主 鏈的一個(gè)例示性鏈段用式II說明(例如，式中Ri、 R2、 R3、和R"蟲立 地是H、任選地有取代的烷基或芳烷基)。
。 例如
14式 //
類似地，所期待的主鏈的碳水化合物部分可以有頗大差異，而且總 體上期待的是，該碳水化合物部分將包括至少一種或多種單糖或如以上 定義的多醇，這些可以獨(dú)立地呈開鏈構(gòu)型或呈環(huán)狀形式。最好，該碳水 化合物部分包括一種天然存在碳水化合物，但許多碳水化合物類似物、 合成碳水化合物、及其所有合理的組合也是所期待的。進(jìn)而，天然存在 碳水化合物部分典型地以這樣一種方式改性，以致能與肽部分的反應(yīng)性 基團(tuán)反應(yīng)。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該碳水化合物部分的端基可以是天然存
在的基團(tuán)、尤其包括OH基、CHO基、和COOH基。然而，在需要的 情況下，應(yīng)當(dāng)知道，可以將適用的反應(yīng)性基團(tuán)導(dǎo)入該碳水化合物部分。 例如，這樣的反應(yīng)性基團(tuán)包括特定的離去基團(tuán)、羰基由等。碳水化合物 部分的一個(gè)例示性鏈段說明于式III中(例如，式中R獨(dú)立地是H、 OH、 COOH、 CH2OH、烷氧基、NH2、 NHCO-烷基、任選地有取代的烷基或
芳基)。
典型地，所期待化合物的平均分子量將是約百至數(shù)十萬(wàn)、甚至更
所期待化合物的主i可以是線型"、線』而^^環(huán)2部分、支化的:或環(huán) 狀的。在又進(jìn)一步期待的方面，按照本發(fā)明主題的嵌合體聚合物也可以
15部分。例如，適用的聚合物可以包括經(jīng)由亞烷基、聚乙二醇、聚醚、或
彼此偶合的碳水化合物和/或肽片斷。最典型地， 力、:^1丙Z5、到承又T可別4守的氰丞吸和/孰萄 合物部分。
進(jìn)而，所期待化合物中的主鏈也可以是支化的。在這樣的化合物 中，該碳水化合物和該氨基酸中至少一種將包括一個(gè)或多個(gè)能偶合到另 一種碳水化合物和/或氨基酸上的官能團(tuán)。最典型地，所期待化合物中分 支的數(shù)目將取決于該碳水化合物和/或氨基酸的具體結(jié)構(gòu)、和所希望的用 途。因具體的結(jié)構(gòu)而異，分支可以用于交聯(lián)2條或更多條主鏈，因而， 所期待化合物也可以視為三維網(wǎng)絡(luò)。替而代之，或此外，支化聚合物也 可以通過多官能共聚單體的添加來合成，該共聚單體可以在該碳水化合 物和/或氨基酸片斷之間偶合。
當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)知道的是，該碳水化合物片斷和/或氨基酸片斷可以分別 制備、然后彼此偶合生成一條主鏈。這樣的偶合可以直接地(例如，經(jīng) 由糖的羥基與氨基酸的羧基之間的酯鍵，或經(jīng)由糖的羧基與肽的氨基之 間的酰胺鍵)或經(jīng)由銜接物間接地進(jìn)行，該銜接物可以不同于該碳水化 合物和/或氨基酸片斷(例如二醇銜接物)。替而代之或此外，可以采用
復(fù)雜'ii。二這樣:^聯(lián):可以包含二個(gè)或多個(gè)碳水化合物片斷和/或氨基i
片斷，也可以是完全不同的。
在本發(fā)明主題的另外方面，也期待的是，該主鏈的至少一端共價(jià)地 偶合到該主鏈上的一個(gè)位置而形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)。例如，在該主鏈的兩 端彼此共價(jià)地偶合的情況下，生成一條全環(huán)狀主鏈。這樣的環(huán)狀主鏈可 以特別有利地提供改進(jìn)的、對(duì)外作用肽酶、酯酶和糖苷酶的抗性。在另 一個(gè)實(shí)施例中，該主鏈的一端也可以偶合到該主鏈的一種側(cè)鏈官能團(tuán)上 而形成一種拴馬索型結(jié)構(gòu)(在這樣的偶合發(fā)生的情況下，雙拴馬索型結(jié)
構(gòu)也是所期待的)。在這樣的聚合物的氨基酸部分內(nèi)2個(gè)半胱氨酸殘基 的情況下，有二硫化物(-S-S-)鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)也是所期待的。
關(guān)于該碳水化合物部分和/或該氨基酸部分的序列，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該 序列可以是為某一特定目的設(shè)計(jì)的，也可以是一種無^L序列。例如，有 未表征化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的現(xiàn)行碳水化合物制劑(例如，來自植物細(xì)胞的 細(xì)胞壁制劑)可以偶合到已表征的寡肽上，形成一種雜基材。類似地，可以分離出或合成地制備一種包括一個(gè)有已知功能的鏈段的肽片斷(例
如亮氨酸拉鏈、或螺旋轉(zhuǎn)螺旋結(jié)構(gòu)、或細(xì)胞表面結(jié)合表位例如RGD等)， 然后可以將該片斷偶合到 一 種已表征來源或未表征來源的碳水化合物 上。在又進(jìn)一步期待的方面，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該碳水化合物片斷和該肽片 斷中至少一種可以包括一種有已知功能的分子的至少一部分。例如，碳 水化合物片斷可以包括與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞粘合、小分子結(jié)合(例如外源 凝集素型或離子結(jié)合)相聯(lián)系的部分。類似地，肽片斷可以包括與催化 功能(氧化還原酶、水解酶、裂合酶、連接酶等)?；瘜W(xué)功能(例如某 些酶的水解、蛋白水解等)、細(xì)胞識(shí)別功能(例如integrin結(jié)合的RGD 等)、結(jié)構(gòu)功能(例如膠原蛋白、肌球蛋白、微管蛋白等)、或其它功 能(例如生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞動(dòng)力因子、趨化因子等)相聯(lián)系的 部分。進(jìn)而，該碳水化合物和肽部分中至少一種當(dāng)它們從其母體聚合物 降解出來時(shí)可以充當(dāng)藥理學(xué)活性劑。例如， 一種或多種肽片斷一旦從相 鄰碳水化合物片斷釋放出來就會(huì)有醫(yī)藥活性(例如GnRH)。
應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，在碳水化合物片斷和/或氨基酸片斷有已知配體 的情況下，這樣的配體可以包括在所期待的組合物中。例如，在該氨基 酸片斷有聚天冬氨酸鏈的情況下，可以讓陽(yáng)離子(尤其CaZ或Mg2。偶 合(結(jié)合)到這樣的片斷上。類似地，在該碳水化合物片斷有已知的對(duì) 其它碳水化合物(例如外源凝集素)的親合性的情況下，適用的配體可 以包括在該組合物中。尤其應(yīng)當(dāng)指出的是，該主鏈中氨基酸和/或單糖的 進(jìn)一步衍生或?qū)徤魇褂每梢越o該嵌合體聚合物提供所希望的性能。例 如，可以將雜聚合物設(shè)計(jì)得具有特定凈電荷、電荷比、或設(shè)計(jì)得完全中 性的，如以下結(jié)構(gòu)III的例示性結(jié)構(gòu)所說明的nh3*
,coo-
O OH OH H H ， o H '
ooc.
O OH OH H H J O H
人n '0H /OH OH p 0丫09 H ( H
/v丫Vr^ii'V):V丄/
oohohH H」oh '
聚合物A: 陽(yáng)離子型的
聚合物B: 陰離子型的
聚合物C: 兩性離子型的
聚合物D: 中性的
ho'
結(jié)構(gòu)瓜
類似地，也可以將雜聚合物設(shè)計(jì)得具有與水溶液的特定相互作用
(例如，是親水的、兩親的、或疏水的)，如以下結(jié)構(gòu)IV的例示性結(jié) 構(gòu)所說明的
感 J綠"、/ O OH OH H H J o H ,
ho'
/、^V、條vu、/
o oh oh
h:noc' i
0^0
、/
0^0,
聚合物D:
親水的
聚合物， 親水的
聚合物F:
疏水的
聚合物G:
疏水的
結(jié)構(gòu)
18替而代之或此外，還可以將官能團(tuán)或其它分子實(shí)體添加到該碳水化 合物部分和/或該肽部分上，以實(shí)現(xiàn)該嵌合體聚合物的特定功能。例如， 在所期待的材料與細(xì)胞接觸的情況下，期待的是，該肽部分可以包括粘 合因子或能與細(xì)胞表面成分相互作用的其它肽。類似地，該碳水化合物 部分可以包括外源凝素(例如作為側(cè)鏈)或能與細(xì)胞的一種或多種表面 成分相互作用的觸角碳水化合物。進(jìn)一步期待的改性包括附著于主鏈上 的一種或多種催化片斷、結(jié)合片斷、信號(hào)發(fā)生片斷、和/或交聯(lián)片斷(要 么直接附著于該主鏈的一個(gè)原子上，要么經(jīng)由該主鏈外的一個(gè)側(cè)鏈基 團(tuán)，要么經(jīng)由外加的銜接物)。
因此，應(yīng)當(dāng)知道的是，所期待化合物的二維或三維網(wǎng)絡(luò)的形成可以 與該主鏈的形成同時(shí)形成，但也可以在這樣一種反應(yīng)中單獨(dú)形成，其中 將交聯(lián)性主鏈(或其它結(jié)構(gòu)，見以下)添加到多條預(yù)制主鏈中。例如， 在反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)附著到該主鏈上(例如肽部分的酪氨酸的苯酚基)的 情況下，可以采用這樣的基團(tuán)作為交聯(lián)目標(biāo)并使用 一種或多種交聯(lián)劑進(jìn) 行。
所期待的用途
本發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)，所期待的化合物中至少一些(最可能很多) 在離體系統(tǒng)中、甚至在活體系統(tǒng)中是低毒至無毒的，還發(fā)現(xiàn)這樣的化合 物顯示出優(yōu)異的生物兼容性。因此，本文中陳述的組合物和方法可認(rèn)為 在活體應(yīng)用和/或離體應(yīng)用中是特別有價(jià)值的，其中該嵌合體聚合物發(fā)揮 結(jié)構(gòu)性作用、生理學(xué)作用、和/或藥理學(xué)作用。除其它例示性用途外，所 期待的雜聚物可用來作為醫(yī)療器件(例如暫時(shí)植入物或永久植入物)的 涂布材料、作為(諸如千擾素、胰島素等，有或無定時(shí)釋放性能的)藥 物輸送栽劑、作為細(xì)胞培養(yǎng)物的可再吸收或永久性平臺(tái)(例如在組織培
養(yǎng)物中或用于培養(yǎng)干細(xì)胞)、作為食品和nutraceutical成分與添加劑、 作為化妝品應(yīng)用的局部和內(nèi)部無毒賦形劑、和/或作為整體植入物材沖牛。 應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，因肽結(jié)構(gòu)而異，所期待的聚合物可能隨pH、溫度、和/或 可用于經(jīng)口 、經(jīng)粘膜或經(jīng)局部施用的離子濃度的變化而發(fā)生溶膠-凝膠過渡。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，所期待組合物有許多用途，而且具體用途將至少部分 地決定特定結(jié)構(gòu)，反之亦然。除其它用途外，特別期待的用途包括這樣的用途，其中按照本發(fā)明主題的化合物用來作為可生物兼容的結(jié)構(gòu)元件 或涂料、作為醫(yī)藥劑載體、作為其它(任選地以可釋放方式附著的)分 子的平臺(tái)、作為(有或無定時(shí)釋放性能的)醫(yī)藥輸送載劑、作為細(xì)胞培 養(yǎng)物(例如在組織培養(yǎng)物中)的可再吸收或永久性平臺(tái)、作為食品和
nutraceutical成分與添加劑、作為化妝品應(yīng)用的局部和內(nèi)部無毒賦形 劑、和/或作為植入物材料。例如，較好的可生物兼容結(jié)構(gòu)元件包括可以 支撐一種組織的局部和可注射化妝品組合物，其中該組合物可以包括月吏 原蛋白或膠原蛋白碎片，且其中該膠原蛋白是經(jīng)由一種l-4-a-糖苷寡糖 偶合到另一種膠原蛋白上的。替而代之，該結(jié)構(gòu)元件可以用來作為細(xì)胞 培養(yǎng)物的支撐體以有助于特定組織和/或器官的形成。在這樣的實(shí)例中， 較好的是，所期待的化合物是相對(duì)親水的，而且會(huì)有凝膠狀稠度。進(jìn)而， 這樣的化合物對(duì)于干細(xì)胞生長(zhǎng)來說較好是可生物兼容的。
可生物兼容涂料可以包括這樣的涂料，其中(金屬)植入物被覆所 期待的化合物，以減少植入物/組織排異。在利用所期待化合物作為醫(yī)藥 栽體的情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該醫(yī)藥的釋放可以以許多方式控制。例如， 該醫(yī)藥可以用可生物兼容生物聚合物封裝，且生物降解和/或侵蝕可以以 一種預(yù)定方式釋放該醫(yī)藥。替而代之或此外，該醫(yī)藥可以共價(jià)地、離子 型地、或以其它方式偶合到該碳水化合物和/或肽片斷上，使得酶促(例 如酯酶或肽酶)或非酶促反應(yīng)(例如經(jīng)由氧化還原)就會(huì)釋^t該醫(yī)藥。 例如，帶正電荷聚合物可以用來作為基因輸送栽劑，其中該聚合物中氨 基酸的正電荷與核酸的帶負(fù)電荷磷酸根相互作用。在又進(jìn)一步期待的方 面，按照本發(fā)明主題的化合物將充當(dāng)一種平臺(tái)，使一種或多種分子實(shí)體 以 一種預(yù)定方式或隨機(jī)方式附著。這樣的化合物可以例如用來作為組合 體庫(kù)栽體，而該大分子平臺(tái)將充當(dāng)一種可衍生固相。
在又進(jìn)一步期待的方面，按照本發(fā)明主題的材料可以用來作為所希 望生物學(xué)結(jié)構(gòu)(例如血管內(nèi)膜層)或非生物學(xué)結(jié)構(gòu)(例如支架)上的層 狀涂料。最好，層狀涂料可以包含交替層，其中一層在某一pH時(shí)有正 凈電荷，而另一層在相同pH時(shí)有負(fù)凈電荷。這樣的多層涂料可以用文 獻(xiàn)上充分記載的逐層沉積方法制備。這樣的層主要由于庫(kù)侖相互作用而 將強(qiáng)烈地相互粘附。進(jìn)而，尤其在這些層形成于支架上的情況下，期待 的是，其中至少一層可以包括一種細(xì)胞和/或一種能釋放NO的化合物，
最好內(nèi)皮細(xì)胞和硝普鹽。實(shí)驗(yàn)
總
體考慮
所期待的合成路線 根據(jù)相對(duì)簡(jiǎn)單的化學(xué)及其許多眾所周知的程序，其中許多排列可以 以一種概念上無苛求方式生產(chǎn)。最好，該嵌合體聚合物的合成是使用預(yù) 制肽部分和預(yù)制碳水化合物部分執(zhí)行的。例如，肽部分和碳水化合物部
形成而彼此共價(jià)地偶合。在另一條路線中，肽部分和碳水化合物部分可
以使用一種雙內(nèi)酯和一種有2個(gè)末端氨基的肽的開環(huán)聚合而彼此共價(jià)地 偶合，如以下流程I中所示。
HQ M
H20, pH - 7,0 'NHj 室溫
A 、。H 糖衍生的雙內(nèi)醋
肽
OH OH
流程/
替而代之，該碳水化合物部分可以改性得具有末端疊氮基，然后利
用Click化學(xué)使其與一種有末端乙炔基的肽反應(yīng)生成該嵌合體聚合物， 如以流程II中例示性說明的。
' H H Y 6hoh 厶 6
糖模塊 舦模塊
HjO,室溫 杭?jí)难徕c
CuS04(1mol%>
"click化學(xué)"
流程if
糖-肽雜共聚物
在又另一種期待的思路中，該肽部分改性得包括末端羥胺基，而糖
部分改性得包括末端a-酮酸基。然后通過N-烷基羥基胺與a-酮酸的縮合 進(jìn)行該嵌合體分子的聚合，如以下流程III的實(shí)例中所說明的。
21糖模塊 , 肽棋塊
DMF
或H2。
糖-舦雜共聚物 流程瓜
所期待的聚合物的交聯(lián) 如此制備的嵌合體聚合物的交聯(lián)可以以許多相對(duì)簡(jiǎn)單的方式執(zhí) 行。最典型地，交聯(lián)可以利用能與該主鏈的側(cè)鏈基團(tuán)形成(共價(jià))鍵的 外源添加交聯(lián)劑的添加執(zhí)行，和/或利用該主鏈和/或側(cè)鏈中已經(jīng)存在的
化學(xué)執(zhí)行。例如，如以下流程IV中所說明的，嵌合體聚合物是從一種
有末端氨基的含酪氨酸三肽和一種有活化末端酸基如酰氯的糖部分制 備的。然后，這樣生成的嵌合體聚合物要么以一種過氧化物酶引發(fā)的反 應(yīng)要么以一種光催化氧化反應(yīng)交聯(lián)，形成各主鏈之間的苯-苯鍵。另外的 和/或替代的交聯(lián)方式，例如主鏈中半胱氨酸殘基所形成的二硫化物(-
s-s-)鍵，也是所期待的，而且尤其包括那些其中各聚合物之間的相互 作用是一種非共價(jià)相互作用者。例如，適用的交聯(lián)相互作用包括(NH3+ 與COCO之間的離子型相互作用、(OH、 NH2、 COOH、 SH、 CONH2) 之間的氫鍵合相互作用、和范德華力引起的疏水相互作用。反應(yīng)條件
I)界面聚合，H20/ca4:ll) 50%TFA/H2O
III)辣根過氣化物臶 (HRP), HOOH; iv> Ru(H)和過硫酸銨(APS)
流程
官能化嵌合體聚合物的制備 類似于交聯(lián)，官能化可以以許多方式進(jìn)4亍，而且可以通過添加外源 官能團(tuán)(例如標(biāo)記物、結(jié)合部分、催化部分、醫(yī)藥活性部分等)和/或在 該主鏈的側(cè)鏈基團(tuán)和/或該主鏈本身中包括官能團(tuán)來采用。該官能化可以 要么通過官能性共聚單體的共聚要么通過聚合后官能化進(jìn)行。 一種例示
性官能化方式見以下流程V,其中一種RGD肽改性的肽部分用開環(huán)聚 合化學(xué)與其它非改性肽部分組合，如以上所說明的。
<formula>formula see original document page 23</formula>合成例
以下方案和程序是作為業(yè)內(nèi)普通技術(shù)人員的例示性指導(dǎo)提供的。然 而，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為它們是對(duì)本發(fā)明主題的限制，因?yàn)榘被?肽成分和/或 碳水化合物成分可以容易地用等效成分置換而不背離本文中陳述的發(fā) 明概念。除其它地方外，還除迷了以上所期待的碳水化合物和所期待的 肽和氨基酸鏈段的例示性變異。在如以下所述的離體環(huán)境和活體環(huán)境中
測(cè)試了其中一些例示性嵌合體聚合物(見結(jié)構(gòu)V: 二賴氨酸、三賴氨酸、 和四賴氨酸衍生的半乳糖共聚物。
如以下進(jìn)一步描述的，測(cè)試了 Poly 1-3的基因輸送應(yīng)用。由于所期
待的結(jié)構(gòu)是可高度適配的，因而可相對(duì)容易地進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異以優(yōu)化基因 轉(zhuǎn)染水平同時(shí)維持相對(duì)低水平的細(xì)胞毒性。所執(zhí)行的初期操作涉及用附
加的L-賴氨酸殘基使該肽單體序列延長(zhǎng)，從而提高該聚合物總體的電荷 密度，且從而提供更強(qiáng)的DNA結(jié)合。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，在提高的電荷 密度改善了該聚合物系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染性的情況下，可以添加更多的殘基 直至發(fā)現(xiàn)最佳長(zhǎng)度。實(shí)測(cè)五賴氨酸單體不溶于水、或水/溶劑混合物中。 由于這個(gè)原因，嘗試了溶液相聚合以得到小聚合物鏈和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以下 結(jié)構(gòu)VI中給出了環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一個(gè)實(shí)例。
結(jié)構(gòu)
24流程PT
在一條不同的思路中，本發(fā)明者指出，通過添加一種組氨酸殘基， 可以在該聚合物處于細(xì)胞內(nèi)部的同時(shí)達(dá)到質(zhì)子海綿效應(yīng)，使得核內(nèi)體逸 出。作為一種潛在后果，在此前已知的轉(zhuǎn)染中添加氯奎，再也不會(huì)需要 成為DNA向細(xì)胞核的健康轉(zhuǎn)染的一種添加劑。結(jié)構(gòu)VII說明了有組氨
酰銜接物的例示性聚合物，而結(jié)構(gòu)vm說明了為用于聚合而合成的例示 性組氨酸單體。
結(jié)構(gòu)VI (左受保護(hù)形式；右脫保護(hù)后)
還嘗試了進(jìn)一步的合成路線，以在溶液相中生成六賴氨酸聚合物。 然而，利用這樣的思路，該聚合物鏈并沒有生成，而有某種環(huán)形成。以
上聚合的Mn是約70,000,而Mw是2,000，000以上。以上聚合物的多 峰分子量分布(如HPLC洗脫所證實(shí)的)指出，可能有若干種不同的聚 合機(jī)理在起作用。流程VI說明了使用七賴氨酸單體使用偶合試劑的聚 合(反應(yīng)條件10:l-DMF/水，EDC4.4叫，DMAP催化，TEA2.2eq)。<formula>formula see original document page 26</formula>
、
流程VII
以下流程VII說明含組氨酸單體的例示性聚合流程(反應(yīng)條件水, MeOH，Na2C03， CC14)。如Mn所示，該聚合條件可以進(jìn)一步優(yōu)化
改進(jìn)的碳水化合物-肽共聚物合成結(jié)果
該組氨酸單體的合成是大規(guī)模進(jìn)行的，以進(jìn)一步試驗(yàn)聚合條件。含 組氨酸肽部分的一種例示性合成路線說明于流程VIII中。<formula>formula see original document page 27</formula>
流程咖
反應(yīng)條件是a)與EDC/HOBt偶合，b)用二甲胺(DMA) /THF 脫保護(hù)，c) 與 EDC/HOBt/FmocHis(Boc)OH 偶合，d) 與 EDC/HOBt/FmocLys(Boc)OH偶合，e)用H2Pd/C脫保護(hù)。讓這種合成達(dá) 到最終單體前的化合物，并在最終單體加氫和分離時(shí)，用'H NMR和 ESMS指出該化合物已經(jīng)失去一些Boc保護(hù)基(峰"k"在脫保護(hù)期間消 失)，如以下語(yǔ)圖中所示。
<formula>formula see original document page 27</formula>這樣的事件可能在Y氮上發(fā)生，如NMR所證實(shí)的。這個(gè)位置上的保 護(hù)基比典型的Boc基團(tuán)更不穩(wěn)定，因?yàn)樗挥谝环N咪唑環(huán)上。為了克服 隨后步驟中的潛在問題，探討了改變聚合物的替代路線。結(jié)構(gòu)IX顯示 例示性的五聚、六聚、和七聚單體。
NHBoc
NHBoc
NHBoc
結(jié)構(gòu)漢
碳水化合物單體簡(jiǎn)化 根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)，顯然糖單體合成可以縮短到一步酯化，得到一種會(huì)
與二胺發(fā)生縮合反應(yīng)而生成酰胺鍵的化合物，如流程ix中所示。這條
^各線是生成聚酰胺的酰氯路線，而不是生成聚酰胺的縮合反應(yīng)。
當(dāng)前路線
QH H ,。H H^!2^L又XX^u ,丙，
6H i)H 0
60%
30%
OH OH 0
"OH, H:O 88% F
新路線HO.
OH
on 6h o
OH i)H 0
流程議
應(yīng)當(dāng)說明的是，如果這條路線在生成高M(jìn)n聚合物方面是可行的，
則它會(huì)省略三個(gè)合成步驟。以下流程x(與二賴氨酸單體和二酯的縮合
28反應(yīng))顯示以這種方式生成二賴氨酸糖共聚物的2種嘗試的結(jié)果。顯而 易見地，這些嘗試給出相對(duì)低的聚合物產(chǎn)率。然而，反應(yīng)條件的優(yōu)化可 望提供改善的產(chǎn)率。
■H 8U0'
O 、 、<
M,CH,2天
OH
Mn 400, Mw 0,單體峰上有 輕微肩峰
流程Z
肽單體筒化
根據(jù)初期轉(zhuǎn)染結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，三賴氨酸聚合物給出最高的轉(zhuǎn) 染水平，而且發(fā)現(xiàn)四賴氨酸給出可比結(jié)果。在一種進(jìn)一步的思路中，添 加了組氨酸殘基?？梢哉J(rèn)為這些殘基具有可提高該聚合物的轉(zhuǎn)染水平的
質(zhì)子海綿效應(yīng)。所期待的是，高結(jié)合效率(來自賴氨酸殘基)和低pKa
片斷(來自組氨酸殘基)是所需要的。因此，用賴氨酸單體、組氨酸單
體和碳水化合物單體制備了一種ABC共聚物，如以下流程XI中所示
流程A7
應(yīng)當(dāng)說明的是，這種聚合物不僅更容易取得(只要有更加收斂的合 成)，而且該聚合物也是高度萬(wàn)能的。進(jìn)而，可以添加不同數(shù)量的組氨
29
W單體峰，無聚合物
9 。M, ^!^:酸和賴氨酸單體以給出不同摻入比例的官能團(tuán)，從而導(dǎo)致有不同性能的
不同聚合物。結(jié)構(gòu)x說明了例示性z保護(hù)單體。
材料:試劑是從Alrich公司(威斯康星州密爾沃基)收到就使用的， 例外的是氨基酸和偶合試劑，這些購(gòu)自NovaBiochem (加利福尼亞州圣 迭戈)。所有反應(yīng)都在氮?dú)夥諊聢?zhí)行，并使用火焰干燥玻璃器皿。用 于水敏反應(yīng)的所有溶劑都是干燥的、用蒸餾法或用氧化鋁過濾系統(tǒng)精制 的。萃取溶劑是商業(yè)級(jí)的。閃急色鐠法是用所指出的溶劑系統(tǒng)在Fisher 硅膠60 (230~400目)上強(qiáng)制流動(dòng)進(jìn)行的。
總體者慮:凝膠滲透色語(yǔ)法(GPC)是使用一個(gè)Agilent 1100系列 GPC-SEC分析系統(tǒng)連同Polymer Labs公司的混合床Plgel Mixed-C柱一 起進(jìn)行的。洗脫劑是THF,使用0.5mL/min的流量率。校準(zhǔn)是使用Aldrich 聚苯乙烯作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行的。！HNMR譜是使用500MHzBruker儀器獲 得的，而"CNMR是使用125MHzBruker儀器獲得的。NMR化學(xué)位移 是作為5值報(bào)告的，用相對(duì)于TMS或氘氣代溶劑而言的ppm表示。數(shù)據(jù) 表述如下化學(xué)位移，峰裂數(shù)(s-單峰，d-雙峰，t-三峰，q^四峰，m= 多峰)，用Hz表示的偶合常數(shù)和積分。多峰是在它們出現(xiàn)的范圍(用 ppm表示)內(nèi)報(bào)告的。碳NMR數(shù)據(jù)是相對(duì)于溶劑信號(hào)記錄的。質(zhì)譜數(shù) 據(jù)是用一臺(tái)Micromass Autospec i普^U尋到的。燃燒分片斤由Atlantic Microlab (佐治亞州諾克羅斯)進(jìn)行。
結(jié)構(gòu)XFmoc-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe的合成。向二異丙基乙基胺(2.8 mL, 16.1 mmoi)在DCM ( 100mL)中的0。C溶液中添加Lys(Z)OMe ( 5.0 g， 15.1 mmol)。向jt匕溶液中添力口FmocLys(Boc)OH(7.08g, 15.1 mmol)、 然后添加HOBt(2.04g, 15.1畫ol)、最后添加EDC 'HCl(2.90g, 15.1 mmol)。讓這種溶液攪拌8 h,此時(shí)該有機(jī)溶液用IN HC1 ( 3x20 mL ) 洗滌、然后用飽和NaHC03 ( 3x20 mL )洗滌、最后用H20 ( 3x20 mL ) 洗滌。有機(jī)層真空濃縮，得到一種白色固體(l) (9.81g， 87%產(chǎn)率)
=7,51, 2H), 7.63 (d' J= 7.23， 2H), 7.42-7.32 (m' 9H), 7.20 (s, 1H), 5,95 (s, 1H)， 5.70 (s, 1H)， 5.25 (s, 1H), 5.15 (m, 1H)， 5.05 (s, 1H), 4,92 (s, IH), 4.60-4.21 (m, 6H)， 3,75 (s' 3H)' 3.18-3,09 (m, 5ff), 2.0(M.65(m' < f), "7(brs,"0-!.25(m， 6H); l3CNMR(125MHz, CDCI3) 5 173.1,172.0, 157.1, 156.7,15", 144,2,141.7， 137.17, 128.9,128.6,128.5， 128.3, 128.2,127.6,125.6, 125.5,120.4,79.5,67.5,67.2, 66.9, 55.2, 54.0, 53.7,52.8， 52.5, 47.5, 40,8, 40.4, 40.3 (2), 32.6 (2), 31.8 (2), 29,9 (3)， 29.6, 28.9, 28.8,23.0, 22.8;
C41H52N409(M+Na)、々HRMS (FAB) m/z計(jì)算值767,3632、實(shí)測(cè)值 767.3645。
Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lvs(ZVOMe(2)的合成。在0°C ,向1 (4.16 g, 5.58 mmol)在THF (55mL)中的溶液中添加二甲胺(28mL, 2M, 56.0 mmol)。讓此反應(yīng)達(dá)到室溫、攪拌2h。此時(shí)，將反應(yīng)混合物真空 濃縮。向該黃色固體中添加DCM (75mL)和DMF (25mL)。向此溶 液中添加F畫-Lys(Boc)-OH( 2.18 g, 4.64 mmol )、然后添加HOBt( 0.627 g， 4.64 mmol)、然后添加EDC . HC1 ( 0.890 g, 4.64 mmol)。讓此溶 液攪拌8h,此時(shí)該有機(jī)溶液用1 NHCK3xl5mL)、然后用飽和NaHC03 (3xl5mL)、最后用H20 (3x15 mL)洗滌。有機(jī)層用MgS04干燥、 真空濃縮，得到一種白色固體。柱色譜法(2。/oMeOH, CHC!3)精制給
H NMR (500MHz, CDC〗3) 3 7.79 (d, J
31出產(chǎn)品2 (3.42g, 63%產(chǎn)率):
'HNMR
(500MHz, CDC13) 8 7.74 (d, 7,55,2H), 7.58 (d,7.35,2H), 7.38-7.25 (m, 15H), 7.00 (br d, 2H), 5.50 (br, s, 1H), 5.16-5.09 (m, 5H), 4.55 (br s, 1H), 4.36 (ra, 3H), 4.25-4.10 (m， 2H), 3.61 (s, 3H), 3.16-3.10 (m, 6H), 1.81-1.39 (m, 23H); 13C NMR (125MHz, CDC13) 5 173,1,172.0,157.1， 156.74,156.6,144.2,141.7,137.2,128.9,128.6,12S.5,128.3,128.2， 127.6， 125.6,125.5， 120.4, 79,5, 67.5, 66.9, 55.2, 52.8, 52.5, 47.5,40,8, 40,4, 40.3' 32.6， 31.8, 29.9, 29.6, 28.9， 28.8, 23.0,22.8; HRMS (FAB) m/z
C52H72N608 (M+Na) +計(jì)算值995.5106，實(shí)測(cè)值995.5132。
FmocHis(Tr)-Lvs(Boc)-Lvs(Boc)-BocLys(Z)的合成向 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z) ( 4.83 g， 4.97 mmol)在THF ( 100 mL )中 的溶液中在0。C添加二甲胺(38mL， 2M, 64 mmol)。讓此反應(yīng)達(dá)到室 溫、攪拌2h。此時(shí)將反應(yīng)混合物真空濃縮。讓該固體通過一個(gè)硅石塞， 先用2%MeOH/CHCl3、然后添加0.5%TEA并使極性提高到5%MeOH、 洗脫。使該產(chǎn)品真空濃縮。向該固體(3.36經(jīng)，4.47mmol)中添加DCM
(45 mL)和DMF ( 20 mL)。向此溶液中添加Fmoc-His(Boc)-OH ( 2.24 g， 4.69 mmol )、然后添加HOBt( 0.634 g, 4.64 mmol )、然后添加EDCHCl
(0.899 g， 4.69 mmol)。將此溶液攪拌8h，此時(shí)有機(jī)溶液用水(1x20 mL)、然后用1NHC1 (3x20mL)、然后用飽和NaHC03 ( 3x20mL)、 最后用H20 (3x20mL)洗涂。該有機(jī)層用MgS04干燥、真空濃縮，得 到一種白色固體。柱色譜法(0~2%MeOH， CHC12)精制給出產(chǎn)品
(m, 1H), 8.09 (s， 1H), 8.04 (br s， 1H), 7.95 (br s， 1H), 7.87 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.55 (brm， 1H), 7.41-7.22 (m, 11H), 6,71 (brm， 2H), 5.00 (s, 2H)， 4.35-4.16 (m, 7H), 3.60 (s, 3H), 2.98-2.82 (m, 9H), 1.70-1.45 (m, 16H), 1.44-1.28 (m, 35H); "C NMR (125MHz, dfi DMSO) S
'HNMR (500MHz' 4 DMSO) 8 8.30 (s, 2H), 8,18
32172.4, 171.7, 17L3,156.1, 155.8, 155.5, 146.6,143.7,143.6， 140.7,140,6， 139.5,137.2， 136.6, 128.3, 127.7,127.6, 127.0, 125.3,125.2,,120.1,120.0, 114.4, 85.0, 79.2, 77.3， 65.8, 65.1, 51.9, 51.7， 46.6， 31.8, 30.4， 29.3,29.2,29.0,28,2， 27.3,22.6， 22.5; ESMS (FAB)m/z
C63Hs7N90i5(M+H)+計(jì)算值1210.64、實(shí)測(cè)值1210.57。
Boc-Lys(Z)His(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z)的合成向 FmocHis(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-BocLys(Z) ( 2.32 g, 1.92 mmol)在THF (40mL)中的溶液中，在0。C添加二甲胺(19.2 mL,2M, 38.4 mmol)。 讓此溶液達(dá)到室溫并攪拌2 h。此時(shí)將反應(yīng)混合物真空濃縮。讓該固體 通過一個(gè)珪石塞，先用2%MeOH/CHCl3、然后添加0.5%TEA、并將極 性提高到5%MeOH、洗脫。產(chǎn)品真空濃縮。向該固體(0.880 g， 0.89 mmol)中添力。DCM ( 20 mL )和DMF ( 6 mL )。向此溶液中添加 Boc-Lys(Z)-OH(0.4063 g, 1.06 mmol)、然后添加HOBt (0.144 g， 1.06 mmol)、然后添加EDC . HC1 ( 0.205 g， 1.06 mmol)。此溶液才覺拌8 h, 此時(shí)該有機(jī)溶液用水(lxl0mL)、然后用1NHC1 (3xl0mL)、然后 用飽和NaHC03 (3xl0tnL)、最后用H20 ( 3x10 mL )洗滌。該有機(jī)層 用MgS04干燥、真空濃縮、得到一種白色固體。柱色譜法(0 2n/。MeOH, CHC13)精制給出產(chǎn)品
DMSO) 5 8,31 (s, 1H), 8.15 (br s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.97 (br m, 2H), 7.83 (br 8,1H), 7,40-7.15 (m, 13H), 6.90 (br s, 1H), 6.65 (br s, 2H), 5.00 (s, 4H), 4.52 (brs， 1H)， 4.35-4.15 (m, 3H)' 3.80 (br s, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.05-2.75 (m, 10H), 1,72-1.40 (m,卿,1.39-1.12 (m， 46H); '3cNMR(125MHa d6DMSO)8 172.4,171.7,171.1,156.0,155.5,146.6,138.9, 137.3' 136.5,128.3, 127,7' 114.5, 85,1,79.2,78.2, 77.3,65.1, 51.9, 51.7,31.3, 30.4, 29.1> 29,0, 28.2, 28.1, 27.3， 22.7,22.5; ESMS (FAB) m/z
C67H,。3NnO!s(M+H)+的計(jì)算值1350.75、實(shí)測(cè)值1351.6。
HNMR(500MHz，d6
33(Boc)Lys(Z)-His(Boc)-Lvs(Boc)-Lys(Boc)-Lys-OMe 的合成。向 (Boc)Lys(Z)-His(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-OMe(0.88 g)在MeOH ( 50 mL)的氯仿(10mL)中的溶液中添加Pd/C ( 0.20 g)。此溶液用H2吹 掃30 min，然后與H2氣球連^J妄。讓反應(yīng)進(jìn)^于8 h，此時(shí)該混合物通過 Celite過濾、真空濃縮，得到純產(chǎn)品
(500MHz, d6 DMSO) S 8,32 (br s, 1H)， 8.05 (s， 2H), 7,95 (br s, 2H)， 7.28 (s, 1H), 6,95 (br s， 1H), 6.78 (br s， 2H), 4.55 (br s, 2H), 4.35-4.15 (br m, 4H), 3.83 (br s, 2H), 3.61 (s, 3jH), 2.95-2,80 (brs, 6H), 2.65-2.75 (brm, 4H), 1.72-U9 (m, 19H), 1.38-1.15 (m, 36H); l3CNMR (125MHz, d6DMSO) 5 172.3,171.8,171.2, 170.8， 155.5,146.6,138.8， 136.53,134.0, 114.5, 85.13, 78.17， 77.3, 54,4, 52.5, 52.3, 51.8， 31.5， 31.0, 29.3, 29,2, 28.3,28.1, 27.4' 27-0， 22,5, 22.4, 22,3; ESMS (FAB) rn^z
C5!H9!NuOw(M+H)+的計(jì)算值1082.68、實(shí)測(cè)值1082.85。
組氨酸官能化聚合物的合成?；衔? ( 0.280 g， 0.259 mmol)連 同Na2CO3(0.603 g)—起在3 mL H20和0.5 mL MeOH中攪拌。向這種劇 烈攪拌的溶液中添加半乳糖二酰氯(0.085 g, 0.259 mmol )在2.0 mL CC14 中的溶液。這種雙相混合物在室溫?cái)?拌30 min。沉淀物用過濾法收集、 用水洗滌，得到一種白色固體。Mn=2000g/mol。
'HNMR<formula>formula see original document page 35</formula>2:3-4:5-四羥基半乳糖二酸二丁酯(6)的合成。將半乳糖二酸 (30.0g， 0.143 moi)、 1-丁醇(220 mL )和濃H2S04 ( 6 mL )的混合物 在一臺(tái)含有4A分子篩的Soxhlet萃取器中回流加熱24 h。讓反應(yīng)混合物 冷卻到室溫、過濾。濾餅用飽和NaHC03 U00mL)洗滌、干燥，得到 純二酯(1， 32.2 g， 70%):
(500 MHz, d6 DMSO) 8 4.87 (d,9.88, 2H), 4.79 (dd, - 3.20， /2 - 7.44,2H), 4.29 (d >/ - 9.42, 2H), 4.07 (m， 4H), 3.77 (d, 7.34,2H), 1.58 (m, 4H), 1.32 (m, 4H), 0.88 (m, - 6H); 13CNMR(125 MHz, d<sDMSO) 5 174,6, 72.2,71.1,64.6,31. , 19.5， R5;HRMS w/z
CwH2608(M+Na)+的計(jì)算值323.1706、實(shí)測(cè)值323.1707。 (^4112608的分析 計(jì)算值C,52.16; H,8.13。實(shí)測(cè)值C,52.15; H,8.15。
2:3-4:5-二-0-偏亞異丙基半乳糖二酸二丁酯(7〗的合成。向6( 10 g， 31 mmol)在無水丙酮(100 mL)中的充分?jǐn)嚢枞芤褐刑砑訚釮2S04 ( 3.0 mL)和無水MgS04 (5.0 g)。此物料在室溫?cái)嚢?4 h,此時(shí)該反應(yīng)混 合物用NaHC03中和。然后將反應(yīng)混合物過濾。添加水(100 mL)使固 體產(chǎn)品從濾液中沉淀出來。將沉淀濾出、千燥、用乙醇重結(jié)晶，得到白
色結(jié)晶固體狀7 (8g，64%)。
、H NMR (500 MHz, CDC13) 5 4.60-4.57 (邁，1H), 4.48-4.45 (m, IH), 4.20 (t, 6.7, 2H), 1.68-1.62 (m, 2H)， 1.50 (s, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.41-1.37 (m， 2H), 0.93 (t, > 7.4, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCI3) S 171.0， 12.3， 79,2， 76.0,65-5， 30.5, 27.0， 26.0,19.0,13,6; HRMS w /z
C20H34O8 (M+Na) +的計(jì)算值403.2332,實(shí)測(cè)值403,2332。 C20H34O8的 分析計(jì)算C,59.68; H,8.5;實(shí)測(cè)值C,60.02; H，8.35。3
2:3-4:5-二-0-偏亞異丙基半乳糖二酸(8)的合成。2:3-4:5-二-0-偏
亞異丙基半乳糖二酸二丁酯7 ( 2.66 g， 5,38 mmol)在5 mL NaOH ( 0.84
g, 21.6 mmol)水溶液中加熱回流12 h進(jìn)行水解。讓該反應(yīng)溶液冷卻到
室溫，然后添加12 mL 2 N HC1。此溶液用冰浴冷卻。冷卻時(shí)生成一種
白色沉淀物。將固體濾出、用乙醇重結(jié)晶，得到8(1.07g， 68%):
鹿R (500MHz, d6 DMSO) S 13.17 (s， 2H), 4.45
(m, 2H), 4.38 (m, 2H), 1.38 (s， 6H), 1.33 (s, 6H); l3C NMR (125MHz, d DMSO) 5 172.2,
111,0,78,5,74.9, 26.8,25.8;
。121"11808的分析計(jì)算值C,49.65; H，6.25。實(shí)測(cè)值C,49.49; H，5.98。
9
2:3-4:5-二-Q-偏亞異丙基半乳糖二酰氯(9)的合成。向酸8(0.5g， 1.72mmo1)在20 mL CH2C12 (DCM)中的懸浮液中添加新蒸餾的亞;危 酰二氯(0.5mL， 6.38 mmol) 。 2 h后向此懸浮液中加一滴DMF。該反 應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?2h，直至得到一種清澈溶液。該混合物通過一種 0.2 pm PTFE過濾器過濾、真空濃縮，得到一種無色固體狀二酰氯9( 0.53 g, 94%):
& NMR (500MHz, dfi DMSO) 5 4.82 (m' 2H), 4,58 (m, 2H)， 1,53 (s, 6H), 1.44 (s, 6H); "CNMR(125MHz， d6DMSO) S 173.9, 114,7, 83.6, 27.5, 26.3;
d2H^Cl206的分析計(jì)算值:C,44.05; H，4.93。實(shí)測(cè)值C,43,75; H,5.07。
36Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OMe(10)的合成。向Z-Lys-OMe . HC1 ( 4.347 g,
B.14mmo1)在無水DCM ("mL)中的水冷溶液中添加二異丙基乙胺
(2.29 mL， 13.14mmo1),隨后添加Z-Lys(Boc)-OH( 5.00 g, 13.4mmo1)、
HOBt( 1.776 g， 13.14 mmol)和EDC . HC1 (2.519 g, 13.14 mmol)。
反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?h。然后，該有機(jī)溶液用1NHCI(3x30mL)、
飽和NaHCOs (3x30 mL )和水(3x30 mL)洗滌。有機(jī)層用MgS04千
燥、真空濃縮，得到一種白色固體。粗產(chǎn)品通過用30。/oEtOAc/己烷結(jié)晶
精制。分離出無色固體狀化合物10 ( 7.123 g， 82.6%):
'H NMR (500MHz， CDC13) S 7,36-7.26 (m, 10H), 6.77 (br s, 1H), 5,29 (br s,
1H), 5.12-5.06 (m, 5H), 4.54 (m, 1H), 4.U (ra, 1H), 3.68 (s,3H), 3.18-3.11 (m， 4H), 1.80-
1,45 (m, 8H), 1.42 (s' 9H), 1.31-1.36 (ra, 4H); 13CNMR (125MHz， CDC3) S 172.5,156.5,
155,8' 136.5,136.4,128.4,128.3,128.1(2), 128,0(2), 127.9(2), 127.7(2), 79,9,66.5, 66.4,
53.9, 52.2, 51.9, 40.3(2), 31.9, 31.4, 29.2, 29.0, 28.2 (3), 22.3, 22.1,
CuH26的分析計(jì)算值C,62.18; H，7.37;實(shí)測(cè)值C,62.33; H,7.44。
Boc-Lys-Lys-OMe(l l)的合成。將二賴氨酸10 ( 7.43 g， 0.0113 mol) 溶解于MeOH ( 100 mL)中。用氮?dú)獯祾咧?，添?0%Pd/C ( 0.30 g)。 然后該燒瓶用氫吹掃，反應(yīng)混合物攪拌過夜。經(jīng)由Celite層過濾除去 Pd/C。向?yàn)V液中添加三氟乙酸(TFA， 1.8 mL， 0.023 mol)、然后真空 脫除溶劑，給出粘性油狀物。用20mL二乙醚研制，得到一種白灰色物 質(zhì)。所得到的物質(zhì)真空干燥，給出玻璃狀固體產(chǎn)品U (6.4g， 92%):'H NMR (500MHz, d。 DMSO) S 8.19 (d， J - 7.5' 1H), 7"0 (br s, 6H), 6.82 (d， J - 8.0,1H), 4,23 (m, 1H), 3.91(m， 1H), 3,61 (s, 3H), 2.75 (m, 4H), 1,36-1,61 (m, 21H); 13C NMR (25MHz, d6 DM^O) S 172.4 (2)， 158,4 (q, 2), 155,3,117.2 (q-), 78.0, 53.9, 51.6, 38.7, 38.6， 3L2, 30.3, 28.1 (3), 26'7, 26.5， 22.3， 22.2; HRMS (FAB) m/z
C22H3sFfsN409(M+H)+的計(jì)算值389.2764,實(shí)測(cè)值389.2767。
Boc-Lys(Z)-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe( 12)的合成。在(TC ,向1 ( 2.405 g， 3.23mmo1)在THF(50mL)中的溶液中添加二甲胺U6mL, 2M， 32.3 mmol)。讓此反應(yīng)達(dá)到室溫、攪拌2h。此時(shí)，將反應(yīng)混合物真空濃縮。 向該黃色的固體中添加DCM (50mL)和DMF ( 10mL)。向此溶液中 添加Boc-Lys(Z)-OH(1.23 g， 3.23 mmol)、然后添力口 HOBt ( 0.458 g )、 然后添加EDC ' HC1 ( 0.650 g, 15.1 mmol)。讓此溶液攪拌8 h，此時(shí) 該有機(jī)溶液用1 NHC1 (3xl5mL)、然后用飽和NaHC03 ( 3x15 mL)、 最后用H20 (3xl5mL)洗滌。該有機(jī)層用MgS04干燥、真空濃縮，得 到一種白色固體。柱色譜法(2。/。MeOH, CHCl3)精制給出產(chǎn)品12( l.86 g, 65%產(chǎn)率)
7,74 (d, 7.S5' 2H)， 7.58 (d, </=7.35， 2H), 7.38-7.25 (m， 15H), 7.00 (br d, 2H), 5.50 (br, s, 1H), 5.16-5.09 (m, 5H), 4.55 (br s, 1H), 4.36 (m, 3H〗,4.25-4.10 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.16-3,10 (ra, 6H)， 1.81-1.39 (m, 23H); ，3C NMR(125MHz, CDC13) S 172.7,172.2， 156.8, 156.5, 156.2， 143.9,143,8,141.4,141.3, 136.7， 128.5，.128.3,128.1, 127.8， 125.2 (2), 120,1， 7"， 67.2, 54,7, 53.6, 52,5， 50,2,47.2,40.3， 32.4,31.4,29.6,29.3,28.6 (3), 22.4; HRMS (FAB)
m/z C45H6sN60,2(M+H)+的計(jì)算值885.4974,實(shí)測(cè)值885.4977。
H NMR (500MHz, CDC13) 5
38Boc-Lys-Lys(Boc)-Lys-OMe( 13)的合成。向12 ( 0.88 g， 0.99 mmol) 在MeOH ( 25 mL)和DCM ( 25 mL)中的溶液中添加Pd/C ( 0.20 g)。 這種溶液用Hz吹掃30 min,然后安裝一個(gè)Hz氣球。讓反應(yīng)進(jìn)行8 h, 此時(shí)讓該混合物經(jīng)由Celite過濾、真空濃縮，得到純的清澈產(chǎn)品13(0.622 g，定量)
s, 1H)， 8.16 (b's, 4H), 7.92 (br s, 1H), 6.92 (br s, 1H), 6.74 (br s, 1H), 4,27 (br s, 1H), 4.20 (br s, 1H), 3,89 (br s, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.46 (br s, 3H)， 2.S7-2.73 (m^ 5H)， 2.52 (s, 1H)， 1.80-1,45(brs, 10H), 1.45-1.15 (m， 22H); uCNMR(125MHz, d6DMS0) 5 173.2,172.8,156.4， 156.2, 78.94, 78.19, 54.91, 53.1, 52.7, 52.6, 39.3,39,2,32.8， 32,0, 30.9,29.1, 29.1， 27.3, 27.2, 23.2, 23.1. HRMS (FAB) m/z
C29Hs6N608(M+H)+的計(jì)算值617.4238，實(shí)測(cè)值617,4236。
Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lvs(Z)-OMe( 14)的合成。向1 (4.16g， 5.58 mmol)在THF (55 mL)中的溶液中，在0。C添加二甲胺(28mL， 2M, 56.0mmo1)。讓此反應(yīng)達(dá)到室溫并攪拌2 h。此時(shí)，讓反應(yīng)混合物真空 濃縮。向該黃色固體中添加DCM (75mL)和DMF (25mL)。向此溶 液中添加Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.18 g, 4.64函ol)、然后添加HOBt( 0.627 g, 4.64mmo1)、然后添加EDC ' HCH 0.890 g， 4.64 mmol)。讓此溶
HNMR (500MHz， d^DMSO) S 8.42 (br
39液攪拌8h,此時(shí)該有機(jī)溶液用1NHC1 (3xl5mL)、然后飽和NaHC03 (3x15 mL)、最后H20 (3x15 mL)洗滌。該有機(jī)層用MgS04千燥、 真空濃縮，得到一種白色固體。柱色譜法(2。/。MeOH， CHCl3)精制給 出產(chǎn)品M (3.42g, 63%產(chǎn)率):
(500MHz' CDCl]) S 7.74 (d, 乂- 7.55, 2H), 7.58 (d, 7.35, 2H)， 7.38-7.25 (邊，15H)， 7,00 (br d, 2H), 5,50 (br' s, 1H)， 5,16-5,09 (m, 5H), 4.55 (br s, 1H), 4,36 (m， 3H), 4,25-4.10 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.16-3.10 (m， 6H), 1.81-1.39 (m, 23H); l3CNMR (125MHz， CDC1》S 173,1, 172.0, 157,1, 156,74, 156.6' 144.2， 141,7， 137.2, 128.9, 128.6， 128.5, 128,3, 128,2, 127.6,125.6, 125.5, 120,4, 79.5， 67.5, 66.9, 55.2， 52.S, 52.5, 47.5, 40,8, 40.4,40.3, 32.6, 31.8, 29.9, 29.6, 28,9， 28,8, 23,0, 22.8; HRMS (FAB) m/z
C52H72N60s(M+Na)+的計(jì)算值995.5106、實(shí)測(cè)值995.5132。
Boc-Lvs(Z)-Lvs(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Z)-OMe(15)的合成。在(TC,向 14 ( 1.48 g, 1.52 mmol)在THF ( 30 mL )中的溶液中添加二甲醚(15.2 mL，在THF中2M, 30.4 mmol)。讓此反應(yīng)達(dá)到室溫并攪拌2 h。此時(shí) 將反應(yīng)混合物真空濃縮。向該黃色固體中添加DCM (30 mL)和DMF (5 mL)。向此溶液中添加Boc-Lys(Z)-OH(0.608 g， 1.60 mmol)、然后 HOBt ( 0.216 g, 1.60 mmol)、然后EDC . HC1 ( 0.3063 g， 1.60 mmol)。 讓此溶液攪拌8 h，此時(shí)該有機(jī)相用1N HCl(3xl5 mL)、然后飽和 NaHC03(3xl5 mL)、最終H20(3xl5 mL)洗滌。該有才幾層用MgS04干燥、 真空濃縮，得到一種白色固體。柱色譜法(2。/。MeOH， CHCl3)精制給 出產(chǎn)品15 ( 1.0 g, 59%產(chǎn)率)
HNMRNMR (500MHz, CDC13) S 8.15 (brs, IH)， 8,03 (brs, 1H); 7.88 (brs, IH), 7.45-7.2S (m， 10H), 7.12 (brs, 1H), 6.65 (brs, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.45-4.35 (m, 3H), 4.05 (brs， 1H), 3.67 (s, 3H), 3.11 (brs, 1H), 3.01 (brs， 1H), 1.卯-1.60 (m, 8H), 1.60-1.38 (m, 44); "CNMR (125MHz, CDCI3) S 173.3, 173,2， V72.7,172.3, 157.2， 156.6， 138.4,129.0,128.4， 79.0,78.1, 66.0, 55.7, 53.8, 53.4, 53.0, 52.2,41.1,40.9, 40.8, 32.7, 32.5, 31.6,29.8, 29.6,28.6, 23.7, 23.5; ESMS (FAB) ra/z
C66H88NsO5(M+H)+的計(jì)算值1113.65，實(shí)測(cè)值1113.52。
NHBoc
Boc-Lys-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-OMe( 16)的合成。向15 ( 1.0 g, 0.89 mmol)在MeOH ( 25 mL )和DCM ( 25 mL )中的溶液中添加Pd/C(0.20 g)。此溶液用H2吹掃30 min、然后裝上一只H2氣^1。讓反應(yīng)進(jìn)行8 h, 此時(shí)該混合物經(jīng)由Celite層過濾、真空濃縮，得到純產(chǎn)品(0."g, 0.89 mmol):
lHNMR (500MHz, CDCI3) S 8.04 (br s, 1H), 6.70 (br s, 3H), 4.32 (br s, 4H), 3.69 (s,'3H), 3.05 (m, 8H)， 1.85-1.65 (m, 8H), 1-65-1.40 (m， 28); 13C NMR (125MHz, CDC13) 5 173.2， 172.9， 156.7,78.9， 78.04， 52.2， 40.8,40.1,34.9,34.8， 32.0' 3.1， 30,6,28.6,28.5,23.6,23,2, 23,1; HRMS (FAB) rayz
C4oH76NsOu(M+H)+的計(jì)算值845.5172、實(shí)測(cè)值845.5699。
N—H
H
41二賴氨酸/碳水化合物共聚物(17)的合成。二賴氨酸11 ( 1.7089 g, 2.77mmo1)連同Na2C03 ( 0.785 g， 7.4 mmol) —起在冷卻于(TC的H20 (60 mL)中攪拌。向這種劇烈攪拌的溶液中添加半乳糖二酰氯9( 0.9066 g， 2.77 mmol)在25 mL CC14中的溶液。這種雙相混合物在(TC攪拌5 min、在室溫?cái)嚢?0 min。將沉淀物過濾收集、用水洗滌，得到一種白 色固體(U g):
lH h(MR (500MHz, CD3OD) S 8.25 (m, 1H), 7.94 (m, 2H), 4.56 (m, 2H), 4,38 (m, 2H), 4,32 (m, 1H), 3-95 (邁,1H), 3.62 (s, 3H), 3.12 (m, 4H), 1.74-1.33 (m, 45H); UC NMR (125MHz, CDC13) S 172.6,158,7, 110.9, 80.0, 78.8, 75.1, 54,0, 52,5, 38.7, 34,5,33.5,29.3， 29.0,28.5,26.9,26.1, 22.9; M - 15,000 g/mol, Mw-27,900 g/mol.
二賴氨酸/碳水化合物聚合物(Poly 1 )的脫保護(hù)。將30。/qTFA/THF 溶液(5.1 mL)添加到受保護(hù)聚合物17(0.123g)中。1 h后加水(1.2 mL)、 讓反應(yīng)進(jìn)行5 h。此時(shí)讓該溶液濃縮，提供脫保護(hù)的聚合物Poly 1 (定
量)
<formula>formula see original document page 42</formula>
CD3OD) S 4.65 (br d, 1H), 4.45-4.43 (ni, 1H), 4.34-4.38 (m, 1H), 4.17 (br s' 1H), 3.95 (br s, IH)， 3.80 (s, 3H), 3.32-3.34 (m， 5H), 2.00-1,80 (m, 4H), 1.70-1.54 (m, 4H), 1.34-1.44 (m, 4H); ，3C NMR (125MHz, (CDC13) S 183.5， 177.6, 177.5,172.5, 73.2, 56.9, 55.6,41.2， 33.， 32.4, 30.6, 30.4， 30,3， 25.7, 24.8， 24.7， 23,8.
三賴氨酸/碳水化合物聚合物(18)的合成。將化合物13 ( 0.296 g, 0.480 mmol)連同Na2C03 (0.H2 g)—起在冷卻于(TC的2.0 mL H20中攪拌。向這種劇烈攪拌的溶液中添加半乳糖二酰氯9 ((M57g, 0.480 tnmol)在4 mL CC14中的溶液。這種雙相混合物在O'C攪拌5 min、在室 溫?cái)嚢?0 min。將沉淀物過濾收集、用水洗滌，得到一種白色固體(0.250 g) 二
力NMR (500MHz, CD3OD) 5 8.25 (叫1H), 7,94 (tn， 2H), 4.56 (m' 2H), 4.38 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 3,95 (m， 1H), 3,62 (s> 3H), 3.12 (邁,4H)， 1.74-1.33 (m, 45H); ，3C NMR 125MHz (CDC13) 5 173,0 (m), 156,63 (m), 111.39 (m), 80.3， 79.39,75.39, 52.8 (ra), 40.6， 39.0, 31.7, 29,8, 28,79-26.4 22.91 (邊);Mn豕卯85 g/mol, Mw = 26686
三賴氨酸/碳水化合物聚合物(Poly 2)的脫保護(hù)。將一種
30%TFA/THF溶液(5.0 mL)添加到受保護(hù)聚合物18 ( 0.105 g)中。1 h 后加水(1.0mL)、讓反應(yīng)進(jìn)行5h。此時(shí)將該溶液濃縮，提供脫保護(hù)的 聚合物(Poly 2，定量)
lH NMR (500MHz,
CD3OD) S 4.625 (br s, 5H), 4.41 (br s, 4H), 4.05 (s, IH)， 3.95 (s, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.98 (m' 3), 1.85-〗.61 (m, 22H); "CNMR 125MHz, (CDC13) 5 173.2,162.5-161.7 (m), 120.73, 118.4,116.1, U3.7, 71.5-71.2 (m), 55.5-51.9 (m)， 39.5,38.5-35,4,31.3 28.9， 27.1,23.1, 22.6,
NHBoc
關(guān)oc
四賴氨酸/碳水化合物聚合物(19)的合成?；衔?6 ( 0.349 g， 0.413 mmol)連同Na2C03 (0.0963 g) —起在冷卻于O'C的3 mLH20中
NX2006 攪拌。向這種劇烈攪拌的溶液中添加半乳糖二酰氯9 (0.135 g， 0.413 mmol)在3.5 mLCCU中的溶液。這種雙相混合物在(TC攪拌5 min、在 室溫?cái)嚢?0 min。將沉淀物過濾收集、用水洗滌，得到一種白色固體 (19, 0.380 g):
3,05 (m, 9H), 2.00-1.62 (br s, 10H), UD-1.62 (br s， 62H); "CNMR(125MHz, (CDCl3) & 174-170 (m), 157-155 (m), 110， 79-74 (ra), 54-51 (m)， 40-38 (m), 31-22 (ra); M - 13213 g/mol, Mw = 47918 g/咖l.
脫保護(hù)四賴氨酸聚合物(Poly 3)的合成。將一種30%TFA/THF溶 液(1.7mL)添加到受保護(hù)聚合物9( 0.050 g)中。1 h后力口水(0.4 mL )、 讓反應(yīng)進(jìn)行5h。此時(shí)將該溶液濃縮，提供脫保護(hù)聚合物(Poly3，定量)
CD3OD) 5 4.40 (m, 4H), 4.05 (m, 2H)， 3.73 (s, 3H), 3.36 (s, 3H,有溶劑峰>,2.97 (br s, 5H),,85-1.41 (m, 22H); 13CNMR(125MHz, (CDC13) S 173-169 (m), 164-160(ra), 71-67 (m), 54-51 (m〉, 40-39 (m), 31-21 (m).
碳水化合物-肽共聚物的替代結(jié)構(gòu) 生成糖肽共聚物的另一條替代路線是使用丙烯酸酯和伯胺系單體 經(jīng)由邁克爾加成反應(yīng)生成聚合物，如以下流程XII所示
'HNMR(500MHz, CDCb) 5 4.51 (m, 6H), 3.74 (s， 3H), 3.32-
HNMR (500MHz:反應(yīng)條件I) 4叫LAH, EtA 4h (產(chǎn)率72,％〉
ii) 4叫丙沐酰氣， 4 eq, DIPBA, DCM, 0.5h (產(chǎn)率60 %) 叫l(wèi)叫22, 1 cq. 23,1 M in DCM
流程ZKT
從該示范反應(yīng)得到一種聚合物。遵照相同的戰(zhàn)略，本發(fā)明者期待以
下合成能產(chǎn)生一種新型生物材料，如以下流程XIV中所示
流程vt77
45二丙烯酸酯糖單體的合成:向有二乙酰亞胺保護(hù)的糖二醇(0.50g, 1.91 mmol)在DCM (19mL)和DIPEA (4mL)中的攪拌溶液中滴加 丙烯酰氯(0,93mL， 11.44 mmol)。此溶液變成褐色，攪拌45 min，此 時(shí)加水(15mL)。產(chǎn)物用Et20 ( 100mL)萃取、然后分離、用MgS04 干燥。柱色鐠法(20。/。Et20/己烷)精制給出產(chǎn)品(60%產(chǎn)率)。
二丙烯酸酯糖單體和ll-氨基十一碳烯的聚合:向11-氨基十一碳烯 (0.1211 g, 0.7153 mmol)和DCM (0.25 mL)的溶液中添加二丙烯酸 酯糖單體(0.2648 g， 0.7153 mmol)。此物料在N2下密封、在45。C攪 拌4天，生成該聚合物。
作為實(shí)例，半乳糖二酸-二賴氨酸、三賴氨酸、和四賴氨酸雜共聚物 (分別為Poly 1 3)是通過L-賴氨酸衍生的單體和相應(yīng)的半乳糖衍生的 單體的界面聚合合成的。EMSA試驗(yàn)顯示，這些聚合物以低達(dá)1.5的N/P 比例有效地結(jié)合和阻滯DNA。 AFM成像為DNA壓實(shí)到適合于基因轉(zhuǎn)染 應(yīng)用的尺寸提供了證據(jù)，其微粒的80.0~90.6%的直徑低于200 nm。蟲 熒光素酶試驗(yàn)顯示，這類聚合物在無血清的氯奎輔助條件下能有效地轉(zhuǎn) 染DNA。轉(zhuǎn)染水平超過對(duì)照實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染水平，這可能部分地由于所期待 聚合物的細(xì)胞毒性降低的緣故。細(xì)胞生存性試驗(yàn)顯示，本文中陳述的共 聚物有顯著低的細(xì)胞毒性。所期待的是，這種降低的毒性起因于親水碳 水化合物間隔物引起的聚合物主鏈上的連續(xù)電荷密度和電荷屏蔽效應(yīng) 的降低。這兩個(gè)因素都降低了與細(xì)胞膜的電荷相互作用，從而減少膜破 裂。這一類新的碳水化合物-肽共聚物可以進(jìn)一步優(yōu)化，以諸如通過使用 氨基酸殘基的替代長(zhǎng)度、使不同的氨基酸殘基取代到該鏈上、以及通過
轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)高轉(zhuǎn)染效率。
Mlt:試劑是從Aldrich公司(威斯康星州密爾沃基)收到時(shí)就使用，例外的是購(gòu)自NovaBiochem (加利福尼亞州圣迭戈)的氨基酸和購(gòu)自GL Biochem (中國(guó)上海)的偶合試劑和添加劑[N-羥基苯并三哇(HOBt)和l-乙基-3-3'-二曱胺基丙基碳化二亞胺.HCl (EDC 'HC1)]。用于轉(zhuǎn)染研究的猴腎成纖維細(xì)胞(COS-7細(xì)胞)購(gòu)自ATCC并在37。C、5%002和購(gòu)自Sigma公司(Saint Louis, MS )的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。蟲熒光素酶檢測(cè)試劑盒(包括報(bào)告者基因)、MTT試劑盒、和pSV-P-gal質(zhì)粒DNA ( 6821 bp )購(gòu)自Promega公司(Madison， WI)。所有反應(yīng)都氮?dú)夥諊逻M(jìn)行，并使用火焰干燥的玻璃器皿。用于水敏反應(yīng)的所有溶劑都是干燥的、并經(jīng)由蒸餾或用氧化鋁過濾系統(tǒng)精制。萃取溶劑是商業(yè)級(jí)的。閃急色譜法是使用所指出溶劑系統(tǒng)在Fisher硅膠60 ( 230-400目)上的強(qiáng)制流動(dòng)進(jìn)行的。
總體者慮:涉及活細(xì)胞使用的任何操作都是在層流通風(fēng)櫥中使用標(biāo)準(zhǔn)無菌技術(shù)進(jìn)行的。凝膠滲透色譜法(GPC)是使用一個(gè)Agilent 1100系列GPC-SEC分析系統(tǒng)連同購(gòu)自Polymer Labs的混合床Plgel Mixed-C柱一起進(jìn)行的。洗脫劑是THF,使用0.5mL/min的流量率。校準(zhǔn)是使用Aldrich聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行的。巾NMR譜是使用500 MHz Bruker儀器獲得的，而"CNMR是使用125 MHz Bruker儀器獲得的。NMR化學(xué)位移是作為S值以相對(duì)于TMS或氘代溶劑而言的ppm報(bào)告的。數(shù)據(jù)表述如下化學(xué)位移，峰裂數(shù)(s-單峰，d-雙峰，t-三峰，q-四峰，111=多峰)，以Hz表示的偶合常數(shù)和積分。多峰是在它們出現(xiàn)的范圍內(nèi)(用ppm表示)報(bào)告的。碳NMR數(shù)椐是相對(duì)于溶劑信號(hào)記錄的。高分辨率質(zhì)譜(HRMS )數(shù)據(jù)是用 一 臺(tái)Micromass Autospec譜儀獲得的。燃燒分析由Atlantic Microlab (Norcross, GA )進(jìn)行。
半乳糖二酸-賴氨酸聚合物/DNA復(fù)合物的電泳。碳水化合物-肽共聚物/pSV-(3-gal質(zhì)粒DNA復(fù)合物是以不同電荷比例在H印es緩沖食鹽水溶液(HBS， 20mMH印es, 150mMNaCl， pH 7.4)中生成的。該復(fù)合物是通過混合DNA溶液(10|liL， 0.1 jxg L)與等體積含試驗(yàn)聚合物的溶液以不同的伯胺/磷酸4艮(N/P)比值形成的。讓該聚合物/DNA溶液在室溫靜置0.5 h，此時(shí)將8)uL該復(fù)合物溶液取出并與2 jaL6x負(fù)荷染料混
47合。將該復(fù)合物/負(fù)荷染料溶液轉(zhuǎn)移到一種瓊脂糖凝膠(0.6% w/v瓊脂糖，含0.5 |^/11^溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鋪)中，并使該凝膠展開(30min, 90 V)。該DNA在該凝膠中的位置是用一臺(tái)UV發(fā)光器確定的。凝膠結(jié)果顯示于
圖1中。
Polyplexes用原子力顯微鏡檢查法(AFM )成像:Polyplexes是像在電泳實(shí)驗(yàn)中那樣配制的。培養(yǎng)30 min后從該P(yáng)olyplexes溶液中取出20樣品、添加到一個(gè)新鮮云母表面上。然后，^使該云母表面以2000 RPM旋轉(zhuǎn)15秒。對(duì)于每種聚合物來說，這都是以20和40N/P進(jìn)行的。使用一臺(tái)購(gòu)自Park Scientific Instruments公司、配備100 jam描述器的CPResearch原子力顯孩i鏡進(jìn)4f Polyplexes觀察。數(shù)才居采集全都采用ProScan軟件U.6版)進(jìn)行。數(shù)據(jù)匯總?cè)缦隆?br> 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。COS-7細(xì)胞以16,000細(xì)胞/孔的密度在轉(zhuǎn)染研究開^臺(tái)前24 h4妄種于一個(gè)24孑L平亞中。在i亥Polyplexes添力口前4 h，通過向每孔中添加25jaL2mM氯奎/PBS溶液，用氯查處理該細(xì)胞。DNA/聚合物復(fù)合物是通過將50 聚合物溶液添加到50 nL 0.7 ng/pL DNA溶液中并進(jìn)行渦旋而以適當(dāng)電荷比制備的。讓該復(fù)合物培養(yǎng)30min。然后將該復(fù)合物溶液添加到該細(xì)胞中，在無血清培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)5h。此時(shí)，將50^L胎牛血清添加到每一孔中(使培養(yǎng)基總體積為550jiL)、將細(xì)胞培養(yǎng)24h。然后，將培養(yǎng)基從細(xì)胞中取出，該細(xì)胞隨后用PBS緩沖劑(2x500 pL )洗滌。然后向該細(xì)胞中添加250 pL溶素緩沖劑、然后該細(xì)胞培養(yǎng)10 min。此時(shí)將50 pL溶胞產(chǎn)物和50 |iL蟲熒光素酶試驗(yàn)試劑混合、其發(fā)生立即用一臺(tái)發(fā)光計(jì)讀數(shù)。然后，用一種商業(yè)上可得的試驗(yàn)測(cè)定其余溶胞產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)含量(n^3)。不用和用氯奎得到的轉(zhuǎn)染效率匯總于圖3中。
細(xì)胞增殖試驗(yàn):細(xì)胞增殖試驗(yàn)是用 一種非放射性MTT試驗(yàn)進(jìn)行的。在增殖研究開始前24 h,將COS-7細(xì)胞以16,000細(xì)胞/孔的密度接種于一種24孔平皿中。向這些細(xì)月包中添加對(duì)照和實(shí)驗(yàn)的聚合物以及空白溶液(作為負(fù)對(duì)照)，其濃度與無血清條件下每個(gè)電荷比例的轉(zhuǎn)染研究中所使用的濃度相同。將這些細(xì)胞培養(yǎng)5 h，向每孔中添加50 pL胎牛血清(使培養(yǎng)基總體積為550 pL)。將這些細(xì)胞培養(yǎng)24h,此時(shí)添加"viL四唑鹽溶液。培養(yǎng)4h后，加一滴溶液，再將這些細(xì)胞培養(yǎng)lh。將每個(gè)孔的內(nèi)容物混合、在570 nm測(cè)定其吸收。然后，計(jì)算相對(duì)于沒有用聚
48合物處理的對(duì)照細(xì)胞而言的吸收，給出％活細(xì)胞。
選擇L-賴氨酸衍生的肽殘基來從其a和s伯氨基導(dǎo)入陽(yáng)離子片斷。盡管PLL不是基因輸送的最有效合成運(yùn)載體，但它是研究得最多的合成運(yùn)載體之一而且文獻(xiàn)上有比較用的豐富數(shù)據(jù)，這使其成為一種用于證實(shí)目前陳述的碳水化合物-肽設(shè)計(jì)概念的良好模型肽。除其它優(yōu)點(diǎn)外，所期待的是，碳水化合物間隔物的導(dǎo)入可以降低PLL的細(xì)胞毒性。雖然PLL能有效地復(fù)合DNA并將DNA運(yùn)送到細(xì)胞中，但它有相對(duì)高的細(xì)胞毒性。已經(jīng)有人顯示，PLL用某些親水片斷的改性能提高該polyplexes的溶解度和降低其細(xì)胞毒性。在目前期待的化合物中，L-賴氨酸衍生的肽與導(dǎo)入多個(gè)極性羥基的碳水化合物衍生單體的共聚可認(rèn)為能給該聚合物以優(yōu)異的水溶性。該碳水化合物間隔物也降低了該聚合物的陽(yáng)離子電荷密度，預(yù)期這會(huì)降低細(xì)胞毒性。在碳水化合物與肽共聚單體之間采用縮合聚合來構(gòu)建雜共聚物。為此，所需要的碳水化合物和肽共聚單體是像以下所討論的那樣制備的。
肽和碳水化合物單體及共聚物的合成。選擇半乳糖二酸作為制造碳
水化合物單體的起始原料的可容易得到碳水化合物衍生物。采用一種簡(jiǎn)單的四步合成來制造二酰氯單體4,如以下流程XV中所說明的
流程AT
用l-丁醇酯化、隨后進(jìn)行羥基官能度的丙酮化物保護(hù)給出2。然后在堿性介質(zhì)中進(jìn)行酯皂化，給出二酸3。然后用SOCl2定量地合成二酰氯單體。肽單體的合成是采用簡(jiǎn)單的溶液相肽合成進(jìn)行的，如流程XVI中所示<formula>formula see original document page 50</formula>
流程"7
在每個(gè)偶合反應(yīng)中，都在HOBt的存在下使用EDC HC1作為偶合劑。每次肽偶合之后，都使用二甲胺/THF進(jìn)行氨基甲酸9-芴基甲酯
(Fmoc)脫保護(hù)，然后使其從反應(yīng)混合物中真空脫除、和進(jìn)行下一個(gè)偶合反應(yīng)。每次單體合成的最終步驟都是通過標(biāo)準(zhǔn)氫解定量脫除芐氧羰基
(Z)保護(hù)基。在測(cè)試各種聚合條件之后，界面聚合給出了最佳結(jié)果，而且用于合成每種共聚物。！H和13CNMR譜都證實(shí)每種聚合物的正確化學(xué)結(jié)構(gòu)。這三種預(yù)聚物(仍有Boc和丙酮化物保護(hù))的數(shù)均分子量(Mn)實(shí)測(cè)值分別為15,000、 9085、和13，200 g/mol。丙酮化物和氨基甲酸叔丁酉旨(Boc X呆護(hù)基使用TFA/H20/THF的全面脫保護(hù)給出最終共聚物Eflly(流程XVII)。流程JTKZT
在流程3中，Poly 1-3的游離胺是以其陽(yáng)離子形式顯示的。用這些雜共聚物的DNA復(fù)合和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是在緩沖至pH 7.4的水溶液中進(jìn)行的，在這種情況下該氨基會(huì)是質(zhì)子化的(oc-NH2 pKa 9, s-NH2pKa~10.8)。
在一條替代的路線中，先通過使一種糖酸脫水環(huán)化，制備一種雙內(nèi)酯，如以下例示性地說明的。當(dāng)一種二賴氨酸單體與該雙內(nèi)酯在極性溶劑例如甲醇或水或混合溶劑中混合時(shí)，末端氨基將內(nèi)脂環(huán)打開并生成雜共聚物?？梢允褂脦в邪被蚱渌H核基團(tuán)的其它單體來使雙內(nèi)酯開環(huán)而生成有其它結(jié)構(gòu)的雜共聚物，如結(jié)構(gòu)XI中所示。以下進(jìn)一步描迷更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)例。
結(jié)構(gòu)"雙內(nèi)酯開環(huán)聚合
如同以上流程I中所說明的，本發(fā)明期待一條更高效率的路線來制
51
o
oa-
fs造所公開的聚合物，其中肽部分和碳水化合物部分可以利用 一種雙內(nèi)酯
與一種有2個(gè)末端氨基的肽的開環(huán)聚合來彼此共價(jià)偶合。為了找出這條直接開環(huán)聚合路線的良好條件，使用乙二胺與葡糖二酸1,4:6,3-雙內(nèi)酯(A)之間的模型聚合來篩選質(zhì)子溶劑中會(huì)生成高聚物的催化條件(表1)。篩選了一系列已知能催化對(duì)酯的親核加成的催化劑。簡(jiǎn)單的親核催化劑例如二曱胺基吡啶(DMAP)和2-羥基吡咬(HOPy)并沒有導(dǎo)致顯著的改善。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)， 一系列路易斯酸催化劑例如Sc(OTf)3和Yb(OTfh能非常有效地催化開環(huán)聚合。如表l中所示，室溫下純水中的模型聚合能給出重復(fù)單元數(shù)為27的聚酰胺。這種鏈長(zhǎng)水平對(duì)于很多應(yīng)用來說會(huì)是足夠的。
表l使用乙二胺和作為單體的雙內(nèi)酯的模型開環(huán)聚合
室溫催化劑 W 0(in OH n溶劑催化劑打"
H20Sc<OTf)327
1:1 MeOH/H20Sc(OTf)318
1:1 MeOH歸Yb(OTf)s19
H,O。MAP<5
H20HOPv<;5
注a)n="!t復(fù)單元數(shù)目W O(!)H OH n
葡糖二酰胺，N,N'-二氨基乙烷共聚物:向葡糖二酸1，4:6,3-雙內(nèi)酯(A) ( 0.1508 g, 0.8666 mmol， 1當(dāng)量)在H20 ( 0.45 mL )中的攪拌溶液中滴加乙二胺(2M)在HzO ( 0.434 mL， 0.8666 mmol)中的溶液，然后立即添加TEA (0.015 mL， 0.2當(dāng)量)。向此溶液中添加Sc(OTf)3(0.084 g， 0.2當(dāng)量)在H2(D (0.2mL)中的溶液。Sc(OTf)3的添加立即在該溶液中生成一種白色沉淀，并在整個(gè)反應(yīng)期間持久發(fā)生。這種混合物又?jǐn)嚢?4 h,此時(shí)所得到的聚合物作為純白色固體從丙酮中沉淀出來。該聚合物有Mn=5.3 K、 Mw=6.53K、重復(fù)單元平均數(shù)=27。
雙內(nèi)酯與二賴氨酸單體的開環(huán)聚合
52遵照從模式系統(tǒng)研究識(shí)別的路易斯酸催化開環(huán)聚合條件，進(jìn)行二賴
氨酸單體與雙內(nèi)酯的聚合并得到聚合物(流程XVIII)
二賴氨酸-雙內(nèi)酯共聚物:向葡糖二酸1，4:6,3雙內(nèi)酯(A) (0.1280g, 0.7358 mmol, 1 eq )在MeOH ( 0.45 mL )中的攪拌溶液中滴加二賴氛酸單體(0.2858 g， 0.7358mmol, 1 eq)在H20 ( 0.45 mL)中的溶液、然后立即添加TEA( 0.015 mL， 0.2叫)。向此溶液中添加Se(OTf)3( 0.089g, 0.2叫)在HsO (0.2 mL)中的溶液。 一種沉淀物生成并在Sc(OTi)3添加時(shí)迅速溶解。讓這種混合物再攪拌24h，此時(shí)所得到的聚合物作為一種純白色固體從丙酮中沉淀出來。聚合物表征Mn-4.58 K， Mn=8.93 K,n=8.70。
在這些新陽(yáng)離子型聚合物的成功合成和表征之后，用它們作為基因載體進(jìn)行DNA復(fù)合和基因轉(zhuǎn)染。然后，利用EMSA和AFM觀察，表征在這些新陽(yáng)離子型聚合物與質(zhì)粒DNA之間生成的polyplexes。進(jìn)行蟲熒光素酶試驗(yàn)以考察轉(zhuǎn)染效率。最后，進(jìn)行細(xì)胞生存性實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)關(guān)于碳水化合物間隔物對(duì)肽鏈的加成從而降低該聚合物系統(tǒng)的細(xì)胞毒性的有效性的假設(shè)。
Polyplex生成和EMSA:穩(wěn)定的聚合物/DNA復(fù)合物的生成是高效率基因輸送的先決條件。遵照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，利用凝膠電泳來表征該polyplexes。 polyplexes是在pH 7.4和才莫擬活體離子強(qiáng)度條件的150 mM鹽濃度的HEPES緩沖食鹽水中生成的。該質(zhì)粒與該聚合物樣品以各種不同的N/P比例混合，并培養(yǎng)和復(fù)合0.5 h。然后，在一種含溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶銻的凝膠中進(jìn)行該聚合物/DNA復(fù)合物的電泳，來觀察DNA。適當(dāng)?shù)年?yáng)離子型聚合物可以與DNA結(jié)合而引起電荷中和，這阻礙了 DNA沿該凝膠的電流梯度向下運(yùn)動(dòng)。每種陽(yáng)離子型聚合物(Poly卜3)都顯示出在N/P比<2.0時(shí)有效地阻滯pSV-(3-gal質(zhì)粒DNA的運(yùn)動(dòng)(見
圖1 )。
Poly 1和Poly 3兩者在N/P比為l.5時(shí)都有效地阻滯了質(zhì)粒DNA,而Eolyl在2.0N/P比值時(shí)阻滯了質(zhì)粒DNA。重要的是要注意，在各種不同N/P比生成的聚合物/DNA復(fù)合物在水溶液中都依然是均相的，這與顯示出非均相的PLL/DNA復(fù)合物成鮮明對(duì)照。這種增大的溶解度歸因于碳水化合物間隔物導(dǎo)入的增強(qiáng)的親水性。
電荷中和在相對(duì)低N/P比時(shí)發(fā)生，表明這些聚合物能非常有效地掩蔽DNA電荷。數(shù)據(jù)顯示，在有高離子強(qiáng)度U50mM)的水溶液中這種電荷屏蔽也發(fā)生了。由于高鹽濃度減少了電荷吸引，因而這種觀察進(jìn)一步支持了這些聚合物對(duì)質(zhì)粒DNA的結(jié)合效能。這種使DNA束上的負(fù)電荷中和的能力讓該polyplex變得致密，從而能經(jīng)由細(xì)胞膜運(yùn)送而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。
該P(yáng)olyplexes的AFM觀察:polyplexes進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)通常經(jīng)由透過細(xì)胞膜的活性內(nèi)吞作用發(fā)生，這需要先與該細(xì)胞膜結(jié)合、總苞到核內(nèi)體中、并在內(nèi)化之后從該核內(nèi)體釋放出來。polyplexes被內(nèi)吞的效率在很大程度上取決于該polyplexes的物理特征，包括粒度。透過細(xì)胞膜的有效運(yùn)送的正常粒度范圍是50~200 nm。在這一范圍以上時(shí)，經(jīng)由內(nèi)吞作用的細(xì)胞內(nèi)化是不太可能的。該聚合物/DNA復(fù)合物的粒度和形狀是用AFM研究的。
AFM樣品是通過用20 nL聚合物/DNA polyplex溶液旋涂云母栽玻片制備的(像在EMSA試驗(yàn)中那樣制備)。每種聚合物都將DNA縮合成球形納米微粒，其直徑典型地在50 200 nm之間。對(duì)于有20和40N/P比的polyplexes觀察到下列粒度分布對(duì)于Poly 1，在20和40 N/P比時(shí)，87.4%微粒的直徑為50 200nm;對(duì)于MjL2,在相同N/P比時(shí)，90.2%微粒的直徑為50 200 nm;最后，對(duì)于Poly 3來說,95.3% Polyplexes的直徑為50 200 nm。
EMSA和AFM研究證實(shí)石友水化合物-肽共聚物可以有效地壓縮質(zhì)粒DNA，形成粒度主要在200 nm以下的納米微粒。這些數(shù)據(jù)表明，該碳水化合物-肽陽(yáng)離子型聚合物適合于在基因輸送應(yīng)用方面的進(jìn)一步研
54基因轉(zhuǎn)染結(jié)果。測(cè)試了這些雜聚合物的轉(zhuǎn)染效率，并與PLL比較。之所以選擇PLL作為對(duì)照，是因?yàn)樗茄芯康米疃嗟木酆衔锘蜣D(zhuǎn)染運(yùn)載體，且包含L-賴氨酸作為其余聚合物。轉(zhuǎn)染研究是用商業(yè)上可得的COS-7細(xì)胞和蟲熒光素酶試驗(yàn)試劑盒進(jìn)行的。
遵照已知的文獻(xiàn)程序，基因轉(zhuǎn)染是在無血清條件下添加氯奎--種
已知能使核內(nèi)體的膜破裂并有助于該polyplexes逸出核內(nèi)體的添加劑一進(jìn)行的。經(jīng)由內(nèi)吞作用的內(nèi)化之后，若該polyplexes不能高效率地逸出核內(nèi)體，它們就會(huì)傳遞到高酸性的溶酶體中，從而引起該DNA降解。增強(qiáng)polyplexes的核內(nèi)體釋放的一種有效機(jī)理是使用質(zhì)子海綿效應(yīng)，其中該聚合物栽體在處于酸性核內(nèi)體中的同時(shí)變得更高度質(zhì)子化。這觸發(fā)了氯根跨越核內(nèi)體膜的流入，且水隨后流入，以抗衡該內(nèi)體內(nèi)的高離子濃度。滲透壓終究導(dǎo)致核內(nèi)體破裂和所截留DNA的釋放。由于L-賴氨酸及其它伯胺基有相對(duì)高的pKa，而且不應(yīng)當(dāng)有任何質(zhì)子海綿效應(yīng)，因而通常來用氯奎的添加來增強(qiáng)核內(nèi)體釋放、從而提高基因轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于新型合成非病毒運(yùn)栽體的基因轉(zhuǎn)染研究來說，在以前的報(bào)告中通過也使用無血清條件。
細(xì)胞與氯奎一起預(yù)培養(yǎng)4 h，然后添加實(shí)驗(yàn)的和對(duì)照的polyplexes,然后在無血清條件下培養(yǎng)5 h。然后添加血清，再經(jīng)歷另外24h培養(yǎng)時(shí)間。然后使細(xì)胞溶解，并測(cè)量其相對(duì)光單位(RLU),將后者歸一化到總細(xì)胞蛋白/孔。這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖2A的圖。如同可以看到的，Poly2和M^在基因轉(zhuǎn)染方面均超過PLL,轉(zhuǎn)染水平接近于1.00E+08RLU/mg蛋白質(zhì)標(biāo)記。
這些結(jié)果顯示，Po，y 2和￡￡0^_可以高效率地輸送基因穿越細(xì)胞膜。Eol^丄有顯著較低的轉(zhuǎn)染效率，這被認(rèn)為可歸因于其結(jié)構(gòu)Poly 1只有一個(gè)a-氨基/重復(fù)單元。這種聚合物上的陽(yáng)離子電荷密度是這些聚合物中最低的，這可能導(dǎo)致對(duì)DNA較弱的結(jié)果。與M^l或i相比，MyL中a-氨基與e-氨基陽(yáng)離子部位之間pKa值和結(jié)合幾何形狀方面的差異也可能對(duì)不同的基因轉(zhuǎn)染效率有貢獻(xiàn)。若干種系統(tǒng)已經(jīng)顯示，非常微妙的結(jié)構(gòu)變化就會(huì)導(dǎo)致DNA結(jié)合和隨后基因輸送性能的顯著差異。 一項(xiàng)研究顯示，側(cè)鏈陽(yáng)離子電荷與聚合物主鏈的距離對(duì)與DNA生成的復(fù)合物有顯著影響。
轉(zhuǎn)染水平在若干濃度和電荷比上是與PLL竟?fàn)幍?，但稍低于最高?br> 55合成聚合物系統(tǒng)的一些例如PEI,后者已被顯示有比PLL高的轉(zhuǎn)染效
率。然而，由于用本發(fā)明主題的聚合物系統(tǒng)可以容易地進(jìn)行結(jié)構(gòu)置換，
因而該雜系統(tǒng)的效率可以進(jìn)一步改變。例如，核內(nèi)體逸出是當(dāng)前一些聚
合物的一個(gè)問題，因而只在較低pH (例如核內(nèi)體中的環(huán)境)才會(huì)質(zhì)子
化的、pKa值較低的氨基(例如組氨酸殘基pKa~5.2)的添加可能潛在 地改善轉(zhuǎn)染效率。
細(xì)胞增殖研究。合成基因輸送運(yùn)栽體的一個(gè)決定性問題是，高效率 合成運(yùn)栽體例如PEI通常有高細(xì)胞毒性。這顯著妨礙了它們向基因治療 臨床試驗(yàn)的發(fā)展。在發(fā)展新載體方面，決定性的是找出它們的細(xì)胞毒性 水平。本發(fā)明者用標(biāo)準(zhǔn)四唑系MTT試驗(yàn)測(cè)試了碳水化合物-肽聚合物的
行的。該雜共聚物與對(duì)照PLL (有類似Mn, 8500 g/mo1)之間毒性的差 異是出乎意外的。如同從圖2B中可以看到的，即使在雜聚合物的高濃 度，細(xì)胞毒性也接近于負(fù)對(duì)照組的水平，24h培養(yǎng)時(shí)間后細(xì)胞生存性為 92~98%。成鮮明對(duì)照的是，在這些研究中所使用的每個(gè)濃度上，PLL都 顯示出高得多的毒性。
純共聚物的這些試驗(yàn)結(jié)果可以代表最大細(xì)胞毒性，因?yàn)橐郧暗难芯?表明，與DNA的復(fù)合通常會(huì)降低陽(yáng)離子型聚合物的細(xì)胞毒性。在陽(yáng)離 子型聚合物中，細(xì)胞毒性往往起因于該陽(yáng)離子型聚合物與細(xì)胞膜的相互 作用，從而引起細(xì)胞膜溶解和細(xì)胞死亡。陽(yáng)離子型聚合物引起的細(xì)胞膜 破裂會(huì)受到三個(gè)主要因素影響氨基官能度類型(伯胺是最毒的，而叔 胺是毒性最小的)、聚合物濃度、和陽(yáng)離子電荷密度(聚合物鏈電荷密 度的增大引起導(dǎo)致胞質(zhì)泄漏的與細(xì)胞膜相互作用的改善)。如果該陽(yáng)離 子型聚合物有高電荷密度而且能容易地與細(xì)胞膜相互作用、有很多近附 著點(diǎn)，則它更可能是細(xì)胞毒性的。
細(xì)胞生存性結(jié)果進(jìn)一步顯示，半乳糖二酸-肽共聚物顯示出即使在高 聚合物濃度也基本上沒有細(xì)胞毒性。雖然細(xì)胞毒性的這種大幅降低的確 切機(jī)理并不清楚，但工作假設(shè)如下。首先，將陽(yáng)離子型肽分離成短鏈段 降低了連續(xù)電荷密度，導(dǎo)致較低的細(xì)胞毒性。在寡-L-賴氨酸研究中，已 經(jīng)顯示，細(xì)胞毒性隨該低聚物的長(zhǎng)度增大，這表明高連續(xù)電荷密度對(duì)細(xì) 胞膜有破裂性影響。其次，親水的碳水化合物鏈段會(huì)屏蔽該DNA聚合 物復(fù)合物的表面電荷，降低了其C電位，從而緩解了細(xì)胞膜破裂。進(jìn)而，
56當(dāng)該陽(yáng)離子型肽鏈段與該碳水化合物-肽雜共聚物中的質(zhì)粒DNA結(jié)合 時(shí)，據(jù)認(rèn)為，可撓曲碳水化合物間隔物可能凸出來并屏蔽該polyplex表 面電荷。作為后果，可以使細(xì)胞毒性降低。
碳水化合物-肽聚合物的免疫學(xué)研究
除低細(xì)胞毒性外，低免疫原性是安全基因輸送運(yùn)栽體的另一個(gè)重要 基準(zhǔn)。早期研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸的無規(guī)線型均聚物是幾乎無抗原的。然而， 由于所期待的碳水化合物-肽共聚物是新化合物，因而重要的是找出它們 在動(dòng)物中是否會(huì)發(fā)生任何免疫反應(yīng)。選擇一種Mn為9000 g/mo1的四賴 氨酸共聚物(Poly A)、用Fisher 344大鼠作為動(dòng)物模型進(jìn)行各種免疫 學(xué)評(píng)估。由于該共聚物是一種含有不同分子量化學(xué)種分布的多分散性樣 品，因而對(duì)于高分子量化學(xué)種和低分子量化學(xué)種來說，試驗(yàn)結(jié)果都應(yīng)當(dāng) 是代表性的。
個(gè)體Fisher 344大鼠進(jìn)行隱靜脈靜脈切開術(shù)、將血清貯存于-2(TC直 至用來作為免疫前血清。若干股大鼠接受50 pg Poly A (無佐藥)作為 50pL腳墊皮下(SC)注射液或100 )aL靜脈內(nèi)(IV)尾靜脈注射液。, i是分別在第一周、第三周和第六周給藥的'動(dòng)物是該聚合物每次追加 給藥之后21天進(jìn)行靜脈切開術(shù)的。血清是在第六周和第九周得到的， 并貯存于4。C直至使用。
一+
96孔Immulon MaxiSorb微升平皿的各個(gè)孔涂布100 ^iL要么濃度為 3 |ag/niL的PolyA要么正常大鼠血清(陽(yáng)性對(duì)照)，并在4。C培養(yǎng)過夜。 將來自正常、IV給藥、和SC注射的M^大鼠的大鼠血清樣品添加到 各孔(50jliL/孔)中而不稀釋，并在室溫下培養(yǎng)lh。各孔用200jaL0.1% Tween-20 1XPBS洗滌4次。Anti-rat IgG(H+L)HRP用1% BSA lxPBS稀 釋1:3000、添加到各孔中、在室溫下培養(yǎng)1 h。各孔用200 pL 0.1% Tween-20 1XPBS洗滌4次。添加TMB ( 75 iuL/孑L )并培養(yǎng)15 min。在
57添加25 iuL2NHCl使反應(yīng)停止后，該平皿用一臺(tái)微平皿讀出器讀數(shù)。
圖3中的圖說明來自這些ELISA的各股大鼠的OD的平均值和SD。 這里說明了抗聚合物ELISA數(shù)據(jù)，包括背景、免疫前血清、皮下注射 (SC)、靜脈內(nèi)注射(IV)、和正常大鼠血清(陽(yáng)性對(duì)照)的結(jié)果。第 1、第2、和第3血清是分別在第3周、第6周和第9周采集的。這些 ELISA數(shù)據(jù)證實(shí)，在聚合物AJ至由要么SC要么IV途徑的3次給藥之后， 相對(duì)于背景而言，沒有任何可4全測(cè)抗體反應(yīng)。沒有任何抗體反應(yīng)的i正 據(jù)，所有大鼠都是健康的(無失重、正?；钚?、良好衛(wèi)生/優(yōu)質(zhì)皮毛)， 表明沒有其它有害免疫反應(yīng)或毒性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，本發(fā)明的碳水化合 物-肽聚合物要么不是免疫原的要么不是毒性的。
糖-肽雜共聚物的酶促降解
進(jìn)行了關(guān)于Polyl-3的酶促降解研究，其結(jié)構(gòu)顯示于結(jié)構(gòu)V中。如 MALDI-TOF質(zhì)譜法所監(jiān)測(cè)的，這些聚合物的分子量隨培養(yǎng)時(shí)間增加而 降低，表明這些聚合物被酶降解。
用枯草桿菌蛋白酶A作為催化劑的Poly 1生物降解研究:向磷酸鹽 緩沖食鹽水(1.38mL， PBS, 120mMNaCl， 2.7mMKCl， lOmM石舞酸 鹽緩沖劑)和枯草桿菌蛋白酶A (0.138 mg, 11 U/mg,來自bacillius globigii)的溶液中添加Eii1^1 ( 13.8 g)。此溶液在該實(shí)驗(yàn)期間在38°C 攪拌。以適當(dāng)時(shí)間間隔采集等分樣品UOOpL)、用MeOH ( 200 pL ) 稀釋。將a-氰基-4-輕基肉桂酸在H20/MeOH ( 1:2)中的飽和溶液的等分 樣品(1 pL)點(diǎn)到作為基體的MALDI樣品板上。讓這些樣品風(fēng)干，此 時(shí)將不同稀釋倍數(shù)的MeOH稀釋降解溶液添加到該基體上。將MALDI 數(shù)據(jù)輸出給ExcelTM，利用一條以100點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)平均值平滑的棱線作圖。 圖4A顯示使用枯草桿菌蛋白酶A和二賴氨酸聚合物(Poly 1 )的降解
研究的結(jié)果。
用枯草桿菌蛋白酶A作為催化劑的Poly2生物降解研究:向磷酸鹽 緩沖食鹽水(2.6mL, PBS， 120mMNaCl， 2.7mMKCl， 10mM磷酸 鹽緩沖劑)和枯草桿菌蛋白酶A (0.26 mg， 11 U/mg，來自bacilius globigii)的溶液中添加Eol^_2 ( l2.9 mg)。此溶液在該實(shí)驗(yàn)期間在38 。C攪拌。以適當(dāng)時(shí)間間隔采集等分樣品(100 ^L)并以MeOH (200 pL) 稀釋。將a-氰基-4-羥基肉桂酸在H20/MeOH (1:2)中的飽和溶液的等分樣品(1 pL)點(diǎn)到作為基體的MALDI樣品板上。讓這些樣品風(fēng)干，此 時(shí)將不同稀釋倍數(shù)的MeOH稀釋降解溶液添加到該基體上。將MALDI 數(shù)據(jù)輸出給ExcelTM,利用一條以100點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)平均值平滑的棱線作圖。 圖4B顯示使用枯草桿菌蛋白酶A和三賴氨酸聚合物(Poly 2 )的降解研 究的結(jié)果。
用胰蛋白酶作為催化劑的Poly 1降解研究:向磷酸鹽緩沖食鹽水 (1.07mL, PBS， 120mMNaCl， 2.7mMKCl， 10mM磷酸鹽緩沖劑) 和胰蛋白酶(0.0011 mg， 10.2U/mL,來自牛胰腺)的溶液中添加EqJ^1 (10.7 mg)。此溶液在該實(shí)驗(yàn)期間在38。C攪拌。以適當(dāng)時(shí)間間隔采集 等分樣品(50pL)、用MeOH ( 100 pL)稀釋。將a-氰基-4-羥基肉桂酸 在H20/MeOH ( 1:2)中的飽和溶液的等分樣品(1 pL)點(diǎn)到作為基體的 MALDI樣品板上。讓這些樣品風(fēng)千，此時(shí)將不同稀釋倍數(shù)的MeOH稀 釋降解溶液添加到該基體上。將MALDI數(shù)據(jù)輸出給Excel ,利用一條 以實(shí)驗(yàn)平均值光滑的棱線作圖。圖4C顯示使用胰蛋白酶和二賴氨酸聚 合物(Poly 1 )的降解研究的結(jié)果。
本發(fā)明者期待使用酪氨酸氧化偶合作為一種手段來使水凝膠形成 用的本發(fā)明聚合物交聯(lián)。這種交聯(lián)方法應(yīng)當(dāng)容易地以可見光作為光引發(fā) 劑或以過氧化物酶作為催化劑(在生物合成路線中)進(jìn)行。為此， 一種 含酪氨酸共聚單體像以下流程XIX中所述那樣合成
含酪氨
酸糖-肽共聚物的合成<formula>formula see original document page 59</formula>
反應(yīng)條件:
i) EDC, HOBt; DEPEA, 12h 90%產(chǎn)率
ii) DMA(2M),THF.
Ui) BocLys(Z)OH, EDC, HOBt D1PEA, 121^ 60%產(chǎn)率 iv) Pd/C, 2當(dāng)量TFA, 12 h, 95%產(chǎn)率
流程mFmoc-Tyr(tBu)-Lys(Z)-OMe的合成:向二異丙基乙基胺(U9 mL, 3.43 mmol) /DCM ( 50 mL )的溶液中添加Lys (Z) OMe ( 1.13 g， 3,43 mtnol)。向此溶液中添加FomcTyr(tBu)OH ( 1.50 g， 3.26 mmol)、然 后HOBt( 0.463 g， 3.43 mmol)、最后EDC 'HCl( 0,6571 g， 3.43 mmol)。 此溶液攪拌8 h,此時(shí)該有機(jī)溶液用IN HCl (2x20 mL)、然后飽和 NaHCO3 (2x20mL)、最后H20 (2x20mL)洗滌。有才幾層真空濃縮， 得到一種白色固體(2.34g, 97.5%產(chǎn)率)
7.53, 2H), 7.55 (m, 2H), 7.40 (t,7.45,2H), 7.38、7.29 (m， 7H), 7.08 (m， 2H), 6.88 (d, 8.25, 2H), 6.43 (br s, 1H), 5.52 (br s, 1H), 5.15-5.07 (brm， 3H)， 4.50 (邁,1H), 4.42 (m, 1H)， 4,30 (m, IH), 4.18 (t, /= 6,92， 1H), 3.70 (s, 3H)， 3.18-2.95 (m,4H), 1.85-1.35 (m, 4H), 1.30 (s, 10H), 1.20 (brs,2H); IJC NMR (125MHz， CDC13)S 163.0,154.6,143.9-143.8 (3)， 141,46， 136.6, 130,0,128.7, 128.2, 127.9， 127.3， 125.2,124.5,120.2 (2), 67.13, 66,8， 53.6, 52,6, 47.3, 4.0, 37.8, 32.6, 29,4,29,0 (3), 22.17;HRMS (FAB) m/z C43H49N30s(M+H)+的計(jì)算值736.3598，實(shí)測(cè)值736.3623。
Boc-Lys(Z)-Tyr(tBu)-Lys(Z)-OMe的合成:向Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Z)國(guó) OMe (7.72g, 10.49 mmol) /THF ( 105 mL )的溶液中添加二甲胺(52.5 mL, 2M, 104.9 mmol)。讓這一反應(yīng)達(dá)到室溫并4覺拌1.5 h。此時(shí)，將 反應(yīng)混合物真空濃縮。向該黃色固體中添加DCM ( 225 mL)和DMF ( 45 mL)。向此溶液中添加Boc-Lys(Z)-OH(4.19 g， 11.01 mmol)、然后HOBt (1.488 g, 11.01 mmol)、然后EDC . HC1 ( 2.112 g, 11.01 mmol)。 此溶液攪拌8 h，此時(shí)該有機(jī)溶液用1 N HC1 (3x100 mL)、然后々包和
H NMR (500MHz， CDC13) S 7.77 (d, J=
60NaHC03 ( 3x100 mL)、最終H20 ( 3x100 mL)洗滌。該有機(jī)層變成凝
膠狀，添加MeOH以破壞該凝膠。該有機(jī)層用MgS04干燥、真空濃縮，
得到 一 種白色固體。柱色譜法(0~ 1 % MeOH ， CHC13)精制給出產(chǎn)品(5.5〗 g, 65%產(chǎn)率)。
Boc-Lvs-Tyr(但u)-Lys-OMe(KYK)的合成:向BocLys(Z) Tyr(tBu) Lys(Z)OMe( 1.79 g, 2.04 mmol)在MeOH ( 113 mL )和TFA ( 0.304 mL， 2叫.)中的溶液中添加Pd/C (催化劑)。此溶液用H2吹掃30 min、然 后安裝一個(gè)H2氣球。讓反應(yīng)進(jìn)行8h,此時(shí)該混合物通過Celite層過濾、 真空濃縮，得到純粹、清澈的產(chǎn)品U.63g, 95%產(chǎn)率)。然后，使含酪 氨酸的單體與半乳糖二酰氯共聚，生成一種含酪氨酸共聚物
受保護(hù)半乳糖二酰-KYK共聚物的合成:將Boc-Lys-Tyr(tBu)曙L(fēng)ys-OMe ( 0.881 g， 1.05 mmol)連同Na2C03 (0.369 g) —起在30.0mLH2O 中攪拌。向這種猛烈旋渦的溶液中添加一種半乳糖二酰氯(0.345 g， 1.05 mmol)在10 mL CC14中的溶液。這種雙相混合物在室溫?cái)嚢?0 min。 沉淀物通過過濾收集、用水洗滌，得到一種白色固體。該聚合物的特征 在于Mn=4.9 kg/mol， Mw=8.9 kg/mol。
61全保護(hù)半乳糖二酰三賴氨酸共聚物的脫保護(hù):向50%TFA/H2O( 15.0 mL)的溶液中添加受保護(hù)聚合物(0.600 g) 。 4h后，將該溶液濃縮， 提供脫保護(hù)聚合物(定量)。為了提高該共聚物的水溶性，也通過一種 二賴氨酸單體(KK)、 一種含酪氨酸共聚單體(KYK)和一種碳水化 合物二酰氯單體的共聚，合成了以下三元共聚物。作為流程XX中所示 的一個(gè)實(shí)例， 一種這樣的聚合物的合成是使用0.3當(dāng)量KYK單體和0.7 當(dāng)量KK單體進(jìn)行的。
反應(yīng)條件:i)0.3eq.KYK, 0.7 eq.KK， l.O叫糖二酰氯，H20/CC14, Mn=13K, Mw-21K, ii) TFA/H20
NMR顯示該聚合物鏈中KK和KYK單體單元的摩爾比為約50:50。 這意味著KYK單體的反應(yīng)性略高于KK單體。KK-KYK-糖共聚物的Mn 高于KYK共聚單體與糖二酰氯的共聚物。合成細(xì)節(jié)說明如下
受保護(hù)KK-KYK糖共聚物的合成:Boc-Lys-Tyr(tBu)-Lys-OMe( 0.332 g， 0.386 mmol) 、 Boc-Lys-Lys-OMe ( 0.528 g, 0.856 mmoi)連同Na2C03
流程xr(0.434 g) —起在含有28.0mLH2O的燒杯中攪拌。向這種渦旋溶液中 添加半乳糖二酰氯4 ( 0.406 g， 1.24mmo1)在12mLCCU中的溶液。這 種兩相混合物在室溫?cái)嚢?0min。沉淀物過濾收集、用水洗滌，得到一 種白色固體(0.380 g產(chǎn)率)Mn=12.9kg/mol, Mw=20.4 kg/mol。
全保護(hù)KK-KYK-糖共聚物的脫保護(hù):向50%TFA/H2O ( 10.0 mL ) 的溶液中添加受保護(hù)聚合物(0.380 g) 。 4 h后，將該溶液濃縮，提供 脫保護(hù)聚合物(定量)。
含酪氨酸共聚物交聯(lián)生成水凝膠
如以上流程IV中所說明的，本發(fā)明者期待2種使水溶液中含酪氨 酸共聚物交聯(lián)的方法。第一種使用Ru(III)(bpy)3作為氧化劑(從 Ru(II)(bpy)3、過硫酸銨和光發(fā)生)。第二種在超氧化物歧化酶的存在下 使用一種過氧化物酶和過氧化氫。在此證實(shí)的是，化學(xué)路線和酶促路線 都能高效率地使含酪氨酸共聚物交聯(lián)成水凝膠(流程XXI)
反應(yīng)條件i) Ru(II)(bpy)3Cl2，過硫酸銨，可見光，180-120s。
ii) HOOH,超氧化物歧化酶，辣根過氧化物酶(HRP )。 流程XXI 水凝膠生成的詳細(xì)條件描述如下
63<formula>formula see original document page 64</formula>
使用Ru(II〗催化劑的水凝膠生威.:向KK-KYK-糖共聚物(70.0 mg) 在PBS ( 0.250 mL )中的溶液中添加足量NaOH ( 2.5 M, 3滴)以使該 聚合物沉淀。添加最低限量HCl(O.l M， 8滴)使該聚合物再變成溶液。 然后，向此溶液中添加Ru(II)(bpy)3Cl2 ' 2H20 ( 1.5 mg， 0.002 mmol)和 過疏酸銨(1.55mg， 0.00679mmol)在PBS (0.100 mL)中的溶液。此 溶液充分混合、光照180s。生成一種半透明橙色凝膠。
<formula>formula see original document page 64</formula>
使用HOOH和HRP的水凝膠生成:向KK-KYK-糖共聚物(70.0 mg) 在硼酸/硼酸鹽緩沖劑(0.25M, 0.250 mL)中的溶液中添加足量NaOH (2.5 M, 2滴)在使該聚合物沉淀。以最低限量HC1 ( 0.10 M， 8滴) 使該聚合物又幾乎完全回到溶液中。然后，向此溶液中添加HRP ( 1.75 mg)和SOD ( 1.75 mg)。此溶液充分混合、然后向其中添加HOOH溶 液(28pL， 0.03%溶液)。5分鐘內(nèi)生成一種微鞣色凝膠。
KK-KYK-糖共聚物水凝膠上的細(xì)胞培養(yǎng)
制備了若干種使用所述條件的水凝膠，用于細(xì)胞生長(zhǎng)研究。這樣生 成的水凝膠用PBS緩沖劑洗滌少數(shù)幾次，直至它們不是酸性的。作為細(xì) 胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例，將平滑肌細(xì)胞(SMC's)接種到該凝膠上，并 監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)。5天后該細(xì)胞健康地生長(zhǎng)。新的含酪氨酸共聚物合威
為了改善該共聚物在較高pH的溶解性，在以下的親水聚合物設(shè)計(jì) 中包括了酸性片斷。為此，以下流程XXII顯示一種有可裂解酸基的KK 單體的合成
反應(yīng)條件 i) EDC, HOB、 DIPEA, 12h, 90%產(chǎn)率 ii) Pd/C, 2當(dāng)量TPA, 12 h, 95%產(chǎn)率
流程ZX7J
然后，將這種單體用于界面聚合，作為如以下流程XXIII中所迷與
KYK單體共聚的試驗(yàn)條件。該聚合進(jìn)行順利，Mn=9118且M『14，390 g/mo1。叔丁酯的TFA脫保護(hù)需要24 h,相比之下，丙酮化物和Boc保 護(hù)基的脫保護(hù)只需3h左右。
反應(yīng)條件i) 1.0當(dāng)量KK, :1.0當(dāng)量二酰氣， H20/CCl4，NIn =
9.1K, Mw = 14.5K; ii) 1 :TFA /水24小時(shí)
流程Xffl7
這種新單體和KYK單體也與一種糖二酰氯共聚，生成以下三元共 聚物(流程XXIV)。這種聚合物的分子量與前面的KK-KYK-糖共聚物 系統(tǒng)的分子量大致相同，Mn=8.6KIMw=13.5K。
65反應(yīng)條件i) 0.70當(dāng)量KKO伯u, 0.30當(dāng)量KYK, 1.0當(dāng)量二酖氯， H2OycC", M8.6 K, Mw = 13.5 K; ii) 1 ;1TFA /水24小時(shí)
流程XXIV
Angew. Chem. Int. Ed 2005， M， 6529-6533中描述了又進(jìn)一步的數(shù) 據(jù)、實(shí)驗(yàn)、和考慮，以及支持信息(例如，在www.angewnadte.org上可 用電子手段獲得)，這些都明確地列為本文參考文獻(xiàn)。
參者文獻(xiàn)
(1) Luo, D.,和Saltzm咖，W. M. (2000) iVhr, Ao/ecAwo/. ", 33-37.
(2) Wolff, J. A. (2002) JVflf.所Wec/mo/. 20, 768-769,
(3) ZhUj J., Grace, M., Casale， J., Chang, A., Musco, M. L" Bordens, R., Greenberg, R., Schaefer, E.,和Indelicato， S, (1999) //"wan G幼e 7%erg y JO, 113-121.
(4) Feigner, P. L. (1997) Sc!.. 27《102-106.
(5) Friedm咖,T. (1997) 276,96-101.
(6) De Smedt, S. C., Demeester, J,,和He加ink, W. E. (2000)/Vwwwcetm'ca》及es, 〃,113-.126 and references therein.
(7) Kakizawa, Y.,和Kataoka,(2002) drfv. DrwgDe"v.及ev. 54， 203-222.
(8) Zauner, W., Ogris, M,和Wagner' B, (1998) jrfv. "rug, ZWtv.及ev. 97-113,
66(9) Fischer, D., Li, Y., Ahlemeyer, B" Krieglstcin, J"和Kissel, T. (2003) 5i'omflfm'afe 2《1121-U31.
(10) Akinc, A" Lynn, D. M., Anderson, D. G.,和Langer, R. (2003) Dte附. Soc. 5316-5323.
()Reineke, T. M.,和Davis, M. E. (2003) &ocon_/wgafe C/ie"i. ", 2.47-254.
(12) Lim, Y,, Kim， C., Kim' K.， Kim, S. W,,和Park, j. (2000) J jot. C/ww. <Soc. 122,6524-6525,
(13) Putnam, D., Gentry, C.A., Pack> D. W.,和Langcr, R. (2001) /Voc. A^/. ^c。d "&4犯，1200-1205，
(14) Wang, J., Mao, H,:Q,,和Leong, K. W, (2001) J. j附.Oiem. <Soc. "3,9480'
9481.
(15) Forrest, M. L,, Koerber, J. T"和Pack, D,W. (2003)歷oco"y'"g。紐CAe加，"， 934-940.
(16) Thomas, M.,和Klibanov, A. M. (2002)尸roc. ;Vi^/,<SW. 卯，14640-
14645.
(17) Zairta, M. A" Belguise-Valladier, P.,和Behr, J, P. (1999) iVoc. W。",5W. 固96, 91-96.
(18) McAllister, IC, Sazani, P., Adam, M., Cho, M., Rubinstein, M， Samulski, R. J.' 和DeSimo加,J. M, (2002) 爿w. Oiewj. >Joc. "4,15198-15207.
(19) Liu, Y., Wenning， L，， Lynch, M,,和Rdneke, T. M. (2004) /血.C7ze附.6bc 風(fēng)7422-7423.
(20) Malik, N., Wiwattanapatapee, R., Klopsch, IL, Lorenz, K., Frey, H., Weener， J. W., Meijer, E. W., Paulus, W.,和Duncan, R. (2000) / C< w/ro//ed及e/eore. (15,133-148.
(21) Howari K. A" Dash, P. R., Read, M. L.， Ward, K,, Tomkins， L. M" Nazarova, O., Ulbrich, K.,和Seymour, L. W. (2000) 5focWw〖ca er及'0;7AyWca為"".^75,245-255.
67(22) Anwer, K" Rhee, B. G.,和Mendiratta, S. K. (2003) O".及ev. Z7ier i>wg O 5>Wew 20' 249-293,
(23) Choi, Y. H., Liu, F., Kim, J,S., Choi, Y. K., Park J. S.,和Kim, S, W. (1998) / Co'"n "e疏/eaje X, 39-48.
(24) EllenbogeA E. (1952) / Jm. CA抓.foe. 74, 5198. ,
(25) Gonzalez, H., Hwang, S. J"和Davis, M. E. (1999)歷.oco"/"ga,e (TAe怖.10, 讓-歸.
(26) Hwang, S. J., Bellocq' N, C,,和Davis, M. E. (2001)所oco y'"gafe CTiew.", 280-290.
(27) Reind", T. M.和Davis, M. B. (2003)歷oco"/"gafeW， 255-261.
(28) Wolfert, M, A., Dash, P. R.， Nazarova, O., Oupicky, D., Seymour, L. W.， Smart, S., Strohalm, J.'和Ulbrich， K. (1999) 5!'ocort/wg"/e C力柳.993-1004.
(29〉 Bruice， T. C.,和Schmir. G. L. (1958) /爿加.Otew. Joe. 80,148.
(30) Plank, C.' Tang, M. X., Wolfe, A. R.,和Szoka, F. C., Jr. (1999) //"w。,》 7><e，", 319-332.
(31) Kabanov, A, V.,和Kabanov, V. A, (1995)歷ocwy'wgate C/ie附.(5, 7-20.
因此，已經(jīng)公開了聚合物材料的具體實(shí)施方案和應(yīng)用。然而，對(duì)于 業(yè)內(nèi)技術(shù)人員來說，應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，除已經(jīng)描述的那些外，只要不 背離本文中的發(fā)明概念，還可以進(jìn)行很多修飾。因而，本發(fā)明主題是不 受限制的，除所附權(quán)利要求書的精神外。進(jìn)而，在解讀本說明書和權(quán)利 要求書兩者時(shí)，所有術(shù)語(yǔ)都應(yīng)當(dāng)以與上下文一致的最廣泛可能方式解 讀。具體地說，"包含，，(comprises和comprising)這一術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)解讀
為系指呈非排他性方式的要素、成分、或步驟，表明所提及的要素、成 分、或步驟可以與未明確提及的其它要素、成分、或步驟一起存在、利
與^文中所提供的該術(shù)語(yǔ)的定l不一致或^盾的情部下，適用本^中所 提供的該術(shù)語(yǔ)的定義，而不適用該參考文獻(xiàn)中該術(shù)語(yǔ)的定義。
權(quán)利要求
1. 一種嵌合體聚合物，有按照式I的結(jié)構(gòu)[(M)x1(N)y1]z1[(M)x2(N)y2]z2 式I式中M獨(dú)立地是一種碳水化合物片斷，且N獨(dú)立地是一種氨基酸；式中x1、x2、y1、y2、z1、和z2獨(dú)立地是1～10000之間的整數(shù)，含1和10000，式中x1當(dāng)y2大于或等于1時(shí)任選地為0，且式中y2當(dāng)x1大于或等于1時(shí)任選地為0；和式中碳水化合物片斷和氨基酸彼此耦合，以致成為聚合物主鏈的碳水化合物片斷和氨基酸。
2. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中xl和x2中至少一個(gè)是2~20 的整數(shù)。
3. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中yl和y2中至少一個(gè)是2~20 的整數(shù)。
4. 權(quán)利要求l的嵌合體聚合物，其中多個(gè)N形成一種氨基酸主鏈， 且其中該氨基酸主鏈?zhǔn)墙?jīng)由一種氨基酸的a、 p、 y、或s氨基之一與第二 種氨基酸的a、 p、和y羧酸根之一之間的共價(jià)鍵形成的。
5. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中該碳水化合物是經(jīng)由酰胺鍵共 價(jià)地偶合到氨基酸上的。
6. 權(quán)利要求l的嵌合體聚合物，其中該碳水化合物片斷中至少一個(gè) 是一種環(huán)狀碳水化合物。
7. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中該碳水化合物片斷中至少一個(gè) 是一種非環(huán)狀碳水化合物。
8. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中該氨基酸中至少一種是一種非 天然存在的氨基酸。
9. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中M和N中至少一種包含交聯(lián) 性官能度，且其中該交聯(lián)性官能度共價(jià)地鍵合到另 一種嵌合體聚合物的 另一種交聯(lián)性官能度上，從而生成一種交聯(lián)聚合物。
10.權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中M和N中至少一種包含交聯(lián) 性官能度，且其中該交聯(lián)性官能度是通過離子鍵、氫鍵、二硫化物鍵、和疏水性相互作用中至少 一種鍵合到另 一種嵌合體聚合物的另 一種交 聯(lián)性官能度上的，從而生成一種交聯(lián)聚合物。
11. 權(quán)利要求9或權(quán)利要求10中任何一項(xiàng)的嵌合體聚合物，其中該 交聯(lián)聚合物是一種任選地包括醫(yī)藥劑和細(xì)胞中至少 一種的水凝膠。
12. 權(quán)利要求1的嵌合體聚合物，其中該聚合物配制成一種適合于 植入、注射、經(jīng)局部、經(jīng)粘膜、和經(jīng)口給藥中至少一種的制劑。
13. —種包含權(quán)利要求1的嵌合體聚合物和醫(yī)藥活性劑的醫(yī)藥組合 物，其中該醫(yī)藥活性劑任選地共價(jià)附著到該聚合物上。
14.權(quán)利要求13的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥活性劑封裝于該聚合物 形成的一種基體中。
15. 權(quán)利要求13的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥活性劑是一種肽，且其 中(N)yl和(N)y2中至少 一種包含該醫(yī)藥活性劑。
16. 權(quán)利要求13的醫(yī)藥組合物，其中該聚合物有適合于生物降解的 組成，從而能釋放出該藥理活性劑。
17. —種包含權(quán)利要求1的嵌合體聚合物的含細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
18. 權(quán)利要求17的含細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中該嵌合體聚合物與至少一種其 它嵌合體聚合物交聯(lián)。
19. 權(quán)利要求18的含細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中該嵌合體聚合物是一種由多種 其它嵌合體聚合物形成的水凝/I交的組成部分。
20. 權(quán)利要求17的含細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中該嵌合體聚合物包含一種共價(jià) 鍵合到該嵌合體聚合物上的細(xì)胞粘合增強(qiáng)劑。
21. 權(quán)利要求17的含細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中該結(jié)構(gòu)構(gòu)型成為一種植入物。
全文摘要
提供了嵌合體聚合物組合物和方法，其中多種碳水化合物片斷和氨基酸形成一種聚合物的主鏈。最好，該聚合物包括構(gòu)成該嵌合體聚合物的交替糖和肽部分。
文檔編號(hào)A01N37/18GK101500420SQ200680013695
公開日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2006年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日
發(fā)明者Z·關(guān) 申請(qǐng)人:加州大學(xué)評(píng)議會(huì)