專利名稱：肝素組合物和選擇素抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般來(lái)說(shuō)是關(guān)于分子生物學(xué)，且更確切地說(shuō)是關(guān)于鑒別和/或分離阻斷L-選擇素和/或P-選擇素結(jié)合活性并減弱選擇素介導(dǎo)轉(zhuǎn)移或其他選擇素介導(dǎo)疾病或病癥 的肝素變體的方法。
背景技術(shù)：
P-和L-選擇素是識(shí)別唾液酸化、巖藻糖基化、硫酸化配體的C型凝集素。P-選 擇素儲(chǔ)存在靜息血小板和內(nèi)皮細(xì)胞中，且在活化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面。L-選擇素在大多 數(shù)白細(xì)胞類型中組成性表達(dá)且介導(dǎo)其與內(nèi)皮配體的交互作用。兩種選擇素在炎癥位點(diǎn) 的外滲期間促進(jìn)白細(xì)胞的初始粘連。P-選擇素在止血中也起作用。P-和L-選擇素的內(nèi) 源性配體(例如PSGL-1)在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(對(duì)選擇素和其配體的綜述參 見(jiàn)例如Varki A.， Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:7390-7; Ley等人，J Immunol (1995) 155:525-8; Kansas GS， Blood (1996) 88:3259-87; McEver等人，J Clin Invest (1997) 100:485-92; Lowe JB. Kidney Int (1997) 51:1418-26; Rosen SD.Annu Rev Immunol (2004) 22:129-56)。
P-和L-選擇素在涉及炎癥和再灌注的許多疾病中(Bevilacqua等人，Annu Rev Med (1994) 45:361-78; Lowe等人，J Clin Invest (1997) 99:822-6; Ley K.， Trends Mol Med (2003) 9:263-8)以及在癌轉(zhuǎn)移中也有病理性作用。許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)選擇素配體， 并且已報(bào)道腫瘤選擇素配體表達(dá)與存活之間的反比關(guān)系(Varki NM， Varki A. Semin Thromb Hemost (2002) 28:53-66)。同種或異種小鼠模型顯示選擇素配體-陽(yáng)性腺癌向 肺的轉(zhuǎn)移是P-和L-選擇素依賴性的(Kim等人，Proc Natl Acad Sci USA (1998)95:9325-30; Friederichs等人，Cancer Res (2000) 60:6714-22; Borsig等人，Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98:3352-7; Borsig等人，Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:2193-8; Ludwig等人，Cancer Res 2004;64:2743-50)。
許多經(jīng)典研究證明未經(jīng)分級(jí)分離的肝素(UFH)在癌癥轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型中具有抑制 效應(yīng)(Zacharski等人，Thromb Haemost (1998) 80:10-23; Engelberg H. Cancer (1999) 85:257-72; Hejna等人，J Nat Cancer Inst (1999) 91:22-36; Smorenburg等人， Pharmacol Rev (2001) 53:93-105),且回顧分析顯示肝素在人類癌癥中可能具有類似效 應(yīng)(Kakkar， Int J Oncol (1995) 6:885-8; Hettiarachchi等人，Thromb Haemost (1999) 82:947-52; Ornstein等人，Haemostasis (1999) 29增刊1:48.60; Smorenburg等人， Thromb Haemost (1999) 82:1600-4;及Zacharski等人，Semin Thromb Hemost (2000) 26增刊1:69-77)。大量文獻(xiàn)也論述了經(jīng)大量文件證明的癌癥與靜脈血栓形成的關(guān)系， 以及經(jīng)由用肝素或蛭素阻斷液相凝血來(lái)抑制轉(zhuǎn)移。然而，使用維生素K拮抗劑作為抗 凝血替代模式的人類實(shí)驗(yàn)顯示在大多數(shù)癌中其對(duì)存活無(wú)效。因此，應(yīng)假定肝素對(duì)轉(zhuǎn)移 的療效并非主要基于其抗凝血活性。
基于未經(jīng)分級(jí)分離的肝素通過(guò)促進(jìn)抗凝血酶使因子Ha和Xa失活來(lái)抑制液相凝 血的能力，人們已經(jīng)將其用于臨床應(yīng)用中。然而，UFH是包含5000至30000道爾頓 的高度硫酸化葡萄糖胺聚糖鏈的復(fù)合多分散混合物的天然產(chǎn)物，實(shí)際上只有某些UFH 結(jié)合抗凝血酶。早期研究顯示P-選擇素可結(jié)合固定化肝素(Skinner等人，Biochem Biophys Res Commun (1989) 164:1373-9)。已顯示各種肝素和類肝素可抑制P-和L-選擇素二者與其天然配體的結(jié)合(Nelson等人，Blood (1993) 82:3253-8; Norgard-Sumnicht等人，Science (1993) 261:480-3; Koenig等人，J Clin Invest (1998) 101:877-89; Ma等人，J Immunol (2000) 165:558-65; Xie等人，J Biol Chem (2000) 275:30718-1)。
人們期望鑒別出可用于抑制L-選擇素和P-選擇素與存于人類細(xì)胞上的配體結(jié)合 的醫(yī)藥級(jí)肝素和類肝素制劑?？蛇M(jìn)一步精制所述制劑以鑒別不僅調(diào)節(jié)L-選擇素和P-選擇素活性，且與此同時(shí)在個(gè)體中不產(chǎn)生不期望副作用的制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供鑒別各種肝素/類肝素(下文中統(tǒng)稱為肝素)抑制P/L-選擇素活性的能 力的方法。本文也提供在兩種不同腫瘤模型中以臨床相關(guān)劑量抑制轉(zhuǎn)移的肝素亞組。 此外，本發(fā)明根據(jù)低分子量肝素(LMWH)不同的選擇素抑制活性鑒別其結(jié)構(gòu)差異，并
闡述在減弱轉(zhuǎn)移中抗凝血和選擇素抑制的相關(guān)作用。
在一實(shí)施例中，提供一種篩選抑制選擇素活性的組合物的方法。所述方法可包括 提供包含多個(gè)肝素分子的肝素制劑。 一般來(lái)說(shuō)，所述制劑是從經(jīng)FDA批準(zhǔn)的肝素批 料中獲得。所述方法也包括一或多種選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群組的選擇素； 一或多種所述選擇素的配體；以及肝素。所述方法進(jìn)一步包括在適用于選擇素與 選擇素配體結(jié)合的條件下同時(shí)或依次使上文所鑒別物品接觸，并檢測(cè)與不存在肝素制 劑的情況相比，在肝素制劑存在下一或多種選擇素與配體結(jié)合的降低程度。
在低于產(chǎn)生一或多種選自由活體內(nèi)抗凝血活性和活體內(nèi)不期望出血所組成群組 的活性的肝素濃度的肝素制劑濃度下，可檢測(cè)到選擇素與選擇素配體結(jié)合的降低程 度。此外，肝素制劑濃度可能不降低E-選擇素與E-選擇素配體的結(jié)合程度。此外， 使一或多種選擇素與配體的結(jié)合程度降低的肝素濃度可比產(chǎn)生活體內(nèi)過(guò)度抗凝血活 性的肝素濃度低2倍至50倍。在某些實(shí)施例中，可鑒別選擇性抑制選擇素的肝素。 通常這些肝素缺少其他肝素活性(例如，血管發(fā)生抑制、乙酰肝素酶抑制、細(xì)胞因子 結(jié)合和諸如此類)。此外，可鑒別僅具有抗凝血活性但缺少其他活性的肝素部分。
通過(guò)本文所提供方法鑒別出的肝素制劑可用作L-選擇素或P-選擇素相關(guān)病狀的 治療藥劑。
本發(fā)明也提供一種篩選抑制選擇素活性的組合物的方法。所述方法可包括提供包 含多個(gè)肝素分子的肝素制劑。 一般來(lái)說(shuō)，所述制劑是從FDA批準(zhǔn)的肝素批料獲得。 方法中也包括一或多種選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群組的選擇素；選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群組的一或多種選擇素的配體；以及肝素。方法可進(jìn)一步包 括分級(jí)分離肝素制劑并分離多個(gè)包含肝素分子的部分，其中這些部分是基于部分中肝 素分子的大小來(lái)分離的。所述方法進(jìn)一步包括在適用于選擇素與選擇素配體結(jié)合的條 件下使各部分與配體和選擇素同時(shí)或依次接觸，并在片段存在下檢測(cè)選擇素與配體結(jié) 合的降低程度，以及鑒別與不存在片段的情況相比，在片段存在下降低一或多種選擇 素與配體結(jié)合程度的片段。
本發(fā)明也提供一種鑒別用作L-選擇素和/或P-選擇素相關(guān)病狀治療藥劑的肝素部 分的方法。
本發(fā)明也提供通過(guò)本文所揭示方法鑒別出的肝素部分。
本發(fā)明提供包括包裝材料的制造物件。包裝材料中可含有通過(guò)本文所提供方法鑒 別出的肝素制劑。包裝材料可包括標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)，其顯示肝素制劑抑制選擇素活 性并可用于在個(gè)體中抑制血行性轉(zhuǎn)移。肝素制劑可包括低分子量肝素(LMWH)制劑。 實(shí)例性制劑包括亭扎肝素(Tinzaparin) (TINZ)。在另一實(shí)施例中，提供包括包裝材料 的制造物件。包裝材料中可含有通過(guò)本文所提供方法鑒別出的肝素部分。包裝材料可 包括標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)，其指明肝素部分可抑制選擇素活性并可用于抑制個(gè)體血行性 轉(zhuǎn)移。在一實(shí)施例中，制造物件包含由于使用本發(fā)明方法而具有特異性肝素活性的有 用肝素部分。例如，包含肝素部分的制造物件可包含標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)，其指明所述 肝素部分可用于抑制選擇素活性并可用于抑制個(gè)體P-和/或L-選擇素介導(dǎo)疾病。
本發(fā)明也提供一種預(yù)防或治療個(gè)體細(xì)胞增殖性病癥的方法。方法可包括向個(gè)體投 與有效量的存于醫(yī)藥上可接受載劑中的特異性選擇素活性抑制劑。 一般來(lái)說(shuō)所述抑制 劑可為肝素制劑或肝素部分。本發(fā)明提供一種預(yù)防或抑制個(gè)體轉(zhuǎn)移的方法。方法包括向所述個(gè)體投與有效量的 存于醫(yī)藥上可接受載劑中的特異性選擇素活性抑制劑。 一般來(lái)說(shuō)所述抑制劑是肝素制 劑或肝素部分。
本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)陳述于附圖和下文說(shuō)明中。根據(jù)所述說(shuō)明及附圖 以及權(quán)利要求書(shū)，可清楚地理解本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。


圖1顯示臨床上采用的肝素制劑在其抑制P-和L-選擇素與癌配體結(jié)合的能力上 顯示顯著差異。在各種濃度不同肝素存在下檢測(cè)人類結(jié)腸癌細(xì)胞與固定化選擇素嵌合 體的結(jié)合。對(duì)照結(jié)合是基于在緩沖液?jiǎn)为?dú)存在下的測(cè)量且背景值是在2.5mM EDTA 中加以測(cè)量。 一式三份檢測(cè)每種肝素濃度，且所呈現(xiàn)數(shù)據(jù)是來(lái)自多次實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié) 果。
圖2顯示使用單一肝素劑量可達(dá)成抗-Xa單位的治療性范圍。在每只小鼠接受各 種肝素的或"3x"單一皮下劑量后30min，在多個(gè)小鼠的血漿中測(cè)量抗-Xa水 平。每個(gè)空心圓代表一只小鼠且水平條代表平均值。
圖3繪示以臨床上可耐受濃度的UFH和TINZ來(lái)達(dá)成對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制， 而FOND (合成五糖)無(wú)效。以皮下方式向小鼠注射"lx"肝素(A)或"3x"肝素(B)(或 注射PBS作為對(duì)照)，并在30分鐘后經(jīng)靜脈內(nèi)向小鼠注射MC38GFP細(xì)胞。27天后， 對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)并通過(guò)定量肺組織勻漿的熒光來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)移。空心圓代表各小鼠并 且水平條代表平均值。通過(guò)假定為雙尾、不等分布的Student's T實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定P值。
圖4繪示具有抑制黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的選擇素抑制活性的肝素。以皮下方式向小鼠 注射"lx"肝素(A)或"3x"肝素(B)(或注射PBS作為對(duì)照)，并在30分鐘后經(jīng)靜脈內(nèi) 向小鼠注射B16F1細(xì)胞。17天后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，經(jīng)氣管向肺灌注福爾馬林 (formalin),然后使其在福爾馬林中固定至少24小時(shí)。轉(zhuǎn)移通過(guò)測(cè)量肺重量來(lái)定量， 其與通過(guò)照相術(shù)記載(代表性圖片顯示于定量圖下方)的肺物理外觀密切相關(guān)。每個(gè) 空心圓代表一只小鼠并且水平條代表平均肺重量。通過(guò)假定為雙尾、不等分布的 Student's T實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定P值。
圖5繪示TINZ對(duì)選擇素的抑制主要是通過(guò)具有相對(duì)較低抗-Xa活性的高分子量 片段來(lái)介導(dǎo)的。(A).使5種肝素(UFH、 3種LMWH、和FOND)的等份試樣流經(jīng) HPLC大小排除系統(tǒng)，并通過(guò)跟蹤在206nm處的吸光度來(lái)評(píng)估其大小分布范圍(所顯 示層析圖的相關(guān)部分是t=17.5至33.3分鐘)?？占^標(biāo)識(shí)合成五糖FOND的洗脫。(B) 使TINZ的等份試樣流經(jīng)與圖5相同的HPLC系統(tǒng)并在UV檢測(cè)器后收集0.5分鐘的 部分。使用咔唑分析來(lái)定量各部分中的糖醛酸總量(叫)。測(cè)定各部分抑制P-選擇素與 sLeX結(jié)合的能力，并使用適宜稀釋度以使得所有讀數(shù)均在線性范圍內(nèi)(約30-70%抑 制)。將一抑制單位任意地定義為P-選擇素結(jié)合的1%抑制。同樣在所述分析的線性范圍中確定各部分中抗-Xa單位的總量(如果未檢測(cè)到活性，則使用分析的最小檢測(cè) 極限)。將總抑制單位和總抗-Xa單位標(biāo)準(zhǔn)化為總糖醛酸含量。如果在樣品中未檢測(cè)到 糖醛酸，使用分析的最小檢測(cè)極限來(lái)計(jì)算。在圖頂部的陰影框指示第28-32部分，當(dāng) 標(biāo)準(zhǔn)化為糖醛酸含量時(shí)這些部分具有髙P-選擇素抑制活性和最小抗-Xa活性。
圖6提供選擇素-抑制活性的可能機(jī)制和較高分子量肝素部分的簡(jiǎn)單說(shuō)明。這個(gè) 說(shuō)明是例示性的，并不以任何方式將所揭示方法和組合物限制于所述機(jī)制中。已知P-選擇素(存在于活化血小板或內(nèi)皮細(xì)胞上)具有兩個(gè)結(jié)合袋 一個(gè)用于唾液酸化路易 斯X (Sialyl Lewis X)部分，而另一個(gè)用于其存在于白細(xì)胞上的天然配體PSGL-1的富 酪氨酸硫酸酯區(qū)域(Somers等人，Ce1 (2000) 103:467-79)。后者PSGL-1的區(qū)域也富 含具有羧酸酯側(cè)鏈的氨基酸。其他P-或L-選擇素配體可為在內(nèi)皮細(xì)胞上或癌細(xì)胞上 存在的硫酸化、唾液酸化粘蛋白。值得注意的是，這些也是存在高密度負(fù)電性硫酸酯 和羧酸酯的分子。由于這些天然和病理性配體具有髙密度硫酸酯和羧酸酯，即存在類 似的"成塊糖區(qū)域"，因此肝素可模擬這些配體。如果肝素鏈極短(如在FOND中)， 其每次只能阻斷一個(gè)位點(diǎn)，這使其成為極弱的抑制劑(上圖)。稍微較長(zhǎng)的肝素鏈可 同時(shí)與P-選擇素上的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)交互作用，并具有一定的抑制活性(中圖)。甚至 更長(zhǎng)的鏈可阻斷多個(gè)P-選擇素分子，并且更顯著地影響涉及P-選擇素配體的細(xì)胞-細(xì) 胞交互作用親合力(下圖)。相反，抗凝血酶-因子X(jué)a復(fù)合物是可溶復(fù)合物，而且單 一五糖(具有與FOND中所發(fā)現(xiàn)者相同的序列)必須充分與抗凝血酶結(jié)合并催化Xa 失活。除非序列中存在不止一個(gè)抗凝血酶結(jié)合五糖，否則延長(zhǎng)肝素分子長(zhǎng)度不會(huì)改變 結(jié)果。然而，與細(xì)胞:細(xì)胞交互作用中P-選擇素與其配體的多價(jià)、多位點(diǎn)結(jié)合不同， 對(duì)抗凝血酶-Xa交互作用的效應(yīng)僅是加性的。在這個(gè)模型中也沒(méi)有詳述由P-選擇素識(shí) 別的肝素結(jié)構(gòu)特異性。然而，我們和其他人的先前工作(參見(jiàn)正文)指出了連續(xù)的結(jié) 合親和過(guò)程，但必需實(shí)施6.0-硫酸化。
圖7展示在正常生理和血行性轉(zhuǎn)移中的P-和L-選擇素-配體交互作用。肝素療法 可通過(guò)抑制白細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞和內(nèi)源性配體間的交互作用使轉(zhuǎn)移 最小化。
圖8顯示在血行性轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，P-和L-選擇素缺失可改善長(zhǎng)期存活。向WT 和？1^-/-小鼠靜脈內(nèi)注射MC38GPP結(jié)腸癌細(xì)胞。每天監(jiān)測(cè)小鼠外觀并在小鼠瀕死時(shí)
對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死術(shù)以驗(yàn)證肺轉(zhuǎn)移灶的存在。以存活小鼠數(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞注射后時(shí)間繪 圖。盡管在終止時(shí)所有PL-Z-小鼠均表現(xiàn)正常，但7只中的5只顯示可見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移灶。
圖9顯示在缺失P-和L-選擇素的小鼠中髙劑量肝素進(jìn)一步改善存活。在t = 0時(shí) 向PL-A小鼠靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞，并在t--O.Sh、 +6h、和+12h時(shí)皮下注射PBS或 100U存于PBS中的未經(jīng)分級(jí)分離的肝素。注射后50天對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，并通過(guò) 定量肺組織勻漿的熒光來(lái)測(cè)定肺轉(zhuǎn)移的形成。通過(guò)實(shí)施假定為雙尾、不等分布的 Student's T實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定P值。
圖10A和B顯示在缺失P-和L-選擇素二者的小鼠中投與臨床相關(guān)濃度的肝素對(duì)轉(zhuǎn)移灶的形成沒(méi)有顯著效果。在t = O時(shí)向PL-A小鼠靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞，并在t = -0.5h、 +6h、和+12h時(shí)皮下注射PBS或19.68U存于PBS中的未經(jīng)分級(jí)分離的肝素 (UFH)。注射后55天對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，并通過(guò)計(jì)數(shù)可見(jiàn)灶數(shù)量(A)和通過(guò)定量肺 組織勻漿的熒光(B)(注意分段的y軸)來(lái)測(cè)定肺轉(zhuǎn)移的形成。如圖9所述測(cè)定P值。
具體實(shí)施例方式
出于所有目的，將美國(guó)專利第6,787,365號(hào)和美國(guó)專利第6,596,705號(hào)的全部?jī)?nèi)容 以引用方式并入本文中。本說(shuō)明書(shū)中所提及的所有專利和公開(kāi)案均表示熟習(xí)本發(fā)明所 屬技術(shù)者的熟習(xí)程度。本發(fā)明揭示內(nèi)容中引用的所有參考文獻(xiàn)均以引用方式并入本文 中，其并入程度如同每個(gè)參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容獨(dú)立地以弓I用方式并入本文中一般。
L-選擇素、E-選擇素和P-選擇素介導(dǎo)引導(dǎo)淋巴細(xì)胞尋靶至淋巴樣器官中的初始粘 著事件，以及白細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮在炎癥位點(diǎn)的交互作用。L-選擇素在白細(xì) 胞上表達(dá)，E-選擇素在內(nèi)皮上表達(dá)，且P-選擇素在血小板和內(nèi)皮上表達(dá)。三種選擇素 與相對(duì)細(xì)胞上的特異性碳水化合物結(jié)構(gòu)結(jié)合，例如，L-選擇素與血小板和內(nèi)皮結(jié)合， 而P-選擇素和E-選擇素與白細(xì)胞結(jié)合。
在諸如病理性再灌注損傷、炎癥病癥和自身免疫病癥等病癥中涉及選擇素粘著。 選擇素交互作用也可介導(dǎo)在某些上皮癌癥轉(zhuǎn)移中所涉及的主要粘著機(jī)制。因此，選擇 素是特征為由選擇素介導(dǎo)的不期望或異常交互作用的病狀治療中的潛在治療靶。
本文提供鑒別抑制P-和/或L-選擇素活性的肝素的類型和批料的活體外和活體內(nèi) 方法。所述方法提供鑒別與P-和/或L-選擇素結(jié)合的肝素形式的各種方式。隨后，所 鑒別肝素形式可用于抑制癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外，本文提供鑒別具有與抗凝血活性相關(guān) 抑制活性的肝素片段的方法。
肝素具有許多與實(shí)體瘤擴(kuò)散潛在相關(guān)的其他生物學(xué)效應(yīng)，包括抑制在降解基底膜
中所涉及的乙酰肝素酶、對(duì)各種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子或細(xì)胞外蛋白酶的調(diào)節(jié)效應(yīng)、在細(xì) 胞粘著中改變整合素機(jī)能、抑制血管發(fā)生等。在所有這些潛在的非抗凝血機(jī)制中，P/L-選擇素抑制是在腫瘤細(xì)胞最初進(jìn)入血流中時(shí)可能首要相關(guān)的機(jī)制。在腫瘤細(xì)胞存活所 涉及的級(jí)聯(lián)事件開(kāi)始時(shí)且在腫瘤細(xì)胞最終外滲并形成為轉(zhuǎn)移灶前也存在這種效應(yīng)。對(duì) 于任何級(jí)聯(lián)，阻斷第一步都可使所有后續(xù)機(jī)制實(shí)質(zhì)上無(wú)關(guān)。實(shí)際上，已顯示在靜脈內(nèi) 引入腫瘤細(xì)胞前所給與單一劑量UPH的效應(yīng)可通過(guò)對(duì)P/L-選擇素的抑制來(lái)解釋，因 為在同時(shí)缺失兩種選擇素的小鼠中肝素對(duì)轉(zhuǎn)移沒(méi)有進(jìn)一步效應(yīng)。在肝素減弱炎癥的效 應(yīng)方面可看到類似結(jié)果，且相關(guān)活性同樣被限制為P-和L-選擇素抑制。
總的來(lái)說(shuō)，解釋在實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移中肝素作用的模型是P/L-選擇素的抑制，以及未知 程度地阻斷通過(guò)液相凝血途徑形成的血管內(nèi)纖維蛋白。然而，在大多數(shù)先前研究中投 與的相對(duì)髙劑量由于過(guò)度抗凝血不能實(shí)用于臨床。 一般來(lái)說(shuō)UFH也具有弱生物利用 度，需要多次每日投藥，并且具有諸如肝素誘導(dǎo)血小板減少癥等副作用(Rosenberg RD.Semin Hematol (1997) 34增刊4:2誦8; Hirsh等人，Chest (2004) 126:188S.203S)。為 防止這種情況發(fā)生，使用多種方法通過(guò)降解UFH產(chǎn)生許多低分子量肝素(LMWH), 降解方法包括化學(xué)解聚和酶消化(Rosenerg,上述文獻(xiàn)；Linhardt等人，Semin Thromb Hemost(1999)25增刊3:5-16)。盡管LMWH也是各種大小片段的混合物(分子量分 布范圍介于3000至卯00道爾頓之間)，但其具有更佳動(dòng)力學(xué)和生物利用度，通常僅 需要單一日劑量。加上LMWH具有類似臨床抗凝血功效(經(jīng)由抗-Xa活性)和較低 副作用(例如肝素誘導(dǎo)血小板減少癥)發(fā)生率，其在臨床實(shí)踐中越來(lái)越受到人們的偏 愛(ài)(Hirsh等人，上述文獻(xiàn)，Valentine等人，Semin Thromb Hemost (1997) 23:173-8)。 據(jù)稱磺達(dá)肝素(Fondaparinux) (FOND)具有其他益處，其是具有與抗凝血酶特異性結(jié) 合的限定結(jié)構(gòu)的合成類肝素五糖。
已有人提出在早期癌的初步診斷與其外科手術(shù)移除后不久期間使用肝素來(lái)限制 轉(zhuǎn)移，最近的發(fā)現(xiàn)支持這一想法經(jīng)LMWH治療的原發(fā)性腫瘤(但沒(méi)有轉(zhuǎn)移)患者 具有較髙存活率(Lee等人，JCIinOncol (2005) 23:2123-9)。
然而，將所有這些有前景的想法轉(zhuǎn)換到臨床實(shí)踐中需要實(shí)驗(yàn)性評(píng)估臨床上可接受 濃度的各種肝素阻斷P/L-選擇素和減弱轉(zhuǎn)移的潛力。然而，因?yàn)榭紤]到可能存在與其 抗凝血活性相關(guān)的不期望副作用，在人類中肝素尚未用于抑制L-選擇素和P-選擇素 結(jié)合的目的。
可以臨床上可耐受劑量(從抗凝血角度來(lái)看)使用FDA已批準(zhǔn)可用作抗凝血?jiǎng)?的肝素制劑來(lái)抑制P-和L-選擇素介導(dǎo)病狀，包括缺血、再灌注損傷、急性炎癥、慢 性炎癥、和癌癥轉(zhuǎn)移。本研究提供鑒別可調(diào)節(jié)P-和L-選擇素活性的肝素制劑類型和 批料的方法。本文提供篩選能最佳抑制P-和L-選擇素的肝素組合物的活體內(nèi)和活體 外方法。例如，所鑒別肝素可經(jīng)標(biāo)記后用于上述病況。肝素療法已廣泛用于抗凝血適 應(yīng)癥，且副作用易于控制。本文也提供可用于非抗凝血治療的肝素和類肝素制劑。本 文也提供與其抗凝血活性相比具有有效選擇素抑制活性的肝素片段。
在USA,臨床級(jí)UFH制劑、三種類型LMWH (亭扎肝素(TINZ)、達(dá)肝素 (Dalt印arin) (DALT)、和依諾肝素(Enoxaparin) (ENOX))、和合成五糖(FOND)可在市 場(chǎng)上購(gòu)得并且代表大部分當(dāng)前出售用于臨床應(yīng)用的肝素(來(lái)源Physician's pesk Reference)。臨床上批準(zhǔn)的肝素調(diào)配物在活體外抑制P-和L-選擇素的能力相差極大。 值得注意的是，LMWH是通過(guò)不同UFH降解方法制備的TINZ,通過(guò)用肝素酶實(shí) 施P-脫去裂解；DALT，通過(guò)用亞硝酸實(shí)施脫氨裂解；以及ENOX，通過(guò)用堿實(shí)施e -脫去裂解。
本發(fā)明提供鑒別缺少顯著抗凝血活性但仍保留L-選擇素和/或P-選擇素抑制活性 的肝素部分的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供抑制個(gè)體轉(zhuǎn)移的方法，其包括投與肝素或肝素 部分。本發(fā)明提供抑制個(gè)體L-選擇素和/或P-選擇素介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的方法，其是通過(guò)向所 述個(gè)體投與一定量不會(huì)在所述個(gè)體中產(chǎn)生顯著抗凝血活性或不期望出血的分級(jí)分離 肝素來(lái)達(dá)成的。在一方面中，肝素濃度包括lIU/ml或更低的抗-Xa水平。重要的是，可以低于在哺乳動(dòng)物個(gè)體中導(dǎo)致過(guò)度抗凝血或不期望出血的濃度的血漿濃度來(lái)達(dá)成 選擇素抑制。
對(duì)于本發(fā)明方法，將一定量不會(huì)產(chǎn)生顯著抗凝血活性或不期望出血的肝素投與個(gè) 體。本文所用關(guān)于"一定量不會(huì)產(chǎn)生顯著抗凝血活性的肝素"意指一定量不導(dǎo)致出血 并發(fā)癥、但可存在輕度抗凝血效應(yīng)的肝素。
不期望出血的臨床體征和癥狀包括尿中或便中帶血、比正常情況嚴(yán)重的月經(jīng)、鼻 出血或小傷口或外科手術(shù)位點(diǎn)的過(guò)多出血。在出現(xiàn)所述臨床現(xiàn)象前可為易發(fā)生淤傷的 情況。如果發(fā)生不期望出血，可通過(guò)投與硫酸魚(yú)精蛋白來(lái)抵消肝素活性；然而對(duì)FOND 來(lái)說(shuō)并非如此。
正如本文所揭示，經(jīng)調(diào)配用于臨床應(yīng)用的肝素可抑制P-選擇素和L-選擇素與其 配體結(jié)合。所述量和方法也可用于抑制轉(zhuǎn)移。由此，本發(fā)明提供抑制個(gè)體L-選擇素和 P-選擇素所介導(dǎo)結(jié)合的方式，其是通過(guò)以在所述個(gè)體中不產(chǎn)生顯著抗凝血活性或不期 望出血的量投與肝素來(lái)達(dá)成的。投與個(gè)體以抑制L-選擇素或P-選擇素介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的肝 素量的特征在于，其不產(chǎn)生作為副作用的不期望出血但其可產(chǎn)生輕度抗凝血活性。因 此，不必?fù)?dān)心諸如出血并發(fā)癥等與使用用于抗凝血療法的肝素相關(guān)的副作用。在一方 面中，本發(fā)明顯示與L-選擇素相比，P-選擇素可以更低濃度肝素來(lái)抑制，由此提供選 擇性抑制P-選擇素的方式。
盡管經(jīng)投與以抑制個(gè)體中L-選擇素和P-選擇素介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的肝素量可部分取決于 個(gè)體,但以導(dǎo)致低于0.2單位肝素/ml血漿之量接受肝素的正常成年個(gè)體一般不表現(xiàn)不 期望出血?？墒褂脴I(yè)內(nèi)已知各種分析方法監(jiān)測(cè)經(jīng)肝素治療個(gè)體是否存在不期望出血。 例如，可使用血液凝固時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、或抗-Xa活性來(lái)確定經(jīng) 投與肝素個(gè)體中的凝血狀態(tài)是否不期望地增強(qiáng)了。如果發(fā)生不期望出血，則中斷肝素投與。
所投與肝素量部分取決于是L-選擇素還是P-選擇素介導(dǎo)轉(zhuǎn)移，以及由此所確定 的是僅抑制P-選擇素還是抑制L-選擇素和P-選擇素二者。例如，可將低于抗凝血?jiǎng)?療法所用量的肝素量投與個(gè)體以達(dá)成與L-選擇素相比主要抑制P-選擇素的目的。投 與個(gè)體的肝素量也取決于期望治療效果的強(qiáng)度。
本發(fā)明也提供篩選并鑒別抑制P-和/或L-選擇素間交互作用的轉(zhuǎn)移抑制劑的方 法。方法包括提供i)包含多個(gè)肝素分子的肝素制劑或肝素部分，其中所述制劑是從 FDA批準(zhǔn)的肝素類型和批料獲得；ii) 一或多種選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群 組的選擇素；iii) 一或多種所述選擇素的配體；和b)在適用于選擇素與選擇素配體結(jié) 合的條件下使a)i)與a)ii)和a)iii)同時(shí)或依次接觸；以及c)檢測(cè)與不存在肝素制劑的情 況相比，在肝素制劑存在下一或多種選擇素與配體結(jié)合的降低程度，其中結(jié)合降低指 示組合物抑制轉(zhuǎn)移?？捎糜诒疚乃峁└鞣N方法中的配體包括(但不限于)PSGL-1 或唾液酸化路易斯x (SLex)。可將配體固定。配體可存在于諸如內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞上。 實(shí)例性細(xì)胞包括LS180細(xì)胞。例如，將P-或L-選擇素嵌合體固定在經(jīng)蛋白質(zhì)-A涂敷的板上且可在不同量肝素 存在下結(jié)合熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。使用這種方法，本發(fā)明顯示，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為抗因子 Xa活性(活體內(nèi)抗凝血活性的預(yù)測(cè)指標(biāo))時(shí)，UFH是兩種選擇素的最佳抑制劑(圖 1)。在三種LMWH之間觀察到很多變化,其中TINZ的抑制活性高于DALT和ENOX。 有趣的是，盡管FOND被合成設(shè)計(jì)為具有特異性有效抗凝血活性，但其不能抑制P-或L-選擇素。在高抗-Xa濃度下，DALT和ENOX能抑制P-選擇素結(jié)合(圖1，上圖)， 但僅能最低限度地抑制L-選擇素結(jié)合(圖l,下圖)。盡管與L-選擇素相比，P-選擇 素的抑制是以更低相對(duì)劑量來(lái)達(dá)成，但總的抑制強(qiáng)弱次序 (UFH>TINZ>DALT=ENOX FOND)是相同的。
此外，所投與肝素量可取決于個(gè)別個(gè)體，因?yàn)橐阎獋€(gè)體內(nèi)肝素的生物利用度是不 同的。例如，有吋以單位肝素/kg體重投與肝素劑量。然而，因?yàn)楦嗡厣锢枚却?在差異，所以在個(gè)體血漿中達(dá)到特異性肝素含量所需的肝素劑量(例如單位肝素/kg 體重)在個(gè)體間可互不相同。因此，以單位/ml血漿形式表示的個(gè)體血液中的肝素濃 度是肝素濃度的更可靠量度?？梢粤蛩狒~(yú)精蛋白使用滴定和中和分析來(lái)測(cè)定個(gè)體中的 血漿肝素量(對(duì)FOND來(lái)說(shuō)并非如此)。
本文所用肝素是指肝素、低分子量肝素、未經(jīng)分級(jí)分離的肝素、與金屬陽(yáng)離子(例 如鈉、鈣或鎂)或有機(jī)堿(例如二乙胺、三乙胺、三乙醇胺等)形成的肝素鹽、肝素 酯、存于脂肪酸連結(jié)物中的肝素、肝素膽汁酸連結(jié)物和硫酸肝素。
本文所用術(shù)語(yǔ)關(guān)于給定濃度肝素對(duì)P-和/或L-選擇素或L-選擇素與其配體結(jié)合的 效應(yīng)的"抑制結(jié)合"是指相對(duì)不存在肝素時(shí)的結(jié)合量，P-和/或L-選擇素或L-選擇素 與其配體結(jié)合量的降低，并且包括結(jié)合降低以及完全抑制結(jié)合二者。
本文所提供肝素的"有效量"或"醫(yī)藥有效量"意指足以提供期望治療效應(yīng)但無(wú) 毒的肝素量。不同個(gè)體所需準(zhǔn)確量不同，取決于年齡、個(gè)體的大體狀況、細(xì)胞增殖性 病癥或其他P-和/或L-選擇素介導(dǎo)病癥的嚴(yán)重度、以及所投與的具體肝素、肝素部分 等。任一個(gè)別病例中的適宜"有效"量可由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者通過(guò)參照相關(guān)文本和文獻(xiàn) 和/或使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。
"醫(yī)藥上可接受"意指由非生物性或原本不需要的材料構(gòu)成的載劑。術(shù)語(yǔ)"載劑" 在屬類上用于指存在于醫(yī)藥調(diào)配物中除活性藥劑以外的任一組份，并因此包括稀釋 劑、粘著劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、填充劑、著色劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、防 腐劑和諸如此類?？苫跇I(yè)內(nèi)專業(yè)技術(shù)調(diào)配延遲和持續(xù)釋放的遞送調(diào)配物。
本文所用術(shù)語(yǔ)"治療"("treating"和"treatment")是指降低癥狀嚴(yán)重度和/或 出現(xiàn)頻率、消除癥狀和/或潛在病因、預(yù)防癥狀和/或其潛在病因發(fā)生、以及改善或補(bǔ) 救損傷。因此例如，"治療"轉(zhuǎn)移或細(xì)胞增殖性病癥(例如癌癥)的本發(fā)明方法涵蓋 抑制或降低腫瘤灶、細(xì)胞增殖能力和諸如此類。
在一方面中，本發(fā)明包括向個(gè)體投與有效量肝素(例如具有期望分子量的肝素) 以抑制轉(zhuǎn)移細(xì)胞與內(nèi)皮的粘著。用于本發(fā)明方法和組合物中的肝素可為具有醫(yī)藥品質(zhì)的市售肝素制劑或粗肝素
制劑，例如從哺乳動(dòng)物組織或器官提取活性肝素后所獲得的肝素制劑。市售產(chǎn)品(USP 肝素)可從若干個(gè)來(lái)源(例如SIGMA Chemical公司、St. Louis, Mo.)獲得， 一般來(lái) 說(shuō)以堿金屬鹽或堿土金屬鹽(最普遍地為肝素鈉)獲得?；蛘撸蓮牟溉閯?dòng)物組織或 器官(尤其從腸粘膜或肺)提取肝素，例如，使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知的各種方法從 牛肉、豬和羊來(lái)提取(參見(jiàn)，例如Coyne, Erwin， Chemistry and Biology of Heparin, Lundblad， R. L.等人，(Eds.)，第9-17頁(yè)，Elsevier/North匿Holland， N.Y. (1981))。
人們?cè)谥参锝M織中也發(fā)現(xiàn)了肝素和肝素樣化合物，其中肝素或肝素樣化合物以復(fù) 合物形式與植物蛋白質(zhì)結(jié)合。得自植物組織的肝素和肝素樣化合物特別重要，因?yàn)槠?比得自動(dòng)物組織的肝素和肝素樣化合物便宜很多。
含有肝素或肝素樣化合物(例如生理上可接受的肝素鹽或其功能類似物)的植物 也可以是用于本發(fā)明的適宜來(lái)源。肝素或肝素樣化合物的典型植物來(lái)源包括魁蒿 (artemisia princeps)、nothogenia fastigia(紅藻)、copallina pililifera(紅藻)、cladophora sacrlis (綠藻)、chaetomorpha anteninna (綠藻)、aopallina officinalis (紅藻)、礁膜 (monostrom nitidum)、海帶(Iaminaria japonica)、旋果蚊子草(filipendula ulmaria)(繡 線菊)、ecklonia kuroma (褐藻)、泡葉藻(ascophyllum nodosum)(褐藻)、銀杏(ginkgo biloba)、石莼(ulva rigida)(綠藻)、stichopus japonicus (海參)、人參(panax ginseng)、 螺旋藻(spirulina maxima)、鈍頂螺旋藻(spirulina platensis)、 laurencia gemmifera (紅 藻)和落葉松屬(larix)(落葉松木材)。
肝素可為低分子量肝素(LMWH)或標(biāo)準(zhǔn)或未經(jīng)分級(jí)分離的肝素。本文所用 LMWH包括所提及的平均分子量為約3,000道爾頓至約10,000道爾頓、通常為約4,000 道爾頓至約8,000道爾頓的肝素制劑。LMWH可以較小百分比包含分子量超過(guò)所述范 圍上限的糖類。例如，亭扎肝素包含少量大于8,000道爾頓的肝素糖。所述LMWH 是從多個(gè)不同來(lái)源購(gòu)得?？赏ㄟ^(guò)熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知并使用的多種不同離析或分級(jí)分 離技術(shù)來(lái)制備本發(fā)明肝素化合物。所述技術(shù)包括(例如)凝膠滲透色譜(GPC)、高效 液相色譜(HPLC)、超濾、大小排除色譜和諸如此類。
當(dāng)前以若干種不同方式制造LMWH: (i)通過(guò)分級(jí)分離濃縮存于標(biāo)準(zhǔn)肝素中的 LMWH;用乙醇?xì)v或分子篩(例如凝膠過(guò)濾或膜過(guò)濾)處理；(ii)受控化學(xué)解聚(通 過(guò)亞硝酸、e-脫去或髙碘酸鹽氧化)；和(iii)通過(guò)肝素酶實(shí)施酶解聚。可謹(jǐn)慎控制解 聚條件以產(chǎn)生具有期望分子量的產(chǎn)物。 一般使用亞硝酸解聚。也可采用通過(guò)P-脫去解 聚肝素的芐酯，其產(chǎn)生的片段類型與用肝素酶實(shí)施酶解聚相同。
可通過(guò)使用高碘酸鹽氧化實(shí)施解聚來(lái)制備具有低抗凝血活性并保留基本結(jié)構(gòu)的 LMWH。若干種LMWH可從市場(chǎng)上購(gòu)得(i)分子量為4000-6000道爾頓的法安明 (Fragmin)是由Kabi Pharmacia Sweden通過(guò)來(lái)自豬腸粘膜的肝素鈉的受控亞硝酸解 聚制造的(也可參見(jiàn)美國(guó)專利第5,686,431號(hào))；(ii)平均分子量為4,500道爾頓的弗 希肝素(Fraxiparin)和屈肝素鈣(Fraxiparine)是由Sanofi (Chaoy實(shí)驗(yàn)室)分別通過(guò)來(lái)自豬腸粘膜的肝素鈣的分級(jí)分離或受控亞硝酸解聚制造的；(iii)依諾肝素(Lovenox) (Enoxaparin和Enoxaparine)是由Farmuka SF France使用P -脫去通過(guò)解聚來(lái)自 豬腸粘膜的肝素鈉制造的并且是由Aventis以商品名Clexane和Lovenox出售的；以 及(iv)分子量為600至20,000道爾頓而且70%以上在1500與10,000道爾頓之間的洛 集帕林(Logiparin) (LHN-1， Novo, Denmark)是使用肝素酶通過(guò)酶解聚來(lái)自腸粘膜的 肝素制造的。實(shí)例性低分子量肝素片段包括(但不限于)依諾肝素、達(dá)肝素、達(dá)那帕 羅(danaproid)、伽馬肝素(gammaparin)、那屈肝素(nadroparin)、阿地肝素(ardeparin)、 亭扎肝素、舍托肝素(certoparin)和瑞維肝素(reviparin)。
在另一實(shí)施例中，可通過(guò)首先解聚未經(jīng)分級(jí)分離的肝素產(chǎn)生低分子量肝素，然后 分離或離析出目標(biāo)部分而自未經(jīng)分級(jí)分離的肝素獲得本發(fā)明肝素化合物。未經(jīng)分級(jí)分 離的肝素是由重復(fù)二糖構(gòu)成的多糖鏈混合物，所述二糖是由糖醛酸殘基(D-葡糖醛酸 或L-艾杜糖醛酸)和D.葡糖胺酸殘基構(gòu)成的。這些二糖中許多在糖醛酸殘基上和/或 葡糖胺殘基上硫酸化。 一般來(lái)說(shuō)，未經(jīng)分級(jí)分離的肝素的平均分子量為約6,000道爾 頓至40,000道爾頓，視肝素來(lái)源和所用分離肝素的方法而變化。
在一實(shí)施例中，肝素保留與P-和/或L-選擇素結(jié)合的能力但卻呈非抗凝血形式。 例如，此實(shí)施例的肝素包括通過(guò)在肝素的糖醛酸殘基的2-0位和/或葡糖胺殘基的3-0 位使肝素脫硫形成的肝素。肝素和硫酸乙酰肝素由重復(fù)二糖單位組成，所述二糖單位 包含D-葡糖醛酸(GIcA)或L-艾杜糖醛酸(IdoA)以及經(jīng)N-硫酸化(GIcNS)、 N-乙酰化 (GIcNAc)或有時(shí)未經(jīng)取代(GIcNH2)的葡糖胺殘基(Esko， J. D.或Lindahl， U. 2001.Molecular diversity of heparan sulfate. J. Clin. Invest. 108:169-173)。所述二糖可 在葡糖胺殘基的C6或C3和糖醛酸殘基的C2上進(jìn)一步硫酸化。肝素的有效抗凝血活 性可取決于硫酸化糖單位和糖醛酸差向異構(gòu)體的特異性布局，其形成抗凝血酶的結(jié)合 位點(diǎn)。參見(jiàn)例如，Wang，L.等人，(2002) J Clin Invest, July 2002，第110巻，第1期， 127-136。 2-0，3-0-脫硫肝素(2/3DS-肝素)可根據(jù)業(yè)內(nèi)已知的任一標(biāo)準(zhǔn)方法加以制備， 例如Fryer, A.等人(1997), Selective O-desulfation produces nonanticoagulant heparin that retains pharmological activity in the lung. J. Pharmacol. Exp. Then 282:208-219 中的方法。肝素和經(jīng)修飾類肝素的抗凝血活性可通過(guò)(例如)酰胺水解抗因子X(jué)a分 析法來(lái)分析，如在Buchanan, M. R.、Boneu， B.、Ofosu， F.和Hirsh, J. (1985) The relative importance of thrombin inhibition and factor Xa inhibition to the antithrombotic effects of heparin.Blood 65:198-201中所述。
單獨(dú)地或與其他P-和/或L-選擇素抑制劑組合使用肝素(例如肝素部分)可抑制 P-和/或L-選擇素與P-和/或L-選擇素配體間的交互作用。抑制交互作用意指(例如) P-和/或L-選擇素與其配體彼此不能正確結(jié)合。所述抑制可能是任一下述各事件的結(jié) 果，包括(例如)阻止或降低P-和/或L-選擇素與配體間的交互作用、通過(guò)(例如) 裂解或其他修飾使P-和/或L-選擇素和/或配體失活、改變P-和/或L-選擇素與配體間 彼此的親和力、稀釋P-和/或L-選擇素和/或配體、阻止P-和/或L-選擇素在細(xì)胞表面、質(zhì)膜上的表達(dá)或降低P-和/或L-選擇素和/或配體的合成、合成異常P-和/或L-選擇素 和/或配體、合成交替剪接的P-和/或L-選擇素和/或配體、阻止或降低P-和/或L-選擇 素和/或配體的構(gòu)象正確折疊、調(diào)節(jié)P-和/或L-選擇素和/或配體的結(jié)合特性、干擾使 P-和/或L-選擇素和/或配體活化或失活所需的信號(hào)、使P-和/或L-選擇素和/或配體在 錯(cuò)誤的時(shí)間活化或失活、或干擾P-和/或L-選擇素和/或其配體正常合成或發(fā)揮作用所 需的其他受體、配體或其他分子。
可與本發(fā)明肝素組合使用的其他P-和/或L-選擇素抑制劑的實(shí)例包括P-和/或L-選擇素或配體的可溶形式、抑制蛋白、抑制肽、抑制碳水化合物、抑制糖蛋白、抑制 糖肽、抑制硫苷脂、P-和/或L-選擇素或配體的合成類似物、某些得自天然產(chǎn)物的物 質(zhì)、顆粒釋放的抑制劑、以及P-和/或L-選擇素或配體合成或發(fā)揮作用所需分子的抑 制劑。
例如，P-和/或L-選擇素或配體或其部分的可溶形式可與其同類分子競(jìng)爭(zhēng)互補(bǔ)分 子上的結(jié)合位點(diǎn)，并由此降低或消除膜結(jié)合P-和/或L-選擇素與細(xì)胞配體間的結(jié)合。 可溶形式可從(例如)天然存在的P-和/或L-選擇素或配體的純化或分泌、從重組體 P-和/或L-選擇素或配體、或從合成的P-和/或L-選擇素或配體獲得。P-和/或L-選擇 素或配體的可溶形式也意指包括(例如)截短可溶分泌形式、蛋白水解片段、其他片 段、和至少部分P.和/或L-選擇素或配體與其他分子的嵌合體構(gòu)成物。P-和/或L-選擇 素的可溶形式闡述于Mulligan等人，J. Immunol., 151: 6410-6417， 1993中，且P-和/ 或L-選擇素配體的可溶形式闡述于Sako等人，Cell 75(6): 1179-1186， 1993中。
可與本發(fā)明肝素組合使用的抑制蛋白包括(例如)抗-P-和/或L-選擇素抗體 (Palabrica等人，Nature 359: 848-851， 1992; Mulligan等人，J. Clin. Invest. 90: 1600-1607， 1992; Weyrich等人，J. Clin. Invest. 91: 2620-2629， 1993; Winn等人，J. Clin. Invest. 92: 2042-2047， 1993);抗-P-和/或L-選擇素配體抗體(Sako等人，Cell 75(6): 1179-1186， 1993);經(jīng)由酶裂解生成的抑制抗體的Fab (2)片段(Palabrica等人，Nature 359:848-851,1992); P-和/或L-選擇素-IgG嵌合體(Mulligan等人，Immunol" 151: 6410-6417， 1993);以及表達(dá)由P-和/或L-選擇素識(shí)別的碳水化合物部分的載劑蛋白。 抗體可針對(duì)P-和/或L-選擇素或配體或其亞單位或片段。多克隆抗體和單克隆抗體二 者都可用于本發(fā)明中。通常使用單克隆抗體?？贵w可含有得自人類抗體的恒定區(qū)和得 自抑制小鼠單克隆抗體的可變區(qū)。針對(duì)人類P-和/或L-選擇素的抗體闡述于Palabrica 等人，Nature 359: 848-851,1992; Stone和Wagner， J. C. I" 92: 804-813， 1993中；且 針對(duì)小鼠P-和/或L-選擇素的抗體闡述于Mayadas等人，Cell, 74: 541-554,1993中。 針對(duì)人類配體的抗體闡述于Sako等人，Cell 75(6): 1179-1186， 1993中。抵抗人類P-和/或L-選擇素的市售抗體包括來(lái)自Becton Dickinson, San Jose， Calif的克隆AC1.2 單克隆。
可與本發(fā)明肝素組合使用的抑制肽可(例如)結(jié)合至P-和/或L-選擇素配體上的 結(jié)合位點(diǎn)以降低或消除使P-和/或L-選擇素與配體結(jié)合的交互作用。抑制肽可(例如)為P-和/或L-選擇素的主要結(jié)合位點(diǎn)或其一部分(Geng等人，J.Biol. Chem.， 266: 22313-22318,1991),或其可來(lái)自不同結(jié)合位點(diǎn)。抑制肽包括(例如)與P-和/或L-選 擇素配體正常結(jié)合的肽或其片段、合成肽和重組體肽。在另一實(shí)施例中，抑制肽可與 除P-和/或L-選擇素或其配體外的分子結(jié)合，并由此干擾P-和/或L-選擇素與其配體 的結(jié)合，因?yàn)樗龇肿又苯踊蜷g接地參與影響P-和/或L-選擇素和/或其配體的合成和 /或發(fā)揮作用。
抑制碳水化合物包括包含唾液酸化路易斯a或唾液酸化路易斯x或相關(guān)結(jié)構(gòu)或類 似物的寡糖、包含2，6唾液酸的碳水化合物、削減抗凝血活性的肝素部分、肝素寡糖, 例如肝素四糖或低分子量肝素以及其他硫酸化多糖。抑制碳水化合物闡述于Nelson 等人，Blood 82: 3253-3258， 1993; Mulligan等人，Nature 364: 149-151， 1993; Ball 等人，J. Am. Chem. Soc. 114: 5449-5451， 1992; De Frees等人，J. Am. Chem. Soc. 115: 7549-7550， 1993中。市售抑制碳水化合物包括(例如)3'-唾液酸-路易斯x、 3'-唾液酸 化-路易斯a、乳酸-N-巖藻糖III和3'-唾液酸化-3-墨角藻糖基乳糖，其來(lái)自O(shè)xford GlycoSystems， Rosedale， N.Y。
抑制P-和/或L-選擇素與其配體交互作用的抑制糖蛋白(例如PSGL-1， 160 kD 單一特異性P-和/或L-選擇素配體、溶酶體膜糖蛋白、包含唾液酸路易斯x的糖蛋白) 和抑制硫苷脂(Suzuki等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. l卯426-434， 1993; Todderud等人，J. Leuk. Biol. 52: 85-88， 1992)也可與本發(fā)明肝素共同用于本發(fā)明中。
P-和/或L-選擇素或配體的合成類似物或模擬物也可用作抑制劑。P-和/或L-選擇 素類似物或模擬物是在形狀和/或電荷分布上與P-和/或L-選擇素相似的物質(zhì)。至少部 分P-和/或L-選擇素的類似物可與其同類膜結(jié)合P-和/或L-選擇素競(jìng)爭(zhēng)配體上的結(jié)合 位點(diǎn)，并由此降低或消除膜結(jié)合P-和/或L-選擇素與配體的結(jié)合。配體類似物或模擬 物包括在形狀和/或電荷分布上與P-和/或L-選擇素的碳水化合物配體相似的物質(zhì)。至 少部分配體的類似物可與其同類細(xì)胞配體競(jìng)爭(zhēng)P-和/或L-選擇素上的結(jié)合位點(diǎn)，并由 此降低或消除P-和/或L-選擇素與細(xì)胞配體的結(jié)合。在使用配體類似物的某些實(shí)施例 中，碳水化合物配體的唾液酸經(jīng)一基團(tuán)取代，所述基團(tuán)增強(qiáng)化合物的穩(wěn)定性但仍保留 或增強(qiáng)其對(duì)P-和/或L-選擇素的親和力，例如具有適宜間隔基的羧基基團(tuán)。增強(qiáng)穩(wěn)定 性的優(yōu)勢(shì)在于其使得藥劑可經(jīng)口投用。在還原性末端具有葡萄烯糖的唾液酸化路易斯 x類似物和經(jīng)由e -1，3-和0 -1，6-鍵接固定在半乳糖殘基上的二價(jià)唾液酸路易斯x也可 抑制P-和/或L-選擇素的結(jié)合(DeFrees等人，J. Am. Chem. Soc， 115: 7549-7550， 1993)。
顆粒釋放抑制劑也可干擾P-和/或L-選擇素在細(xì)胞表面的表達(dá)，并由此干擾P-和 /或L-選擇素的功能。顆粒釋放意指通過(guò)胞吐作用分泌包含P-和/或L-選擇素的儲(chǔ)存顆 粒內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體或血小板的[agr]-顆粒。顆粒膜與質(zhì)膜的融合導(dǎo)致在 細(xì)胞表面表達(dá)P-和/或L-選擇素。這些藥劑的實(shí)例包括秋水仙素。(Sinha和Wagner， Europ. J. Cell. Biol. 43: 377-383， 1987)。
活性藥劑也包括P-和/或L-選擇素和/或配體合成、翻譯后修飾、或發(fā)揮作用所需分子的抑制劑，或抑制P-和/或L-選擇素和/或配體合成或發(fā)揮作用的分子的活化劑。 藥劑包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、荷爾蒙、信號(hào)組份、激酶、磷酸酶、同源異形框蛋白 質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子和翻譯后因子或酶。藥劑也意指包括可(例如)至少部分地 鈍化或破壞P-和/或L-選擇素和/或配體的電離輻射、非電離輻射、超聲和毒劑。
如上所述，在本發(fā)明某些實(shí)施例中，活性藥劑可為針對(duì)P-和/或L-選擇素或其配 體(例如PSGL-1)的單克隆和/或多克隆抗體。可使用各種免疫策略獲得可與P-和/ 或L-選擇素或其配體反應(yīng)的小鼠或其他非人抗體，例如在美國(guó)專利第6,210,670號(hào)； 第6,177,547號(hào)；和第5,622,701號(hào)中所述的策略；所述各專利均以引用方式并入本文 中。在某些策略中，用P-和/或L-選擇素抗原使諸如小鼠等非人動(dòng)物(通常是非人哺 乳動(dòng)物)免疫。免疫原通常是經(jīng)P.和/或L.選擇素穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并在其細(xì)胞表面表達(dá)這些 分子的細(xì)胞。其他免疫原包括P-和/或L-選擇素蛋白或包含這些分子中與經(jīng)例證反應(yīng) 性抗體結(jié)合的區(qū)段的P-和/或L-選擇素的抗原決定部位片段。
將從經(jīng)免疫動(dòng)物獲得的抗體產(chǎn)生細(xì)胞固定化并經(jīng)選擇以供產(chǎn)生可與多種選擇素 特異性結(jié)合的抗體。參見(jiàn)Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P. N.Y" 1988)。
可與本發(fā)明涵蓋用于本發(fā)明的肝素組合使用的其他選擇素抑制劑包括阻斷P-和/ 或L-選擇素結(jié)合的類肝素；阻斷選擇素-配體交互作用的碳水化合物分子巖藻多糖和 諸如OJ-R9188等合成糖衍生物；甘草次酸GM2296和其他唾液酸化路易斯X擬糖化 合物的碳-巖藻糖基化衍生物；P-和/或L-選擇素表達(dá)的抑制劑，例如麥考酚酸嗎乙酯 (mycophenolate mofetil)、蛋白酶體抑制劑ALLN和諸如PDTC等抗氧化劑；諸如 BMS-190394等硫苷脂和硫苷脂類似物;PSGL1的19個(gè)氨基酸的末端肽、其他PSGL-1 肽、PSGL-1融合蛋白、PSGL-1類似物和諸如e -C-甘露糖苷等PSGL-1結(jié)合的選擇 性抑制劑；諸如化合物2等衍生自ZZZ21322的苯并噻唑化合物；和/或抑制素，特別 是由Merck以商品名Zocor出售的辛伐他汀(Simvastatin)。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋使用增強(qiáng)劑，例如使用脂質(zhì)體和/或納米膠襄以單 獨(dú)遞送本發(fā)明肝素或遞送本發(fā)明肝素與其他抑制劑,以使藥劑與增強(qiáng)劑化合物復(fù)合從 而有效增強(qiáng)肝素從胃腸(GI)道至血流中的吸收。所述調(diào)配物可用于引入醫(yī)藥上可接受 的肝素、抗體和/或本文所揭示其他活性藥劑的調(diào)配物。 一般來(lái)說(shuō)脂質(zhì)體的調(diào)配物和應(yīng) 用對(duì)熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者是已知的。參見(jiàn)例如Backer, M.V.等人，(2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7。
在一實(shí)施例中，l-(酰氧基烷基)咪唑(AAI)是以對(duì)pH敏感的無(wú)毒脂質(zhì)體形式用于 本發(fā)明中。將AAI納入脂質(zhì)體中，如Chen， F等人(2003)， Cytosolic delivery of macromolecules: I. Synthesis and characterization of pH-sensitive acyloxyalkylimidazoles Biochimica et Biophysica Acta (BBA)_Biomembranes,第1611 巻，第1-2期，第140-150頁(yè)中所述?？赏ㄟ^(guò)用咪唑親核取代脂肪酸的氯代烷基酯來(lái) 合成實(shí)例性1-(酰氧基烷基)咪唑(AAI)。前者可從脂肪酸的氯化物和醛來(lái)制備。如通過(guò)熒光分析所測(cè)定，當(dāng)納入脂質(zhì)體時(shí)，這些脂質(zhì)顯示明顯的pKa值(從l-(棕櫚酰氧基 甲基)咪唑(PMI)的5.12到l-[( a -肉豆蔻酰氧基)乙基]咪唑(a -MEI)的5.29)。如由針對(duì) 紅細(xì)胞的溶血活性所顯示，當(dāng)咪唑部分被質(zhì)子化時(shí)，這些脂質(zhì)具有表面活性。可在血 清中以及在細(xì)胞勻漿中水解AAI。如通過(guò)MTT分析所測(cè)定，這些脂質(zhì)針對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢(Chinese hamster ovary) (CHO)和RAW 264.7 (RAW)細(xì)胞的毒性顯著低于生化上 穩(wěn)定的N-月桂基咪唑(NDI)。
許多吸收增強(qiáng)劑是業(yè)內(nèi)已知的并可用于本發(fā)明中。例如，中鏈甘油酯顯示具有可 增強(qiáng)跨腸粘膜吸收親水性藥物的能力(Pharm. Res.第ll巻:1148-54 (1994))。已報(bào)道 癸酸鈉可通過(guò)細(xì)胞旁路途徑增強(qiáng)腸和結(jié)腸的藥物吸收(Pharm. Res. 10:857-864 (1993); Pharm. Res. 5:341-346 (1988))。美國(guó)專利第4,545,161號(hào)揭示一種通過(guò)添加非 離子型表面活性劑來(lái)增強(qiáng)肝素和類肝素腸吸收能力的方法，所述表面活性劑是(例如) 可通過(guò)使環(huán)氧乙烷與脂肪酸、脂肪醇、烷基酚或失水山梨糖醇脂肪酸酯或脂肪酸甘油 酯反應(yīng)來(lái)制備的表面活性劑。
可使用一種通過(guò)共投與砜和脂肪醇與肝素來(lái)增強(qiáng)經(jīng)粘膜吸收肝素的方法(美國(guó)專 利第3,510,561號(hào))。頒予Sache等人的美國(guó)專利第4,239,754號(hào)闡述用于肝素經(jīng)口投
與的脂質(zhì)體調(diào)配物，其意欲提供延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間。肝素保持在脂質(zhì)體之內(nèi)或之上， 脂質(zhì)體通常是從包含衍生自不飽和脂肪酸的酰基鏈的磷脂形成的。
用于本發(fā)明肝素的其他遞送方法闡述于下列專利中頒予Teng的美國(guó)專利第 4,654,327號(hào)(關(guān)于以具有四級(jí)銨離子的復(fù)合物形式經(jīng)口投與肝素)、頒予Herr的美國(guó) 專利第4，656，161號(hào)(闡述一種通過(guò)經(jīng)口投與藥物和諸如聚氧乙烯-20鯨蠟基醚、聚氧 乙烯-20硬脂酸鹽、其他聚氧乙烯(聚乙二醇)-基表面活性劑、聚氧丙烯-15硬脂酰醚、
蔗糖棕櫚酸酯硬脂酸酯、或辛基-e -D-吡喃葡萄糖苷等非離子型表面活性劑來(lái)促進(jìn)肝
素或類肝素腸吸收能力的方法)、頒予Bauer的美國(guó)專利第4,695,450號(hào)(闡述一種包 含聚乙二醇、諸如丙二醇等二元醇、或諸如甘油等三元醇的親水性液體和尤其是動(dòng)物 油、礦物油或合成油的疏水性液體的無(wú)水乳劑)、頒予Bodor的美國(guó)專利第4，703，042 號(hào)(闡述聚陰離子肝素酸鹽和聚陽(yáng)離子肝素酸鹽的經(jīng)口投與)、頒予Longenecker等 人的美國(guó)專利第4,994,439號(hào)(闡述一種通過(guò)共投與藥物與膽汁鹽或夫西地酸鈉 (fusidate)或其衍生物和非離子型去污劑(表面活性劑)來(lái)改善諸如肽和蛋白質(zhì)等大分 子藥物跨膜吸收能力的方法)、頒予Owen等人的美國(guó)專利第5，688，761號(hào)(主要是關(guān) 于使用通過(guò)添加水性流體可容易地轉(zhuǎn)化為水包油乳劑的油包水型微乳劑調(diào)配物來(lái)遞 送肽類藥物，其中肽或其他水溶性藥物釋放后由身體吸收)、頒予Owen等人的美國(guó) 專利第5，444，041號(hào)、第5,646,109號(hào)和第5,633,226號(hào)(是關(guān)于遞送諸如蛋白質(zhì)或肽 等生物活性藥劑的油包水微乳劑，其中活性藥劑最初儲(chǔ)存在乳劑的內(nèi)部水相中，但當(dāng) 組合物與體液混合后轉(zhuǎn)化為水包油乳劑時(shí)活性藥劑被釋放出來(lái))、頒予Einarsson的美
國(guó)專利第5,714,477號(hào)(闡述一種通過(guò)投與活性藥劑與一種或若干種脂肪酸甘油酯來(lái) 改善肝素、肝素片段或其衍生物的生物利用度的方法)、頒予New的美國(guó)專利第5，853，749號(hào)(闡述一種通過(guò)共投與生物活性藥劑和膽汁酸或膽汁鹽和緩沖劑來(lái)將腸 pH緩沖至7.5至9的調(diào)配物)。
在一實(shí)施例中，本發(fā)明劑型實(shí)質(zhì)上是延遲釋放的，以使得在經(jīng)口投與后組合物自 劑型中的釋放延遲，并且通常可在下GI道中發(fā)生。到達(dá)預(yù)期釋放位點(diǎn)后，可存在或 不存在進(jìn)一步的機(jī)制來(lái)控制組合物自劑型中釋放。也就是說(shuō)，自劑型延遲釋放組合物 可為速發(fā)型并實(shí)質(zhì)上在預(yù)期釋放位點(diǎn)完成，或者，在預(yù)期位點(diǎn)的釋放可以持續(xù)方式在 延長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行或以階段性或脈沖方式進(jìn)行。例如，可通過(guò)體外/體內(nèi)可植入泵來(lái)遞 送肝素。所述泵可遞送基本量和/或推注量的肝素。
如上所述，以可有效抑制轉(zhuǎn)移癌癥細(xì)胞與P-和/或L-選擇素結(jié)合的量單獨(dú)地或與 其他選擇素抑制劑一起投與本發(fā)明肝素。可通過(guò)業(yè)內(nèi)已知各種方法來(lái)分析這種結(jié)合抑 制。
本發(fā)明肝素可單獨(dú)或與其他選擇素抑制劑共同納入用于治療性投與的各種調(diào)配 物中。更具體來(lái)說(shuō)，可通過(guò)與適宜的醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑組合來(lái)將肝素單獨(dú) 或與其他藥劑共同調(diào)配至醫(yī)藥組合物中，并且可將其調(diào)配至各種制劑中，包括以諸如
漿液和溶液等液體形式調(diào)配。可通過(guò)經(jīng)口投與來(lái)達(dá)成活性藥劑的投與。
適用于本發(fā)明中的調(diào)配物可參見(jiàn)Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第19版(1995))，其教示以引用方式并入本文 中。此外，藥物遞送方法的概述可參見(jiàn)Langer等人(1990) Science 249:1527-1533，其 教示以引用方式并入本文中?？梢允炝?xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知的方式來(lái)制造本文所述醫(yī)藥組 合物，即通過(guò)習(xí)用混合、溶解、研磨、乳化、包埋或凍干制程來(lái)制造。下述方法和賦 形劑僅為例示性并且決非限制性的。
適用于本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包括其中以治療有效量包含活性成份的組合物。當(dāng) 然，所投與組合物的量可取決于所治療個(gè)體、個(gè)體體重、患病嚴(yán)重性、投與方式和處 方醫(yī)師的判斷。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者精通有效量的確定，尤其可根據(jù)本文提供的詳細(xì)揭示 內(nèi)容來(lái)確定。
本發(fā)明醫(yī)藥組合物可使用任一習(xí)用方法來(lái)制造，例如混合、溶解、?；?、研磨、 乳化、包封、包埋、熔融紡絲、噴霧干燥、或凍干制程。然而，可端視投與途徑和期 望劑量由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者確定最佳醫(yī)藥調(diào)配物。所述調(diào)配物可影響所投與藥劑的物理 狀態(tài)、穩(wěn)定性、活體內(nèi)釋放速率、和活體內(nèi)清除速率。端視所治療病況，可全身性或 局部性調(diào)配并投與這些醫(yī)藥組合物。
也可通過(guò)多種途徑投與本發(fā)明醫(yī)藥組合物，包括(但不限于)局部地、經(jīng)直腸、 經(jīng)口、經(jīng)陰道、經(jīng)鼻、經(jīng)皮。經(jīng)腸投與模式包括(例如)經(jīng)口 (包括含服和舌下給藥) 和經(jīng)直腸投與。經(jīng)上皮投與模式包括(例如)經(jīng)粘膜投與和經(jīng)皮投與。經(jīng)粘膜投與包 括(例如)經(jīng)腸投與以及經(jīng)鼻、吸入、和深度肺投與；經(jīng)陰道投與；和經(jīng)直腸投與。 經(jīng)皮投與包括被動(dòng)或主動(dòng)經(jīng)真皮或經(jīng)表皮模式，包括(例如)貼劑和離子電滲裝置， 以及糊劑、膏劑或軟膏劑的局部施用。調(diào)配醫(yī)藥組合物以使其包含適宜醫(yī)藥上可接受的載劑，并視需要可包含有助于將 活性化合物加工為醫(yī)藥上可用制劑的賦形劑和輔助劑。 一般來(lái)說(shuō)投與模式可決定載劑 性質(zhì)。對(duì)于組織或細(xì)胞投與來(lái)說(shuō)，在調(diào)配物中可使用適于穿越擬透過(guò)屏障的滲透劑。 一般來(lái)說(shuō)這些滲透劑是業(yè)內(nèi)已知的。對(duì)于某些制劑調(diào)配物可包含穩(wěn)定材料，例如多元 醇(例如蔗糖)和/或表面活性劑(例如非離子型表面活性劑)和諸如此類。
這些制劑可包含一或多種賦形劑，其包括(但不限于)a)稀釋劑，例如糖，包 括乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；b)粘著劑，例如硅酸鎂鋁、來(lái)自玉 米、小麥、稻、馬鈴薯等的淀粉；c)纖維素材料(例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維 素、和羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯基吡咯垸酮、樹(shù)膠(例如阿拉伯樹(shù)膠和黃蓍膠)、和 蛋白質(zhì)(例如明膠和膠原)；d)崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、 瓊脂、海藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)、或泡騰組合物；e)潤(rùn)滑劑，例如二氧化硅、滑 石粉、硬脂酸或其鎂或鈣鹽，和聚乙二醇；f)矯味劑和甜味劑；g)著色劑或顏料， 例如用來(lái)鑒別產(chǎn)物或表征活性藥劑的量(劑量)；和h)其他成份，例如防腐劑、穩(wěn)定 劑、溶脹劑、乳化劑、溶液促進(jìn)劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、和緩沖液。
可以活性藥劑的鹽形式提供醫(yī)藥組合物，這些鹽可用多種酸來(lái)形成，包括(但不 限于)氫氯酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等。在水性溶劑或?yàn)閷?duì) 應(yīng)游離堿形式的其他質(zhì)子型溶劑中鹽更易于溶解。
如上所述，藥劑自身和藥劑調(diào)配物的特性可影響所投與藥劑的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、 活體內(nèi)釋放速率和活體內(nèi)清除速率。所述藥物動(dòng)力學(xué)和藥物藥效學(xué)信息可通過(guò)活體外 和活體內(nèi)臨床前研究來(lái)收集，之后在臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程期間于人類中加以證實(shí)。因此，對(duì) 于本發(fā)明方法中所用任一化合物，在哺乳動(dòng)物中，尤其在人類中的治療有效劑量最初 可根據(jù)生化分析和/或基于細(xì)胞的分析來(lái)估算。然后，可在動(dòng)物模型中調(diào)配劑量以達(dá)成 調(diào)節(jié)P-和/或L-選擇素結(jié)合的期望治療劑量范圍。
所述化合物的毒性和治療效用可在諸如活體外人類臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞培 養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥程序來(lái)測(cè)定，例如，用于測(cè)定LD50 (可導(dǎo)致群體中 50%死亡的劑量)及ED50 (對(duì)群體中50%具有治療效果的劑量)的程序。
對(duì)于本發(fā)明方法，可使用調(diào)節(jié)用藥時(shí)限和順序的任一有效投藥方案?；钚运巹┑?劑量包括包含有效量藥劑的醫(yī)藥劑量單位。
通常，活性產(chǎn)物(例如肝素)可以下述濃度存于醫(yī)藥組合物中約lmg/劑量至 3,000 mg/劑量，并且更通常為約40 mg (IO，OOO單位)/劑量至約2,700 mg (300,000 單位)/劑量，或約50mg/劑量至約600mg/劑量。然而，可根據(jù)肝素調(diào)配物而有所改 變(例如，如果其是對(duì)選擇素具有集中抑制作用的部分，則可給與較少肝素)。在一 實(shí)施例中，活性藥劑可以設(shè)計(jì)為可促進(jìn)自GI道吸收的片劑或膠襄形式來(lái)投與。在另 一實(shí)施例中，活性藥劑包含于適用于經(jīng)口投與的固體或膠囊形式中，總劑量為約50mg 至約500 mg,而且通?？倓┝繛?0 mg (6,250單位)、100 mg (12，500單位)、250 mg (31,250單位)或500 mg (62,500單位)。端視特定活性藥劑的特異性活性，日劑量可大幅度變化。端視投與途徑，可根據(jù) 體重、體表面積或器官大小來(lái)計(jì)算適宜劑量。主治醫(yī)師可參照良好醫(yī)療實(shí)踐，考慮改 變藥物作用的各種因素來(lái)確定最終劑量方案，這些因素例如藥劑的特異性活性、疾病 狀態(tài)的嚴(yán)重度、患者反應(yīng)性、年齡、病況、體重、性別和患者飲食、任何感染的嚴(yán)重 度和諸如此類。可考慮的其他因素包括投與時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對(duì) 治療的耐勢(shì)反應(yīng)。適用于涉及本發(fā)明所提及任一調(diào)配物的治療的劑量的進(jìn)一步改進(jìn)是 由熟練從業(yè)者未經(jīng)過(guò)度實(shí)驗(yàn)以常規(guī)方式達(dá)成的，尤其是根據(jù)所揭示的劑量信息和分 析，以及在臨床實(shí)驗(yàn)中所觀察到的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)達(dá)成?？赏ㄟ^(guò)使用在體液或其他
樣品中測(cè)定藥劑濃度連同劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)的既定分析來(lái)確定適宜劑量。
投藥頻率可取決于藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)和投與途徑?？烧{(diào)節(jié)劑量和投與以提供
充足的活性藥劑濃度或維持期望效應(yīng)。因此，可根據(jù)需要以單一劑量、多次分開(kāi)劑量、 連續(xù)輸注、持續(xù)釋放貯藏物質(zhì)或其組合投與醫(yī)藥組合物以維持藥劑的最低期望濃度。 短效醫(yī)藥組合物(即短半衰期)可每天投與一次或每天投與一次以上(例如每天
兩次、三次或四次)。長(zhǎng)效醫(yī)藥組合物可每3至4天、每周、或每?jī)芍芡杜c一次。
可制備包含調(diào)配在醫(yī)藥上可接受載劑中的本發(fā)明活性藥劑的組合物，將其置于適 宜容器中，并作好標(biāo)記以用于適應(yīng)癥的治療。標(biāo)記適應(yīng)癥可包括(但不限于)細(xì)胞增 殖性病癥和轉(zhuǎn)移的治療。也涵蓋試劑盒，其中試劑盒包括醫(yī)藥組合物的劑型和包含在 醫(yī)學(xué)病況的治療中所述組合物的使用指導(dǎo)的包裝說(shuō)明書(shū)。
一般來(lái)說(shuō)，以有效量向個(gè)體投與用于本發(fā)明的活性藥劑。 一般來(lái)說(shuō)，有效量是對(duì) 下述情況有效的量(1)減少欲治療疾病的癥狀，(2)引發(fā)與治療欲治療疾病相關(guān)的藥 理學(xué)變化，和/或(3)預(yù)防待治療疾病的癥狀。
本文所揭示的結(jié)果以及所建立的肝素作為治療藥劑的記錄顯示，使用低于抗凝血 療法所需量的數(shù)量，肝素可用于抑制基于P-和/或L-選擇素的交互作用。具體來(lái)說(shuō)， 本發(fā)明提供包含在亭扎肝素中發(fā)現(xiàn)的高分子量肝素的肝素部分(例如大于8,000道爾 頓)。理想地，肝素部分分子量大于8,000道爾頓，但并不大到可引起不期望副作用或 降低生物利用度。由此，本發(fā)明提供一種抑制個(gè)體P-和/或L-選擇素結(jié)合的方法，其 是通過(guò)向個(gè)體投與一定量不會(huì)在個(gè)體中產(chǎn)生顯著抗凝血活性或不期望出血的肝素來(lái) 達(dá)成的。本發(fā)明進(jìn)一步提供治療P-和/或L-選擇素相關(guān)病狀的方法，其是通過(guò)向患有 所述病狀的個(gè)體投與一定量不會(huì)在個(gè)體中產(chǎn)生顯著抗凝血活性或不期望出血的肝素 來(lái)達(dá)成的。
使用本發(fā)明方法可治療其中P-和/或L-選擇素具有病理生理性作用的特定急性和 慢性病況。例如，根據(jù)本發(fā)明方法可通過(guò)向個(gè)體投與肝素來(lái)抑制不期望免疫應(yīng)答，其 中白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞的尋靶或粘著是 通過(guò)L-選擇素與內(nèi)皮細(xì)胞配體的交互作用介導(dǎo)的。例如，嗜中性粒細(xì)胞粘著的抑制可 干擾由氧自由基的分泌引發(fā)的損傷級(jí)聯(lián)和在心肌梗塞中存在的導(dǎo)致組織損傷和心肌 收縮功能受損的相關(guān)活性。類似地，在個(gè)體中，如果P-和/或L-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞和血小板)粘著是不期望的，可抑制這種活性。因此，使用本發(fā)明方 法可降低慢性免疫病癥或急性炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重度。
當(dāng)將肝素投與個(gè)體時(shí)，是以醫(yī)藥組合物的形式加以投與。所述肝素醫(yī)藥組合物可 在市場(chǎng)上購(gòu)得，且肝素投與方案為業(yè)內(nèi)所熟知。所述組合物和投與方案可方便地用于 實(shí)踐本發(fā)明。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可了解，具體肝素醫(yī)藥組合物的選擇取決于(例如)投 與途徑，并且可通過(guò)各種途徑將肝素醫(yī)藥組合物投與個(gè)體，包括(例如)非經(jīng)腸投與、 尤其靜脈內(nèi)投與?？赏ㄟ^(guò)靜脈內(nèi)或皮下注射投與肝素組合物，并且可以推注或通過(guò)連 續(xù)輸注實(shí)施投與。此外，可經(jīng)口、經(jīng)直腸或通過(guò)吸入來(lái)投與肝素的粘膜可吸收形式， 前提條件是血液中所達(dá)到的肝素濃度不超過(guò)在個(gè)體中產(chǎn)生顯著抗凝血活性或不期望 出血的濃度。
盡管上文已概述本發(fā)明，但在下文具體揭示內(nèi)容中闡述本發(fā)明的其他方面，其是 例示性而非限制性的。
實(shí)例 實(shí)例l
材料下述材料是來(lái)自UCSD Medical Center Pharmacy:來(lái)自American Pharmaceutical Partners的未經(jīng)分級(jí)分離的肝素鈉(UFH) (20，000U/ml;批號(hào)302523、 333246);來(lái)自Pharmion, USA的Innohep(亭扎肝素，TINZ)(由LEO Pharmaceutical Products, Denmark許可，20，000IU/ml;批號(hào)E9867A和G3371A);來(lái)自Pharmacia 的法安明(達(dá)肝素，DALT) (5000IU/0.2ml;批號(hào)94250A51、 94683A02和94802A01); 來(lái)自Aventis的依諾肝素(依諾肝素，ENOX)(30mg/0.3ml;批號(hào)30324、9367和9369); 以及來(lái)自Sanofi-Synthelabo的Arixtra (磺達(dá)肝素，F(xiàn)OND) (2.5mg/0.5ml;批號(hào) 0010000003和0170000010)。除非另外說(shuō)明，否則所有其他化學(xué)物質(zhì)均是購(gòu)自Sigma Chemical公司,St. Louis。
細(xì)胞系培養(yǎng)LS180人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和MC38GFP細(xì)胞(經(jīng)EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系)。在具有10WFCS的DMEM中培養(yǎng)小鼠黑素瘤B16F1細(xì)胞。除 FCS是來(lái)自HyClone之外，所有培養(yǎng)基和添加物均是來(lái)自Gibco (Invitrogen)。所有 細(xì)胞均是在37'C和5免C02下培養(yǎng)。使用前，通過(guò)在37X:下于具有2mM EDTA的 PBS中培養(yǎng)5-10分鐘來(lái)釋放細(xì)胞，然后將其在具有Ca2+、 Mg"和葡萄糖的PBS中洗 滌，之后將其在相同緩沖液中懸浮以用于靜脈內(nèi)注射。
小鼠隨意地用標(biāo)準(zhǔn)食物和水喂養(yǎng)來(lái)自Jackson Laboratories的C57BL/6J小鼠 (Bar Harbor, Maine),并將其維持在12小時(shí)光/暗循環(huán)中。某些小鼠是通過(guò)室內(nèi)喂養(yǎng) 這些C57BL/6J小鼠獲得的。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，當(dāng)所有購(gòu)得小鼠到達(dá)后，使其在動(dòng)物飼 養(yǎng)所內(nèi)適應(yīng)最少一周。所有實(shí)驗(yàn)都是在AAALAC特許的動(dòng)物詞養(yǎng)所中根據(jù)由 University's IACUC所批準(zhǔn)的方案來(lái)實(shí)施的。
LS180與選擇素結(jié)合的肝素抑制基于肝素的抗-Xa活性將肝素濃度標(biāo)準(zhǔn)化。研 究細(xì)胞與固定化人選擇素-Fc嵌合體的結(jié)合，但使用加載鈣黃綠素AM的LS180細(xì)胞。結(jié)果表示為使用下式計(jì)算的對(duì)照結(jié)合的百分比100* (肝素值-EDTA值)/ (僅緩 沖液值-EDTA值)。以各種的相關(guān)濃度在孔中(一式三份)檢測(cè)每種抗凝血?jiǎng)?br> 經(jīng)由血漿抗-Xa水平滴定肝素劑量以不同終濃度向小鼠皮下注射100nl稀釋于 PBS中的UFH、 TINZ或FOND。 30分鐘后，通過(guò)心臟穿刺將血液收集至包含30 ^ lOmMEDTA的lcc注射器中。在24卩以2,000 rcf將樣品離心兩次以收集血漿，將 其儲(chǔ)存在-80'C下直至用于分析抗-Xa活性。將存于155 pL 25 mM HEPES/150 mM NaCl/pH7.5中的人抗凝血酶III (3.3 ^g/孔)(Enzyme Research Laboratories)和人類 因子X(jué)a (0.02 ng/孔)(Enzyme Research Laboratories)添加至1.25 血漿樣品中， 然后將其與25 pg/孔合成因子X(jué)a發(fā)色底物(Chromogenix)共同培養(yǎng)。15分鐘后通過(guò)添 加50 ^11/孔20%乙酸終止反應(yīng)。在405 nm處測(cè)量所獲得發(fā)色團(tuán)。通過(guò)與摻入肝素的 小鼠血槳樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比以抗-Xa單位/ml來(lái)計(jì)算血漿肝素濃度。 一式三份分析 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。用于"lx"劑量的最終量為6.56 U UFH、 7.32 IU TINZ和0.0033 mg FOND。 "3x"劑量使用所述量的三倍。
癌的實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移分析向小鼠皮下注射100 pLPBS或存于100 ^LPBS中的肝素。 30分鐘后，將500,000 MC38GFP細(xì)胞靜脈內(nèi)注射至側(cè)面尾部靜脈中。以交替順序向 各研究組的小鼠注射，并且在吸取用于每次注射的樣品前通過(guò)輕彈試管使細(xì)胞再懸 浮。注射后27天，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，移出肺并在溶解產(chǎn)物中定量EGFP熒光。
黑素瘤實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移分析使用癌轉(zhuǎn)移分析中所述方案向小鼠注射肝素和500,000 B16F1細(xì)胞。注射后17天，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，用10%緩沖福爾馬林實(shí)施氣管灌 注，并將肺移出置于10%緩沖福爾馬林中。使肺固定最少24小時(shí)，將其分別從福爾 馬林中移出，并使用數(shù)碼相機(jī)拍照。通過(guò)下述步驟測(cè)定肺重量將肺從福爾馬林中移 出，暫時(shí)將其置于濾紙上以去除多余液體，然后將其在Sartorius分析天平上稱重。
肝素二糖分析二糖分析是由UCSD Glycotechnology Core Facility實(shí)施的。簡(jiǎn) 單來(lái)說(shuō)，將5叫每種肝素干燥，再懸浮于100mM乙酸鈉、O.lmM乙酸鈣、pH 7.0 的溶液中，并在37'C下分別與5mU肝素裂解酶I、 1I和III共同培養(yǎng)18小時(shí)。將樣 品煮沸2分鐘并使其流經(jīng)預(yù)洗滌的MicroconlO過(guò)濾器。然后干燥樣品，將其再懸浮 于MilliQ水中，并在60分鐘內(nèi)于Dionex ProPac PA1陰離子交換柱上使用pH 3.5的 MilliQ水以50-1000mM的氯化鈉梯度通過(guò)HPLC將其離析。通過(guò)在洗脫液流中使用 Eldex雙通道泵混合2-氰基乙酰胺(1%)與250 mM NaOH來(lái)達(dá)成伴有熒光檢測(cè)的柱后 衍生法。然后使洗脫液流經(jīng)加熱至130'C的Eppendorf TC-40反應(yīng)螺管，之后實(shí)施冷 卻浴，再用激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為346 nm且發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為410 nm的Jasco熒光檢測(cè)器對(duì)其分 析。這種方法的靈敏度為約5pmole。
肝素篩分以0.4 ml/min使10 mM KH2P04、 0.5M NaCl和0.2% Zwittergent (Calbiochem)流經(jīng)TosoHaas TSKG2000SW HPLC柱。使用葡聚糖藍(lán)測(cè)定外水體積。 將胞苷一磷酸(CMP， 0.5ng)摻入所有樣品中用作內(nèi)部對(duì)照來(lái)標(biāo)記所包括體積。評(píng)估各 肝素的兩個(gè)不同批料。用MilliQ水將每個(gè)樣品補(bǔ)足至10 pl的總體積。在整個(gè)45分鐘的運(yùn)行期間以206 nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)UV吸光度。在一額外運(yùn)行中，使TINZ的較大等份 試樣(19.5 fil TINZ和2.5 jig CMP標(biāo)記)流經(jīng)相同柱，并收集200 ^部分且評(píng)估其針 對(duì)P-選擇素與sLeX結(jié)合的抑制活性(參見(jiàn)本文分析細(xì)節(jié))。使用標(biāo)準(zhǔn)咔唑分析來(lái)定量 各部分中的糖醛酸含量。
對(duì)P-選擇素與sLex結(jié)合的抑制的分析用存于50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5) 中的2 pg/ml sLex-PAA (Gycotech， Maryland)涂敷髙結(jié)合力96孔ELISA板過(guò)夜。用 HPLC流動(dòng)緩沖液的1:5稀釋物(終濃度為2 mM KH2P04、 0.1 M NaCl和0.04% Zwittergent)將板沖洗兩次，然后在HPLC流動(dòng)緩沖液的1:5稀釋物+ 0.5% BSA中 將其封閉1小時(shí)。在所收集HPLC部分的1:5稀釋物(或那些部分在柱緩沖液中的稀 釋物)或肝素標(biāo)準(zhǔn)品存在下，將人P-選擇素嵌合體與山羊抗人IgG-AP(BioRad)(0.25 M : 0.25 pl)于室溫下預(yù)復(fù)合攪拌1小時(shí)。將樣品添加至封閉板中并將其在室溫下培養(yǎng) 2-3小時(shí)。用HPLC緩沖液的1:5稀釋物+ 0.5% BSA將板沖洗兩次，然后用HLPC 緩沖液的1:5稀釋物再?zèng)_洗兩次。將AP底物溶液(150^1; 10 mM對(duì)-硝基苯基磷酸 鹽、100mMNa2CO3、 1 mM MgCl2、 pH 9.5)添加至板中并使其在室溫下顯影。用 SpectraMax 250板讀數(shù)器讀取在405nm處的光密度。在分析的線性范圍內(nèi)，將一單 位抑制活性任意地定義為為選擇素結(jié)合的1%抑制。結(jié)果表示為使用下式計(jì)算的總抑 制單位100*[(最大結(jié)合-未知結(jié)合)/ (最大結(jié)合-最小結(jié)合)]* (200/nl在抑制 分析中所檢測(cè)的部分)，其中"最大結(jié)合"是在于肝素洗脫前所洗脫部分的存在下的 結(jié)合量且"最小結(jié)合"是在0.5 IU/ml TINZ存在下的結(jié)合量。
小鼠中進(jìn)行的用以標(biāo)準(zhǔn)化肝素投藥的藥物動(dòng)力學(xué)研究。實(shí)施比較UFH、 TINZ和 FOND的額外研究，由此涵蓋選擇素抑制特性的范圍。在文獻(xiàn)中未記載關(guān)于這些肝素 在小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)的詳細(xì)資料。實(shí)際上，大多數(shù)先前小鼠研究使用髙UFH劑量， 其可能產(chǎn)生在人類臨床應(yīng)用中不可接受的抗凝血效應(yīng)。在轉(zhuǎn)移分析中檢測(cè)這些肝素之 前，實(shí)施研究以標(biāo)準(zhǔn)化投藥，使得每次所投與肝素產(chǎn)生相似的、臨床上可接受的活體 內(nèi)抗-Xa水平。皮下遞送是投與LMWH的典型途徑。由此，優(yōu)化小鼠中的皮下肝素 劑量以達(dá)成臨床上相關(guān)的抗-Xa水平。用于經(jīng)肝素治療靜脈血栓栓塞的患者的治療性 濃度對(duì)于LMWH為約1抗因子X(jué)a單^/ml,其通常是在注射后3-4小時(shí)加以測(cè)量。 全身性皮下投與肝素劑量以在小鼠中達(dá)成大致相似的血漿抗-Xa水平。經(jīng)測(cè)定，單一 劑量注射量的"lx" UFH、TINZ和FOND可產(chǎn)生在此范圍內(nèi)的平均抗-Xa水平(圖2A， 如在人類中，個(gè)體間單一皮下劑量的效應(yīng)存在相當(dāng)大差異)。在皮下遞送后30分鐘(即 在所計(jì)劃的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中將腫瘤細(xì)胞注射至脈管系統(tǒng)中時(shí))分析血漿抗-Xa水平。然而， 藥物動(dòng)力學(xué)研究顯示事實(shí)上在小鼠中TINZ的清除比在人類中快得多，在人類中一次 日劑量足以維持抗凝血。將單一肝素劑量從"lx"增加至"3x"劑量，并分析抗-Xa水平 (圖2B)。此處，初期峰值水平可能略髙于臨床上可接受的水平，但實(shí)際上相關(guān)水平 可持續(xù)稍久。將和"3x"肝素劑量二者用于轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，其與服用這些藥物的患者 中可能發(fā)現(xiàn)的濃度范圍近似。僅可通過(guò)某些肝素來(lái)減弱癌轉(zhuǎn)移。所有后續(xù)活體內(nèi)研究都使用"實(shí)驗(yàn)性"轉(zhuǎn)移模 型，其中腫瘤細(xì)胞是經(jīng)靜脈內(nèi)注射。這種方法使得可以受控方式在已知時(shí)間點(diǎn)(即"自 發(fā)性"轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)不適合)研究在腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)的最初幾小時(shí)內(nèi)腫瘤細(xì)胞和血 細(xì)胞之間的交互作用。我們的實(shí)驗(yàn)采用在注射腫瘤細(xì)胞前單次推注注射肝素。
已顯示可通過(guò)在注射腫瘤細(xì)胞前30分鐘靜脈內(nèi)注射100U UFH來(lái)減弱人類和小 鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移。在注射腫瘤細(xì)胞前使用12.5或60 IU UFH的其他人的 研究也顯示黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的降低。盡管這些以及大多數(shù)先前研究顯示肝素具有降低 轉(zhuǎn)移的潛力，但其是使用臨床上不可接受的肝素劑量來(lái)實(shí)施的。為在臨床相關(guān)性更強(qiáng) 的環(huán)境中評(píng)估肝素治療，實(shí)施轉(zhuǎn)移分析來(lái)比較"lx"和"3x"劑量的UFH、 TINZ和 FOND。在以"lx"投藥或"3x"劑量用肝素或用PBS對(duì)照實(shí)施皮下投藥后30min,向小 鼠靜脈內(nèi)注射已知攜帶選擇素配體的同源MC38GFP結(jié)腸癌細(xì)胞。使用"lx"劑量的結(jié) 果顯示與所觀察到的活體外選擇素抑制活性相匹配的降低轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)(即， UFH>TINZ FOND)(圖3A)。然而這些結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。以UFH和TINZ 注射"3x"肝素幾乎完全減弱轉(zhuǎn)移，但在FOND與PBS之間仍無(wú)顯著差異(圖3B)。 值得注意的是，這種FOND劑量產(chǎn)生相當(dāng)于或髙于臨床抗凝血的所接受范圍的血漿抗 -Xa水平(圖2B)。
黑素癬轉(zhuǎn)移的肝素抑制也取決于選擇素抑制活性。用MC38GFP細(xì)胞所獲得的結(jié) 果顯示結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的抑制與肝素抑制P-和L-選擇素的能力之間的關(guān)系。為確定這種 現(xiàn)象是否適用于其他癌癥轉(zhuǎn)移模型，在皮下注射UFH、 TINZ或FOND (PBS作為對(duì) 照)的"lx"劑量或"3x"劑量后30分鐘向小鼠靜脈內(nèi)注射B16Fl黑素瘤細(xì)胞。注射后 17天，切除肺并評(píng)估轉(zhuǎn)移灶的存在。不計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移灶，而是獲得肺重量并與來(lái)自未注射 腫瘤細(xì)胞的小鼠的肺重量作比較。其他人已使用這種方法，而且其與肺的物理外觀密 切相關(guān)(參見(jiàn)圖4)。在接受"lx"肝素劑量的小鼠中，在接受UFH和TINZ的小鼠 中觀察到轉(zhuǎn)移在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(圖4A)。同樣，F(xiàn)OND沒(méi)有效果，肺的外觀與注 射PBS的小鼠的肺的外觀相當(dāng)。當(dāng)肝素量增加至"3x"劑量時(shí)，用UFH和TINZ治療 可觀察到甚至更大的轉(zhuǎn)移降低，其肺重量與未接受腫瘤細(xì)胞的小鼠的肺重量相似(圖 4B)。同樣，F(xiàn)OND對(duì)轉(zhuǎn)移無(wú)效，即使以更高劑量投藥也是如此。因此，在即將注射 黑素瘤細(xì)胞之前給與單次推注低劑量UFH和TINZ能降低轉(zhuǎn)移。這種趨勢(shì)符合用結(jié) 腸癌細(xì)胞所觀察到的結(jié)果，此證實(shí)了在多種腫瘤細(xì)胞類型中選擇素抑制的重要性(且 抗凝血效應(yīng)缺乏重要性)。
LMWH抑制選擇素的能力差異與二糖組成無(wú)關(guān)。肝素是具有多分散分布硫酸化 和差向異構(gòu)化模式的復(fù)合多糖。先前已顯示硫酸化模式可影響經(jīng)化學(xué)修飾肝素抑制選 擇素的能力?？紤]到制備三種LMWH調(diào)配物的不同方法，獨(dú)特的硫酸化模式可解釋 其抑制P-和L-選擇素的不同能力。FOND的結(jié)構(gòu)是人所皆知的。如"材料和方法 (Materials and Methods)"中所述評(píng)估兩批料每種UFH的二糖組成和三種LMWH 每種的二糖組成?？勺⒁獾礁鞣N二糖的百分比間無(wú)顯著差異。因此，所觀察到的各種LMWH間的抑制差異可能不能歸因于基本硫酸化模式中的主要差異。而是，應(yīng)歸因 為髙級(jí)結(jié)構(gòu)和/或總長(zhǎng)度。對(duì)于后一種可能性的證據(jù)，我們先前的工作顯示在1-7個(gè)二 糖范圍內(nèi)增加長(zhǎng)度與增強(qiáng)抑制P-和L-選擇素的能力有關(guān)。
通過(guò)大小分級(jí)分離鑒別具有與抗凝血活性相關(guān)的有效選擇素抑制特性的肝素。肝 素調(diào)配物的隨附包裝說(shuō)明書(shū)表明TINZ可能比DALT或ENOX含有更多髙分子量 (HMW)肝素片段。〉8000道爾頓的片段量指定為T(mén)INZ是22-36%，DALT是14-26%， 且ENOX是0-18%。為確定這種HMW含量的潛在差異是否存在于我們的樣品中， 對(duì)所有五種肝素實(shí)施大小排除HPLC分析。通過(guò)監(jiān)測(cè)在206nm處的UV吸光度來(lái)測(cè) 定每種肝素的大小分布范圍(圖5A)。三種LMWH中每種的肝素片段的大小分布范 圍顯著小于UFH。 ENOX的分子量分布范圍小于TINZ和DALT 二者。盡管TINZ 和DALT的平均分子量似乎相似，但TINZ的分子量分布范圍比DALT更廣。因此， TINZ包含少量在DALT中不存在的更髙分子量分子(圖5A)。
為確定這種少量較大片段是否不成比例地參與P-選擇素抑制，在HPLC大小分 離TINZ的較大等份試樣后收集各部分。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)咔唑分析測(cè)量糖醛酸含量來(lái)測(cè) 定各部分中的總肝素量。評(píng)估部分的P-選擇素抑制單位總量。在少量最髙分子量部分 中記錄到大量P-選擇素抑制活性(圖5B)。實(shí)際上，甚至在樣品中可檢測(cè)到糖醛酸以 前就已觀察到這種活性，其表示相對(duì)少量的HMW材料具有高P-選擇素抑制活性。這 個(gè)結(jié)果強(qiáng)有力地支持了我們的假說(shuō)長(zhǎng)度是決定抑制活性的重要因素。
當(dāng)在TINZ的大小分級(jí)分離特性曲線(圖SB)中評(píng)估抗-Xa單位總量時(shí)，可看到 在P-選擇素抑制和抗-Xa的峰之間存在偏移。事實(shí)上，當(dāng)這些變量標(biāo)準(zhǔn)化為各部分中 的糖醛酸量時(shí)，可看到存在少量包含極高量P-選擇素抑制活性和最低抗-Xa活性的部 分的亞組(部分28 - 32，在圖頂部由陰影框表示)(圖5B)。因此，市場(chǎng)上有售的肝 素包含在給定濃度下能抑制P-選擇素與其配體結(jié)合同時(shí)僅最低限度對(duì)影響凝血過(guò)程 的片段亞組。
已有文件詳細(xì)記載了癌癥與過(guò)度全身性血栓形成之間的密切關(guān)系，而且在所述情 況下顯然需要抗凝血。在本發(fā)明中闡述了抗凝血是否影響癌癥擴(kuò)散。許多先前研究顯 示，在小鼠中UFH抑制實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移，而且有限的數(shù)據(jù)表明所述效應(yīng)可能也與人類相
關(guān)。因此基本假定在減弱轉(zhuǎn)移過(guò)程中其作用的主要機(jī)制是抗凝血。如先前所討論的， 肝素是具有與實(shí)體瘤的整體生物學(xué)潛在相關(guān)的許多效應(yīng)的生物活性分子的復(fù)合混合
物。數(shù)據(jù)表明在循環(huán)中與腫瘤細(xì)胞的初期存活相關(guān)的肝素效應(yīng)主要?dú)w因于抑制P/L-選擇素，還可能歸因于阻斷經(jīng)由液相凝血途徑達(dá)成的血管內(nèi)纖維蛋白形成。如果按照 建議在臨近手術(shù)時(shí)才給與肝素，那么在脈管系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞的無(wú)活性期間肝素的其他 效應(yīng)可有益于患者，因?yàn)槠淇捎捎趯?duì)血管發(fā)生、乙酰肝素酶等的抑制而能降低原發(fā)性 腫瘤生長(zhǎng)和侵襲以及已形成轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)。
幾乎所有在嚙齒類動(dòng)物中的研究都以相對(duì)髙的劑量使用肝素，而且從未以臨床相 關(guān)劑量實(shí)施過(guò)當(dāng)前出售的各種類型肝素的分析。本發(fā)明首次顯示不同肝素在活體外抑制P-和L-選擇素的能力與其抑制兩種不同類型的同源鼠類腫瘤轉(zhuǎn)移的能力相關(guān)。也 顯示這種轉(zhuǎn)移的降低與肝素的抗凝血活性無(wú)關(guān)，因?yàn)槿缁铙w內(nèi)所測(cè)量，在相同水平的 臨床上可耐受的抗-Xa活性下優(yōu)良的抗凝血?jiǎng)〧OND不能抑制轉(zhuǎn)移。就此而言，最近 在小鼠中用蛭素(有效的抗凝血酶)抑制轉(zhuǎn)移的研究使用了遠(yuǎn)高于推薦在人體中使用 的劑量，并且有時(shí)導(dǎo)致抗凝血水平超出其分析的檢測(cè)上限。因此，雖然先前所報(bào)道髙 劑量肝素和蛭素對(duì)支持腫瘤轉(zhuǎn)移的纖維蛋白形成的效應(yīng)可能是正確的，但其未必與人 類患者的臨床情況髙度相關(guān)。最近報(bào)道，即使在蛭素存在下，特魯索綜合癥(Trousseau Syndrome)的血小板和白細(xì)胞介導(dǎo)的P/L-選擇素依賴性微血管凝血癥也可通過(guò)向小鼠 注射腫瘤粘蛋白來(lái)引發(fā)。
本文所提供數(shù)據(jù)顯示，選擇素抑制是肝素以臨床相關(guān)劑量影響腫瘤轉(zhuǎn)移的重要作 用。各種肝素活體外抑制P-和L-選擇素的能力的強(qiáng)弱次序與活體內(nèi)對(duì)減弱轉(zhuǎn)移的效 應(yīng)相匹配。同樣，這些研究使用產(chǎn)生臨床上可耐受抗-Xa水平的肝素的單次推注劑量， 其在幾小時(shí)內(nèi)就被自體內(nèi)清除。因此，肝素的許多其他后續(xù)作用(例如血管發(fā)生抑制、 乙酰肝素酶抑制等)可能與所揭示轉(zhuǎn)移研究無(wú)關(guān)，因?yàn)閱我粍┝扛嗡卦隗w內(nèi)存留時(shí)間 不夠長(zhǎng)，不能影響這些交互作用。此外，在所述轉(zhuǎn)移模型中肝素的這些其他作用是在 選擇素效應(yīng)的下游，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞是直接引入脈管系統(tǒng)中的，其中腫瘤細(xì)胞首先與承 載血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的P-和L-選擇素交互作用。在連續(xù)投與肝素的臨床環(huán)境中，其 在不同情況下可能會(huì)有或沒(méi)有不同程度的貢獻(xiàn)。應(yīng)注意，在臨床環(huán)境中每次投藥后肝 素可在循環(huán)中存留更久(因?yàn)槠湓谌祟愔邪胨テ谘娱L(zhǎng))。也可存在延長(zhǎng)更多的治療持 續(xù)時(shí)間。因此，在這些單次注射研究中觀察到的顯著效應(yīng)在臨床環(huán)境中可能甚至?xí)?明顯。
血小板和白細(xì)胞可通過(guò)與在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的選擇素-配體交互作用來(lái)支持轉(zhuǎn) 移。然而，先前顯示這些研究中所用的黑素瘤細(xì)胞系表達(dá)低濃度的sLex (選擇素配體 的主要組份)，并且在我們的實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施的實(shí)驗(yàn)表明重組體P-選擇素最低限度地與 這些細(xì)胞結(jié)合。這表明黑素瘤細(xì)胞的肝素抑制可能也歸因于內(nèi)源性選擇素-配體交互作 用例如PSGL-l與P-選擇素之間的交互作用)的抑制(。最新發(fā)現(xiàn)支持這一論點(diǎn)即 使在腫瘤細(xì)胞未攜帶P-選擇素配體時(shí)，血小板在腫瘤細(xì)胞周圍的聚集也可發(fā)生。通過(guò) 肝素抑制P-選擇素和/或阻斷L-選擇素的其他效應(yīng)干擾這些血小板聚集可能足以降低 轉(zhuǎn)移。因此，肝素療法不一定限制于僅對(duì)其腫瘤細(xì)胞攜帶選擇素配體的患者實(shí)施。
本發(fā)明提供設(shè)計(jì)預(yù)期臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估手術(shù)前、手術(shù)期間和手術(shù)后的肝素療法與原發(fā) 性惡性腫瘤去除手術(shù)的關(guān)系的方法，該手術(shù)是惡性細(xì)胞可進(jìn)入脈管系統(tǒng)的時(shí)期。其還 顯示了選擇已知為有效的P/L-選擇素結(jié)合抑制劑的肝素制劑的重要性。本文所述活體 外和活體內(nèi)數(shù)據(jù)可表明TINZ比DALT和ENOX更能增強(qiáng)無(wú)轉(zhuǎn)移存活并且FOND對(duì) 結(jié)果無(wú)影響。因此，對(duì)于使用DALT療法顯示患者存活率增髙的近期臨床實(shí)驗(yàn)，如果 將TINZ引入其研究，可能會(huì)得到甚至更強(qiáng)的效果。本文所鑒別的是傳統(tǒng)上具有較小 有害副作用風(fēng)險(xiǎn)的LMWH,其也能經(jīng)由選擇素抑制來(lái)降低轉(zhuǎn)移。此外，本發(fā)明研究評(píng)估TINZ的各種部分，顯示最終有可能分離出一種肝素片段亞組，其容許投與不影 響患者凝血狀態(tài)、但仍能顯著抑制P-選擇素的極低劑量。最后，因?yàn)闊o(wú)論如何癌癥患 者都頻繁需要抗凝血?jiǎng)┋煼▉?lái)治療血栓形成，本發(fā)明數(shù)據(jù)顯示應(yīng)更關(guān)注抗凝血?jiǎng)┑倪x 擇，因?yàn)槠淇赡芸梢耘c抗凝血無(wú)關(guān)的方式改善存活。
盡管不必鑒定本發(fā)明如何起作用的理論，但本發(fā)明仍提供所揭示肝素和類肝素可 能的作用機(jī)制的論述。因此，保證簡(jiǎn)要論述抗凝血效應(yīng)和選擇素抑制效應(yīng)之間差異的 潛在原因(細(xì)節(jié)參見(jiàn)圖6)。最有可能的原因是由于P-選擇素凝集素結(jié)構(gòu)域的延伸雙 位點(diǎn)性質(zhì)和涉及細(xì)胞表面的選擇素-配體結(jié)合的多價(jià)親合力。這與肝素-抗凝血酶結(jié)合 相反，其僅涉及一個(gè)特異性需要在FOND中所發(fā)現(xiàn)精密結(jié)構(gòu)的五糖結(jié)合位點(diǎn)，有人發(fā) 現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)也沿著較長(zhǎng)肝素鏈長(zhǎng)度分布。圖6中通過(guò)模型描述這些概念并在圖例中加 以解釋。另一可能(并非互相抵觸)解釋在于下述事實(shí)當(dāng)陰離子多糖長(zhǎng)度增加時(shí)， 在鏈中部可能發(fā)生許多變化，包括構(gòu)象和電荷變化。因此，延長(zhǎng)的肝素鏈可能具有適 合P/L-選擇素的新內(nèi)部特征。
先前已討論了設(shè)計(jì)抗凝血活性降低但仍保留其他活性的新類型肝素；然而，在這 些經(jīng)修飾新肝素最終可獲得批準(zhǔn)用于人類之前,其需要完整的臨床前和階段I-III臨床 檢測(cè)。本發(fā)明顯示不需要特殊修飾，且可自當(dāng)前經(jīng)FDA批準(zhǔn)肝素形式中的片段亞組 分離有效制劑。
本發(fā)明闡述由肝素抑制P/L-選擇素在降低轉(zhuǎn)移中的重要性，同時(shí)所述發(fā)現(xiàn)對(duì)治療 其中P/L-選擇素具有重要作用的許多其它人類疾病也很重要。這些疾病包括炎癥性疾 病，例如過(guò)敏性皮炎、哮喘、動(dòng)脈粥狀硬化、和炎癥性腸道疾?。黄渲腥毖俟嘧p 傷起關(guān)鍵作用的疾病，例如器官移植、阻塞性冠狀動(dòng)脈炎的血管成形術(shù)后的心肌功能 障礙等(Bevilacqua等人，Annu Rev Med (1994) 45:361-78; Lowe等人，J Clin Invest (1997)99:822-6;和Ley K.， Trends Mol Med (2003) 9:263-8);以及其他疾病，例如鐮 狀紅細(xì)胞病(Matsui等人，Blood (2002) 100:37卯-6)。
實(shí)例2
細(xì)胞系MC38GFP細(xì)胞是經(jīng)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠結(jié)腸癌細(xì) 胞，將其培養(yǎng)并制備用于注射。
小鼠C57BL/6J (WT)小鼠來(lái)自Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine)或來(lái) 自這些小鼠的室內(nèi)喂養(yǎng)。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，當(dāng)所有購(gòu)得小鼠到達(dá)后，使其在動(dòng)物飼養(yǎng)所內(nèi) 適應(yīng)最少一周。缺失P-和L-選擇素二者(PL-A)并與C57BL/6J背景同源的小鼠是業(yè)內(nèi) 已知的。隨意地用標(biāo)準(zhǔn)食品和水喂養(yǎng)所有小鼠并將其維持在12小時(shí)^/暗循環(huán)中。在 AAALAC特許的動(dòng)物飼養(yǎng)所中實(shí)施實(shí)驗(yàn)。與IACUC建議一致，"存活"研究不使用 死亡作為終點(diǎn)，而是當(dāng)小鼠到達(dá)明顯瀕死狀態(tài)時(shí)(基本不動(dòng)，身體弓起，呼吸急促、 并且不尋找食物或水)使用安樂(lè)死來(lái)代替。
癌的實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移分析向小鼠皮下注射100 jiLPBS或存于100 pLPBS中的肝素 (100 U或19.68 U)。相對(duì)于腫瘤細(xì)胞注射，在t = -0.5h、 +6h、和+12h時(shí)實(shí)施肝素或PBS注射。在t-0時(shí)將MC38GFP細(xì)胞靜脈內(nèi)注射至側(cè)面尾部血管中。當(dāng)WT小 鼠表現(xiàn)瀕死狀態(tài)時(shí)對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死術(shù)。在注射后50或55天對(duì)所有存活小鼠實(shí)施安樂(lè) 死術(shù)。為評(píng)估轉(zhuǎn)移，計(jì)數(shù)所切除肺上的可見(jiàn)灶，和/或定量肺組織勻漿的GFP熒光。
同時(shí)缺失P-和L-選擇素可顯著延長(zhǎng)經(jīng)靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞的小鼠的存活。實(shí)驗(yàn) 性轉(zhuǎn)移研究中顯示在PL-A小鼠中轉(zhuǎn)移灶形成減少。然而，這些研究在第一只WT對(duì) 照小鼠表現(xiàn)瀕死狀態(tài)的時(shí)間點(diǎn)即終止。因此，對(duì)P-和L-選擇素缺失的改善存活的能 力從未作過(guò)評(píng)估。向WT和PL-A小鼠實(shí)施同源小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的靜脈內(nèi)注射，并在 較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠，且僅在個(gè)體動(dòng)物表現(xiàn)瀕死狀態(tài)時(shí)才對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，并實(shí) 施典型尸體剖檢發(fā)現(xiàn)肺薄壁組織幾乎完全被融合性腫瘤細(xì)胞團(tuán)所代替。在腫瘤細(xì)胞注 射后第33天對(duì)第一只WT小鼠實(shí)施安樂(lè)死術(shù)(圖8)。盡管存活WT小鼠數(shù)量繼續(xù)隨 時(shí)間減少，但在注射腫瘤細(xì)胞后第55天研究終止時(shí)并未觀察到PLV-小鼠出現(xiàn)瀕死狀 態(tài)(圖8)。然而在第55天超過(guò)半數(shù)PL-A小鼠具有可見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移。因此，盡管缺失P-和L-選擇素可顯著增強(qiáng)存活，但如果實(shí)驗(yàn)實(shí)施時(shí)間更長(zhǎng)，這并不是絕對(duì)的。長(zhǎng)時(shí)間存 活的PL-A小鼠仍產(chǎn)生一些轉(zhuǎn)移損傷，這一事實(shí)使得能確定肝素對(duì)這些動(dòng)物是否具有 任何其他效應(yīng)。
在缺失P-和L-選擇素的小鼠中髙劑量肝素進(jìn)一步降低轉(zhuǎn)移。先前研究顯示在血 行性轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的極早時(shí)間點(diǎn)P-選擇素可能在轉(zhuǎn)移中起作用，可能是通過(guò)促進(jìn)血小板在 腫瘤細(xì)胞周圍聚集來(lái)達(dá)成。根據(jù)功能阻斷抗體研究，在稍晚時(shí)間點(diǎn)(腫瘤細(xì)胞注射后 約6-18小時(shí))L-選擇素似乎也具有相對(duì)早期的作用。在腫瘤細(xì)胞注射前0.5h或在腫 瘤細(xì)胞注射后6h和12h注射100 U肝素可顯著降低WT小鼠中轉(zhuǎn)移灶形成。據(jù)信在 這些研究中肝素的作用機(jī)制主要?dú)w因于其抑制P-和/或L-選擇素的能力。為證實(shí)這個(gè) 假說(shuō),在相對(duì)于注射經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞的相同時(shí)間點(diǎn)-0.511、+611和+12h向PL-/-小鼠注射PBS或100U肝素。使這些小鼠在實(shí)驗(yàn)中保持50天，使得至少在某些動(dòng)物 中可形成顯著轉(zhuǎn)移灶。當(dāng)定量肺組織勻漿的GFP熒光作為轉(zhuǎn)移灶形成的量度時(shí)，與 接受PBS對(duì)照注射的小鼠相比，在接受三種肝素注射的PL-A小鼠中可觀察到顯著降 低(圖9)。因此，這些高劑量肝素注射對(duì)減弱轉(zhuǎn)移具有某些額外效應(yīng)，這些效應(yīng)與選 擇素抑制活性無(wú)關(guān)。
如上所述，肝素具有許多其他潛在的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)，包括抗凝血。某些實(shí)驗(yàn)性研究 顯示使用抗凝血酶劑蛭素的抗凝血可降低轉(zhuǎn)移。在這些研究中的一個(gè)研究中，在即將 靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞之前、注射后4h、并隨后每隔一天給與小鼠20 mg/kg蛭素，共 注射10天。觀察到轉(zhuǎn)移灶形成顯著減少。另一組在注射腫瘤細(xì)胞前20分鐘以10 mg/kg 向小鼠注射蛭素。同樣，顯示用蛭素治療可降低腫瘤細(xì)胞的肺部滯留。然而，如果在 注射腫瘤細(xì)胞時(shí)測(cè)量蛭素的抗凝血，幾乎所有結(jié)果均髙于檢測(cè)極限(在活化部分凝血 活酶時(shí)間檢測(cè)中凝固時(shí)間> 300秒)。由于此劑量約為第一個(gè)所提及研究中給予劑量 的一半，倘若在所給與劑量下達(dá)成過(guò)度抗凝血，則兩組結(jié)果均極有可能是臨床上不相 關(guān)的。將未經(jīng)分級(jí)分離的肝素與無(wú)選擇素抑制活性的合成五糖磺達(dá)肝素作比較。當(dāng)以類似的臨床上可耐受的抗凝血水平給與時(shí)，所述五糖對(duì)血行性轉(zhuǎn)移無(wú)效。習(xí)用于小鼠
研究的100 u肝素的劑量所達(dá)成的抗凝血水平在臨床應(yīng)用中也不可接受。
臨床上可耐受的肝素劑量對(duì)與P-和L-選擇素抑制無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)移無(wú)顯著效應(yīng)。研究 檢測(cè)以臨床上可耐受濃度給與的未經(jīng)分級(jí)分離的肝素以及除抑制P-和L-選擇素之外 UFH是否對(duì)限制轉(zhuǎn)移具有任何加成效應(yīng)。因此，實(shí)施其中在相同的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)給與肝 素的類似實(shí)驗(yàn)，以抑制P-選擇素和L-選擇素。與先前實(shí)驗(yàn)(圖9)中所給與的高劑量 肝素相反，使用肝素的臨床相關(guān)劑量。正如通過(guò)評(píng)估可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量(圖10A)或通 過(guò)定量肺組織勻漿中的熒光(圖10B)可知，在缺失P-和L-選擇素的環(huán)境中臨床相關(guān) 的肝素注射對(duì)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著效應(yīng)(盡管肝素存在稍微改善的趨勢(shì)，但這種趨勢(shì)通過(guò)任一 量度測(cè)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均不顯著)。
先前己顯示這種肝素劑量對(duì)WT小鼠中轉(zhuǎn)移灶形成具有顯著效應(yīng)。既然在缺失 P-和L-選擇素二者的小鼠中未觀察到其他效應(yīng)，可推斷臨床相關(guān)肝素劑量主要是經(jīng)由 抑制P-和L-選擇素來(lái)減弱轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，始終存在一種可能性肝素也抑制一或多種 與選擇素對(duì)轉(zhuǎn)移的作用處于相同線性途徑內(nèi)的其他機(jī)制。然而，在其中腫瘤細(xì)胞是直 接投與至脈管系統(tǒng)中并立即與血細(xì)胞交互作用的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的某些最 早步驟可能涉及選擇素。因此，抑制級(jí)聯(lián)中的這些早期步驟可使肝素的其他下游效應(yīng) 實(shí)際上無(wú)關(guān)。此外，由于在此實(shí)驗(yàn)中所投與的肝素劑量在數(shù)小時(shí)內(nèi)被清除，肝素的許 多其他效應(yīng)(例如乙酰肝素酶和血管發(fā)生抑制)在所研究時(shí)間范圍內(nèi)可能不相關(guān)。仍 有可能的是，與趨化因子結(jié)合的肝素在此時(shí)間段內(nèi)也可相關(guān)。
本文已闡述了本發(fā)明的許多實(shí)施例。然而，應(yīng)了解，可在不違背本發(fā)明精神和范 圍的情況下作出各種修改。因此，其他實(shí)施例均屬于下述權(quán)利要求書(shū)的范疇。
權(quán)利要求
1、一種篩選抑制選擇素活性的組合物的方法，所述方法包括a)提供i)包括多個(gè)肝素分子的肝素制劑，其中所述制劑是從FDA批準(zhǔn)的肝素類型和批料獲得；ii)一或多種選擇素，其選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群組；iii)一或多種選擇素的配體，所述選擇素選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群組；及b)在適用于選擇素與選擇素配體結(jié)合的條件下使a)i)與a)ii)和a)iii)同時(shí)或依次接觸；以及c)檢測(cè)與不存在所述肝素制劑的情況相比，在所述肝素制劑存在下一或多種選擇素與配體結(jié)合的降低程度，其中結(jié)合的降低指示組合物抑制選擇素活性。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合的降低程度是使用低于產(chǎn)生一或多 種活性的肝素濃度的所述肝素制劑濃度來(lái)檢測(cè)的，所述活性選自由活體內(nèi)抗凝血活性 和活體內(nèi)不期望出血組成的群組。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述肝素制劑濃度低于產(chǎn)生選自由血管發(fā)生 抑制、乙酰肝素酶抑制和細(xì)胞因子結(jié)合組成的群組的活性的肝素濃度。
4、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述肝素制劑濃度不降低E-選擇素與E-選擇素配體的結(jié)合程度。
5、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中使所述一或多種選擇素與所述配體的結(jié)合程 度降低的肝素濃度比產(chǎn)生過(guò)度或危險(xiǎn)活體內(nèi)抗凝血活性的肝素濃度低2倍至50倍。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述配體是PSGL-1。
7、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體是唾液酸化路易斯x(sialyl-Lewis" (SLe
8、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中將所述配體固定。
9、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體存在于細(xì)胞上。
10、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
11、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細(xì)胞是HL-60細(xì)胞。
12、 如權(quán)利要求1所述的方法，其另外包括鑒別肝素制劑作為L(zhǎng)-選擇素相關(guān)病狀 的治療藥劑。
13、 如權(quán)利要求1所述的方法，其另外包括鑒別肝素制劑作為P-選擇素相關(guān)病狀 的治療藥劑。
14、 一種篩選抑制選擇素活性的組合物的方法，所述方法包括 a)提供i) 包括多個(gè)肝素分子的肝素制劑，其中所述制劑是從FDA批準(zhǔn)的肝素批料獲得；ii) 一或多種選擇素，其選自由L-選擇素和P-選擇素組成的群組；iii) 一或多種選擇素的配體，所述選擇素選自由L-選擇素和P-選擇素組成 的群組；及iii)肝素；b) 分級(jí)分離a)i)肝素制劑并分離多個(gè)包括肝素分子的部分，其中所述部分是基于 所述部分中所述肝素分子的大小來(lái)分離的；c) 在適用于選擇素與選擇素配體結(jié)合的條件下使b)中各部分與a)ii)和a)iii)同時(shí) 或依次接觸；及d) 鑒別與不存在所述部分的情況相比，在所述部分存在下降低所述一或多種選擇 素與所述配體的結(jié)合程度的部分。
15、 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述配體是PSGL-1。
16、 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述配體是唾液酸化路易斯x(SLeX)。
17、 如權(quán)利要求14所述的方法，其中將所述配體固定。
18、 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述配體存在于細(xì)胞上。
19、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
20、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞是HL-60細(xì)胞。
21、 一種肝素部分，其通過(guò)如權(quán)利要求14所述的方法鑒別出。
22、 如權(quán)利要求21所述的肝素部分，其中所述肝素包括分子量介于約8,000與 40,000道爾頓之間的肝素多糖。
23、 如權(quán)利要求2i所述的肝素部分，其中所述肝素包括可用肝素酶實(shí)施e-脫去裂解并且分子量為至少8,000道爾頓的肝素多糖。
24、 如權(quán)利要求21所述的肝素部分，其中所述部分的特征在于其為高分子量的 亭扎肝素(tinz叩arin)部分。
25、 一種制造物件，其包括包裝材料并且在所述包裝材料內(nèi)含有通過(guò)如權(quán)利要求 1所述的方法鑒別出的肝素制劑，其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)，其指明 所述肝素制劑抑制選擇素活性并且可用于抑制個(gè)體血行性轉(zhuǎn)移。所述相同標(biāo)簽還提供 關(guān)于與選擇素抑制活性相關(guān)的抗凝血活性水平的信息。這使得醫(yī)師投與的劑量可在活 體內(nèi)提供充足的P-和L-選擇素阻斷活性而不會(huì)導(dǎo)致可能將患者置于出血風(fēng)險(xiǎn)中的過(guò) 度抗凝血。
26、 如權(quán)利要求25所述的制造物件，其中所述肝素制劑是包括分子量大于8,000 道爾頓的肝素的中間分子量肝素制劑。
27、 如權(quán)利要求25所述的制造物件，其中所述肝素制劑是亭扎肝素。
28、 一種制造物件，其包括包裝材料并且所述包裝材料中包含通過(guò)如權(quán)利要求14 所述的方法鑒別出的肝素部分，其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)，其指明所述肝素部分抑制選擇素的活性并且可用于抑制個(gè)體血行性轉(zhuǎn)移或任何其他由P-和/或 L-選擇素介導(dǎo)的病狀。
29、 如權(quán)利要求24或28所述的制造物件，其中所述選擇素選自由P-選擇素和 L-選擇素組成的群組。
30、 一種預(yù)防或治療個(gè)體細(xì)胞增殖性病癥的方法，所述方法包括向所述個(gè)體投與 有效量的特異性選擇素活性抑制劑，其包括存于醫(yī)藥上可接受載劑中的中間分子量肝 素，其中所述抑制劑是肝素制劑或肝素部分。
31、 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述中間分子量肝素包括分子量介于約8,000 與40,000道爾頓之間的肝素多糖。
32、 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述中間分子量肝素制劑包括可用肝素酶 實(shí)施P -脫去裂解并且分子量為至少8,000道爾頓的肝素多糖。
33、 一種預(yù)防或治療個(gè)體細(xì)胞增殖性病癥的方法，所述方法包括向所述個(gè)體投與 有效量的存于醫(yī)藥上可接受載劑中的如權(quán)利要求21所述的肝素制劑。
34、 一種預(yù)防或抑制個(gè)體轉(zhuǎn)移或任何其他由P-和/或L-選擇素介導(dǎo)病狀的方法，所述方法包括向所述個(gè)體投與有效量的存于醫(yī)藥上可接受載劑中的特異性選擇素活 性抑制劑，其中所述抑制劑是包括中間分子量肝素的肝素制劑或肝素部分。
全文摘要
本發(fā)明提供鑒別可調(diào)節(jié)選擇素活性的肝素和類肝素的活體外和活體內(nèi)方法。本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)選擇素活性的肝素和類肝素。所述肝素調(diào)配物的鑒別和分離可調(diào)節(jié)眾多種由P-和/或L-選擇素介導(dǎo)的病狀，包括血行性轉(zhuǎn)移、炎癥相關(guān)疾病(例如哮喘、關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性皮炎)、缺血-再灌注損傷、或諸如鐮狀細(xì)胞貧血癥等其他病狀?？梢栽诘陀谌祟悅€(gè)體中導(dǎo)致過(guò)度抗凝血或不期望出血的濃度的血漿濃度下來(lái)達(dá)成選擇素的抑制。
文檔編號(hào)A01N43/04GK101583273SQ200680032519
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者珍妮弗·L·史蒂文森, 阿吉特·瓦爾基 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)