專利名稱：：農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的具有高β-伴大豆球蛋白含量的大豆的制作方法農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的具有高(3-伴大豆球蛋白含量的大豆
背景技術(shù)：
：本申請(qǐng)要求2005年9月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/714,779和2005年9月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/722,493的優(yōu)先權(quán)。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來說涉及植物育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的具有高(3-伴大豆球蛋白(conglydnin)含量的大豆品種和用于制備這樣的植物的材料。2.相關(guān)技術(shù)描述大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白是大豆中的兩種主要貯存蛋白，占總蛋白的約70%,或種子總重量的40%。大豆球蛋白(lls球蛋白)由5種不同的亞基組成，這些亞基分別命名為AlaB2、A2Bla、AlbBlb、A5A4B3、A3B4。每個(gè)亞基由通過二硫鍵共價(jià)連接的2個(gè)多肽組成，所述多肽一個(gè)是酸性的，一個(gè)是堿性的。2個(gè)多肽鏈源自大豆球蛋白原(proglycinin)前體的翻譯后切割，該步驟發(fā)生在前體進(jìn)入蛋白體之后(Chrispeels爭(zhēng)，1982)。已經(jīng)鑒別出編碼這些多肽亞基的5個(gè)主要基因。它們分別命名為Qy7、Qv入Qy丄Qy4和G^5(Nidsen夢(mèng)，1997)。另外，也報(bào)道了假基因gy6和次要基因Qy7(Beilinson爭(zhēng)，2002)。各個(gè)研究組已經(jīng)報(bào)道了這些基因的遺傳作圖(Diers爭(zhēng)，1993,Chen和Shoemaker1998,Beilinson爭(zhēng)，2002)。和Gj/2的位置相隔3kb,且作圖在連鎖群N(Nielsen爭(zhēng)，1989),G_y3作圖在連鎖群L(Beilinson爭(zhēng)，2002)。和Gy5分別作圖在連鎖群O和F。所有這些基因都使用RFLP探針在DNA印跡上作圖。另一方面，P-伴大豆球蛋白由a(約67kda)、a'(約71kDa)和(3(約50kDa)亞基組成，且每個(gè)亞基通過共翻譯或翻譯后的修飾來加工(Ladin爭(zhēng)，1987;Utsumi,1992)。P-伴大豆球蛋白亞基分別由基因Cgy/、Cgy2和Cgy3編碼。遺傳分析表明，Cgy2與Cgy3緊密連鎖，而Cg少/與另外2個(gè)獨(dú)立地分離。(3-伴大豆球蛋白基因家族含有至少15個(gè)成員，它們分成2個(gè)主要組，分別編碼2.5kb和1.7kb胚mRNA(Harada爭(zhēng)，1989)。具有提高的(3-伴大豆球蛋白水平和降低的大豆球蛋白水平的大豆植物會(huì)提供相當(dāng)大的益處。一個(gè)原因是，p-伴大豆球蛋白是一種可溶蛋白，而大豆球蛋白的溶解度低得多。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與大豆球蛋白相比，J3-伴大豆球蛋白、尤其a'亞基具有明顯更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和對(duì)人類健康的積極影響(Baba爭(zhēng)，2004)。許多使用動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，來自大豆P-伴大豆球蛋白的ot'亞基會(huì)降低血漿甘油三酯，且也會(huì)增加LDL("壞，，膽固醇)從血液中的去除(Duranti爭(zhēng)，2004,Moriyama爭(zhēng)，2004,Adams爭(zhēng)，2004,Nishi爭(zhēng)，2003)。因此，具有提高的(3-伴大豆球蛋白含量的大豆品種具有比傳統(tǒng)品種更高的價(jià)值，且將適用于營(yíng)養(yǎng)飲料和其它食品中。令人感興趣地，大豆球蛋白基因中的突變對(duì)大豆種子中的(3-伴大豆球蛋白含量具有直接影響。具有降低的大豆球蛋白含量的突變大豆植物具有提高的(3-伴大豆球蛋白含量。但是，由于多個(gè)大豆球蛋白等位基因參與大豆球蛋白亞基生產(chǎn)，已經(jīng)證實(shí)難以培育多個(gè)Gy亞基表達(dá)降低的植物，因?yàn)檫@樣的植物具有其它特征，例如低產(chǎn)量、過度倒伏和綠種子，這些使它們商業(yè)上不合算。以前的測(cè)定導(dǎo)致降低的大豆球蛋白含量的突變遺傳的方法，不能實(shí)現(xiàn)在導(dǎo)入農(nóng)學(xué)上優(yōu)異的特征的同時(shí)選擇這些表型所需的高通量技術(shù)。例如，以前的Gy遺傳的評(píng)估，依賴于蛋白表達(dá)的分析，這是高成本的、勞動(dòng)密集的，且不能跟蹤隱性突變的遺傳。不顧勞動(dòng)生產(chǎn)這樣的植物的可能性也是未知的，這是由于其它的復(fù)雜因素，例如與漸滲突變G^等位基因的嘗試有關(guān)的連鎖累贅(linkagedrag)和上位性。在得到的表型方面，等位基因的組合也是不可預(yù)知的。因而，本領(lǐng)域長(zhǎng)期需要(但是沒有得到滿足)農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的多個(gè)Gy蛋白亞基表達(dá)降低的大豆植物和生產(chǎn)這樣的植物的方法。脂加氧酶是催化多不飽和脂肪酸的雙加氧的酶。大豆種子含有3種脂加氧酶同工酶-脂加氧酶1、2和3。這些同工酶有助于生產(chǎn)大豆種子的令人厭惡的風(fēng)味。在缺乏這些同工酶、尤其缺乏脂加氧酶-2的種子中，這種令人厭惡的風(fēng)味不存在或不太顯著。因此，需要將缺乏一種或多種脂加氧酶同工酶的大豆種子用于制備飲料和食品。脂加氧酶l、2、和3缺陷系的遺傳研究表明，各自的不存在分別是由于單個(gè)隱性等位基因-/;c/、/;c2和/;c3。由/義/和/義2定義的基因座緊密連鎖，且在遺傳上不與/義3連鎖(Kitamura,1984;Kitamura爭(zhēng),1985;Hajika爭(zhēng),1992;Hildebrand爭(zhēng)，1982)。已經(jīng)克隆了編碼脂加氧酶1、2、和3的結(jié)構(gòu)基因，且分別命名為Zojc/、Zox2和Lo;c3(Shibata爭(zhēng)，1987;Shibata爭(zhēng)，1988;Yenofsky夢(mèng)，1988)。Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI)是大豆中的一種抗?fàn)I養(yǎng)且變應(yīng)原性因子，當(dāng)存在于飲食中時(shí)，它干擾蛋白的消化和吸收。因而，具有KTI-無效突變性狀的大豆品種具有比傳統(tǒng)品種更高的商業(yè)價(jià)值。已經(jīng)對(duì)大豆系中的KTI生產(chǎn)進(jìn)行了遺傳和生化研究(辦如deMoraes爭(zhēng)，2006;Natarajan爭(zhēng),2006),且已經(jīng)鑒別出3個(gè)相關(guān)的基因，其中KTI3在培養(yǎng)的大豆基因型中編碼優(yōu)勢(shì)的Kunitz胰蛋白酶抑制劑蛋白(Natarajan爭(zhēng),2006)。已經(jīng)報(bào)道了與某些大豆系中與喪失KTI生產(chǎn)有關(guān)的一些特定DNA標(biāo)記(deMoraes爭(zhēng),2006)。發(fā)明概迷在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆植物，其具有賦予Gy3和Gy4無效表型和提高的種子p-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變。因而，本發(fā)明的植物在一個(gè)方面包含具有低大豆球蛋白含量和高p-伴大豆球蛋白含量的種子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物的種子(3-伴大豆球蛋白含量是總蛋白含量的約或至少約34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%或更高。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物的種子大豆球蛋白含量是總蛋白的約或小于約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0%。在有些情況下，本發(fā)明植物可以包含突變Qy4等位基因。例如，突變Qy4等位基因可以包含在核苷酸682處的點(diǎn)突變，從而取消翻譯起始密碼子。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的植物可以包含Gy/和Qy2無效等位基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GW、Qy入Gy3和/或G盧等位基因中的任意一個(gè)或多個(gè)可以與系B2G2中的無效等位基因相同，所述系B2G2是已經(jīng)在ATCC登記號(hào)PTA-6893下保藏的種子的代表樣品。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提供了大豆植物，其另外包含賦予降低水平的Gyl/Gy2蛋白的突變。本文使用的"降低水平的Gyl/Gy2蛋白"是指，與缺乏突變的具有相同遺傳背景的植物相比，包含非轉(zhuǎn)基因突變的植物的種子具有降低的Gyl/Gy2蛋白水平。例如，包含賦予降低的Gyl/Gy2的非轉(zhuǎn)基因突變的植物的Gyl/Gy2蛋白含量可以小于總種子蛋白的約3.P/。。在某些情況下，賦予降低的Gyl/Gy2蛋白含量的突變可以是非轉(zhuǎn)基因突變。在本發(fā)明的有些方面，本發(fā)明的植物包含突變G少l等位基因。例如，突變G少/等位基因可以包含跨越上游啟動(dòng)子區(qū)、外顯子I和內(nèi)含子I的缺失。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可以另外包含賦予降低的Gy5蛋白水平的突變。在某些情況下，賦予降低的Gy5蛋白含量的突變是非轉(zhuǎn)基因突變。因而在有些方面，本發(fā)明植物包含賦予降低的Gyl、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5蛋白水平的突變。在某些方面，本發(fā)明植物可以包含賦予降低的Gyl、Gy2Gy3、Gy4和Gy5表型的非轉(zhuǎn)基因突變。這些植物的種子的大豆球蛋白含量可以是總蛋白的約或小于約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0%。因而，包含降低的Gyl、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5表型的本發(fā)明植物可以包含這樣的種子，其p-伴大豆球蛋白含量是總蛋白含量的約或至少約34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%或更多。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可以另外包含賦予/jc/、/jc2、和/或/x表型的突變。在某些情況下，賦予/;c/、/W、和/或/x表型的突變是非轉(zhuǎn)基因突變。因而在有些方面，本發(fā)明植物包含賦予降低的Gy3和Gy4表型的突變，和賦予/x八/;c2、和/或"3表型中的一個(gè)或多個(gè)的突變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的植物可以另外包含賦予降低的Gyl、Gy2Gy3和Gy5表型的突變。本發(fā)明也提供了植物部分。本發(fā)明的植物部分包括，但不限于，花粉、胚珠、分生組織、細(xì)胞和種子。本發(fā)明的細(xì)J包還可以包含可再生的細(xì)胞，例如胚分生細(xì)胞，花粉，葉，根，根尖和花。因而，這些細(xì)胞可以用于再生本發(fā)明的植物。本文也提供了本發(fā)明植物的種子部分。因而，從本發(fā)明種子制備的粉碎的種子和粗粉或面粉，也作為本發(fā)明的部分來提供。本發(fā)明還包含制備大豆粗粉或面粉的方法，其包含，粉碎或研磨本發(fā)明的種子。根據(jù)個(gè)實(shí)施方案中，可以將i物定i為包含這樣的植物的i因組。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的大豆粗粉或面粉可以定義為，與從具有相同遺傳背景的植物種子制備的粗粉或面粉相比，包含提高的P-伴大豆球蛋白和降低的大豆球蛋白含量，但是不包含非轉(zhuǎn)基因的突變Gy3和G;^無效等位基因。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)大豆種子的方法，其包含，使本發(fā)明植物與它本身或與第二種大豆植物雜交。因而，該方法可以包含，通過使本發(fā)明植物與第二種不同的大豆植物雜交，制備雜種大豆種子。本發(fā)明的另一個(gè)方面是生產(chǎn)用于人或動(dòng)物消費(fèi)的食品的方法，其包括(a)得到本發(fā)明的植物；(b)栽培該植物至成熟；和(c)從該植物制備食品。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，食品可以是蛋白濃縮物、蛋白分離物、粗粉、油、面粉或者大豆殼。在有些實(shí)施方案中，食品可以包含飲料例如豆?jié){和其它營(yíng)養(yǎng)飲料，泡制食物、沙司、調(diào)味品、色拉調(diào)料、果汁、糖漿、甜食、糖衣和餅餡、軟的冷凍產(chǎn)品、糖食或者半成品食物。從本發(fā)明植物生產(chǎn)的食物可以包含提高的|3-伴大豆球蛋白含量，且因而具有比用典型大豆品種制備的食物更大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另外，包含降低的大豆球蛋白含量的本發(fā)明植物可以用于需要低不溶蛋白量的食物組合物中。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可以另外包含轉(zhuǎn)基因。例如，植物可以包含賦予除草劑耐受性、抗病性、昆蟲和害蟲抗性、改變的脂肪酸、蛋白或糖類代謝、增加的谷粒產(chǎn)量(grainyield)、改變的植物成熟度和/或改變的形態(tài)學(xué)特征的轉(zhuǎn)基因。例如，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因可以包含草甘膦抗性基因。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可以定義為通過下述方法制備，其中使包含賦予Gy3和Gy4無效表型和提高的P-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變的植物與包含農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的植物雜交?？梢詼y(cè)定該雜交的子代的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的特征和Gy3和Gy4蛋白含量，并基于這些特征選擇子代植物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的植物。因而，在某些實(shí)施方案中，可以如下生產(chǎn)本發(fā)明的植物使選擇的起始品種與包含農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的特征的第二種大豆植物雜交。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可以定義為通過下述方法制備，其中使包含賦予/;d、/x2、和/或/;c3表型的非轉(zhuǎn)基因突變的植物與包含降低的Gy3和Gy4蛋白含量和提高的j3-伴大豆球蛋白含量的植物雜交。本發(fā)明也提供了植物育種的方法，其中測(cè)定植物的與G^//Qy2弄Q)^等位基因有關(guān)的大豆植物基因組區(qū)域中多態(tài)性的存在，其包含，選擇植物，和使該植物與第二種大豆植物雜交，以生產(chǎn)子代。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包含如下選擇子代植物測(cè)定植物的與低Gy1/Gy2或Gy4表型有關(guān)的多態(tài)性，和使該植物與第二種大豆植物雜交，以生產(chǎn)其它子代植物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第二種大豆植物可以包含農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的特征。本發(fā)明的方法也可以另外包含，選擇包含所述多態(tài)性和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的特征的大豆植物。因而，本發(fā)明使得能將賦予Gyl/Gy2和/或Gy4表型和提高的種子(3-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變導(dǎo)入農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆植物中。本發(fā)明的方法可以根據(jù)需要重復(fù)1、2、3、4、5、10、15、20或更多次，以在每個(gè)步驟中選擇具有指示在G少〃G少2和/或Qy^等位基因處的非轉(zhuǎn)基因突變的多態(tài)性的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的子代。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第一種大豆植物可以是系B2G2的植物，所述系B2G2是已經(jīng)在ATCC登記號(hào)PTA-6893下保藏的種子的代表樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以另外包含，選擇包含指示在Gj〃Qy2和Qy4等位基因中的非轉(zhuǎn)基因突變的多態(tài)性的植物。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以另外包含，選擇具有指示降低的Gy3和/或Gy5含量的標(biāo)記的植物。因而，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記輔助的植物育種方法可以用于培育具有降低的Gyl、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5含量的大豆。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，賦予降低的Gyl、Gy2或Gy4表型的非轉(zhuǎn)基因突變可以包含在QW、Gy入Qy3或等位基因中的突變。在某些實(shí)施方案中，使用在Gy等位基因的50cM內(nèi)包含多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，檢測(cè)突變Qy等位基因。在本發(fā)明的其它方面，具有降低的Gy1/Gy2表型的植物包含突變G^/等位基因。在有些情況下，突變等位基因包含缺失，例如缺失啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子I和內(nèi)含子I。在其它實(shí)施方案在本P發(fā)明的某些方面，可以用的標(biāo)記檢測(cè)突變Gy/等位;因，i因?yàn)檫@2個(gè)基因緊密連鎖。因而，在本發(fā)明的其它方面，可以用Qy/的標(biāo)記檢測(cè)突變Qy2等位基因。本文表明，具有突變QW,2等位基因的植物也可以具有降低的Gy3表型。因而，在本發(fā)明的有些方面，可以用Gy/或Qy2的標(biāo)記選擇包含降低的Gy3表型的植物，因?yàn)檫@些標(biāo)記已經(jīng)被表明與B2G2衍生植物中降低的Gy3表型有關(guān)。因此，Qy/或Gy2的標(biāo)記，例如NS0199002或NS0199008，可以用于測(cè)定突變、Qy2和G^5等位基因的存在。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，表型上Gy4無效的植物包含突變G;^等位基因。在其它實(shí)施方案中，突變Q^等位基因包含點(diǎn)突變，例如取消翻譯起始密碼子的SNP。在本發(fā)明的其它方面，可以用NS0199003標(biāo)記檢測(cè)Gy4無效等位基因?？梢詸z測(cè)SNP標(biāo)記，例如使用熒光標(biāo)記的寡核香酸。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以另外包含，選擇具有指示降低的脂加氧酶1、2、和/或3含量的標(biāo)記的植物。因而，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記輔助的植物育種的方法可以用于生產(chǎn)具有降低的脂加氧酶1、2、和/或3含量的大豆。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，賦予/W、/x2、和/或/x3表型的非轉(zhuǎn)基因突變可以包含在丄ox/.丄o;c2、和/或丄o;d等位基因中的突變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含在丄ax等位基因的50cM內(nèi)的多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，檢測(cè)賦予/;c/,/x2、和/或/;d表型的突變等位基因。在某些實(shí)施方案中，使用如下面表14所示的INDEL178-180、SNP326、SNP363、SNP380、SNP713、SNP1196、SNP1253、SNP1372、SNP1388、SNPR1527、SNP1554、SNP2267、SNP3088、SNP3125、SNP3139、INDEL3832國(guó)3905、SNP4043、SNP4057、SNP4193、SNP4225、SNP4247、SNP4267、或SNP4439中的一個(gè)或多個(gè)，檢測(cè)/jc/等位基因。在有些實(shí)施方案中，使用如下面表15所示的SNP323、SNP439、SNP1390、SNP1431、SNP1458、INDEL2486-87、或SNP2542中的一個(gè)或多個(gè)，可以檢測(cè)/x2等位基因。SNP2542也稱作NS0203296標(biāo)記。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以另外包含，選擇具有指示KTI-無效或KTI-減少的性狀的標(biāo)記的植物。因而，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記輔蛋白酶抑制劑含量的二豆。；,J"'在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，賦予KTI無效表型的突變可以包含KTI編碼基因中的突變。在具體的實(shí)施方案中，賦予KTI無效表型的突變包含也稱作"KTIA"的KTI3基因中的突變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含在KTI等位基因的50cM內(nèi)的多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，檢測(cè)賦予KTI無效表型的突變等位基因。在某些實(shí)施方案中，使用位于KTI3基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)INDEL或SNP，例如如下面表18中所示的那些，檢測(cè)KTI等位基因。這樣的選擇因而可以基于標(biāo)記信息(植物基因型)，而不是胰蛋白酶活性的酶分析或KTI含量分析。關(guān)于本文所述的任何其它方法或組合物，可以采用在本發(fā)明的方法和/或組合物的上下文中討論的實(shí)施方案。因而，屬于一種方法或組合物的實(shí)施方案，也可以應(yīng)用于本發(fā)明的其它方法和組合物。在說明書或權(quán)利要求書中使用的"一個(gè)/種"可以指一個(gè)/種或多個(gè)/種。如本文在權(quán)利要求書中使用的，當(dāng)與詞語"包含"一起使用時(shí)，詞語"一個(gè)/種"可以指一個(gè)/種或超過一個(gè)/種。本文使用的"另一個(gè)/種"可以指至少第二個(gè)/種或多個(gè)/種。從下面的詳述中，可以明白本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，詳述和具體實(shí)施例盡管指明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但它們僅僅作為解釋來給出，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員從該詳述中可以明白在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾。附圖簡(jiǎn)述下面的附圖構(gòu)成本說明書的一部分，且用于進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的某些方面。參考這些附圖中的一幅或多幅，以及本文所述的具體實(shí)施方案的詳述，可以更好地理解本發(fā)明。圖1:通過SDS-PAGE,分離從指出的大豆品種的種子提取的蛋白，并通過考馬斯染色顯現(xiàn)。指出了每個(gè)基因編碼的酸性大豆球蛋白亞基的遷移率。凝膠分離不足以分離QW編碼的蛋白亞基和Qy2編碼的蛋白亞基。圖2A-B:基于種子的Gy/和G^2編碼的蛋白含量，將包含突變GW和G^2等位基因的子代植物分配成2個(gè)表型組。圖2A.該圖顯示了與由Qy7和Gy2編碼的酸性蛋白組成的總蛋白的百分比(x軸)相比，F(xiàn)2植物的數(shù)目(y軸)。圖2B.來自F2子代植物的數(shù)據(jù)表明，來自B2G2大豆的突變Qyl和Gy2等位基因是隱性的。對(duì)2個(gè)類別中具有Gy/和Qy2編碼的蛋白水平的子代植物的數(shù)目進(jìn)行卡方分析，且在每種情況下測(cè)定概率值。圖3A-B:基于Gy3種子中總蛋白的百分比，將"11S無效"植物的子代分配成2個(gè)群體。圖3A.該圖顯示了與由Gy3編碼的蛋白組成的總蛋白的百分比(x軸)相比，F(xiàn)2植物的數(shù)目(y軸)。圖3B.來自子代植物的數(shù)據(jù)表明，來自B2G2大豆的突變G少3等位基因是隱性的。對(duì)2個(gè)類別中具有G;z3編碼的蛋白水平的子代植物的數(shù)目進(jìn)行卡方分析，且在每種情況下測(cè)定概率值。圖4:Qy3編碼的蛋白的量與Gy/和Qy2編碼的蛋白的量正相關(guān)。圖4A.該圖繪制了觀察到的Qy/和Qy2編碼的酸性蛋白的量(x軸)對(duì)Qy3編碼的蛋白的量(y軸)的圖。圖4B.該表顯示了Gy/、Gy2、Qy3、G;^和Gy5編碼的蛋白的表達(dá)水平之間的相關(guān)系數(shù)。圖5:基于Gy4種子中總蛋白的百分比，將11S無效植物的子代分配成2個(gè)群體。圖5A.該圖顯示了與由Gy^編碼的酸性蛋白組成的總蛋白的百分比(x軸)相比，F(xiàn)2植物的數(shù)目(y軸)。圖5B.來自子代植物的數(shù)據(jù)表明，來自B2G2大豆的突變G盧等位基因是隱性的。對(duì)2個(gè)類別中具有G^/編碼的蛋白水平的子代植物的數(shù)目進(jìn)行卡方分析，且在每種情況下測(cè)定纟既率值。圖6A-B:大豆種子中大豆球蛋白的降(氐的表達(dá)與(3-伴大豆球蛋白的提高的表達(dá)相關(guān)。圖6A.該圖繪制了Gy等位基因編碼的總蛋白的百分比(x軸)對(duì)Cgy等位基因編碼的總蛋白的百分比(y軸)的圖。圖6B.該表顯示了Gy編碼的蛋白的表達(dá)和Cgy/"編碼的蛋白的表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)。圖7A-B:基因組Gj;標(biāo)記有效地選擇生產(chǎn)具有高(3-伴大豆球蛋白表達(dá)的種子的常規(guī)植物。圖7A.該圖繪制了種子的總(3-伴大豆球蛋白蛋白含量(y軸)對(duì)總種子大豆球蛋白含量(x軸)的圖。菱形指示通過大豆球蛋白亞基的蛋白分析選擇的植物。圖7B.該圖與圖7A相同，但是菱形指示通過標(biāo)記NS0199002、NS0199003和NS0199008選擇的植物。圖8:為在位置2542處的SNP設(shè)計(jì)的Taqman測(cè)定的Allelogram(標(biāo)記NS0203296)。如圖8所示，該標(biāo)記允許清楚地區(qū)分來自/jc2突變體的"A"等位基因和來自如實(shí)施例13和表15所述野生型的"T"等位基因。圖9:Kimitz胰蛋白酶抑制劑的序列比對(duì)顯示了Kunitz無效突變系中的缺失/插入。解釋性實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了植物和生產(chǎn)植物的方法，所述植物包含賦予Gy3和Gy4無效表型和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的非轉(zhuǎn)基因突變。這些突變賦予突變植物種子低大豆球蛋白和高(3-伴大豆球蛋白含量。因而，本發(fā)明植物將具有巨大價(jià)值，因?yàn)镻-伴大豆球蛋白提供比大豆球蛋白改善的營(yíng)養(yǎng)特征和溶解度。另外，本文提供的植物包含農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征，使得能夠?qū)崿F(xiàn)商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量的高P-伴大豆球蛋白、低大豆球蛋白的大豆。在本發(fā)明的某些方面，具有提高的P-伴大豆球蛋白含量的植物包含非轉(zhuǎn)基因的Gy3和/或Gy4無效等位基因，且因此與在這些基因座處含有對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因等位基因的大豆品種相比，具有減少的政府管理的額外優(yōu)點(diǎn)。也提供了另外包含非轉(zhuǎn)基因的Gy/和G^2無效等位基因且也提供了這樣的益處的植物。本發(fā)明也提供了植物和生產(chǎn)植物的方法，所述植物包含賦予脂加氧酶-2無效表型的非轉(zhuǎn)基因突變。脂加氧酶-2無效和大豆球蛋白無效表型的組合，提供提高的含量的高功能性和健康的p-伴大豆球蛋白蛋白。卩-伴大豆球蛋白尤其含有負(fù)責(zé)降低膽固醇和體重管理(通過飽滿感效應(yīng)和脂肪沉積的減少)益處的生物活性肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)有價(jià)值的組合是脂加氧酶-2無效的且中等油酸的含量(辨如40-65%油酸)。這樣的大豆將產(chǎn)生低水平的臭氣，因?yàn)樗狈χ愌趸闹饕呋瘎?脂加氧酶-2)，且具有低得多水平的底物(亞油酸)。另外，這樣的大豆將具有改良的(更低的)-6/0)-3脂肪酸比，這對(duì)心血管健康是有益的。本文還提供了培育大豆植物的方法，所述大豆植物包含賦予降低的Gyl、Gy2、Gy3和Gy4表型和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的非轉(zhuǎn)基因突變。下面詳述的研究鑒別出可以用于鑒別具有降低的Gyl、Gy2、Gy3和Gy4蛋白含量的植物的多態(tài)性。在本文中鑒別出的3個(gè)標(biāo)記，NS0199002、NS0199003和NS0199008,可以用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)大豆植物的降^氐的Gyl、Gy2、Gy3和Gy4表型。如下面所證實(shí)的，Gy/和Qy2的遺傳在遺傳上連鎖，因而Gy/(NS0199008)或Gy2(NS0199002)的標(biāo)記可以用于跟蹤降低的Gyl和Gy2表型的遺傳。另外，如圖4所示，降低的Gyl,2表型與降低的Gy3表型密切相關(guān)。因而，QW,2的標(biāo)記(例如NS0199008和記可以用于i別編碼的蛋白在表型上無效的植物。例如，NSO199003標(biāo)記用于研究中，來精確測(cè)定大豆植物的Gy4表型。因而，通過使用(&/,2,3標(biāo)記與Gy4遺傳標(biāo)記的組合，本發(fā)明使得能實(shí)現(xiàn)具有賦予降低的Gyl、Gy2、Gy3和Gy4表型和高種子p-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變的植物的高通量篩選和標(biāo)記輔助育種。在本文中還采用測(cè)序研究，其已經(jīng)鑒別出可以用于測(cè)定降低的Gy5表型的遺傳和直接選擇降低的Gy3表型的標(biāo)記。還提供了培育大豆植物的方法，所述大豆植物包含賦予降低的脂加氧酶-2表型的非轉(zhuǎn)基因突變。例如，下面描迷的研究鑒別出大豆中與脂加氧酶-2無效(/jc2)表型有關(guān)的序列變異。已經(jīng)為/jc2表型的這些序列變異開發(fā)出了分子標(biāo)記。使用這些與脂加氧酶-2無效性狀有關(guān)的標(biāo)記，育種人可以作出基于標(biāo)記信息或基因型的選擇，而不是基于通過SDS-PAGE進(jìn)行的脂加氧酶分析。標(biāo)記數(shù)據(jù)是更節(jié)省成本的、快速且可靠的，使得能夠測(cè)試更大的數(shù)目和鑒別具有多種性狀(辨*脂加氧酶-2無效和大豆球蛋白-無效)的優(yōu)良系。I.本發(fā)明的植物本發(fā)明首次提供了大豆品種植物和其衍生物，其組合了賦予Gy3和Gy4無效表型和提高的(3-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變與農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的表型。在有些實(shí)施方案中，這樣的植物可以另外包含非轉(zhuǎn)基因的Gy/和Qy2無效等位基因。這樣的植物可以定義為具有商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量，例如，定義為對(duì)照系(checkline)AG2703和DKB23-51的至少103%的產(chǎn)量。在某些其它實(shí)施方案中，提供了包含非轉(zhuǎn)基因的Gy/一突變等位基因和提高的(3-伴大豆球蛋白含量和這些系的至少約90%、94%、98%、100%、105%或約110%的谷粒產(chǎn)量的植物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以將這樣的植物定義為在至少10種環(huán)境中具有超過每英畝約35、37、39、41、43或45蒲式耳的產(chǎn)量。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物種子的(3-伴大豆球蛋白含量可以大于約34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、4P/q、42%、43%、44%、450/。、460/0、47%、48%、49%、或甚至50%或其中可推導(dǎo)出的任意范圍。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物可以另外包含賦予/jc7、/;c2、和/或/;d表型的突變。本發(fā)明的一方面因此涉及前述植物和其部分和使用這些植物和植物部分的方法。植物部分包括，但不限于，花粉、胚珠和細(xì)胞。本發(fā)明還提供了這些植物的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物再生能夠表達(dá)起始品種的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的大豆植物。此類可再生的細(xì)胞可以包括胚、分生細(xì)胞、花粉、葉、根、根尖或者花，或者從其得到的原生質(zhì)體或愈傷組織。本發(fā)明還提供了從此類組織培養(yǎng)物再生的大豆植物，其中該植物能夠表達(dá)用以得到所述可再生細(xì)胞的起始植物品種的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。II.用于產(chǎn)生具有非轉(zhuǎn)基因的突變Gv等位基因和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良表型的大豆品種的標(biāo)記輔助的選擇本發(fā)明提供了遺傳標(biāo)記和將非轉(zhuǎn)基因的突變G;/等位基因?qū)朕r(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆植物的方法。本發(fā)明因此首次允許產(chǎn)生組合這些賦予高種子(3-伴大豆球蛋白含量的突變G少等位基因與商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量和農(nóng)學(xué)優(yōu)良的遺傳背景的植物。使用本發(fā)明的方法，賦予"11S無效"表型的基因座可以導(dǎo)入所需大豆遺傳背景中，例如，在產(chǎn)生具有商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量和高種子(3-伴大豆球蛋白含量的新品種中。標(biāo)記輔助的漸滲現(xiàn)象涉及將來自一種種質(zhì)的一種或多種標(biāo)記定義的染色體區(qū)域轉(zhuǎn)移到第二種種質(zhì)。該方法中的最初步驟是通過基因作圖對(duì)性狀進(jìn)行定位，基因作圖是通過連鎖分析確定基因相對(duì)于其它基因和遺傳標(biāo)記的位置的方法。連鎖作圖的基本原理是染色體上的兩個(gè)基因越近，它們一起遺傳的可能性越高。簡(jiǎn)言之，通常在兩種遺傳上相容的但是相對(duì)于研究中的性狀趨異的親本之間進(jìn)行雜交。然后可以用遺傳標(biāo)記跟蹤雜交所得的子代，通常為回交(BC1),F2,或者重組近交群體中所研究的性狀的分離。術(shù)語數(shù)量性狀基因座或者QTL用于描述基因組的區(qū)域，該區(qū)域?qū)Ρ硇惋@示出數(shù)量或者加性效應(yīng)。Gy基因座代表示例性的QTL,因?yàn)槎鄠€(gè)突變等位基因?qū)е路N子大豆球蛋白總含量的日益降低和(3-伴大豆球蛋白含量的重要的伴隨增加。本文鑒別出了非轉(zhuǎn)基因的突變Gy等位基因的遺傳標(biāo)記，其使得能夠用農(nóng)學(xué)上優(yōu)異的植物培育包含非轉(zhuǎn)基因的突變Gy等位基因的大豆植物，并選擇遺傳了突變Gy等位基因的子代。因而，本發(fā)明允許使用分子工具來組合這些QTL與所需農(nóng)學(xué)特征。還鑒定了非轉(zhuǎn)基因的突變/義7和/jc2等位基因的遺傳標(biāo)記，其使得能培育包含非轉(zhuǎn)基因的突變/;c/和/x2等位基因之一或二者的大豆植物，并選擇遺傳了一個(gè)或多個(gè)突變/x等位基因的子代。具有減少的脂加氧酶的大豆植物本身是有用的，且可以與其它農(nóng)學(xué)特征組合使用。例如，降低的脂加氧酶和降低的大豆球蛋白是有價(jià)值的性狀組合。另一種有價(jià)值的組合是降低的脂加氧酶和中等油酸含量(辨如40-65%油酸)。因而，本發(fā)明允許使用分子工具來在如上所述的農(nóng)學(xué)上優(yōu)異的植物中組合/義等位基因與例如突變Gy等位基因。A.連鎖的遺傳標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用可以對(duì)樣品第一植物群體確定遺傳的遺傳標(biāo)記的基因型以形成基因型數(shù)據(jù)庫。本文使用的"遺傳的遺傳標(biāo)記"是單個(gè)基因座上的等位基因?；蜃侨旧w上的位置，并且等位基因指這些基因座上基因的狀況，即不同的核普酸序列。每個(gè)基因座的標(biāo)記等位基因組成可以是純合或者雜合的。為了在雜交中從遺傳標(biāo)記得到信息，標(biāo)記必須是多態(tài)的；即它必須以不同的形式存在，從而攜帶突變基因的染色體可以通過它攜帶的標(biāo)記的形式與具有正?；虻娜旧w區(qū)分開來。通過直接觀察來自樣品植物的人工或者自然自花傳粉的子代的一種或多種性狀或者通過定量評(píng)估樣品植物的組合能力可完成基因型數(shù)據(jù)庫的形成。例如，；隨物系可以與一種或多種測(cè)交品系(tester)雜交或者被一種或多種測(cè)交品系雜交。測(cè)交品系可以是近交系、單交雜種、雙交雜種或者多交雜種，或者通過受控制的或者自由交配產(chǎn)生或維持的植物的任何其它集聚，或者其任意組合。對(duì)于一些自花傳粉植物，優(yōu)選直接評(píng)估，而不用子代測(cè)試?？梢栽跍y(cè)交世代和作圖的標(biāo)記基因座中確定標(biāo)記基因型。為了通過連鎖方法對(duì)特定性狀作圖，必須在特定染色體基因座的遺傳和性狀的遺傳之間確立正相關(guān)。對(duì)于復(fù)合遺傳，如數(shù)量性狀，具體包括大豆球蛋白含量和產(chǎn)量，連鎖通常將更難以辨別。在該情況中，可以需要統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來確立表型和基因型之間的相關(guān)。這還必須檢查來自特定雜交的許多子代，因?yàn)閱蝹€(gè)基因座可以具有對(duì)總體表型的小貢獻(xiàn)。特定性狀和標(biāo)記的共同遺傳(coinheritance)或者遺傳連鎖提示，它們?cè)谌旧w上物理上相互接近。通過分析雜交中基因和標(biāo)記的遺傳才莫式來確定連鎖。遺傳圖距離的單位是厘摩(cM),它隨著重組的增加而增加。兩個(gè)標(biāo)記如果在減數(shù)分裂中在它們必須重組的每100次機(jī)會(huì)中重組約一次，那么它們相距l(xiāng)厘摩。厘摩是一種遺傳度量，不是物理度量。位于與笫二種基因座小于50cM的那些標(biāo)記被認(rèn)為是遺傳連鎖的，因?yàn)樗鼈儾幌嗷オ?dú)立地遺傳。從而，每代在基因座之間觀察到的重組百分比將小于50%。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，使用的標(biāo)記可以定義為與基因座相距小于約45、35、25、15、10、5、4、3、2、或1或更小的cM。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用檢測(cè)有貢獻(xiàn)的基因座自身內(nèi)的多態(tài)性、并從而對(duì)于所述基因座位于0cM處的標(biāo)記，例如，包含QW、Qy2、Qy3、或Qy5編碼序列或者調(diào)節(jié)元件內(nèi)的突變。在減數(shù)分裂期間，同源染色體對(duì)聚到一起并且在稱作重組的過程中交換片段。標(biāo)記越是遠(yuǎn)離基因，基因和該標(biāo)記之間重組的機(jī)會(huì)越大。在連鎖分析中，在特定雜交中跟蹤標(biāo)記和基因或性狀的共同遺傳。計(jì)算它們觀察到的遺傳模式可以僅僅偶然發(fā)生，即它們完全不連鎖的概率。重復(fù)該計(jì)算，假定具體的連鎖程度，并確定兩種概率(無連鎖對(duì)特定的連鎖程度)的比率。該比率表達(dá)了是(及不是)所述連鎖程度的可能性，并且因?yàn)槭褂昧吮嚷实膶?duì)數(shù)，所以它被稱為可能性對(duì)數(shù)，例如，/od評(píng)分。例如，等于或者大于3的/od評(píng)分用于證實(shí)基因和標(biāo)記連鎖。這代表兩個(gè)基因座連鎖的1000:l可能性。通過使用利用程序的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析極大地促進(jìn)了連鎖計(jì)算。通過基因作圖模型可以確立標(biāo)記分子的遺傳連鎖，所述基因作圖模型諸如^f旦不限于，Lander和Botstein(1989)才艮導(dǎo)的側(cè)翼標(biāo)記才莫型，和基于Lander和Botstein(1989)描述的最大似然法并且用軟件包MAPMAKER/QTL實(shí)現(xiàn)的區(qū)間作圖。其它的軟件包括Qgene,版本2.23(1996)(DepartmentofPlantBreedingandBiometry,266EmersonHall,CornellUniversity,Ithaca,NY)。B,遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記包括兩個(gè)或更多個(gè)植物攜帶的遺傳信息中檢測(cè)得到的差異(多態(tài)性)。用遺傳標(biāo)記對(duì)基因座的遺傳作圖通常需要兩個(gè)基本的組分可檢測(cè)的多態(tài)性等位基因和那些等位基因的重組或者分離。在植物中，測(cè)量的重組事實(shí)上總是減數(shù)分裂的，且因此，植物基因作圖的兩個(gè)遺傳需求是多態(tài)性遺傳標(biāo)記，和其中所述那些等位基因是分離的一種或多種植物。標(biāo)記優(yōu)選以共顯性方式遺傳，從而可以容易地檢測(cè)在二4咅體基因座上兩種等位基因的存在，并且它們沒有環(huán)境變異，即它們的遺傳率為1。二倍體生物如大豆中標(biāo)記基因型通常在每個(gè)基因座上包含兩個(gè)標(biāo)記等位基因。每個(gè)基因座的標(biāo)記等位基因組成可以是純合或雜合的。純合性是其中基因座上的兩個(gè)等位基因的特征是相同的核苷酸序列的情形。雜合性指基因座上該基因的不同的情形。許多不同的標(biāo)記類型可以用于遺傳作圖。用于本發(fā)明的示例性遺傳標(biāo)記類型包括但不限于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、核普酸插入和/或缺失(INDEL)和同工酶?？梢砸远喾N方式測(cè)定包含小至單個(gè)核苷酸改變的多態(tài)性。例如，通過電泳技術(shù)可以進(jìn)行檢測(cè)，所述技術(shù)包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Orita等，1989)、變性梯度凝膠電泳(Myers等，1985),或者切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性(LifeTechnologies,Inc.,Gathersberg,MD20877),但是DNA測(cè)序機(jī)器的普遍可用性常常使得僅僅直接測(cè)序擴(kuò)增的產(chǎn)物更容易。一旦多態(tài)性序列差異是已知的，就可以設(shè)計(jì)快速測(cè)定用于子代測(cè)試，通常包括某種形式的特定等位基因的PCR擴(kuò)增(PASA,Sommer,等，1992),或者多個(gè)特定等位基因的PCR擴(kuò)增(PAMSA,Dutton和Sommer,1991)。檢測(cè)DNA樣品中SNP的一種方法是，使用PCR與多態(tài)性的熒光探針的組合，如在本文中引作參考的Livak爭(zhēng)，1995和美國(guó)專利號(hào)5,604,099所述。簡(jiǎn)而言之，合成2個(gè)探針寡核苷酸，其中的一個(gè)退火至SNP位點(diǎn)，且另一個(gè)退火至野生型序列。優(yōu)選地，SNP的位點(diǎn)接近探針寡核苷酸的5，末端。然后用非焚光猝滅劑和小溝結(jié)合部分(它們分別降低背景熒光和降低寡核苷酸的Tm)在3'末端標(biāo)記每個(gè)探針。用不同熒光染料標(biāo)記每個(gè)探針的5'末端，其中熒光依賴于從探針切割下來的染料。這樣的染料的有些非限制性實(shí)例包括VICTM和6-FAMTM。然后對(duì)被懷疑包含給定SNP的DNA進(jìn)行PCR,使用具有5'-3'外切核酸酶活性的聚合酶和側(cè)翼引物。在有兩種探針寡核苷酸存在下，進(jìn)行PCR。如果探針結(jié)合試驗(yàn)DNA中的互補(bǔ)序列，則聚合酶的外切核酸酶活性釋放出熒光標(biāo)記，激活它的焚光活性。因此，僅含有野生型序列的試驗(yàn)DNA將表現(xiàn)出與野生型探針上的標(biāo)記有關(guān)的熒光。另一方面，僅含有SNP序列的DNA將具有來自SNP探針上的標(biāo)記的熒光活性。但是，在DNA來自異質(zhì)來源的情況下，將觀察到兩種標(biāo)記的明顯熒光。在已知SNP位點(diǎn)處的這類間接基因型分型，使得能高通量地、廉價(jià)地篩選DNA樣品。因而，對(duì)于包含突變Gy等位基因的子代大豆植物的鑒別，這樣的系統(tǒng)是理想的。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)是DNA經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶消化后，一般通過瓊脂糖凝膠電泳揭示出的DNA片段長(zhǎng)度可以檢測(cè)的遺傳差異?？梢岳枚喾N限制性內(nèi)切核酸酶，其特征是它們的核苷酸切割位點(diǎn)和它們的來源，例如，EcoRI。RFLP來自限制位點(diǎn)序列內(nèi)的單個(gè)堿基對(duì)多態(tài)性和給定限制片段內(nèi)的可測(cè)量的插入或者缺失。RFLP是容易和相對(duì)廉價(jià)產(chǎn)生的(需要克隆的DNA,但是不需要序列)，并且是共顯性的。RFLP的缺點(diǎn)是在分型階段是勞動(dòng)密集型的，盡管這可以通過許多任務(wù)的復(fù)合(complexing)和印跡的再利用在一定程度上減輕。大多數(shù)RFLP是雙等位基因(biallelic)的，并且比微衛(wèi)星具有更小的多態(tài)性含量。由于該原因，在植物遺傳學(xué)圖中RFLP的使用已經(jīng)減少。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多類型的分子標(biāo)記可以用作監(jiān)控基因遺傳的工具，并且不限于RFLP、SSR和SNP,并且技術(shù)人員將還理解，可以用多種片企測(cè)方法來跟蹤多種分子標(biāo)記。本領(lǐng)域才支術(shù)人員將還認(rèn)識(shí)到，不同類型的標(biāo)記可以用于作圖，特別是隨著技術(shù)的發(fā)展和鑒定出了新類型的標(biāo)記和筌定方法。為了方便的目的，可以將遺傳的標(biāo)記基因型轉(zhuǎn)化成數(shù)字得分，例如，如果使用特定酶，在特定基因座上有稱作A和B的兩種形式的SNP,或者其它標(biāo)記，那么可以將二倍體套轉(zhuǎn)化成數(shù)字得分，例如，為AA=2,AB=1，和BB二0;或AA4，AB=0和BB=-1。得分的絕對(duì)值不是重要的。重要的是數(shù)字標(biāo)記的加性性質(zhì)。上面的得分涉及共顯性標(biāo)記?？梢越o予類似的評(píng)分系統(tǒng)，其與顯性標(biāo)記相一致。C.標(biāo)記輔助的選擇本發(fā)明提供了具有提高的(3-伴大豆球蛋白含量組合商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的大豆植物。此類植物可以根據(jù)本發(fā)明通過標(biāo)記輔助的選擇方法產(chǎn)生，所述方法包括，測(cè)定基因組DNA中與非轉(zhuǎn)基因的突變Qy/、Qy入Qy3>Qy么或Qy5等位基因包括其所有可能的組合遺傳連鎖的標(biāo)記的存在。本發(fā)明也提供了具有降低的脂加氧酶含量的大豆植物。這樣的植物可以根據(jù)本發(fā)明通過標(biāo)記輔助的選擇方法產(chǎn)生，所述方法包括，測(cè)定基因組DNA中與非轉(zhuǎn)基因的突變/ox八丄o:c2、或Lox3等位基因包括其所有可能的組合遺傳連鎖的標(biāo)記的存在。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可能需要得到與G少等位基因連鎖的額外標(biāo)記。這可以例如如下進(jìn)行首先通過自交Fi雜種制備F2群體，所述Fi雜種通過近交品種的雜交產(chǎn)生，所述近交品種中僅一個(gè)包含賦予降低的大豆球蛋白含量的突變Gy等位基因。然后可以制備重組近交系(RIL)(遺傳上相關(guān)的系；通?！礔s,從朝純合性連續(xù)自交F2系開發(fā))，并將其用作作圖群體。從顯性標(biāo)記得到的信息可以通過使用RIL最大化，因?yàn)樗谢蜃际羌兒系幕蛘呓咏兒系?。也可能需要得到與丄ox等位基因連鎖的額外標(biāo)記。這可以例如如下進(jìn)行首先通過自交F!雜種制備F2群體，所述Fi雜種通過近交品種的雜交產(chǎn)生，所述近交品種中僅一個(gè)包含賦予降低的脂加氧酶含量的突變丄o;c等位基因。如上所述，然后可以制備重組近交系，并將其用作作圖群體，且從顯性標(biāo)記得到的信息可以通過使用RIL最大化，因?yàn)樗谢蜃际羌兒系幕蛘呓咏兒系?。本發(fā)明也提供了具有降低的含量的KTI、例如KTI無效性狀的大豆植物，其可以通過標(biāo)記輔助的選擇來得到，并與商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征組合提供。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以將這樣的植物定義為在至少IO種環(huán)境中具有超過每英畝約35、37、39、41、43或45蒲式耳的產(chǎn)量。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于這樣的標(biāo)記輔助的選擇的標(biāo)記可以包括SNP或INDEL。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)INDEL可以存在于編碼Kunitz胰蛋白酶抑制劑的基因中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記可以包含在編碼Kunitz胰蛋白酶抑制劑的基因(SEQIDNO:167)的位置622-623處的缺失和/或在位置664處的插入，如圖9所示，且所述植物可以根據(jù)本發(fā)明通過標(biāo)記輔助的選擇方法產(chǎn)生，所述方法包括，測(cè)定基因組DNA中這種標(biāo)記的存在。攜帶以前不存在的性狀的回交群體(例如從所需的品種(回歸親本)和另一品種(供方親本)之間的雜交產(chǎn)生)也可以用作作圖群體?？梢赃M(jìn)行與回歸親本的一系列回交以恢復(fù)其所需的性狀的大多數(shù)。從而，產(chǎn)生由與回歸親本相似的個(gè)體組成的群體，但是每個(gè)個(gè)體攜帶來自供方親本的不同量的基因組區(qū)域。如果回歸親本中的所有基因座都是純合的并且供方親本和回歸親本具有對(duì)比多態(tài)性標(biāo)記等位基因，那么回交群體可以用于顯性標(biāo)記作圖(Reiter等，1992)。用于作圖目的的有用的群體是近等基因系(NIL)。通過多次回交以產(chǎn)生一系列個(gè)體來產(chǎn)生NIL,所述個(gè)體除了所需的性狀或者基因組區(qū)域外在遺傳組成上接近相同，其可以用作作圖群體。在用NIL作圖中，預(yù)期僅部分多態(tài)性基因座作圖到所選的區(qū)域。也可以在轉(zhuǎn)化的植物系上進(jìn)行作圖。D.植物育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的某些方面提供了標(biāo)記輔助的植物育種的方法，其使得能將非轉(zhuǎn)基因的突變Gy等位基因?qū)氘愒创蠖惯z傳背景中。本發(fā)明的某些方面還提供了標(biāo)記輔助的植物育種的方法，其使得能將非轉(zhuǎn)基因的突變/ox等位基因?qū)氘愒创蠖惯z傳背景中。一般而言，育種技術(shù)利用了植物的傳粉方法。有兩種一般的傳粉方法自花傳粉，其在如果來自一朵花的花粉轉(zhuǎn)移到相同植物的相同或者另一朵花時(shí)發(fā)生；和異花傳粉，其在如果花粉來自不同植物上的花時(shí)發(fā)生。已經(jīng)自花傳粉并且對(duì)許多世代進(jìn)行類型選擇的植物在幾乎所有基因座上都純合，并且產(chǎn)生真實(shí)育種子代的均一群體，純合植物。在合適的品種的開發(fā)中，可以使用系譜育種。特定性狀的系譜育種方法涉及雜交兩種基因型。每種基因型可以具有另一種基因型中缺乏的一種或多種所需的特征；或者每種基因型可以與另一種互補(bǔ)。如果兩種最初的親本基因型不提供所有所需的特征，那么在育種群體中可以包括再次^交。'每個(gè)連續(xù)世代由于自花傳粉和選擇而變得更:質(zhì):通常，這種育種方法涉及5代或者更多代的自交和選擇Si—S2;S2~>S3;S3—S4;S4—Ss等等。自交的世代(S)可以被認(rèn)為是一種類型的雜交后代(F)并且同樣命名為F。至少5代后，認(rèn)為近交植物是遺傳上純的。每個(gè)育種程序?qū)ㄓN過程效率的周期性的客觀評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依賴于目標(biāo)和目的而變。將有希望的較晚育種系在代表商業(yè)靶區(qū)域的環(huán)境中充分測(cè)試并與合適的標(biāo)準(zhǔn)一般比較3年或更多年。難以筌定遺傳上優(yōu)異的個(gè)體，因?yàn)榛祀s的植物性狀或者環(huán)境因素可以掩蓋基因型值。鑒定優(yōu)異植物的一種方法是觀察其相對(duì)于其它實(shí)驗(yàn)植物和一種或多種廣泛栽培的標(biāo)準(zhǔn)品種的性能。單次觀察可能是不確定的，但是重復(fù)觀察提供了對(duì)遺傳價(jià)值的更好的估計(jì)?；旌线x擇和輪回選擇可以用于改進(jìn)自花或者異花傳粉的農(nóng)作物的群體。通過幾種不同親本的互交可以筌定或者產(chǎn)生雜合個(gè)體的遺傳變異群體。基于個(gè)體優(yōu)越性、杰出的子代或者卓越的組合能力選擇最好的植物。將所選的植物互交以產(chǎn)生新的群體，其中繼續(xù)其它輪的選擇。關(guān)于常用于不同性狀和農(nóng)作物的其它育種方法的描述可以見幾種參考書籍之一(例如，Allard,1960;Simmonds,1979;Sneep等，1979;Fehr，1987a，b)。在育種程序中對(duì)具有目的性狀(例如，高產(chǎn)量、抗病性、脂肪酸譜)的基因型的選擇的有效性將取決于l)群體中個(gè)體植物的目的性狀的變異性是遺傳因素的結(jié)果并且從而傳遞到所選基因型的子代的程度；和2)植物中目的性狀中多少變異性是由于不同基因型所生長(zhǎng)的環(huán)境。性狀的遺傳范圍為通過一種主要基因控制(其表達(dá)不受環(huán)境的影響(即，質(zhì)量性狀))到受到許多基因的控制(其效果受到環(huán)境的很大影響(即數(shù)量性狀))。對(duì)于數(shù)量性狀如產(chǎn)量的育種的其它特征是如下事實(shí)l)每種基因的作用導(dǎo)致的差異是小的，從而使得難以或者不可能單獨(dú)地鑒定它們；2)有助于一種性狀的基因的數(shù)目很大，從而很少(如果得到的話)得到不同的分離比；和3)基因的作用可以基于環(huán)境變異以不同方式表達(dá)。因此，具有目的性狀的超親分離物(transgressivesegragate)或者優(yōu)異基因型的準(zhǔn)確鑒定極端困難，并且它的成功取決于植物育種者使得影響群體中數(shù)量性狀的表達(dá)的環(huán)境變異最小化的能力。隨著組合到一種基因型的性狀的數(shù)目的增加，鑒定超親分離子的可能性很快減小。例如，如果在三種復(fù)雜性狀(如產(chǎn)量、(3-伴大豆球蛋白含量和至少笫一種農(nóng)學(xué)性狀)有差別的栽培種之間進(jìn)行雜交，那么不用分子工具極其難以通過將三種性狀的每一種的最大數(shù)目的有利基因重組到一個(gè)基因型中同時(shí)回收。因此，所有育種者一般所希望的是得到除所選基因外到一個(gè)基因型中的第一種復(fù)雜性狀的基因的有利分配與第二種性狀的基因的有利分配組合。回交是轉(zhuǎn)移特定所需性狀的有效方法。這可以通過例如首先將優(yōu)異品種近交系(inbred)(A)(回歸親本)與供方近交系(非回歸親本)雜交來實(shí)現(xiàn)，所述供方近交系攜帶對(duì)于研究中的性狀合適的基因(Fehr，1987)。然后將該雜交的子代與優(yōu)異回歸親本(A)回交，接著在所得子代中選擇將從非回歸親本轉(zhuǎn)移的所需性狀。這種選擇可以基于如下面提到的遺傳測(cè)定，或者備選地，可以基于子代植物的表型。經(jīng)過5或者更多回交世代選擇所需的性狀后，子代對(duì)于控制正轉(zhuǎn)移的性狀的基因座是雜合的，但是對(duì)于大多數(shù)或者幾乎所有其它基因與優(yōu)異親本相似。將回交的最后世代自交，或者同胞交配，以得到所轉(zhuǎn)移的基因(例如，提供具有降低的種子大豆球蛋白含量的植物的基因座)的純育子代。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，回交轉(zhuǎn)變的方法可以定義為包括下面步驟的方法(a)將含有一種或多種所需的基因、DNA序列或者元件(如與降低的種子大豆球蛋白含量有關(guān)的突變Gy7、Gy2、G_y3、G^和/或G^5等位基因)的第一種基因型的植物與缺乏所述所需的基因、DNA序列或者元件的第二種基因型的植物雜交；(b)選擇含有所述所需的基因、DNA序列或者元件的一種或多種子代植物；(c)將所述子代植物與第二種基因型的植物雜交；并(d)重復(fù)步驟(b)和(c),以用于將來自第一種基因型的植物的所述所需的基因、DNA序列或者元件轉(zhuǎn)移到第二種基因型的植物中。特定DNA元件或者一組元件向植物基因型中的漸滲現(xiàn)象定義為回交轉(zhuǎn)變方法的結(jié)果。DNA序列已經(jīng)漸滲入其中的植物基因型可以稱作回交轉(zhuǎn)變的基因型、系、近交系或者雜種。類似地，缺乏所需的DNA序列的植物基因型可以稱作未轉(zhuǎn)變的基因型、系、近交系或者雜種。在育種過程中，與降低的大豆球蛋白含量連鎖的遺傳標(biāo)記可以用于輔助育種，以用于產(chǎn)生具有降低的大豆球蛋白含量、且優(yōu)選提高的P-伴大豆球蛋白含量的大豆植物?；亟缓蜆?biāo)記輔助的選擇尤其可以用于本發(fā)明，以將根據(jù)本發(fā)明的降低的大豆球蛋白含量性狀引入任意品種，這通過用有關(guān)的非轉(zhuǎn)基因的突變QW、G^2、G;/3、G^/和/或Gy5等位基因轉(zhuǎn)變?cè)撈贩N來實(shí)現(xiàn)。合適的回歸親本的選擇是成功的回交過程的重要步驟?；亟灰?guī)程的目的是改變或者代替最初近交系中的性狀或者特征。為了完成該目的，將回歸近交系的一個(gè)或多個(gè)基因座用來自非回歸親本的所需基因修飾或者代替，而保持最初近交系的基本上所有剩余的所需遺傳的，并且因此所需生理學(xué)和形態(tài)學(xué)的構(gòu)成。具體非回歸親本的選擇將取決于回交的目的，其在本發(fā)明的情況中可以為加入賦予降低的大豆球蛋白含量的一種或多種等位基因。確切的回交規(guī)程將取決于被改變的特征或者性狀以確定合適的測(cè)試規(guī)程。盡管當(dāng)被轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時(shí)，回交方法可以簡(jiǎn)化，但也可以轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在該情況中，必須引入子代的測(cè)試以確定是否已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)移了所需的特征。對(duì)于本發(fā)明，可以測(cè)試在回交程序期間產(chǎn)生的子代系的大豆球蛋白含量，例如通過SDS-PAGE/考馬斯染色，以及使用本文描述的標(biāo)記系統(tǒng)來基于標(biāo)記而不是基于視覺性狀選擇系。通過天然或者機(jī)4成4支術(shù)可以雜交大豆植物(大豆(Gcz"ewaxL.))(見例如，F(xiàn)ehr,1980)。通過自花傳粉或者天然異花傳粉在大豆中發(fā)生天然傳粉，其通常得到傳粉生物的幫助。在天然或者人工雜交中，開花和開花時(shí)間是重要的考慮因素。大豆是短日照植物，但是對(duì)光周期的敏感性有相當(dāng)大的遺傳變異(Hamner,1969;Criswell和Hume,1972)。開花的臨界曰長(zhǎng)范圍為對(duì)于適應(yīng)熱帶緯度的基因型的約13小時(shí)到對(duì)于在更高緯度生長(zhǎng)的光周期不敏感的基因型的24小時(shí)(Shibles等，1975)。大豆在出苗(emergence)后9天對(duì)日長(zhǎng)似乎不敏感。需要7到26天的短于臨界日長(zhǎng)的光周期來完成花誘導(dǎo)(Borthwick和Parker,1938;Shanmugasundaram和Tsou,1978)。使用和不使用雌花的去勢(shì)，可以通過用鑷子從雄性親本的花取出雄蕊和雌蕊并對(duì)雌花的柱頭輕輕刷花藥進(jìn)行手工傳粉。通過除去前萼片和龍骨瓣花瓣，或者用閉合的鑷子穿刺龍骨瓣并允許它們打開以推開花瓣可以實(shí)現(xiàn)接近雄蕊。在柱頭上刷花藥導(dǎo)致它們破裂，且當(dāng)在柱頭上清晰可見花粉時(shí)，得到最高百分比的成功雜交?？梢酝ㄟ^在刷柱頭前輕打花藥檢查花粉的脫落。當(dāng)條件不利時(shí)，可能必須使用幾朵雄花以得到合適粉。:二:司:::,、，'、[、、5::,、的雜交，尤其對(duì)于輪回選擇程序(Brim和Stuber,1973)。完全分離雜交區(qū)組(block)所需的距離還不清楚；然而，當(dāng)雄性不育植物與外來花粉來源為12m或者更遠(yuǎn)時(shí)，異型雜交小于0.5%(Boerma和Moradshahi,1975)。雜交區(qū)組的邊界上的植物與外來花粉維持最多的異型雜交并且可以在收獲時(shí)將其除去以使污染最小化。一旦收獲，就通常將豆莢在至多38°C的溫度下風(fēng)干，直到種子含有13%水分或者更小，然后手工取出種子。如果相對(duì)濕度為50%或者更低，則可以將種子在約25。C下令人滿意的保存最長(zhǎng)達(dá)1年。在濕潤(rùn)氣候中，萌發(fā)百分比快速降低，除非種子被干燥到7%水分并且在密封容器中室溫下保存。通過將種子干燥到7%水分并將其在10°C或更低在維持50%相對(duì)濕度的房間或者在密封容器中保存最好地完成了在任何氣候中的長(zhǎng)期保存。m.用于修飾和改進(jìn)大豆品種的性狀在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的大豆植物可以包含一種或多種轉(zhuǎn)基因。此類轉(zhuǎn)基因的一個(gè)實(shí)例賦予除草劑抗性。通常的除草劑抗性基因包括賦予草甘膦抗性的EPSPS基因，賦予對(duì)卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptn)基因(Fraley等，1983),賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(VandenElzen等，1985)，賦予對(duì)草銨膦或者broxynil的抗性的基因(Comai等,1985;Gordon-Kamm等,1990;Stalker等，1988),如二氫葉酸還原酶和乙酰乳酸合酶(Eichholtz等，1987,Shah等，1986,Charest等，1990)。其它實(shí)例包括賦予對(duì)咪唑啉酮類(imidazalinone)或者磺酰脲類的抗性的突變ALS和AHAS酶(Lee等，1988;Miki等，19卯)、賦予膦絲菌素抗性的膦絲菌素-乙酰-轉(zhuǎn)移酶基因(歐洲申請(qǐng)0242246)、賦予苯氧基丙酸和環(huán)己酮(cycloshexones)如稀禾定(sethoxydim)和p比氟氯禾靈的抗性的基因(Marshall等，1992);和賦予對(duì)三。秦的抗性的基因(psbA和gs+基因)和對(duì)千腈抗性的基因(腈水解酶基因)(Przibila等，1991)。本發(fā)明的植物還可以包含賦予對(duì)昆蟲、害蟲、病毒或者細(xì)菌攻擊的抗性的基因。例如，賦予對(duì)害蟲如大豆胞嚢線蟲的抗性的基因在PCT申請(qǐng)WO96/30517和PCT申請(qǐng)W093/19181中描述。Jones等,(1994)描述了關(guān)于對(duì)暗黃枝孢(C/atfo^wnwm/w/viw2)的抗性的番茄Cf-9基因的克隆；Martin等，(1993)描述了關(guān)于對(duì)丁香假單胞菌致病變種(尸5^wt/謹(jǐn)ow(3w,/"gwpv.)的抗性的番癡Pto基因，以及Mindrinos等，(1994)描述了關(guān)于對(duì)丁香假單胞菌(P化i^om朋tw^yn力gae)的抗性的鼠耳芥(y4ra&c/o戸z;s)RSP2基因。蘇云金芽孢桿菌(Sa"〃w^2wh"g^似^)內(nèi)毒素也可以用于昆蟲抗性(見，例如，Geiser等，(1986))。維生素結(jié)合蛋白，如抗生物素蛋白也可以用作殺幼蟲劑(PCT申請(qǐng)US93/06487)。已知病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的應(yīng)用賦予對(duì)該外殼蛋白基因所來源的病毒以及相關(guān)病毒影響的病毒感染和/或疾病發(fā)展的抗性(見Beachy等，1990)。已經(jīng)賦予轉(zhuǎn)化的植物對(duì)苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕斑病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同前。還可以使用通過病原體或者寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育停頓蛋白。例如，Logemann等，(1992)已經(jīng)表明表達(dá)大麥核糖體滅活基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌疾病已具有增強(qiáng)的抗性。還可以使用賦予增加的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或者另一種增值性性狀的轉(zhuǎn)基因。一個(gè)實(shí)例是修飾的脂肪酸代謝，例如，通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以增加植物的硬脂酸含量(見Knutzon等，1992)。還可以引入有義去飽和酶基因以改變脂肪酸含量。通過導(dǎo)入肌醇六磷酸酶編碼基因來增強(qiáng)肌醇六磷酸的分解來修飾肌醇六磷酸含量，從而向轉(zhuǎn)化的植物添加更多的游離磷酸。也可以例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來影響改變的糖類組成。(見Shiroza等，1988)(變異鏈球菌(S^印to"ccw)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等，(1985)(枯草芽孢桿菌(S"c"/msw^fe)果聚糖蔗糖酶基因的核苦酸序列)；Pen等，(1992)(產(chǎn)生表達(dá)地衣芽孢桿菌(紐,〃m/,c/z—畫^)a—淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物)；Elliot等，(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核普酸序列)；S0gaard等，(1993)(大麥a-淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)；和Fisher等，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II))。轉(zhuǎn)基因還可以用于改變蛋白代謝。例如，美國(guó)專利號(hào)5,545,545描述了賴氨酸不敏感的玉米二氫吡啶二羧酸合酶(DHPS),其顯著抗要不然抑制天然DHPS活性的L-賴氨酸的濃度。類似地，EP0640141描述了編碼賴氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)的序列，其能夠?qū)е赂哂谡５奶K氨酸生產(chǎn)，以及編碼反義賴氨酸-酮戊二酸還原酶的亞片段，其用于增加賴氨酸。在另一實(shí)施方案中，可以使用改變植物糖類代謝的轉(zhuǎn)基因。例如，已知果糖激酶基因用于轉(zhuǎn)基因植物和它們的果實(shí)中果糖激酶基因表達(dá)的代謝工程改造(見美國(guó)專利號(hào)6,031,154)?？梢允褂玫霓D(zhuǎn)基因的另一實(shí)例是改變谷粒產(chǎn)量的基因。例如，美國(guó)專利號(hào)6,486,383描述了用腺苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶("ADPGPPase")的亞基蛋白修飾植物中的淀粉含量。在EP0797673中，討論了轉(zhuǎn)基因植物，其中特定DNA分子的導(dǎo)入和表達(dá)導(dǎo)致在液泡外形成容易活動(dòng)化的磷酸庫和增強(qiáng)的生物量產(chǎn)生和/或改變的開花行為。還已知改變植物成熟度的基因。美國(guó)專利號(hào)6,774,284描述了編碼植物脂肪酶的DNA和其用于控制植物中衰老的方法。美國(guó)專利號(hào)6,140,085討論了改變開花特征，尤其開花時(shí)間選擇的FCA基因。美國(guó)專利號(hào)5,637,785討論了基因修飾植物，其具有受調(diào)節(jié)LEAFY蛋白的"構(gòu)基因。^、a、'—用于改變植物形態(tài)學(xué)特征的基因也是已知的并且可以根據(jù)本發(fā)明使用。美國(guó)專利號(hào)6,184,440討論了基因工程改造的植物，其由于表達(dá)細(xì)胞壁調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因而顯示出改變的結(jié)構(gòu)或者形態(tài)學(xué)。細(xì)胞壁調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的實(shí)例包括纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，纖維素結(jié)合蛋白，或者細(xì)胞壁修飾蛋白或者酶，如內(nèi)切木葡聚糖(endoxyloglucan)轉(zhuǎn)移酶、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶、擴(kuò)展蛋白、纖維素合酶，或者新分離的內(nèi)切-l,4-15-葡聚糖酶。導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的方法是本領(lǐng)域公知的并且包括生物學(xué)和物理學(xué)的植物轉(zhuǎn)化規(guī)程。見例如Miki等(1993)。一旦轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入品種中，它就可以容易地通過雜交轉(zhuǎn)移。通過使用回交，除了通過回交技術(shù)轉(zhuǎn)移到品種中的基因座外，回收了品種的基本上所有所需的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征?；亟环椒梢杂糜诒景l(fā)明以改善特征或向植物中引入特征(Poehlman等，1995;Fehr,1987a,b)。IV.大豆植物的組織培養(yǎng)物和體外再生本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的大豆品種的組織培養(yǎng)物。本文使用的術(shù)語"組織培養(yǎng)物"指包含相同或不同類型的分離的細(xì)胞的組合物或者組織成植物的部分的一組這類細(xì)胞。組織培養(yǎng)物的示例性類型是在植物或植物部分中完整的原生質(zhì)體、愈傷組織和植物細(xì)胞，如胚、花粉、花、葉、根、根尖、花藥等等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組織培養(yǎng)物包含胚、原生質(zhì)體、分生細(xì)胞、花粉、葉或花藥。用于制備可再生大豆細(xì)胞的組織培養(yǎng)物和從其再生大豆植物的示例性方法公開在美國(guó)專利號(hào)4,992,375;美國(guó)專利號(hào)5,015,580;美國(guó)專利號(hào)5,024,944和美國(guó)專利號(hào)5,416,011中，將它們每一個(gè)的公開內(nèi)容都完整地特別引入本文作為參考。組織培養(yǎng)物的重要的能力是能夠再生能育的植物。這允許例如轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)物細(xì)胞后再生轉(zhuǎn)基因植物。為了有效轉(zhuǎn)化和成功轉(zhuǎn)化，必須將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，該細(xì)胞產(chǎn)生植物或者種系組織。大豆通常通過兩種不同的過程再生枝條形態(tài)發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Finer,1996)。枝條形態(tài)發(fā)生是枝條分生組織組構(gòu)和發(fā)育的過程。枝條從來源組織長(zhǎng)出并被切斷和生根以得到完整植物。在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，從體細(xì)胞植物組織形成含有枝條和根軸的胚(類似于合子胚)。從體細(xì)胞胚的萌發(fā)得到完整植物而不是生根的枝條。枝條形態(tài)發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生是不同的過程并且再生的特定途徑主要依賴于用于組織培養(yǎng)操作的外植體來源和培養(yǎng)基。盡管系統(tǒng)是不同的，但是兩種系統(tǒng)都顯示出品種特異性應(yīng)答，其中一些系對(duì)于組織培養(yǎng)操作比其它系更有應(yīng)答性。在枝條形態(tài)發(fā)生中高度應(yīng)答的系不能產(chǎn)生許多體細(xì)胞胚。在"誘導(dǎo)"步驟過程中產(chǎn)生許多胚的系可能不產(chǎn)生快速生長(zhǎng)的增殖培養(yǎng)物。因此，需要對(duì)每種大豆系最優(yōu)化組織培養(yǎng)條件。這些最優(yōu)化可以由組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
中技術(shù)人員通過小規(guī)模培養(yǎng)研究容易地實(shí)施。除了系特異性應(yīng)答外，也可以在枝條形態(tài)發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生兩者中觀察到增殖性培養(yǎng)物。增殖對(duì)于兩種系統(tǒng)都是有益的，因?yàn)樗试S單個(gè);^皮轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖到將有助于種系組織的點(diǎn)。Wright等(1986)首次報(bào)導(dǎo)枝條形態(tài)發(fā)生為從大豆幼苗的子葉節(jié)從頭得到枝條所借助的系統(tǒng)。枝條分生組織在表皮下形成并且形態(tài)發(fā)生組織可以在含有千基腺噤呤(BA)的培養(yǎng)基上增殖。如果認(rèn)識(shí)到枝條的表皮下多細(xì)胞起源并且利用增殖培養(yǎng)物，那么該系統(tǒng)可以用于轉(zhuǎn)化。想法嵌合狀態(tài)有關(guān)的問題。如果被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不足夠增殖并且不產(chǎn)2^系:織，那么在分生組織內(nèi)僅單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化得到的嵌合體的形成是有問題的。一旦充分理解了該系統(tǒng)并且令人滿意的重復(fù)該系統(tǒng)，那么它就可以用作大豆轉(zhuǎn)化的一種靶組織。Christianson等(1983)首次報(bào)導(dǎo)大豆中體細(xì)胞胚胎發(fā)生是其中最初從合子胚軸得到胚胎發(fā)生組織的系統(tǒng)。這些胚胎發(fā)生培養(yǎng)物是增殖的，但是該系統(tǒng)的重復(fù)性低并且沒有報(bào)導(dǎo)胚的起源。后來對(duì)不同增殖性胚胎發(fā)生大豆培養(yǎng)物的組織學(xué)研究表明增殖性胚是頂端或者表面起源的，其中少數(shù)細(xì)胞有助于胚形成。初生胚(來自最初外植體的第一個(gè)胚)的起源取決于外植體組織和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素水平(Hartweck等，1988)。使用增殖性胚培養(yǎng)物，"較老，，體細(xì)胞胚的單個(gè)的細(xì)胞或者小組表面細(xì)胞形成"較新，，的胚。如果認(rèn)識(shí)到胚的起源并且理解了增殖性胚胎發(fā)生培養(yǎng)物的生物學(xué)限制，那么胚胎發(fā)生培養(yǎng)物還可以成功地用于再生，包括轉(zhuǎn)基因植物的再生。生物學(xué)限制包括開發(fā)增殖性胚胎發(fā)生培養(yǎng)物的困難和與從長(zhǎng)期增殖性胚胎發(fā)生培養(yǎng)物再生的植物有關(guān)的降低的能育性問題(培養(yǎng)物誘導(dǎo)的變異)。在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中這些問題中的一些更明顯。使用更近期培養(yǎng)的細(xì)胞可以減小或者消除此類問題。V.大豆植物的利用本發(fā)明提供的大豆植物可以用于認(rèn)為有價(jià)值的任意目的。通常的用途包括制備用于人類消費(fèi)的食物、用于非人動(dòng)物消費(fèi)的飼料和工業(yè)用途。本文使用的"工業(yè)用途"或者"工業(yè)使用"指大豆或基于大豆的產(chǎn)品的非食物和非飼料用途。通常將大豆加工成兩種主要產(chǎn)品大豆蛋白(粗粉)和粗大豆油。這兩種產(chǎn)品通常被進(jìn)一步精煉以用于特定目的。精煉的油產(chǎn)品可以分解成甘油、脂肪酸和固醇。這些可以用于食物、祠料或工業(yè)使用。可食用的食品用途例子包括稀奶油盅、人造黃油、蛋黃醬、藥物、色拉調(diào)料、起酥油、烘焙產(chǎn)品和巧克力糖衣。大豆蛋白產(chǎn)品(例如，粗粉)可以分成具有食物/飼料和工業(yè)用途的大豆面粉濃縮物和分離物。大豆面粉和渣(grit)通常用于生產(chǎn)肉類補(bǔ)充劑(extender)和類似物、寵物食物、烘焙成分和其它食品。由大豆面粉和分離物制備的食品包括嬰兒食物、糖果產(chǎn)品、谷類、食物飲料、面條、酵母、啤酒、上面哞酒等等。大豆粗粉尤其常用作家畜飼養(yǎng)，主要是豬和家禽的蛋白來源。祠料用途從而包括但不限于，水產(chǎn)養(yǎng)殖祠料、蜜蜂銅料、小牛飼料替代品、魚飼料、家畜飼料、家禽飼料和寵物飼料等等。完整大豆產(chǎn)品也可以用作食物或飼料。通常的食物使用包括這樣的產(chǎn)品，諸如種子、豆芽、烘焙的大豆、用于各種烘焙產(chǎn)品的全脂大豆面粉、用作糖食的烘烤大豆、大豆堅(jiān)果仁醬(soynutbutter)、大豆咖啡(soycoffee)和東方食物的其它大豆衍生物。對(duì)于伺料4吏用，通常從大豆取出殼并將其用作飼料。大豆還具有許多工業(yè)用途。大豆的一種常見的工業(yè)使用是制備可以用于生產(chǎn)復(fù)合材料的粘合劑。例如，使用改性的大豆蛋白、水解的大豆蛋白和PF樹脂的混合物、含有粉末樹脂的大豆面粉和含有泡沫膠水的大豆蛋白可以生產(chǎn)木材復(fù)合材料。利用基于大豆的粘合劑生產(chǎn)常見的木材產(chǎn)品，如膠合板已經(jīng)超過70年了。盡管脲曱^和酚醛樹脂的引入已經(jīng)降低了木材產(chǎn)品中基于大豆的粘合劑的使用，但是環(huán)境關(guān)心和消費(fèi)者對(duì)從可再生的原料生產(chǎn)的粘合劑的偏愛已經(jīng)導(dǎo)致重新出現(xiàn)對(duì)開發(fā)用于木材復(fù)合材料工業(yè)的新的基于大豆的產(chǎn)品的興趣。粘合劑的制備代表大豆的另一常見的工業(yè)使用。大豆粘合劑的實(shí)例包括大豆水解產(chǎn)物粘合劑和大豆面粉粘合劑。大豆水解產(chǎn)物是無色的水溶液，其通過將大豆蛋白分離物在5%氫氧化鈉溶液中在熱(120°C)和壓力(30psig)下反應(yīng)而制備。得到的降解的大豆蛋白溶液在室溫下是石咸性的(pHll)和可流動(dòng)的(約500cps)。大豆面粉是從大豆制備的精細(xì)研磨的脫脂粗粉。可以從大豆面粉制備各種粘合劑制劑，第一步通常需要將面粉溶解在氫氧化鈉溶液中。所得制劑的強(qiáng)度和其它性質(zhì)將依賴于制劑中的添加劑而變。大豆面粉粘合劑還可能與其它可商購的樹脂組合。大豆油還可以應(yīng)用于多種工業(yè)用途。大豆油是世界上最容易得到的和成本最低的植物油之一。大豆油的常見的工業(yè)用途包括用作抗靜電劑、填隙化合物、消毒劑、殺真菌劑、墨水、油漆、保護(hù)涂層、壁板、消泡劑、醇、人造黃油、油漆、墨水、橡膠、起酥油、化妝品等等的組分。大豆油多年來也是醇酸樹脂的主要成分，所述醇酸樹脂溶解在載體溶劑中以制備基于油的油漆。在熱和壓力下將植物油轉(zhuǎn)化成為醇酸樹脂的基本化學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解的。處于可商購的未精煉或者精煉的食用級(jí)狀態(tài)的大豆油是相當(dāng)穩(wěn)定和干燥緩慢的油。還可以改性大豆油以增強(qiáng)它在環(huán)境條件下的反應(yīng)性，或者輸入各種形式的能量，以導(dǎo)致油共聚或者熟化成干燥膜。這些形式的改性中的一些包括環(huán)氧化、醇解或者酯交換、直接酯化、復(fù)分解、異構(gòu)化、單體修飾、和各種形式的聚合作用，包括熱粘化。對(duì)于許多工業(yè)用途，大豆油的反應(yīng)性亞油酸組分與其雙4建可以比主要的油酸和亞油酸組分更有用。35還可以使用基于大豆的成分制備溶劑。例如，豆油脂肪酸甲酯(methylsoyate)-—種基于大豆油的甲酯-正在市場(chǎng)上被接受為在諸如部件清潔和脫脂、油漆和墨水去除和漏油補(bǔ)救應(yīng)用中的優(yōu)秀的溶劑替代備選方案。它還以多種配制的消費(fèi)者產(chǎn)品上市，所述產(chǎn)品包括洗手劑、汽車蠟和亂畫洗凈劑。通過大豆油與曱醇的酯交換產(chǎn)生豆油脂肪酸曱酯。它可以從多種生產(chǎn)商和供應(yīng)商商購得到。作為溶劑，豆油脂肪酸甲酯具有重要的環(huán)境和安全性相關(guān)的性質(zhì)，其使得它對(duì)于工業(yè)應(yīng)用是有吸引力的。它的毒性比大多數(shù)其它溶劑更低，容易生物降解，并且具有非常高的閃點(diǎn)和低水平的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOC)。豆油脂肪酸曱酯與金屬、塑料、大多數(shù)高彈體和其它有機(jī)溶劑的相容性是優(yōu)良的。豆油脂肪酸甲酯的當(dāng)前用途包括清潔劑、脫漆劑、漏油清除和生物整治(bio腦ediation)、殺蟲劑佐劑、防腐劑和生物柴油機(jī)燃料添加劑。VI.保藏信息本文公開的大豆系B2G2和系譜3的至少2500粒種子已經(jīng)保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209USA,保藏日為2005年7月28日。所述保藏物確定的ATCC保藏號(hào)分別為PTA-6893和PTA-6892。種子由ATCC保藏。按照布達(dá)佩斯條約，在本申請(qǐng)未決期間，可以獲取該保藏物。所述保藏物將維持在ATCC保藏機(jī)構(gòu)(它是公開的保藏機(jī)構(gòu))，保藏期為30年或保藏機(jī)構(gòu)最后接到要求之后至少5年，或保藏到該專利的可實(shí)施壽命，哪一項(xiàng)時(shí)間更長(zhǎng)就取決于哪一項(xiàng)，并且在所述時(shí)間段內(nèi)，如果保藏物變得不可存活，則要進(jìn)行更換。VII.試劑盒本文所述的任意組合物可以包含在試劑盒中。在非限制性實(shí)施例中，用于檢測(cè)本文所迷多態(tài)性的組合物和/或其它試劑，可以包含在試劑盒中。試劑盒因而可以在合適的容器中包含用于檢測(cè)多態(tài)性的探針或SI物和/或本發(fā)明的其它試劑。在具體實(shí)施方案中，試劑盒將允許檢測(cè)至少一種非轉(zhuǎn)基因的Gy無^1等位基因，且另外可以4全測(cè)脂加氧酶和/或KTI無效等位基因，例如，通過檢測(cè)這樣的等位基因和/或否則含有等位基因的連鎖不平^f中的多態(tài)性。試劑盒可以包含適當(dāng)?shù)确衷嚇拥谋景l(fā)明試劑組合物，其可以標(biāo)記或未標(biāo)記，用于檢測(cè)這樣的等位基因的任意測(cè)定形式中。試劑盒組分可以包裝在含水介質(zhì)中，或以凍干的形式。試劑盒的容器通常包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器，其中可以裝有組分，且優(yōu)選地適當(dāng)?shù)确衷嚇拥?。?dāng)試劑盒中存在超過一種組分時(shí)，試劑盒通常也將含有第二個(gè)、第三個(gè)或其它額外容器，其中可以分別裝有其它組分。但是，組分的各種組合可以包含在小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常也將包括容納檢測(cè)組合物的工具和商業(yè)銷售緊密密封的任意其它試劑容器。這樣的容器可以包括注射或吹塑塑料容器，其中保持所需小瓶。當(dāng)試劑盒的組分提供在一種和/或多種液體溶液中時(shí)，液體溶液可以是含水溶液，無菌含水溶液是特別優(yōu)選的。但是，試劑盒的組分可以作為干燥粉末來提供。當(dāng)試劑和/或組分作為千燥粉末來提供時(shí)，粉末可以通過加入合適溶劑來重建。預(yù)見到，溶劑也可以在另一個(gè)容器中提供。容器通常將包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其它容器，其中可以裝有用于檢測(cè)無效等位基因的組合物，優(yōu)選地適當(dāng)分配。試劑盒也可以包含第二個(gè)容器，其裝有無菌緩沖液和/或其它稀釋劑。本發(fā)明的試劑盒也通常將包括容納商業(yè)銷售緊密密封的小瓶的工具，例如注射和/或吹塑塑料容器，其中保持所需小瓶。無論容器的數(shù)目和/或類型，本發(fā)明的試劑盒也可以包含用于輔助使用檢測(cè)組合物的儀器，和/或與其一起包裝。vin.定義在下面的描述和表中，使用了許多術(shù)語。為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求書的清楚和一致的理解，提供下面的定義一個(gè)/種當(dāng)與詞語"包含"或者權(quán)利要求書中的其它開放用語結(jié)合使用時(shí)，詞語"一個(gè)/種"指"一個(gè)/種或多個(gè)/種"。農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的如本文使用的，指基因型，其具有許多可辨別性狀的最佳表現(xiàn)，如種子產(chǎn)量、突出體、萌發(fā)勢(shì)、營(yíng)養(yǎng)勢(shì)、抗病性、種子結(jié)實(shí)、站立能力(standability)和脫粒能力，其允許生產(chǎn)者收獲具有商業(yè)重要性的產(chǎn)品。等位基因基因座的一種或多種可選形式的任一種，所有等位基因都涉及性狀或者特征。在二倍體細(xì)胞或者生物中，給定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對(duì)同源染色體上的對(duì)應(yīng)基因座。回交一種方法，其中育種者將雜種子代例如第一代雜種(F^與雜種子代的親本之一重復(fù)雜交。回交可以用于從一種遺傳背景向另一遺傳背景引入一個(gè)或多個(gè)單一基因座轉(zhuǎn)變。商業(yè)上相當(dāng)大產(chǎn)量對(duì)栽培者具有商業(yè)重要性的谷粒產(chǎn)量，當(dāng)生長(zhǎng)在相同條件下時(shí)，由對(duì)照系A(chǔ)G2703和DKB23-51的至少95%的實(shí)際谷粒產(chǎn)量來表示。雜交兩種親本植物的交配。異花傳粉通過來自不同植物的兩種配子的聯(lián)合受精。下調(diào)突變?yōu)榱吮旧暾?qǐng)的目的，將下調(diào)突變定義為降低給定基因的蛋白表達(dá)水平的突變。因而，下調(diào)突變包含無效突變。Fi雜種兩種非等基因植物雜交的笫一代子代。基因型細(xì)胞或生物的基因組成。INDEL:由核苦酸序列插入或缺失引起的遺傳突變。工業(yè)用途大豆植物的非食物和非飼料用途。術(shù)語"大豆植物"包括大豆植物的植物部分和書f生物。連鎖一種現(xiàn)象，其中相同染色體上的等位基因比如果等位基因的傳遞是獨(dú)立的而偶然預(yù)期的更傾向于一起分離。標(biāo)記容易檢測(cè)的表型，優(yōu)選以共顯性方式遺傳(在二倍體雜合子中基因座上的兩個(gè)等位基因容易檢測(cè))，沒有環(huán)境變異組分，即遺傳率為1。非轉(zhuǎn)基因突變天然發(fā)生的或通過常規(guī)方法(例如將植物暴露于輻射或誘變化合物)誘導(dǎo)的突變，不包括使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的突變。無效表型本文使用的無效表型是指，給定蛋白不以可檢測(cè)的水平表達(dá)。在Gy亞基的情況下，通過SDS-PAGE和考馬斯染色測(cè)定表達(dá)水平。表型細(xì)胞或者生物的可檢測(cè)的特征，該特征是基因表達(dá)的表現(xiàn)。數(shù)量性狀基因座(QTL):數(shù)量性狀基因座(QTL)指在一定程度上控制通常連續(xù)分布的以數(shù)值表示的性狀的遺傳基因座。SNP:當(dāng)對(duì)比2個(gè)同源序列時(shí)，指單核苷酸多態(tài)性或單核苷酸突變。嚴(yán)格條件指5XSSC、50。/。曱酰胺和42。C的核酸雜交條件?；旧系韧囊环N特征，當(dāng)被比較時(shí)，不與平均值顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(例如，p=0.05)。組織培養(yǎng)物組合物，其包含相同或不同類型的分離的細(xì)胞或者一組組織成植物部分的此類細(xì)月包。轉(zhuǎn)基因遺傳基因座，其包含已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大豆植物的基因組的序列。IX.實(shí)施例包括下面的實(shí)施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人中良好運(yùn)行的技術(shù)，并且因此可以神皮認(rèn)為組成它的實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容應(yīng)明白，在所公開的特定實(shí)施方案中可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下做出許多改變，并且仍然得到同樣或者相似的結(jié)果。實(shí)施例1在研究中使用的大豆品種B2G2或"11S無效"大豆品種具有獨(dú)特的種子組成，包括高水平的p-伴大豆球蛋白和低量大豆球蛋白。但是，B2G2品種表現(xiàn)出農(nóng)學(xué)上劣等的特征，例如低產(chǎn)量、過度倒伏和綠種子。開發(fā)了許多育種系，其攜帶B2G2系中存在的突變的全部或部分。15個(gè)這樣的系以及B2G2系用作重復(fù)測(cè)序組(resequencingpanel)的突變系。8個(gè)野生型用于本研究中的對(duì)比。表1列出了在測(cè)序組中使用的所有系。表1系語AH—(A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500COR:@.0042.0006.@.AH二A3244/(B2G2/A1923:.077.5:0001.0064.0001.)/DKB19-51通.0232.0002.詠AH二(A3244/(B2G2/A1923:.077Z):0001.0064.0001j/DKB19-51:@.0228.0015.@.AjaC(A3244/B2G2/A1923:.077.'):0001.0097.0011.)/DAK250lAOR:@.0314.0009.@.AH^A3244/(b2g2/A1923:.077.^0001.0097.0015.vdjw2500cor:@.0042.0012.@.AH二A3244/(B2G2/A1923:.077.;:0001.0011.0008》AG2402:@.0028.0010.@.AkC(A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0008.0016.)/DBL3201AOX:@.0256.0014.@.AH:(A3244/(B2G2/A1923:.077.5:O001.0097.0O15.)/DJW25OOCOR:@.O234.0O19.@.AH:704416-JB924/(7A3244/(B2G2/A1923:.O77.):0001.OO97.O015.)/DJW25O0C0R:@.0005.):@.0O67.0016.JB10AH—704416-24/((A3244/(B2G2/Al923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500COR:@.0005.):@.0067.0007.JB11AH:704'416-24/((A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500COR:@.0005.):@.0067.0003.JB12AH二704416-24/((A3244/O2G2/A1923:.077.^0001.0097.0015,)/DJW2500C0R:銀0005.):私0067.0002.JB13AH二DAK2301A1R/((A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500COR:私0013.):銀0018.0001.JB14AH_DAK2301A1R/((A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500COR:@.0013.):@.01R0011.JB15AH—DAK2301A1R/^A3244/(B2G2/A1923:.077.5:0001,0097.0015.5/DJW2500COR:@,0013.'):@.0130,0001.B2G2A1923A1923A3244A3244AG2403AG2403AG2703AG2703AG3201AG3201AG3202AG3202DKB17-51DKB17-51DKB19-51DKB19-51實(shí)施例2等位基因的標(biāo)記的設(shè)計(jì)所有大豆球蛋白基因的DNA序列都可來自GenBank(NCBI)。這些序列用作針對(duì)Monsanto序列數(shù)據(jù)庫的blast的查詢。使用"blastn"程序，得到了許多高得分命中(hit)。比對(duì)從blast搜索得到的序列，來提供用于引物設(shè)計(jì)的高質(zhì)量共有序列。設(shè)計(jì)嵌套引物，來完全覆蓋在每個(gè)基因座處的整個(gè)基因，并從不同系產(chǎn)生擴(kuò)增子。比對(duì)這些擴(kuò)增子的序列，來鑒別與高(3-伴大豆球蛋白表型有關(guān)的SNP和INDEL。最初，為設(shè)計(jì)10對(duì)引物，為Qy2和Qy3各設(shè)計(jì)7對(duì)，為Qy4設(shè)計(jì)14對(duì)，為Qy5設(shè)計(jì)10對(duì)，且為(3少7設(shè)計(jì)11對(duì)。一旦從該研究中得知它們的序列，就設(shè)計(jì)其它引物。表2列出了在該研究中使用的引物。使用Qiagen植物DNA試劑盒分離DNA,并用KOD規(guī)程(EMDBiosciences,Inc,Madison,WI)進(jìn)行PCR。反應(yīng)混合物包括3.4jul5M甜菜石咸，2pi10xKOD緩沖液,2jul2mMdNTPs,0.8jul25mMMgS04,0.2piKOD酶(IU1.6pi引物(5)iM)和10jalDNA模板(2ng/iul)。PCR循環(huán)如下94°C5分鐘；8個(gè)94。C40秒、62°C40秒、72°C1分鐘、94°C40秒、60°C40秒、40系或reffiffireffiffi72°Cl分鐘、94°C40秒、58°C40秒、72°C1分鐘、94°C40秒、56°C40秒、72。C1分鐘的循環(huán)；3個(gè)94。C40秒、55。C40秒、72。C1分鐘的循環(huán)；在72°C保持7分鐘。在P/。瓊脂糖^y交中，通過電泳分析PCR產(chǎn)物。為了測(cè)序，將5piPCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新管中，并加入1jul外切核酸酶1(1:10稀釋的)和1^奸(Shrimp)堿性磷酸酶(l:IOO稀釋的)。將混合物在37°C溫育20分鐘，然后在80。C溫育20分鐘，以滅活酶。加入40iulH20，將6jul用作模板，具有l(wèi)jul測(cè)序引物。使用Capillaiy測(cè)序儀ABI3730進(jìn)行測(cè)序。裝配序列，并使用DNAStar福的SeqManII程序(LaserGene)比對(duì)。設(shè)計(jì)終點(diǎn)SNP/Taqman⑧測(cè)定，并通過為它們提供的基于SNP序列的AppliedBiosystems來生產(chǎn)。才艮據(jù)提供的說明書(AppliedBiosystems)，進(jìn)行SNP檢測(cè)。Taqman⑧測(cè)定或?qū)崟r(shí)PCR,通過擴(kuò)增反應(yīng)期間雙標(biāo)記的熒光探針的雜交和切割，檢測(cè)特定PCR產(chǎn)物的積累。Taqman測(cè)定包括4種寡核苷酸，其中的2種用作PCR引物，并產(chǎn)生包括待測(cè)多態(tài)性的PCR產(chǎn)物。另外2種是等位基因-特異性的熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)探針;每個(gè)探針具有獨(dú)特的熒光團(tuán)，其在TaqDNA聚合酶降解探針后釋放，有效地指示樣品中存在的每個(gè)等位基因的量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例3G少表達(dá)分析的方法在分別源自AAH3504T0C/AH0209439-130之間和AAH2104J0C/AH0209439-130之間的雜交的命名為JB0305602和JB0305605的2個(gè)F2群體中，進(jìn)行Qy標(biāo)記的遺傳構(gòu)造。取樣400林F2單個(gè)植物，用SNP標(biāo)記對(duì)372林植物進(jìn)行基因型分型。如下進(jìn)行蛋白分析收集8粒大豆種子，使用CATMega-研磨機(jī)(SOPAsci-01-0002)進(jìn)行研磨。將研磨的樣品保藏在4。C。為了分析，將約30mg來自每種的面粉稱量進(jìn)96孔2ml微量滴定板的一個(gè)孔中。在搖動(dòng)下，在含有0.1M二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑的1.0mlIXLaemmliSDS緩沖液pH6.8中，提取蛋白l小時(shí)。離心后，在SDS緩沖液中進(jìn)一步稀釋每種提取物的部分，以產(chǎn)生0.2-0.5)iig/|LiL總蛋白，加熱至90-100。C10分鐘，并冷卻。對(duì)于每種樣品，使用12通道移液管將1-2pg總蛋白裝載到26泳道15。/。T梯度Tris/HClCriterion凝膠上。在每個(gè)凝膠中，在2個(gè)泳道中包括分子量標(biāo)準(zhǔn)品和親本對(duì)照。蹤跡染料達(dá)到凝膠底部之前，對(duì)凝膠電泳約1.2小時(shí)，然后在膠體考馬斯藍(lán)G-250中染色過夜，在DI(去離子)水中脫色，且使用GS800校準(zhǔn)的光密度計(jì)成像。在圖1中顯示了染色凝膠的示例性圖像，且在圖的左側(cè)指示著與G^等位基因有關(guān)的蛋白帶。使用Bio-RadQuantityOne軟件，進(jìn)行定量。使用軟件來測(cè)定樣品泳道中每個(gè)帶的相對(duì)量。將百分比酸性大豆球蛋白和百分比p-伴大豆球蛋白蛋白亞基帶記錄為泳道中總蛋白的相對(duì)百分比。使用MasterLIMSTM,追蹤樣品特性和重量。實(shí)施例4Qy/和Qy2中的突變分析F2子代植物中G少/和Qy2編碼的蛋白的總含量。如圖2所示，將植物分配入2個(gè)表型組，一個(gè)組具有小于3%的Qy/,2編碼的蛋白，且另一組具有3.1%更大的G少/,2編碼的蛋白?？ǚ椒治?圖2B)與作為隱性性狀的連鎖的突變Gy7，2等位基因相一致。在G少7基因的大部分中得到了良好的序列覆蓋度。由于2個(gè)引物對(duì)的失敗，存在2個(gè)小缺口。將共有序列列為SEQIDNO:163。在表3中給出了在Gy/的一些選定核苷酸位置處的等位基因評(píng)分。在JB7/JB8和其它系之間，存在3個(gè)在位置643、835和839處的SNP。因?yàn)樵谶@些位置處沒有從B2G2系重新獲得序列，所以沒有確定SNP是否是從B2G2突變系遺傳而來。沒有從突變系B2G2和它的衍生系JB3、JB4、JB13、JB14和JB15得到擴(kuò)增子或在Qy/基因的5'末端的序列，從而表明在突變系中可能存在序列缺失。用前3對(duì)引物進(jìn)行另外的PCR反應(yīng)，并得到一致的結(jié)果。這證實(shí)了突變系中的缺失。缺失跨越上游啟動(dòng)子區(qū)、外顯子I和內(nèi)含子I。還沒有精確測(cè)定缺失的接頭。在缺失上設(shè)計(jì)顯性標(biāo)記，以用作G^/基因座的診斷標(biāo)記?；虻臏y(cè)序僅僅指明了3個(gè)可鑒別的SNP,且罕見的等位基因都來自JB7系。所有其它系都是相同的。因?yàn)镚y/、Qy2和Qy3之間的高序列同源性，甚至用基因座特異性的引物也發(fā)生偶然的交叉污染，因而可能存在沒有鑒別出的其它變異。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)施例5中的突變分析了F2子代植物中Gy3編碼的蛋白的總含量。如圖3所示，將植物分配入2個(gè)表型組，一個(gè)組具有小于1%的G少3編碼的蛋白，且另—組具有1.1%或更大的G少3編碼的蛋白。卡方分析(圖3B)與作為隱性性狀的減少的Gy3表達(dá)相一致。當(dāng)對(duì)比Qy/,2和Qv3亞基的表達(dá)水平時(shí)(圖4),發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)與qy3編碼的蛋白的表達(dá)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為.88,見圖4B。該數(shù)據(jù)表明，低Qv3編碼的蛋白水平的表達(dá)可以基于Gy7和/或Qy2基因型來測(cè)定。通過在多個(gè)系上對(duì)整個(gè)基因重新測(cè)序，測(cè)定在Qy3基因座處的DNA序列變異。將得到的共有序列列為SEQIDNO:164。在表4中給出了在該基因座處多態(tài)性的等位基因評(píng)分。在突變型和野生型之間檢測(cè)到5個(gè)SNP和2個(gè)INDEL。原始突變系B2G2攜帶在位置848-851處的插入(TGAT),而所有其它系攜帶在該位置處的缺失。B2G2也攜帶在位置1083、1120和1866處的的3個(gè)SNP上的罕見等位基因，而所有其它系攜帶豐富的等位基因。數(shù)據(jù)表明，這些SNP和INDEL與Qy3編碼的蛋白的低表達(dá)處于連鎖不平衡(LD)中。但是，在該基因的3，末端處，位置2504-2505、2574和3189的3個(gè)序列變異，似乎沒有與Qy3編碼的蛋白的低表達(dá)處于LD中，因?yàn)楹币姷任换虿粌H在B2G2上檢測(cè)到，而且也在野生型AG2703和DKB19-51上4企測(cè)到。在該研究中使用的B2G2衍生系都沒有遺傳在G^3基因座處的B2G2等位基因。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)施例6Qy4中的突變對(duì)子代植物進(jìn)行蛋白分析，以測(cè)定表達(dá)的編碼的多肽的量。如圖5所示，將植物分配入2個(gè)表型組，一個(gè)組是Q)^無效的，且另一組表現(xiàn)出Qy4編碼的多肽的表達(dá)?？ǚ椒治?圖5B)與作為隱性性狀的Qy4無效等位基因相一致。Gj^等位基因的序列分析揭示了在突變系B2G2和它的衍生系中的翻譯起始密碼子處的突變(表5,位置682,SEQIDNO:165)。突變將ATQ改變成AT厶。由于喪失翻譯起始密碼子，由該基因編碼的肽亞基最可能不能翻譯。該SNP可以理想地用作指示Qy4喪失的分子標(biāo)記。使用得到的序列來"i殳計(jì)用于才全測(cè)稱作NS0199003的該標(biāo)記的引物(見表8)。在來自B2G2和某些子代系的有些序列處，也觀察到在位置1620和1632處的其它多態(tài)性，但是它們與Q^編碼的蛋白亞基的喪失無關(guān)。因而，這些不一致可能由該區(qū)域引物的非特異性擴(kuò)增造成。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實(shí)施例7Qy5中的突變G3/5等位基因的序列分析表明，與其它親本品種相比，在B2G2植物中存在2個(gè)SNP(SEQIDNO:166上的位置363和612)和2個(gè)INDEL(位置447-453,519-524)(表6)。另外，在外顯子II的位置752處鑒別出了SNP,這將氨基酸殘基從絲氨酸變成天冬酰胺。所有5個(gè)SNP或INDEL在測(cè)試的系中形成2個(gè)單元型。突變系B2G2和它的衍生系JB1、JB5和JB8共有一個(gè)單元型，而其它系共有另一個(gè)單元型。這些SNP/INDEL似乎是連鎖不平衡的，且與"lls無效，，表型相關(guān)。仍然不清楚這些SNP或INDEL是否確實(shí)造成如圖1所示的B2G2中A3亞基的喪失。因?yàn)樗鼈兌际窃诰幋a區(qū)中檢測(cè)到的序列變異，所以在啟動(dòng)子區(qū)可能存在一些其它變異，它們?cè)斐稍诘鞍啄z上觀察到的A3帶的喪失。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例8Gy突變標(biāo)記的開發(fā)為上面鑒別出的SNP或INDEL，設(shè)計(jì)PCR分析，例如Taqman⑧測(cè)名稱。使用在不同位置處的SNP,分別為Qy/和Qy3設(shè)計(jì)2個(gè)測(cè)定。這些測(cè)定首先運(yùn)行在用于在該研究中重復(fù)測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)組上，然后用于分離群體中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例9標(biāo)記和蛋白亞基之間的高度一致分析F1子代植物來測(cè)定大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白蛋白的總含量。圖6A中的圖顯示了每種植物的總大豆球蛋白蛋白對(duì)總P-伴大豆球蛋白蛋白。數(shù)據(jù)表明，大豆球蛋白的低表達(dá)與P-伴大豆球蛋白(Cgy)亞基的高表達(dá)相關(guān)(圖6B)。在2個(gè)F2分離群體JB0305602和JB0305605中，進(jìn)行分子標(biāo)記和它們的對(duì)應(yīng)大豆球蛋白亞基之間的遺傳相關(guān)。為了確定哪個(gè)遺傳標(biāo)記能指示突變Gj/等位基因，在SDS-PAGE上分析2個(gè)群體的所有個(gè)體的蛋白含量，并用在研究中開發(fā)的SNP標(biāo)記以及許多貫穿基因組中選擇的標(biāo)記，進(jìn)行基因型分型。如上面和在圖1中指出的，Gy/和G^2的蛋白帶聚簇在一起，且因而它們被測(cè)量為一個(gè)單位。表8表明，蛋白帶的分離(表達(dá)為總蛋白的百分比)與SNP標(biāo)記高度相關(guān)。例如，具有在G^/處的突變等位基因的植物總是含有更低的大豆球蛋白Ala、Alb和A2亞基，在2個(gè)群體中分別是2.5和2.4%,而具有"TT"等位基因的那些則含有更高的大豆球蛋白Ala、Alb和A2亞基，分別是7.6和8.1%。相關(guān)是非常顯著的(P-值分別是1.7x10-55和4.1x10-62)，且在Qy2的情況下觀察到類似的相關(guān)。在G^/基因座處，攜帶"AA"等位基因的個(gè)體含有更低的大豆球蛋白亞基A4B3A5,在它們各自的群體中為0.6%和0.1%,而雜合子("AG")在2個(gè)群體中含有1.8%,且具有"GG，，的那些含有最高的大豆球蛋白亞基A4B3A5，在它們各自的群體中為2.9%和3.3%。相關(guān)是非常顯著的，P-值分別是2.3xl0'"和2.3x10—69。數(shù)據(jù)表明，NS0199008、NS0199002和NS0199003標(biāo)記與指定的大豆球蛋白亞基的減少的表達(dá)特別相關(guān)，且可以用于預(yù)測(cè)減少的大豆球蛋白表型。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實(shí)施例10Qy3和Qy4無效大豆植物的蛋白表達(dá)的變化分析包含賦予無效Gy3和Gy4表型和降低的Gyl/Gy2表型的非轉(zhuǎn)基因突變的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆植物中各種大豆球蛋白和|3-伴大豆球蛋白亞基的總含量。研究了3個(gè)不同系，系譜l(AH一DAK2301A1R/((A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500C0R:銀0013.):@.0114.0008.@);系譜2(AH—DAK2301A1R/((A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500C0R:@.0013.):@.0096.0007.@);和系譜3(AH—DAK2301A1R/((A3244/(B2G2/A1923:.077.):0001.0097.0015.)/DJW2500C0R:詠0013.):@.0105.0006,@)(保藏為ATCC登記號(hào)PTA-6892)，且各自的數(shù)據(jù)分別顯示在表9、10和11中。在每個(gè)系的情況下，分析了在2004-2005季期間生長(zhǎng)在各個(gè)位置的植物。顯示在這些表中的數(shù)據(jù)指示了Gyl/Gy2、Gy5、a'BC、aBC和(3BC蛋白亞基的總含量，表達(dá)為總種子蛋白含量的百分比。也指示了酸性大豆球蛋白亞基的總含量和(3-伴大豆球蛋白總含量。對(duì)于3個(gè)系譜中的每一個(gè)，在每個(gè)表的最后兩行中指示了平均數(shù)據(jù)(Avg.)和平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(St.Dev.)。使用上面實(shí)施例3所述的方法，計(jì)算值。在任何情況下，都沒有觀察到可檢測(cè)的Qy3或Qy4編碼的蛋白。在表9-11中所示的研究表明，在測(cè)試的3個(gè)植物系(辦如來自不同基因組背景的作用)和在不同環(huán)境條件(在不同位置)下生長(zhǎng)的植物之間各種大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白蛋白亞基的含量是可變的。這些數(shù)據(jù)突出了使用多態(tài)性標(biāo)記選擇Qy突變植物的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@些標(biāo)記的4企測(cè)將不會(huì)發(fā)生基于基因組背景和環(huán)境條件的變異性。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>實(shí)施例11基因組標(biāo)記可以用于選擇低大豆球蛋白大豆植物在2個(gè)F2群體上，分析了G_y/(NS0199008)、Gy2(NS0199002)和Gy《NSO199003)標(biāo)記的分離。如表9所示，Gy/和Gy2都是顯性標(biāo)記，且各自以3:l比分離。Qy4是共顯性標(biāo)記。3個(gè)鑒別出的標(biāo)記可以用于鑒別具有低大豆球蛋白和高(3-伴大豆球蛋白種子含量的植物。圖7解釋了F2植物的大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白含量?；趤喕磉_(dá)的蛋白分析(圖7A)或使用3個(gè)突變Gy標(biāo)記(圖7B),選擇植物。數(shù)據(jù)顯示，基于標(biāo)記的選擇錯(cuò)誤鑒別小于1%(7/754)的F2植物。實(shí)施例12生產(chǎn)的低大豆球蛋白大豆植物的大豆種子的顏色分析大豆農(nóng)場(chǎng)主和消費(fèi)者經(jīng)常認(rèn)為綠種子顏色是較不合需要的。因此需要消除系的綠種子顏色。對(duì)如本文所述生產(chǎn)的低大豆球蛋白大豆，分析綠種子顏色的消除程度。使用ColorFlex反射分光光度計(jì)(型號(hào)45/0),對(duì)完整大豆進(jìn)行顏色分析。使用黑色玻璃和白色磚，標(biāo)準(zhǔn)化分光計(jì)。使用具有生產(chǎn)商HunterAssociatesLaboratory,Inc.(Reston,VA,USA)證實(shí)過的顏色值的綠色磚，檢查標(biāo)準(zhǔn)化。該分光光度計(jì)測(cè)量CIE三色激勵(lì)色標(biāo)值X、Y和Z,并從這些值計(jì)算CIELAB色標(biāo)值L氣&*和b*。CIELAB色標(biāo)允許4安照三維空間描述色感覺(CIE,Colorimetry,Publication15.2,第二版，Vienna,1986),C正LAB色空間組織為立方體。L、軸是從頂?shù)降?，且稱作光亮度值，它從0(黑色)延伸至100(白色)。&*和M軸沒有具體的數(shù)字邊界。坐標(biāo)a*在正值時(shí)代表紅色，在0時(shí)代表灰色，且在負(fù)值時(shí)代表綠色。坐標(biāo)b*在正值時(shí)代表黃色，在0時(shí)代表灰色，且在負(fù)值時(shí)代表藍(lán)色。在35xl0mm型聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿中裝滿多層完整大豆，將蓋子置于培養(yǎng)皿底部，以便保護(hù)讀數(shù)表面。在置于分光光度計(jì)口上之前，從組織培養(yǎng)皿的底部去除蓋子。將含有完整大豆的組織培養(yǎng)皿置于分光光度計(jì)口上，待測(cè)的一側(cè)朝向口。將擋光器置于樣品上，以便限制任何外部光干擾。在ColorFlex上顯示CIE三色激勵(lì)色標(biāo)屏。按下Read鍵，且測(cè)量完整大豆樣品的CIE三色激勵(lì)色標(biāo)值。顏色捕獲程序?qū)⒅涤涗浀紼xcel電子制表軟件中。將圖像轉(zhuǎn)換(toggle)到CIELAB色標(biāo)屏上，按下Read鍵，使用分光光度計(jì)計(jì)算完整大豆樣品的CIELAB色標(biāo)值1^、&*和13*。為每個(gè)樣品測(cè)量一式五份多層排列的完整大豆。將相同的完整大豆重新包裝4次，以得到5個(gè)顏色測(cè)量結(jié)果。在下面的表12中，總結(jié)了顏色分析的結(jié)果。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例13脂加氧酶基因中的序列變異將來自GenBank的Lox2序列GI505137用作針對(duì)Monsanto序列數(shù)據(jù)庫的blast的查詢。使用S叫Man程序(DNASTAR,INC,Madison，WI),下載并裝配60個(gè)高命中。在MonsantoDNA序列收集中，鑒別出2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄物。轉(zhuǎn)錄物之一對(duì)應(yīng)著GenBank中的脂加氧酶-l(Loxl)基因，且因而命名為/x/(SEQIDNO:157),而另一個(gè)對(duì)應(yīng)著Lox2(/x2)基因(SEQIDNO:158)。設(shè)計(jì)基因-特異性的引物，并用于從8系組產(chǎn)生擴(kuò)增子。該組由6個(gè)突變型和2個(gè)野生型組成。表13列出了在測(cè)序組中使用的系。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>擴(kuò)增子測(cè)序揭示，在8個(gè)系中在丄ojc/基因座上存在27個(gè)多態(tài)性,包括21個(gè)SNP和6個(gè)INDEL(表14)。在這些多態(tài)性中，10個(gè)位于外顯子中?；谠谒羞@些多態(tài)性處的等位基因評(píng)分，序列組中的8個(gè)系落入6個(gè)單元型。野生型A3469和A224屬于相同的單元型，而其它突變型屬于不同單元型。在IA2025、IA2032和PI408251中檢測(cè)到74bp缺失。該缺失似乎與突變型表型有關(guān)(表13)。表14注#GATC代表在IA2025、IA2032和PI408251中缺失的74bp序列。在表15中顯示了在Aojc2基因座處的多態(tài)性。檢測(cè)到6個(gè)SNP和2bp的INDEL，且在這8個(gè)系中形成了2個(gè)不同的單元型。單元型明顯與/x2表型有關(guān)(表13)。除了一個(gè)在位置2542處以外，所有這些多態(tài)性都位于內(nèi)含子中。在位置2542處的SNP是錯(cuò)義突變，從而造成遺傳密碼子從編碼組氨酸的CAT變成編碼谷氨酰胺的CAA。INTEXINTEXINTiNTEXEXEXEXEXEX31253139320432783832-390540434057419342254247426744304439*TCCGATC*A*CTACAG*TCCGATCAC丁ACAGGAGACAGCG丁CAGAGACAGCGTCAGAGACAGCGTCAGAGAGATCCAGCG丁CAGAGAGATCCAGCGTCAGAGAGATCCAGCGyCAINTINTINTINTEXINTINT1253137213881527155422673055]丁丁丁AAGCTTTAAGCTTTAACATTTAACAAGCTCCAA'GC丁CCAAGc丁CCA-AGcTCCA品種HaploP郵023L2-3Hap2IA2025Hap5IA2032Hap6PI408251Hap4PI417458Hap1A3469Hap3A2247Hap3'品種H印loPl86023L2-3Hap21A2025Hap51A2032Hap6PI408251Hap4PI417458Hap1'A3469Hap3EXINTINT178-180326363GCGCATGCGCA丁GCGcA丁COTTGGGGGGE"AAAATT"-AGAGAT犯00co一A*A*AT丁一GG一TCOp4257表15<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>為在位置2M2處的SNP，設(shè)計(jì)Taqman測(cè)定。測(cè)定信息在表16中給出。該測(cè)定的allelogram如圖8所示。該標(biāo)記允許清楚區(qū)分在丄ox2處來自突變型的"A"等位基因和來自野生型的"T"等位基因。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實(shí)施例14大豆中與Kunitz胰蛋白酶抑制劑無效表型有關(guān)的序列變異從編碼大豆的KTI的4個(gè)候選序列中，鑒別出編碼大豆的Kunitz胰蛋白酶抑制劑蛋白(KTI)的候選序列。一個(gè)候選序列KTIA(SEQIDNO:167)用作模板，來設(shè)計(jì)用于隨后PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物。從該候選序列設(shè)計(jì)基因座特異性的引物，且從5個(gè)KTI無效突變系和7個(gè)野生型系產(chǎn)生PCR擴(kuò)增子(表17)。比對(duì)這些擴(kuò)增子的序列，允許鑒別出與Kunitz表型有關(guān)的核苷酸變異(圖9)。在所有Kunitz無效突變型中檢測(cè)到在位置622-623處的2-bp缺失和在位置624處的單石咸基突變(見圖9),而"GAG"在所有野生型中存在于相同位置中。缺失/插入是無義突變，從而造成蛋白過早終止，這解釋了表現(xiàn)出Kunitz無效表型的突變系表型。該INDEL可以用作Kunitz無效大豆系和品種的標(biāo)記輔助選擇的遺傳標(biāo)記。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>根據(jù)本說明書，無需過多的實(shí)驗(yàn)就可以制備和實(shí)施本文所公開的和本文所要求保護(hù)的所有組合物和方法。盡管業(yè)已按照優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可以對(duì)本文所描述的組合物和方法以及所述方法的步驟或步驟的順序進(jìn)行改變。更具體地，將明白的是，可以用化學(xué)上和生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑取代本文所描述的試劑，同時(shí)能獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的所有這樣的類似取代和修飾，都被視為在如所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。參考文獻(xiàn)在本文中具體引入下面的參考文獻(xiàn)作為參考，其程度為它們提供補(bǔ)充本文所給出的那些的示例性程序或者其它細(xì)節(jié)。美國(guó)專利4,992,375美國(guó)專利5,015,580美國(guó)專利5,024,944美國(guó)專利5,416,011美國(guó)專利5,545,545美國(guó)專利5,604,099美國(guó)專利5,637,785美國(guó)專利6,031,154美國(guó)專利6,140,085美國(guó)專利6,184,440美國(guó)專利6,486,383美國(guó)專利6,774,284Adamsefa/"丄A^r"134(3):511-516,2004.AUard,In:P">za》/eso/7VaW5ree力力g,JohnWiley&Sons,NY，50-98,1960.Babae《aZ"/M^.FfM挑i打o/.(To^o義50(1):26-31，2004.BeachyWa/"J肌rev.~《0戸麵.28:451(1990Beilinson"a/"J7zeor.^p;/.Gew".，104(6-7):1132-1140,2002.BoermaandMoradshahi，Cc;p&z'.，15:858-861，1975.BorthwickandParker,5of.100:374-387，1938.BrimandStuber，OopScz"13:528-530,1973.Charestaa/"尸/慮Ce〃鄉(xiāng).8:643(1990ChenandShoemaker,■//fern/.,89:211-215,1998.Chrispeelse"/"J!Ce踐o/"93:306-313,1982.Christianson&a/"<SWeMce,222:632-634，1983.Comai"JV。她317:741-744(1985)CriswellandHume,Ocp&;z'.,12:657-660，1972.deMoraes"a/.，一ca149:221-226，2006.DiersWa/.,7%eor.如/.Ge"e/.，89:297-304，1993.DurantiWa,.,/M^r"134(6):1334-1339,2004.DuttonandSommer，5她c/mz々腦，11(6):700-7002.,1991.EichholtzeM/.，&w^/cCe//M)/.13:67(1987)Elliot"a/.,尸/a^Mo/ec.所o/.21:515(1993EuropeanAppln.0242246EuropeanAppln.0640141EuropeanAppln.0797673Fehr,In:rAeo^yaweJfec/m—e,andOcjp§ea'asiSoy6e朋，IowaStateUniv.，MacmillianPub.Co.，NY，(l)(2):360-376，1987b.Fehr，In:Soybeans:Improvement,ProductionandUses,2ndEdition,Manograph.,16:249,1987a.Fehr,/w:i^y&nWz'zario"o/Oo_p尸/tmto，F(xiàn)ehrandHadley(Eds.)，乂附.Soc.jg/w,awefC，Madison,WI，卯-599,1980.Finera'/.,S"o>>6eaw.'(7eweft'cj,■Mb/eaz/ar丑/o/ogyanrf丑z'ofecAwo/ogy，CABIntl.,VermaandShoemaker(ed)，Wallingford,Oxon,UK，250-251,1996.Fisher"a/.,尸/cmm狎'oZ.，102(3):1045-1046,1993.Fraley"a/.，尸roc.淑/.加dSW.園，80:4803,1983.Geiser"aZ,,G微，48:109,1986.Gordon-Kamma/.，P/aw《CeZ/,2:603-618,1990.HajikaWa/,々".《/42:787-792,1992.Hamner，/w.'T7zei"wdMcrio"o/_F7owen'"gvSo附eCosei^'Wohes,Evans(ed),CornellUniv.Press,Ithaca，NY,62-89,1969.Haradaa/.,/5yeed.，33:23-30，1983.Hartweck"a/.,/"「仿-oCe//.Deve/o;.及.o.，24:821-828,1988.Hildebrande《a/"Cra;22:851-853，1982.Jonesa/"5Wewce,266:789，1994.Kitamuraea/,批5reec"35:413-420,1985.Kitamura,jgr/c.歷o/.CAew.,27:234-239,1984.Knutzon"fl/"iVoc.7Va"^cfi^.89:2624,1992.LadinWa/.,P/aW尸/i3OT7"84:35-41,1987.LanderandBotstein,Ge7!幼o(hù)s,121(1):185-199,1989.Leea。/"五MS(9J:,7:1241,1988.LivakWa/"艦G肌，9:341-342,1995.Logemann"fl/"5z.o/rec/wo/ogv,10:305,1992.Marshalle《fl/.，?。or.如/.Ge織83:435,1992.Martin"a/"towce,262:1432,1993.Miki"a/"rAeon柳/.C7e7zW"80:449,1990.Mindrinose"/.，Ce〃，78:1089，1994.Moriyama"a/"歷osa'.歷ofe由o/.所oc力e附.,68(2):352-359,2004.Myers,EPO0273085Natarajan&a/"/尸/.尸A;/i7'o/.(inpress).Nielsena/"In:Ce〃"/armo/ecw/orWo/ogy<^/*//aw,j《eddeve/o/me"/,LarkinsandVasilK(Eds).,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,TheNetherlands,151-220，1997.Nielsen"CW/.，1:313-328,1989.Nishi"<J!淑r,133(2):352-357,2003.Oritaetal.,Genomics,8(2):271-278,1990.PCTAppln.US93/06487PCTAppln.W093/19181PCTAppln.WO96/30517Pen"aZ.，及'o/Jfec72woZogy,10:292，1992.PoehlmanandSleper，La:Sree&wgFz'eWOo;w，IowaStateUniversityPress,Ames，1995.Przibilaa/.，尸/加CW/,3:169,1991.ReiteriVoc.胸/.爿cad固，89(4):1477-1481,1992.ShahScz'ewce,233:478,1986.ShanmugasundaramandTsou，OqpScz'.,18:598-601,1978.ShibataeM/.,■/5z'oZ.CTem.,262:10080-10085,1987.ShibataeM/.,J!5zo/.CAem.,263:6816-6821,1988.Shibles""Z"In.'Oo;尸一油gy,5"o附eC咖船《o"'ay，Evans(ed),CambridgeUniv,Press,Cambridge,England,51-189，1975.Shiroza"d,/5ac《eo/.,170:810,1988.Simmonds,In:WMczj/aso/。鄰z'附prov柳eW，Longman,Inc.,NY，369-399,1979.SneepandHendriksen,In:尸/awf6麼必"gpe邵e"z'vas，Wageningen(ed),CenterforAgriculturalPublishingandDocumentation,1979.S0gaardeM/.,J!5zo/.C/e肌，268(30):22480-22484，1993.SommereM/.,歷她由z々譜，12(l):82-87，1992.Stalkera/.,Sdewce,242:419-423,1988.Steinmetz"a/.，Mo/.C7饑Ce"",,20:220,1985.Utsumi，In:W聽cay朋dM^r故o"及咖"rc/;j,Kinsella(Ed.),36:89-208，AcademicPress,SanDiego，CA，1992.VandenElzen"a/"尸toz《編.5z'o/.,5:299,1985.Wright""/.,7V"",'Ce//及e/7。,W,5:150-154,1986.Yenofsky"d"Mo/.Gew.Ge"e《"211:215-222,1988.權(quán)利要求1.包含非轉(zhuǎn)基因突變的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆品種植物，所述非轉(zhuǎn)基因突變提供賦予提高的種子J3-伴大豆球蛋白含量的Gy3和Gy4無效表型。2.權(quán)利要求1的植物，其中所述種子(3-伴大豆球蛋白含量是至少約30%。3.權(quán)利要求1的植物，其中所述種子P-伴大豆球蛋白含量是至少約40%。4.權(quán)利要求2的植物，其中所述種子(3-伴大豆球蛋白含量進(jìn)一步定義為選自約30%-約60%,約35%-約60%，約40%-約60%,約35%-約55%,約40%-約55%,和約40%-約50%。5.權(quán)利要求1的植物，定義為包含小于約25%總提取的蛋白的種子酸性大豆球蛋白含量。6.權(quán)利要求1的植物，定義為包含小于約18%總提取的蛋白的種子酸性大豆球蛋白含量。7.權(quán)利要求1的植物，定義為包含小于約10%總提取的蛋白的種子酸性大豆球蛋白含量。8.權(quán)利要求l的植物，定義為包含小于約8%總提取的蛋白的種子酸性大豆球蛋白含量。9.權(quán)利要求1的植物，其中提供Gy3和Gy4無效表型的所述非轉(zhuǎn)基因突變賦予與缺乏所述非轉(zhuǎn)基因突變的植物相比降低的Qy/和Gy2表達(dá)。10.權(quán)利要求1的植物，進(jìn)一步定義為包含在系B2G2中發(fā)現(xiàn)的Gy/和Gy2突變，所述系B2G2的種子的代表樣品在ATCC登記號(hào)PTA-6893下保藏。11.權(quán)利要求1的植物，其中所述提供賦予提高的種子p-伴大豆球蛋白含量的Gy3和Gy4無效表型的突變是提供在系譜3系中發(fā)現(xiàn)的Gy3和Gy4無效表型的突變，所述系譜3系的種子的代表樣品在ATCC登記號(hào)PTA-6892下保藏。12.權(quán)利要求1的植物，定義為包含跨越上游啟動(dòng)子區(qū)、外顯子I和內(nèi)含子I的Gyl基因座中的缺失。13.權(quán)利要求l的植物，其中所述植物包含Qy3等位基因，后者在所述等位基因中位置處含有與SEQIDNO:164的核苷酸848-851對(duì)應(yīng)的核苦酸TGAT插入。14.權(quán)利要求l的植物，其中所述植物包含Gy4等位基因，后者在所述等位基因與SEQIDNO:165的核苷酸682對(duì)應(yīng)的位置處含有腺嘌呤，它取消翻譯起始密碼子。15.權(quán)利要求l的植物，還包含導(dǎo)致降低的Qy5蛋白含量的突變。16.權(quán)利要求l的植物，其中所述植物包含Qy5等位基因，后者包含選自下述的至少笫一種多態(tài)性在位置363處的單核苷酸多態(tài)性(SNP),在位置612處的SNP,在位置447-453處的缺失，和在位置519-524處的缺失，其中所述位置是與SEQIDNO:166相對(duì)應(yīng)的所述等位基因中的位置。17.權(quán)利要求l的植物，其中所述Gy3和Gy4無效表型通過用于表達(dá)在系B2G2中發(fā)現(xiàn)的所述無效表型的遺傳方式提供，所述系B2G2的種子的代表樣品已經(jīng)在ATCC登記號(hào)PTA-6893下保藏。18.權(quán)利要求1的植物，定義為生產(chǎn)CIELAB色標(biāo)a*值是至少5且LN直大于54的大豆。19.權(quán)利要求l的植物，進(jìn)一步定義為包含轉(zhuǎn)基因。20.權(quán)利要求19的植物，其中所述轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步定義為賦予選自下述的性狀除草劑耐受性；抗病性；昆蟲或害蟲抗性;改變的脂肪酸、蛋白或糖類代謝;增加的谷粒產(chǎn)量；改變的植物成熟度和改變的形態(tài)學(xué)特征。21.權(quán)利要求20的植物，其中所述轉(zhuǎn)基因賦予對(duì)草甘膦除草劑的耐受性。22.權(quán)利要求1的植物，還包含選自/jc/、/jc2和/;d的脂加氧酶無效等位基因。23.權(quán)利要求22的植物，進(jìn)一步定義為包含至少2個(gè)所述無效等位基因。24.權(quán)利要求22的植物，進(jìn)一步定義為包含/x八/jc2無效表型。25.權(quán)利要求22的植物，進(jìn)一步定義為包含/;c/、/義2和/x無效表型。26.權(quán)利要求22的植物，其中所述脂加氧酶無效等位基因是非轉(zhuǎn)基因的無效等位基因。27.權(quán)利要求22的植物，其中所述脂加氧酶無效等位基因是/jc2。28.權(quán)利要求l的植物，進(jìn)一步定義為包含Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI)無效等位基因。29.權(quán)利要求1的植物的植物部分。30.權(quán)利要求29的植物部分，進(jìn)一步定義為花粉、胚珠、種子、分生組織或細(xì)胞。31.權(quán)利要求29的植物部分，還包含種子部分。32.權(quán)利要求1的才直物的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。33.權(quán)利要求32的組織培養(yǎng)物，其中所述可再生細(xì)胞是胚、分生細(xì)胞、花粉、葉、根、根尖或花。34.權(quán)利要求l的植物，定義為通過包含下述步驟的方法制備(a)使笫一種和笫二種大豆植物雜交，其中所述第一種和第二種植物共同地包含導(dǎo)致Gy3和Gy^無效表型和提高的種子(3-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變，且其中第一種和第二種植物共同地包含能賦予所述植物的子代植物農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的種質(zhì);和(b)測(cè)定雜交產(chǎn)生的子代大豆植物的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征和Gy3和Gy4蛋白含量;和(c)選擇包含所述Gy3和Gy4無效表型和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的至少第一種子代植物，以得到權(quán)利要求1的植物。35.權(quán)利要求34的植物，其中所述第一種或第二種大豆植物之一是品種B2G2,其中B2G2的種子的代表樣品已經(jīng)在ATCC登記號(hào)PTA-6893下保藏。36.權(quán)利要求34的植物，其中所述第一種和第二種植物共同地包含導(dǎo)致Gyl-Gy4無效表型和提高的種子(3-伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變，且其中第一種子代植物包含導(dǎo)致Gyl-Gy4無效表型的非轉(zhuǎn)基因突變。37.生產(chǎn)大豆食物或飼料產(chǎn)品的方法，其包含得到權(quán)利要求l的植物或其部分，和從其生產(chǎn)食物或飼料。38.權(quán)利要求37的方法，其包含從權(quán)利要求1的植物得到種子，和從種子制備食物。39.權(quán)利要求37的方法，其中所述食物是蛋白濃縮物、蛋白分離物、大豆殼、粗粉或面粉。40.權(quán)利要求37的方法，其中所迷食物是油。41.權(quán)利要求37的方法，其中所述食物包含飲料、泡制食物、沙司、調(diào)味品、色拉調(diào)料、果汁、糖漿、甜食、糖衣和餅餡、軟的冷凍產(chǎn)品、糖食或者半成品食物。42.通過權(quán)利要求37的方法生產(chǎn)的食物，其中所述食物包含來自權(quán)利要求1的植物的基因組材料。43.生產(chǎn)大豆種子的方法，其包含使權(quán)利要求1的植物與它自身或第二種大豆植物雜交。44.權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步定義為制備雜種大豆種子的方法，其包含使權(quán)利要求1的植物與第二種不同的大豆植物雜交。45.預(yù)測(cè)大豆植物表型的大豆球蛋白和(3-伴大豆球蛋白含量的方法，其包含測(cè)定大豆植物中在離非轉(zhuǎn)基因突變G>7、Gy2或Gy4等位基因50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)域中至少第一種多態(tài)性的存在，以鑒別賦予降低的大豆球蛋白和提高的(3-伴大豆球蛋白含量的至少第一種等位基因。46.植物育種的方法，其包含下述步驟(a)測(cè)定大豆植物中在離非轉(zhuǎn)基因突變Gy/、Gy2或Q^等位基因50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)域中至少第一種多態(tài)性的存在，所述等位基因賦予降低的大豆球蛋白和提高的(3-伴大豆球蛋白含量；(b)選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物，以選擇所述等位基因；和(c)使包含所述多態(tài)性的第一種大豆植物與第二種大豆植物雜交，以產(chǎn)生包含至少笫一種非轉(zhuǎn)基因突變G少AGy2或G少4等位基因的子代植物，所述等位基因賦予降低的大豆球蛋白和提高的(3-伴大豆球蛋白含量。47.權(quán)利要求46的方法，還包含下述步驟(d)使用步驟(c)的子代植物作為原材料，重復(fù)步驟(a)-(c)至少約2-10次，以生產(chǎn)其它子代植物。48.權(quán)利要求46的方法，其中所述第二種大豆植物屬于農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的品種。49.權(quán)利要求46的方法，其包含選擇包含所述多態(tài)性和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的大豆植物。50.權(quán)利要求46的方法，其中所述突變QW等位基因包含缺失。51.權(quán)利要求46的方法，其中所述非轉(zhuǎn)基因突變Qy/、Gy2或QW等位基因?qū)?yīng)著在系B2G2中發(fā)現(xiàn)的突變等位基因，所述系B2G2的種子的代表樣品在ATCC登記號(hào)PTA-6893下保藏。52.權(quán)利要求46的方法，其中所述突變G^/等位基因包含取消翻譯起始密碼子的點(diǎn)突變。53.權(quán)利要求46的方法，還包含選擇關(guān)于所迷多態(tài)性純合的第一種大豆々直物。54.權(quán)利要求46的方法，還包含選擇包含至少2種多態(tài)性的第一種大豆植物。55.權(quán)利要求46的方法，其包含測(cè)定在QW和Qy4等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性。56.權(quán)利要求46的方法，其包含測(cè)定在Qy2和等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性。57.權(quán)利要求46的方法，其包含測(cè)定與SEQIDNO:165的核苷酸682相對(duì)應(yīng)的Gy4等位基因中的多態(tài)性。58.權(quán)利要求46的方法，還包含選擇包含至少3種多態(tài)性的第一種大豆4直物。59.權(quán)利要求46的方法，還包含選擇包含在非轉(zhuǎn)基因突變Qy3等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性的第一種大豆植物。60.權(quán)利要求59的方法，其中選擇第一種大豆植物包含，檢測(cè)選自下述的Gy3等位基因中的至少第一種多態(tài)性在位置848-851處的插入，在位置1083處的SNP,在位置1120處的SNP,和在位置1866處的SNP;其中所述位置是與SEQIDNO:164相對(duì)應(yīng)的所述等位基因中的位置。61.權(quán)利要求46的方法，還包含選擇第一種大豆植物，其包含在非轉(zhuǎn)基因突變Gy5等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性。62.權(quán)利要求61的方法，其中選擇植物包含，檢測(cè)選自下述的Gy5等位基因中的至少第一種多態(tài)性在位置363處的單核普酸多態(tài)性(SNP)，在位置612處的SNP,在位置447-453處的缺失，和在位置519-524處的缺失，其中所述位置是與SEQIDNO:166相對(duì)應(yīng)的所述等位基因中的位置。63.權(quán)利要求46的方法，其包含檢測(cè)選自NS019卯02、NS019卯03和NSO199008的標(biāo)記。64.權(quán)利要求46的方法，還包含選擇第一種大豆植物，其包含在非轉(zhuǎn)基因突變/x2等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性。65.權(quán)利要求62的方法，其中所述多態(tài)性包含選自下述的/;c2等位基因中的多態(tài)性在位置323處的單核苷酸多態(tài)性(SNP),在位置439處的SNP,在位置1390處的SNP,在位置1431處的SNP，在位置1458處的SNP,在位置2486-2487處的缺失，和在位置2542處的SNP;其中所述位置是與SEQIDNO:158相對(duì)應(yīng)的所述等位基因中的位置。66.權(quán)利要求46的方法，其中測(cè)定大豆植物的多態(tài)性包含PCR。67.權(quán)利要求46的方法，其中通過用標(biāo)記的核苷酸探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)所述多態(tài)性。68.權(quán)利要求46的方法，其中通過DNA測(cè)序^:測(cè)所述多態(tài)性。69.權(quán)利要求46的方法，其中步驟(a)還包含，測(cè)定大豆植物中在離Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI)無效等位基因50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)域中至少第一種多態(tài)性的存在。70.權(quán)利要求46的方法，其中步驟(b)的選擇至少第一種大豆植物還包含，選擇第一種大豆植物，其包含在Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI)無效等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性，以選擇所述無效等位基因。71.權(quán)利要求69的方法，其中所述Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI)無效等位基因50cM內(nèi)的多態(tài)性選自在位置622-623處的2-bp缺失，和在位置624處的突變，其中所述位置是與SEQIDNO:167相對(duì)應(yīng)的所述等位基因中的位置。72.權(quán)利要求69的方法，其中測(cè)定大豆植物的多態(tài)性包含PCR。73.權(quán)利要求69的方法，其中通過用標(biāo)記的核苷酸探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)所述多態(tài)性。74.權(quán)利要求69的方法，其中通過DNA測(cè)序檢測(cè)所述多態(tài)性。75.植物育種的方法，其包含下述步驟(a)測(cè)定大豆植物在/似2等位基因中選自SNP1W0、SNP1"1、SNP1458和INDEL2486-2487的至少第一種多態(tài)性的存在，其中所述等位基因與降低的脂加氧酶-2含量有關(guān)；(b)選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物，以選擇所述等位基因；和(c)使第一種大豆植物與第二種大豆植物雜交，以產(chǎn)生包含所述多態(tài)性和所迷等位基因的子代植物。76.權(quán)利要求75的方法，還包含下述步驟(d)使用步驟(c)的子代植物作為原材料，重復(fù)步驟(a)-(c)至少約2-10次，以生產(chǎn)其它子代植物。77.權(quán)利要求75的方法，還包含選擇關(guān)于所述多態(tài)性純合的第一種大豆纟直物。78.權(quán)利要求75的方法，還包含選擇包含至少2種所述多態(tài)性的第一種大豆植物。79.權(quán)利要求75的方法，還包含選擇包含至少3種所述多態(tài)性的第一種大豆植物。80.試劑盒，其包含擴(kuò)增和/或雜交與非轉(zhuǎn)基因的大豆突變Gy八Gy2、或G^等位基因連鎖不平衡的至少第一種多態(tài)性的探針或引物，所述等位基因賦予降低的大豆球蛋白和提高的(3-伴大豆球蛋白含量。81.試劑盒，其包含擴(kuò)增和/或雜交與/o;c2無效等位基因連鎖不平衡的至少第一種多態(tài)性的探針或引物，其中所述多態(tài)性選自SNP1390、SNP1431、SNP1458和INDEL2486-2487。82.具有提高的種子P-伴大豆球蛋白含量的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆品種的植物，其包含提供選自Gyl、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5的至少2種大豆球蛋白亞基的無效表型的非轉(zhuǎn)基因突變。全文摘要本發(fā)明如下克服了本領(lǐng)域的缺陷通過提供農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆植物，其具有選自Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5的至少2種大豆球蛋白亞基的非轉(zhuǎn)基因突變，例如在種子中賦予Gy3和Gy4無效表型和提高的β-伴大豆球蛋白含量。本發(fā)明也提供了這些植物的衍生物和植物部分及其用途。作為本發(fā)明的部分，也提供了標(biāo)記輔助的選擇大豆品種的方法，所述大豆品種包含賦予降低的Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5表型的非轉(zhuǎn)基因突變。也提供了生產(chǎn)另外脂加氧酶和/或Kunitz胰蛋白酶抑制劑無效的植物的方法，和由此生產(chǎn)的植物。本發(fā)明的重要之處是，來自這樣的植物的大豆是優(yōu)選的飲食添加劑，并提供重要的健康益處。文檔編號(hào)A01H5/10GK101312644SQ200680041478公開日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年9月7日優(yōu)先權(quán)日2005年9月7日發(fā)明者D·佩,J·拜倫,J·楊,K·吳,N·布林格,R·賴特,T·霍爾西申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司