專利名稱：：用于治療和診斷與骨髓增生異常綜合征(mds)相關(guān)的增殖性病癥的sall4的靶向的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—般而言，本發(fā)明涉及與Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號通路相關(guān)的因子，更具體而言，本發(fā)明涉及通路的轉(zhuǎn)錄成分之間的相互作用，所述轉(zhuǎn)錄成分包括SALL蛋白家族和OCT4，其涉及胚胎和腫瘤干細胞的調(diào)節(jié)，包括通過靶向這些相互作用診斷和治療增殖性病癥的方法。背景信息源自胚泡的內(nèi)細胞群(ICM)的胚胎干細胞能進行自我更新(self-renewing)細胞分裂并在未確定的時期內(nèi)保持其多潛能性。當體外培養(yǎng)時，胚胎干細胞也可分化成多種不同細胞類型。Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號通路與正常人類干細胞(HSCs)和慢性髓細胞樣白血病(CML)的粒系-巨噬系祖細胞(granulocyte-macrophageprogenitor)(GMPs)的自我更新相關(guān)。此外，轉(zhuǎn)錄因子OCT4已被鑒別為在前植入發(fā)展期間形成ICM的主要調(diào)控子。而且，OCT4蛋白通過調(diào)控寬范圍的基因似乎在保持胚胎干細胞(ES)的多潛能性方面起主要作用。在癌癥的病原學中，已經(jīng)考慮干細胞的作用。不斷增加的證據(jù)表明腫瘤可能包含著這類腫瘤干細胞，即導致腫瘤生長的稀有細胞(rarecell)。這些具有不確定增殖潛能的稀有細胞可解釋癌細胞應答傳統(tǒng)治療方法中觀察到的抗性。己知干細胞在成熟組織中可被鑒別，其中這類細胞源自特定組織；例如造血細胞。由于在正常器官發(fā)生中干細胞的自我更新特性被緊緊控制，自我更新的脫調(diào)節(jié)(de-regulation)可能導致致癌作用。例如，骨髓增生異常綜合征(MDS)是在造血干細胞(HSC)—定水平下基因異常積聚為標志的血液病，在該水平下導致各類血細胞減少癥、多譜系分化損傷(multilineagedifferentiationimpairment)和骨髓細胞凋亡。該疾病的致命性是由于各類血細胞減少癥或轉(zhuǎn)化為急性髓細胞性白血病(AML)。AML是以未成熟脊髓祖細胞(myeloidprecursor)在骨髓和外周血中的積聚為特征的血癌。從得自AML患者的骨髓樣品中的基因易位(genetictranslocation)分析，顯然對于血細胞生成關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子在白血病生成中起重要作用。認為AML的發(fā)病機理包括多歩基因更替。因為考慮僅HSCs具有自我更新的能力，所以HSC是多歩積累、白血病前期基因改變和將它們轉(zhuǎn)化為所謂"白血病干細胞"(LSCs)的最佳候選。另夕卜，下游祖細胞(progenitor)可得到自我更新能力并且引起白血病。在當前的化學治療方案中，LSC沒有被特意耙向，然而己經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類細胞導致耐藥性和白血病復發(fā)。SALL基因家族SALL1、SALL2、SALL3和SALL4最初基于它們的DNA序列與Drosophila^fl/"sal)的同源性而克隆。在果蠅屬(Drosophila)中，印a"是形成后面的頭和前面的尾片段所必需的同源異形基因。其在氣管形成、光感受器的終末分化以及翅脈安置(wingveinplacement)中起重要作用。在人類中，SALL基因家族與正常發(fā)育以及腫瘤發(fā)生相關(guān)。SALL蛋白屬于以在整個蛋白分布的多指結(jié)構(gòu)域(multiplefingerdomain)為特征的一組C2H2鋅指(zincfinger)轉(zhuǎn)錄因子。在果蠅氣管形成中，5pa/Z是活化的無翅(Wingless)——Wnt直向同源物(ortholog)——的下游耙。已經(jīng)闡明通過行使共激活因子的功能，SALL1與P-聯(lián)蛋白相互作用，這表明SALL1和Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號通路之間的相互作用是雙向的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及SALL4——果蠅屬(Drosophila)s戸/,的人同系物，其是發(fā)育必需的鋅指轉(zhuǎn)錄因子?？寺〔y序SALL4和其同種型(SALL4A、SALL4B和SALL4C)。本公開內(nèi)容表明SALL4在人初級AML中沒有停止產(chǎn)生。此外，闡述了在鼠科動物模型中的SALL4組成型表達的致白血病的潛力。而且，描述了形成類骨髓增生異常綜合征(MDS)跡象和癥狀的SALL4B-轉(zhuǎn)基因小鼠和隨后的可植入性AML。與骨髓增生異常綜合征(dysmyd叩oiesis)相關(guān)的凋亡的增加在轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓和集落形成(CFU)分析中是明顯的。兩種同種型能與P-聯(lián)蛋白結(jié)合，并且協(xié)同增強Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路。這表明SALL4的組成型表達引起MDS/AML，并且這類表達侵害Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號通路。在相關(guān)的方面，公開的鼠類模型提供研究人MDS/AML轉(zhuǎn)化的平臺，并且研究在白血病干細胞的發(fā)病機理中Wnt/(3-聯(lián)蛋白通路的作用。在一個實施方式中，公開抗體或抗體片段，其與包括SEQIDNO:13所列出的氨基酸序列的多肽相結(jié)合。在另一個實施方式中，公開治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將治療有效量的抗體施用給對象，所述抗體與包括SEQIDNO:13所列出的氨基酸序列的多肽相結(jié)合。在另一個實施方式中，提供治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將具有如下所述多核苷酸的組合物施用給對象，所述多核苷酸具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體、SEQIDNO:5的補體和它們的片段中列出的序列，所述片段包括編碼在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸。在一個實施方式中，公開治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將具有在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4禾口/或SEQIDNO:6中列出的序列的多肽組合物施用給對象。在相關(guān)的方面中，MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。在一個實施方式中，公開診斷對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括提供對象的生物樣品，將該生物樣品在雜交條件下與探針接觸，所述探針包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體或SEQIDNO:5的補體列出的序列的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，并且檢測探針和生物樣品之間的雜交，其中檢測雜交與MDS有關(guān)。在另一個實施方式中，公開診斷對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括提供對象的生物樣品，將該生物樣品與抗體接觸，所述抗體與包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的多肽結(jié)合，并且檢測抗體和樣品之間的結(jié)合，其中檢測結(jié)合與MDS有關(guān)。在一個實施方式中，提供分離白血病干細胞的方法，包括從對象獲得細胞樣品，從不表達SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的細胞分選表達含有SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的多肽的細胞，并且通過骨髓表面標記從表達含有SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的多肽的細胞樣品選擇白血病干細胞。在另一個實施方式中，提供具有人SALL4基因的轉(zhuǎn)基因動物，其中修飾動物以表達含有編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸的核苷酸的人SALL4基因的序列。在相關(guān)的方面中，該動物組成型表達插入的SALL4基因。在一個實施方式中，公開了制備含有人SALL4基因的轉(zhuǎn)基因動物的方法，其中修飾動物以組成型表達含有編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸的核苷酸的人SALL4基因的序列，所述方法包括將含有人SALL4基因的構(gòu)建物的核酸分子引入胚胎細胞，其中所述人SALL4基因含有編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸的核苷酸，從源自引入構(gòu)建物歩驟的細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，飼養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因動物以得到人SALL4基因純合的轉(zhuǎn)基因動物，并且檢測從轉(zhuǎn)基因動物的組織得到的人SALL4轉(zhuǎn)錄物。在一個實施方式中，公開調(diào)節(jié)多核苷酸細胞內(nèi)表達的方法，所述多核苷酸編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸序列，所述方法包括將與多核苷酸雜交的雙鏈RNA(dsRNA)或與多核苷酸雜交的反義RNA或它們的片段引入細胞。在一個實施方式中，公開了識別具有多能性潛能(pluripotentpotential)的細胞的方法，包括將從內(nèi)細胞群(ICM)、腫瘤組織(neoplastictissue)或腫瘤分離的細胞與檢測SALL家族成員蛋白表達的試劑(agent)接觸，并且確定是否SALL家族成員蛋白在該細胞中表達，其中確定SALL家族成員蛋白在該細胞中表達與在細胞中誘導自我更新正相關(guān)，因此，這類表達表示多潛能性。在一方面，SALL家族成員包括SALL1、SALL3禾QSALL4。在相關(guān)的方面中，SALL4是SALL4A或SALL4B。在另一方面，試劑是針對SALL家族成員蛋白或與編碼SALL家族成員蛋白的mRNA互補的核酸的抗體。在相關(guān)的方面中，SALL家族成員蛋白序列包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24。在另一相關(guān)方面，核酸與包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:21和SEQIDNO:23的核酸序列的有義鏈互補。在一方面，細胞是胚胎干(ES)細胞、胚胎癌(EC)細胞、成體干細胞或腫瘤干細胞。在相關(guān)的方面中，組織是對象的血漿或活組織檢査樣品。在進一步相關(guān)的方面，對象是人。在一個實施方式中，公開了識別調(diào)控SALL家族成員蛋白對OCT4表達的影響的試劑的方法，包括用含有啟動子-報告基因構(gòu)建物的載體和含有編碼SALL家族成員蛋白的核酸的載體共轉(zhuǎn)染細胞，其中構(gòu)建物含有可操作連接的OCT4啟動子和編碼基因表達報告蛋白的核酸，將該細胞與試劑接觸并且檢測在存在和不存在該試劑的情況下啟動子-報告基因構(gòu)建物的活性，其中檢測啟動子-報告基因構(gòu)建物的活性與試劑對SALL家族成員蛋白/OCT4相互作用的影響有關(guān)。在相關(guān)的方面中，啟動子區(qū)含有在SEQIDNO:26列出的核酸序列并且表達報告蛋白是熒光素酶。在另一個實施方式中，公開了診斷瘤性或增殖性疾病的方法，包括將對象細胞與檢測SALL家族成員蛋白表達的試劑接觸，和確定SALL家族成員蛋白是否在該細胞表達，其中確定SALL家族成員蛋白在該細胞中表達與在細胞中誘導自我更新正相關(guān)，因此，這類表達表示瘤形成或增殖。在一方面，標記該試劑并且控制歩驟包括通過將對象暴露于對該試劑位置成像的儀器檢測試劑。在相關(guān)的方面中，通過磁共振、X-射線或放射性核素發(fā)射產(chǎn)生圖像。在一個實施方式中，公幵了治療瘤性或增殖性疾病的方法，其中對象細胞表現(xiàn)自我更新的脫調(diào)節(jié)，所述方法包括給對象施用含有抑制SALL4表達的試劑的藥物組合物。在另一個實施方式中，公開了識別具有多能性潛能的細胞的試劑盒(kit)，其包含檢測一種或多種SALL家族成員蛋白的試劑、提供試劑-細胞相互作用和標記試劑的足夠條件的反應物和緩沖液、標記檢測反應物和將試劑與細胞接觸的說明書以及含有所述成分的容器。公開檢測與增殖性疾病或瘤細胞形成進展相關(guān)的細胞的方法，包括將細胞與針對SALL4的抗體接觸，將與抗體結(jié)合的細胞運用到表面分隔的腔(surfacedelimitedcavity)——該腔含有至少兩個用于流體和細胞的進入或出去的孔，和允許細胞和流體通過該腔，其中在流體混合物中抗體結(jié)合的細胞通過光學檢測器檢測出，并且其中將電壓運用到流體從而電壓將結(jié)合的細胞分配到一個或多個收集器中。下面更詳細地描述了根據(jù)本發(fā)明的示例性方法和組合物。附圖簡述圖l(a-c)圖解三種SALL4同種型(SALL4A，SEQIDNO:l[GenBankAcc.No.:AY172738];SALL4B,SEQIDNO:3[GenBankAcc.No.AY170621]);禾口SALL4C,SEQIDNO:5[GenBankAcc.No.AY170622]的性質(zhì)。另外剪接產(chǎn)生兩種變異體形式的SALL4mRNA。圖1(a)SALL4A和SALL4B的蛋白質(zhì)長度和不同數(shù)量特征sal-樣鋅指結(jié)構(gòu)域存在具有變化。SALL4A(編碼1,067氨基酸)含有八個鋅指結(jié)構(gòu)域，而SALL4B(編碼623氨基酸)具有三個鋅指結(jié)構(gòu)域。SALL4C含有276氨基酸并且缺乏與全長SALL4A的氨基酸43到820相應的區(qū)域。兩個變異體都具有外顯子1、3和4，并且SALL4A含有1到4的所有外顯子。然而，SALL4B使用另外的剪接受體，這導致外顯子2的大的3'部分的缺失。圖l(b)表示在不同組織中SALL4A變異體的RT-PCR分析。圖解了SALL4的四個外顯子和它們編碼結(jié)構(gòu)的能力，其中箭頭表示用于SALL4轉(zhuǎn)錄物的PCR擴增(A)的引物。通過RT-PCR的組織依賴性SALL4轉(zhuǎn)錄物的表達(B)。用各種組織的cDNAs擴增對具有引物Al(外顯子2)和Bl(外顯子4)的SALL4A特異性的315-bp期望的產(chǎn)物。使用引物D1(外顯子4)和C1(外顯子l)擴增1,851-bp期望的SALL4B的產(chǎn)物。通過GAPDH確定可比較量的cDNA。圖l(c)表示SALL4蛋白產(chǎn)物，通過SALL4肽抗體識別SALL4A禾BSALL4B。通過10%SDS-PAGE凝膠溶解短暫表達His-SALL犯(第1泳道)、His-SALWA(第2泳道)或?qū)φ蛰d體(第8泳道)的Cos-7細胞的溶胞產(chǎn)物或不同人組織的溶胞產(chǎn)物，將它們轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，并且用N-末端SALL4肽抗體探測。圖2(a-b)表示SALL4在人初級AML和髓細胞性白血病細胞系中的表達。圖2(a)表示在AML中，SALL4沒有停止產(chǎn)生。標準化為GAPDH的SALL4A和SALL4B的實時PCR量表明SALL4A和SALL4B都在純化的CD34+細胞中表達，但是在正常骨髓(N-3沐正常外周血(^3)細胞中SALL4A被快速下調(diào)并且SALL4B停止。與之相反，在15個初級AML樣品和3個髓細胞性白血病細胞系(Kasumi-l、THP-1禾卩KG.l)中，SALL4A或SALL4B或者它們兩者沒有被下調(diào)。針對在純化的CD34+細胞中SALL4A或SALL4B的表達校準結(jié)果。圖2(b)表示在人AML(FABM1-M5,N-81)中SALL4蛋白的組成型表達，如通過免疫組織化學染色表示的。在正常骨髓(A)、正常脾臟(B)或正常胸腺(C)中，沒有檢測到SALL4表達。將所有細胞核染藍。CD34+HSC/HPCs的核表明表示SALL4表達的褐色染色(D);急性髓細胞性白血病胚細胞(blasts)在微陣列白血病組織樣品中表明相似的染色(E，低倍率[x4])。每一圓形代表一個白血病樣品。F部分表示一個白血病樣品的(F)高倍率(xlOO)圖。紅色箭頭表示陽性核染色。圖3(a-h)表示SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠具有MDS-樣/AML表型。圖3(a)闡明SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生CMV/SALL4B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物和轉(zhuǎn)基因系507的PCR分析。(A)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物的示意圖。將SALL4B的大約1.8-kb的cDNA亞克隆入pCEP4載體，并且通過用Sail消化使CMV/SALL4構(gòu)建物興奮。(B)SALL4B在轉(zhuǎn)基因小鼠中組織分布。在A部分，用于RT-PCR擴增的引物的位置用箭頭表示。對于人SALL4BC-末端特異性的引物被用作5'引物，與對各種組織RT-PCR的SV40-非編碼序列-特異性引物一起。圖3(b)表示在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中MDS-樣變化。正常、年齡匹配的WT小配偶(littlemates)的外周血吉姆薩染色示出正常嗜中性粒細胞(A)，和正常紅細胞和血小板(B，黑色箭頭)。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，嗜中性粒細胞是多葉核的(E)，并且擬-Pelger-Huet-樣非典型白細胞存在(F-H)，并且幼稚細胞數(shù)量增加(I-K)。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，也觀察到成核的紅細胞(L，紅色箭頭)、巨血小板(M，紅色箭頭)，和多染性(N)。在源自轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓的細胞離心涂片器(cytopsin)中，發(fā)現(xiàn)小葉過少(hypolobulated)核的雙核發(fā)育異常的紅細胞(O，紅色箭頭)和發(fā)育異常的巨核細胞(P，紅色箭頭)。WT對照動物的紅細胞前體(C)和巨核細胞(D)被表示以進行比較。圖3(c)表明AML在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中可觀察到。在外周血(A，x600)、骨髓活檢標本(B，xlOO;C，x400)、骨髓涂片(D，x600)、肝(E，x100)、淋巴結(jié)(F，x400)和脾(G和H，大體觀察(grossview);I，xlOO;和插入圖x400)中，存在胚細胞。圖3(d)表示SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中AML的流式細胞術(shù)分析。對于CD45、c-kit、Gr-l和Mac-l，AML細胞是陽性的；對于B220、CD3和Terl19是陰性的。圖3(e)表示將SALL4B-誘導的AML連續(xù)植入NOD/SCID小鼠。在白血病植入后6周，在NOD/SCID小鼠中，通過白血病浸潤引起的脾腫大(3e-A黑色箭頭，3e-C)、肝腫大(3e-A雙黑色箭頭，3e-D)、淋巴結(jié)腫大(3e-B黑色箭頭，3e-E)和腎無力(palekidney)(3e-B雙黑色箭頭，3e-F)的總圖(A&B)和組織學(B、C、D、E,x200)。圖3(f)表明SALL4B轉(zhuǎn)基因和對照小鼠的骨髓之間的比較。與對照WT小鼠相比，SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓示出增加的細胞構(gòu)成(cellularity)、骨髓種群(Gr-l/Mac-l雙陽性)、幼稚種群(c-kit陽性)和凋亡(膜鈣蛋白V陽性，PI陰性)。圖3(g)表示在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的CFU中有增加量的幼稚細胞和凋亡。在培養(yǎng)的第7天，在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的CFU中比對照CFU(A)中觀察到更大量的幼稚細胞(B、C和D，紅色箭頭)和凋亡細胞(B、C和D，雙紅色箭頭)。與這種形態(tài)學觀察相一致，有增加的凋亡(膜鈣蛋白V陽性，PI陰性，E)和更多的CD34+幼稚細胞(F)。圖3(h)闡述SALL4B轉(zhuǎn)基因和對照小鼠的骨髓CFU之間的比較。在SALL4B轉(zhuǎn)基因和對照小鼠(A)中，發(fā)現(xiàn)不同類型群落的百分比。與對照小鼠相比，SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠CFU表明CFU隱GM(B)(轉(zhuǎn)基因53.6±10.3,N=13，相對比WT:38.1±3.1，N=8;P^.002)統(tǒng)計顯著增力B，并且BFU-E(轉(zhuǎn)基因7.8士3.8,N43，相對比WT:14.1±2.7,N=8;P=O.OOl)增加。圖4(a-d)表示SALL4和Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路之間的相互作用。圖4(a)表明SALL4A和SALL4B都可以與|3-聯(lián)蛋白相互作用。用HA-SALL4A或HA-SALL4B短暫轉(zhuǎn)染從Cos-7細胞制備的核提取物(溶胞產(chǎn)物)。(A)抗-HA抗體識別SALL4A(165kDa)和SALL4B(95kDa)。(B)在溶胞產(chǎn)物檢測(3-聯(lián)蛋白。(C)使用HA親和性樹脂實施免疫沉淀反應，并且使用抗P-聯(lián)蛋白抗對其進行檢測。卩-聯(lián)蛋白在HA-SALL4A和HA-SALL4B降低中很容易檢測。圖4(b)表示SALL4A和SALL4B活化Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路。用l.Opg的SALL4A或SALL4B質(zhì)粒和TOPflash報告質(zhì)粒(UpstateUSA,Chicago,IL)轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞。在用Wntl或模擬品剌激24-h后，測量熒光素酶活性。圖4(c)表示在CML的胚細胞期(N42)而不是慢性期(N41)存在SALL4蛋白表達，如免疫組織化學染色表示的。(A)表示在不同時期的CML標本的組織陣列的低倍數(shù)示圖。在慢性期CML(B)不存在SALL4表達，所有細胞核保持藍色(B,x4;D，x400)。然而在胚細胞-轉(zhuǎn)捩(crisis)-期CML存在SALL4表達，如SALL4棕色核染色所指出的(C,x4;E,x400)。在CML加速期(N-6)，其中胚細胞數(shù)量增加但是仍<15%，僅幼稚胚細胞被觀察到對SALL4表達染色陽性(F,紅色箭頭)；成熟嗜中性粒細胞不染色(F，黑色箭頭，x600)。圖4(d)表示工作假設(shè)(workinghypothesis)。在人千細胞/祖細胞表達SALL4，但是在正常血細胞生成期間不存在成熟造血細胞。SALL4同種型的組成型表達(沒有停止產(chǎn)生SALL4)導致阻斷分化和具有千細胞庫(stemcellpool)異常膨脹的組成型更新，這導致白血病轉(zhuǎn)化(+，存在SALL4表達；-，不存在SALL4表達)。圖5圖解SALL4B對OCT4啟動子劑量依賴性的影響。將0.3嗎的OCT4-Luc構(gòu)建物(PMOct4)和O.l嗎海腎質(zhì)粒和增加量的(0-1.0嗎)SALL4B或pcDNA3載體對照共轉(zhuǎn)染。圖6表示OCT4對SALL基因家族成員啟動子的影響。每一(0.3|ttg)SALL-Luc啟動子構(gòu)瑋物(即pSALLI、pSALL3和pSALL4)和0.9嗎的OCT4或pcDNA3載體對照在HEK-293細胞中共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時后，評估每一組的熒光素酶活性。圖7表示SALL4同種型A和B對SALL4啟動子活性的影響。將0.3叫的SALL4-Luc和O.lpg表達質(zhì)粒的SALL4A或SALL4B在不同細胞系(HEK-293或COS-7)中共轉(zhuǎn)染；pcDNA3載體被用作對照。將熒光素酶活性標準化為海腎報告活性。值表示三次實驗的平均士標準差(s.e.)。圖8表示SALL4A對SALL4啟動子活性的劑量依賴性影響。在HEK-293細胞中，將0.3叫的SALL4-Luc禾口0.1pg海腎質(zhì)粒和增加比例的SALL4A構(gòu)建物和對照pcDNA3載體共轉(zhuǎn)染。將熒光素酶活性標準化為海腎報告活性。圖9表示SALL4A對SALL1和SALL3啟動子活性的影響。每一(0.3|ig)SALL-Luc啟動子構(gòu)建物和0.9嗎的SALL4A質(zhì)粒或pcDNA3載體(對照)在HEK-293細胞中短暫共轉(zhuǎn)染。圖10表示在存在過量SALL4A情況下，OCT4對SALL4啟動子的影響。將0.25嗎的SALL4-Luc構(gòu)建物(pSALL4)與等量(0.5pg)的SALL4A和OCT4質(zhì)粒在HEK-293細胞中瞬時共轉(zhuǎn)染。將pcDNA3用作對照。圖11表示在存在SALL4情況下，OCT4對其它SALL成員啟動子的影響。用不同SALL成員啟動子報告基因(pSALLl或pSALL3)和OCT4質(zhì)粒和/或SALL4A構(gòu)建物瞬時共轉(zhuǎn)染在24孔平板中接種的HEK-293細胞。將pcDNA3用作對照。圖12表示，自身啟動子相互作用對其它SALL蛋白家族成員啟動子活性的影響。將HEK-293細胞接種于24孔平板上，并且用0.3嗎SALL1-Luc報告構(gòu)建物和各種量的SALL1質(zhì)粒(0.45和0.9ng)SIXl——先前發(fā)現(xiàn)活化SALU啟動子，并被用作陽性對照——進行瞬時轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染。將熒光素酶活性標準化為海腎報告活性。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明的組合物、方法和培養(yǎng)方法之前，應該理解本發(fā)明不擬限定于所描述的特定的組合物、方法和實驗條件，同樣組合物、方法和條件可以變化。也應該理解本文使用的方法僅僅是以描述具體實施方式為目的的，其不擬進行限定，因為本發(fā)明的范圍僅僅在所附的權(quán)利要求書中進行限定。如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一("a"、"an"和"the")"包括復數(shù)涵義，除非文中明確指明相反。因此，例如"一種核酸(anuclearacid)"的涵義包括一種或多種核酸，和/或本文描述的組合物類型，在閱讀了本公開內(nèi)容等后，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的意義相同的意義。相似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料可被用于本發(fā)明的實施或檢測，將被理解修改和變化被包含在本公開的精神和范圍內(nèi)。本文所提及的所有出版物整體被引入本文作為參考。同源基因框基因和同源異型基因在正常發(fā)育中起重要作用。一些同源基因框基因如Hox和Pax也在腫瘤發(fā)生或白血病發(fā)生中行使癌基因或腫瘤抑制物的功能。因為異質(zhì)SALL4突變導致杜安放射線綜合征(DuaneRadialRaysyndrome),所以在人發(fā)育中，SALL4、同源異型基因和轉(zhuǎn)錄因子的重要作用被認知。在相關(guān)的方面中，本文描述在白血病發(fā)生中SALL4的癌基因作用。在一個實施方式中，本公開內(nèi)容鑒別兩種SALL4同種型SALL4A和SALL4B。在相關(guān)的方面中，本公開提供SALL4核酸和蛋白質(zhì)作為工具診斷和治療具有增殖性疾病如血液惡性腫瘤和其它包含SALL4核酸和蛋白質(zhì)組成型表達的腫瘤的分析。在相關(guān)的方面中，SALL4作為惡性干細胞標記，以便診斷和治療癌癥。例如，在血細胞生成期間，SALL4同種型在CD34+HSC/HPC群中表達，并且在正常人骨髓核外周血中迅速停止(SALL4B)或下調(diào)(SALL4A)。與之相比，在被檢測的所有AML樣品(N-81)中，SALL4被組成型表達，并且在人初級AML和髓細胞性白血病細胞系中沒有停止。在相關(guān)的方面中，通過SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生，直接檢測體內(nèi)SALL4組成型表達的致白血病能力。這類轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)了失調(diào)的血細胞生成，非常像人MDS的血細胞生成失調(diào)，并且表現(xiàn)AML是可植入的。在這些SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中，MDS-樣特征不需要協(xié)同突變并且在最早2個月大的時候被觀察到。在這些小鼠中觀察到的無效血細胞生成的特征為如在人MDS中，細胞過多的骨髓和反常的外周血細胞減少(嗜中性粒細胞減少和貧血)和發(fā)育異常，這相對于注意到的骨髓中增加的凋亡可能是次要的。盡管不被理論所束縛，在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中，白血病形成后期發(fā)作原因可能是在28個月的重復應力(replicativestress)期間，額外的基因損傷的積聚。疾病的后期發(fā)作也可能是SALL4-誘導的基因組不穩(wěn)定性。此外，特異性、再發(fā)的染色體易位表現(xiàn)許多白血病的特征，其可山于免疫球蛋白或T細胞受體基因重排的正常過程的衰減(breakdown)，這引起之間-染色體易位而不是內(nèi)染色體重排。在染色體易位斷裂點將遺傳信息從基因流到蛋白質(zhì)具有幾個治療劑可以干擾的點。研究鋅指結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的序列特異性結(jié)合元素可被用來產(chǎn)生能作為基因開關(guān)(geneswitch)的新生序列特異性結(jié)合元素，所述基因開關(guān)可靶向染色體融合連接以停止異?；蛉诤袭a(chǎn)物的表達。在一個實施方式中，SALL4可被用作作為基因開關(guān)靶向染色體融合連接的融合蛋白的成分，以調(diào)節(jié)基因融合產(chǎn)物的表達。重組融合蛋白的產(chǎn)生在本領(lǐng)域是公知的(參見，例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989》。在一個實施方式中，檢測SALL4蛋白和/或核酸，以診斷淋巴瘤和白血病或其它類型癌癥的亞群。在另一個實施方式中，SALL44蛋白和核酸的檢測可被用來識別處于形成/或得增殖性疾病的危險下的對象，包括但不限于人類對象。在進一步的實施方式中，公開用于鑒別改變SALL44蛋白和核酸水平的化合物的方法。在相關(guān)的方面中，SALL4可作為治療靶，其中阻斷SALL4的功能可抑制腫瘤的形成和發(fā)展。在另一方面，涉及白血病發(fā)生的潛在機制的研究表明SALL4A和SALL4B與P-聯(lián)蛋白相互作用，所述P-聯(lián)蛋白是涉及HSC自我更新的Wnt信號通路的必要成分。另外，在受體基因分析中，它們兩種都能活化Wnt/p-聯(lián)蛋白通路，這與在果蠅和人類中SALL家族功能相一致。而且，與P-聯(lián)蛋白的情況相似，SALL4在CML中的表達在不同的疾病期變化在慢性期不存在SALL4表達，在加速期僅在幼稚胚細胞中可檢測到，而在胚細胞期中強烈陽性。在這些研究的基礎(chǔ)上，公開了工作假設(shè)(例如，參見圖4d)。盡管不被理論所束縛，AML中SALL4的組成型表達可能使白血病胚細胞獲得干細胞的特性，如自我更新和/或去分化，并且因此成為LSCs。該假設(shè)的模型與在卩-聯(lián)蛋白的情況中所見到的類似。例如，在正常髓細胞生成中，(3-聯(lián)蛋白僅僅在擁有自我更新特性的HSC中活化。在CML的胚細胞期，P-聯(lián)蛋白通過在GMP中活化得到功能，這導致白血病轉(zhuǎn)化。在另一方面，癌基因SALL4在正常血細胞生成和白血病發(fā)生中起重要作用。SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)MDS-樣表型，并且隨后AML轉(zhuǎn)化是可植入的。對于研究人類MDS,很少有動物模型目前是可行的。通過本文描述的方法產(chǎn)生的SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠提供理解和治療人MDS和其隨后轉(zhuǎn)化為AML的適合的動物模型。SALL4和Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路之間的相互作用不但提供涉及白血病發(fā)生的SALL4的似乎正確的機制，而且促進理解在CML胚細胞轉(zhuǎn)化中的Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路的活化。如本文公開的，檢查在所有人AML中的SALL4同種型和它們的組成型表達的鑒別。在體內(nèi)，檢測AML中SALL4表達的直接影響。公丌內(nèi)容表明，在小鼠中SALL4的組成型表達足以誘導MDS-樣癥狀和轉(zhuǎn)化為AML,其是可植入的。本公開內(nèi)容也表明SALL4能與(3-聯(lián)蛋白結(jié)合并且活化Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號通路。SALL4和P-聯(lián)蛋白在CML的不同期中具有相^i的表達方式。在一個實施方式中，提供含有下述序列的分離的多核苷酸，所述序列編碼SEQIDNO:2(GenBankAcc.No.AAO44950)、SEQIDNO:4(GenBankAcc.No.AA016566)或SEQIDNO:6(GenBankAcc.No.AA016567)所列出的氨基酸序列。在相關(guān)的方面中，這些序列包含SEQIDNO:1(GenBankAcc.No.AY172738)、SEQIDNO:3(GenBankAcc.No.AY170621)、SEQIDNO:5(GenBankAcc.No.AY170622)或它們的補體所列出氨基酸序列。在另一相關(guān)方面，也公開了含有這些多核苷酸的載體，包括但不限于，在宿主細胞中可操作連接到指導多核苷酸表達的調(diào)節(jié)序列的表達載體。在另一個實施方式中，提供含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的分離的多肽。在一方面，提供治療個體中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，該包括施用這類多肽。在另一方面，也公開與這類多肽結(jié)合的抗體或其結(jié)合片段。被用于公開的方法中的抗體包括特異性結(jié)合含有SALL4或在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的其同種型的多肽的抗體。在一方面，SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的片段被用于產(chǎn)生這些抗體。在相關(guān)的方面中，這樣的片段基本上由SEQIDNO:13組成。在一個實施方式中，公開識別具有多潛能性潛力的細胞的方法，包括將從內(nèi)細胞群(ICM)、腫瘤組織或腫瘤隔離的細胞與檢測SALL家族成員蛋白表達的試劑接觸，并且確定是否SALL家族成員蛋白在該細胞中表達，其中確定SALL家族成員蛋白在該細胞中表達與在細胞中誘導自我更新正相關(guān)，因此，這類表達表示多潛能性。在一方面，SALL家族成員包括SALL1、SALL3禾卩SALL4。在相關(guān)的方面中，SALL4是SALL4A或SALL4B。在另一方面，試劑是針對SALL家族成員蛋白或與編碼SALL家族成員蛋白的mRNA互補的核酸的抗體。在相關(guān)的方面中，SALL家族成員蛋白序列包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24。在另一相關(guān)方面，核酸與包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:21和SEQIDNO:23的核酸序列的有義鏈互補。在一方面，細胞是胚胎干(ES)細胞、胚胎癌(EC)細胞、成體干細胞或腫瘤干細胞。在相關(guān)的方面中，組織是對象的血漿或活組織檢査樣品。在進一步相關(guān)的方面，對象是人。如本文使用的，"多潛能性潛力"指細胞通過有絲分裂更新自己的能力。如本文使用的"正相關(guān)"指與觀察到的現(xiàn)象肯定相關(guān)。例如，SALL4A或SALL4B的誘導與細胞更新能力相關(guān)。如本文使用的"瘤(neoplasm)"包括其語法上的變化，指組織新的和異常的生長，其可以是良性的或癌性的。如本文使用的"基本由……組成"包括特定分子實體(例如，但不限于特定序列鑒定劑(identifier))和不在本質(zhì)上影響與特定分子實體相關(guān)的特性的其它分子實體。例如，對于產(chǎn)生針對SEQIDNO:2、SEQIDNO:4禾卩/或SEQIDNO:6的免疫原應答，含有SEQIDNO:13和佐劑的融合蛋白，將基本由SEQIDNO:13組成。抗體是本領(lǐng)域公知的并且例如，在美國專利第6,391,589號中被討論。本發(fā)明的抗體包括但不限于多克隆的、單克隆的、多特異性、人、人化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、Fab表達文庫產(chǎn)生的片段、抗-個體基因型(抗-Id)抗體(包括例如對本發(fā)明的抗體的抗-Id抗體)和上述任何的抗原表位結(jié)合片段。如本文使用的術(shù)語"抗體"指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有與抗原免疫結(jié)合的抗體結(jié)合位點的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞種。本發(fā)明的抗體包括抗體片段，其包括但不限于Fab、Fab鄰F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段。包括單鏈抗體在內(nèi)的抗原結(jié)合抗體片段可以包括僅僅可變區(qū)(一個或多個)或者可變區(qū)(一個或多個)與下列的全部或部分的組合鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也包括抗原結(jié)合片段，其也包括可變區(qū)(一個或多個)和鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。本發(fā)明的抗體也可以是任何包括鳥類和哺乳動物在內(nèi)的動物源的。在一方面，抗體是人、鼠科動物(例如小鼠和大鼠)、驢、綿陽、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞源的。此外，這些抗體可以是動物抗體的人化版本(參見例如美國專利第6,949,245號)。本發(fā)明的抗體可以是單一特異性的、二特異性的、三特異性的或更多的多特異性。通過本領(lǐng)域已知的適當?shù)姆椒梢援a(chǎn)生本發(fā)明的抗體。目的抗原的多克隆抗體可以通過在本領(lǐng)域公知的多種方法產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的多肽可被施用給多種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以誘導產(chǎn)生含有對抗原特異性的多克隆抗體的血漿。各種佐劑可被用來增加免疫反應，這取決于宿主種類，所述佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全或不完全的)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復合多元醇(pluronicpolyols)、多聚陰離子、多肽、油乳膠、匙孔嘁血藍蛋白、二礎(chǔ)基苯酚和潛在可用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。這些佐劑也是本領(lǐng)域公知的。此外，抗體和類抗體結(jié)合蛋白也可通過噬菌體展示制備(參見，例如SmithandPetrenko,ChemRev(1997)97(2):391-410)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)制備單克隆抗體，所述技術(shù)包括使用雜交瘤、重組體和噬菌體展示技術(shù)或它們的組合。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的在下列文獻中教導的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體例如，Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988);Hammerling,etal.,:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.，1981)(所述文獻整體被引入本文作為參考)。如本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"不限定于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的。術(shù)語"單克隆抗體"指源自單一克隆的抗體，包括真核、原核或噬菌體克隆，并且不限定于產(chǎn)生克隆的方法。在一個實施方式中，提供使用這類抗體分離白血病干細胞的方法，包括從對象獲得細胞樣品，從不表達SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的細胞分選表達SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的細胞，并且通過骨髓表面標記從表達SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的多肽的細胞樣品選擇白血病干細胞。在相關(guān)的方面中，分選步驟包括通過熒光激活細胞分選法和/或磁珠分選法進行分選。在另一相關(guān)方面，標記是CD34、c-kit、Gr-l、Mac-l、MPO和/或非特異性酯酶。在進一步相關(guān)的方面，其中白血病干細胞對于B細胞(B220和CD19)、T細胞(CD4、CD8、CD3和CD5)、巨核細胞(CD41)和紅細胞(Ter119)標記是陰性的。在一個實施方式中，公開識別具有多能性潛能的細胞的試劑盒，其包含檢測一種或多種SALL家族成員蛋白的試劑、提供試劑-細胞相互作用和標記試劑的足夠條件的反應物和緩沖液、標記檢測反應物和將試劑與細胞接觸的說明書以及含有所述成分的容器。根據(jù)本公開內(nèi)容的方法識別干細胞首先從細胞群中不含有SEQIDNO:13標記表達陽性的細胞中分選含有SEQIDNO:13標記表達陽性的細胞。然后，從陽性標記細胞選擇目的干細胞；這通過分選已知細胞標記的表達進行實施。已知與目的干細胞相關(guān)的任何標記都可被使用。根據(jù)本公開的方法，可以分選任何經(jīng)猜測發(fā)現(xiàn)干細胞的細胞群。在一方面，細胞從非胎動物的骨髓獲得，其包括但不限于人細胞。也可使用胎細胞?？梢酝ㄟ^分選細胞領(lǐng)域已知的任何方法分選細胞，包括通過熒光激活細胞分選法(FACS)(參見，例如BaumgarthandRoederer,JImmunolMethods(2000)243:77-97)和或磁珠分選法(MACS)進行分選。傳統(tǒng)的MACS方法被Miltenyi等所描述"HighGradientMagneticCellSeparationwithMACS,"Cytometry11:231-238(1990)。為了通過MACS分選細胞，用磁珠標記細胞，并且將細胞通過磁分離柱。該分離柱被置于強的永久磁鐵中，從而在柱內(nèi)產(chǎn)生磁場。被磁標記的細胞在柱內(nèi)被捕獲；沒有標記的細胞通過柱。然后，從柱上洗脫捕獲的細胞。在一個實施方式中，針對SALL4的抗體被用于細胞分選，以分離胚胎干細胞、成體干細胞和/或腫瘤干細胞。在另一個實施方式中，針對SALL4的抗體被用于流式細胞術(shù)分析以檢測表達SALL4的細胞，其中這些細胞與增殖型疾病進展或瘤細胞形成相關(guān)。在相關(guān)的方面中，SALL4是SALL4A或SALL4B。在一個實施方式中，公開了檢測在生物樣品中含有編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的核酸序列的多核苷酸存在或不存在的方法，包括但不限于在雜交條件下，將生物樣品與探針接觸，所述探針包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5、或SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體或SEQIDNO:5的補體列出的序列的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，并且檢測探針和生物樣品之間的雜交，其中雜交指示多核苷酸存在。在另一個實施方式中，公開了檢測存在于生物樣品中含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽的方法，包括但不限于提供與多肽結(jié)合的抗體，將該生物樣品與抗體接觸，并且檢測抗體和生物樣品之間的結(jié)合，其中結(jié)合指示多肽存在。在一個實施方式中，描述治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將具有如下所述多核苷酸的組合物施用給對象，所述多核苷酸具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體、SEQIDNO:5的補體或它們的片段列出的核酸序列，所述片段包括編碼在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸。在相關(guān)的方面中，該方法包括施用SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5列出的多核苷酸。在一方面，MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。在一個實施方式中，公開識別調(diào)控SALL家族成員蛋白對OCT4表達的影響的試劑的方法，包括用含有啟動子-報告基因構(gòu)建物的載體和含有編碼SALL家族成員蛋白的核酸的載體共轉(zhuǎn)染細胞，其中構(gòu)建物含有可操作連接的OCT4啟動子和編碼基因表達報告蛋白的核酸，將該細胞與試劑接觸并且檢測在存在和不存在該試劑的情況下啟動子-報告基因構(gòu)建物的活性，其中檢測啟動子-報告基因構(gòu)建物的活性與試劑對SALL家族成員蛋白/OCT4相互作用的影響有關(guān)。在相關(guān)的方面中，啟動子區(qū)含有包括但不限定于SEQIDNO:26的核酸序列，并且表達報告蛋白是熒光素酶。在另一個實施方式中，公丌治療瘤性或增殖性疾病的方法，其中對象細胞表現(xiàn)自我更新的脫調(diào)節(jié)，所述方法包括給對象施用含有抑制SALL4表達的試劑的藥物組合物。在另一個實施方式中，提供鑒別與含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出多肽結(jié)合的物質(zhì)的方法，其中所述方法包括將多肽與候選物質(zhì)接觸，并且檢測該物質(zhì)與多肽的結(jié)合。在一個實施方式中，公開鑒別調(diào)節(jié)多肽功能的物質(zhì)的方法，所述多肽含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸序列，其中所述方法包括將多肽與候選物質(zhì)接觸，并且檢測多肽的活性，其中在存在候選物質(zhì)的情況下活性的改變指示該物質(zhì)調(diào)節(jié)多肽功能。在另一個實施方式中，描述診斷對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括但不限于提供對象的生物樣品，將該生物樣品在雜交條件下與探針接觸，所述探針包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體或SEQIDNO:5的補體列出的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，并且檢測探針和生物樣品之間的雜交，其中檢測雜交與MDS有關(guān)。在一方面，MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。在另一個實施方式中，描述診斷對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括但不限于提供對象的生物樣品，將該生物樣品與抗體接觸，所述抗體與包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸的多肽結(jié)合，并且檢測抗體和樣品之間的結(jié)合，其中檢測結(jié)合與MDS有關(guān)。在一方面，MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。在一個實施方式中，公開診斷瘤性或增殖性疾病的方法，包括將對象細胞與檢測SALL家族成員蛋白表達的試劑接觸，和確定SALL家族成員蛋白是否在該細胞表達，其中確定SALL家族成員蛋白在該細胞中表達與在細胞中誘導自我更新正相關(guān)，因此，這類表達表示瘤形成或增殖。在一方面，標記該試劑并且控制步驟包括通過將對象暴露于對該試劑位置成像的儀器來檢測試劑。在相關(guān)的方面中，通過磁共振、X-射線或放射性核素發(fā)射產(chǎn)生圖像。在一個實施方式中，為一種調(diào)節(jié)多核苷酸細胞內(nèi)表達的方法，所述多核苷酸編碼在初級急性髓細胞性白血病細胞中組成型表達的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，所述方法包括將與多核苷酸雜交的雙鏈RNA(dsRNA)或與多核苷酸雜交的反義RNA或它們的片段引入細胞。在相關(guān)的方面中，該調(diào)節(jié)是下調(diào)。在一個實施方式中，公開轉(zhuǎn)基因動物。在通常的方面，通過以允許轉(zhuǎn)基因表達的方式引入外源基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。制造轉(zhuǎn)基因動物的方法被普遍描述Wagner和Hoppe(美國專利第4,873,191號；其被引入本文作為參考)、Brinster等((1985);其全部被引入本文作為參考)和"ManipulatingtheMouseEmbryo;ALaboratoryManual"2ndedition(eds"Hogan，Beddington,CostantimiandLong,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1994);其全部被引入本文作為參考)。典型地，通過微量注入受精卵，轉(zhuǎn)移基因。將微量注入的卵植入雌性宿主，并且篩選轉(zhuǎn)基因表達的子代。轉(zhuǎn)基因動物可以從大量動物的受精卵產(chǎn)生，所述動物包括但不限于爬行類動物、兩棲類動物、鳥類、哺乳動物和魚類。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備微量注入的DNA克隆。例如，可以用適當?shù)拿盖懈钗⒘孔⑷氲腄NA克隆，以除去細菌質(zhì)粒序列，并且使用標準技術(shù)在TBE緩沖液中的1。/。瓊脂糖凝膠上電泳DNA片段。通過用溴化乙淀染色使DNA帶可見，并且切離含有表達序列的帶。然后，將切離的帶置于含有0.3M乙酸鈉、pH7.0的透析袋中。將DNA電洗脫入透析袋中，并用l:l的苯酚氯仿溶液洗提和通過兩體積的乙醇沉淀。將該DNA重新溶解于1m的低鹽緩沖液(0.2MNaCl、20mMTris、pH7.4和1mMEDTA)中，并且在Elutip-DTM柱上將其純化。首先用高鹽緩沖液(lMNaCl、20mMTris、pH7.4和1mMEDTA)預處理該柱，然后用5ml低鹽緩沖液進行洗滌。使DNA溶液通過該柱三遍，以將DNA結(jié)合到柱基質(zhì)。在用3ml低鹽緩沖液洗滌后，用0.4ml高鹽緩沖液洗脫該DNA，并且通過兩體積的乙醇沉淀。通過在UV分光光度計中260nm處的吸收，測量DNA的濃度。本發(fā)明也提供含有至少一種有效量的能治療病癥的化合物和藥學可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可含有其它治療劑，如所描述的，并且可以被配制例如根據(jù)技術(shù)如在藥學制劑領(lǐng)域公知的那些技術(shù)，使用傳統(tǒng)的固體或液體載體或稀釋劑以及對期望給藥方式的恰當類型的藥學添加劑(例如，賦形劑、粘合劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、香料等)。用作發(fā)明制品成分的藥物組合物可以以固體、溶液、乳液、分散體、微膠粒、脂質(zhì)體等形式使用，其中所形成的組合物包括一種或多種上述化合物作為活性成分，與適合于腸內(nèi)或腸胃外應用的有機或無機載體或賦形劑混合。用作發(fā)明制品成分的化合物可以與例如通常無毒的，對于片劑、丸劑、囊劑、栓劑、溶液、乳液、懸液和其它適合使用的形式的藥學可接受的載體相組合。可以使用的載體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、明膠、甘露醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、膠體硅、馬鈴薯淀粉、尿素、中等鏈長度甘油三酯、葡聚糖和其它適合用于制備制劑的載體，其可以是固體、半固體或液體形式。另外，也可使用輔助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和著色劑以及香料。本發(fā)明的藥物組合物可以以含有無毒、藥學可接受的載體或稀釋劑的劑量單位制劑形式、以任何適當?shù)姆绞浇o藥，例如口服的，如以片劑、囊齊!J、顆粒或粉末的形式；舌下的；口腔的；腸胃外的，例如通過皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或腦池內(nèi)注入或輸注技術(shù)(例如，作為無菌可注射的水或非水溶液或懸液)；鼻的，如通過吸入噴霧；局部的，如以乳膏或軟膏的形式；或者直腸的，如以栓劑的形式。本發(fā)明的化合物例如可以以適合立刻釋放或延長釋放的形式給藥。通過使用含有本發(fā)明化合物的適合的藥物組合物可以實現(xiàn)立刻釋放或延長釋放，或者特別在延長釋放的情況下通過使用設(shè)備如皮下植入片(subcutaneousimplants)或滲透泵實現(xiàn)所述釋放。本組合物也可以用脂質(zhì)體給藥(administeredliposomally)。除了靈長類如人，各種其它哺乳動物可根據(jù)本發(fā)明的方法進行治療。例如，包括但不限于牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、豚鼠、大鼠或其它?？苿游?、羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物或鼠科種類的哺乳動物也可被治療。然而，在其它物種例如鳥類(例如雞)，該方法也可被實行。在上述方法中治療的對象一一其中需要耙向細胞進行調(diào)節(jié)，是哺乳動物，其包括但不限于牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、豚鼠、大鼠或其它?？苿游?、羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物或鼠科種類，并且優(yōu)選人類，男性或女性。術(shù)語"治療有效量"指誘發(fā)出正在被研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)學博士或其它臨床醫(yī)師研究的組織、系統(tǒng)、動物或人的生物或醫(yī)學反應的對象化合物的量。如本文使用的術(shù)語"組合物"擬包括含有特定成分、特定量的產(chǎn)物，以及可以直接或間接由特定成分、特定量組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。至于"藥學可接受的"，其指載體、稀釋劑或賦形劑必須與制劑的其它成分相容并且對其接受者無害。術(shù)語化合物的"給藥"和/或"施用"化合物應該被理解為指將本發(fā)明的化合物提供給需要治療的個體。用于施用本發(fā)明化合物的藥物組合物可以簡單的以劑量單位形式存在，并且可以通過藥物領(lǐng)域公知的任何方法進行制備。所有的方法包括使活性成分與構(gòu)成一種或多種補充成分的載體結(jié)合。一般而言，通過使活性成分均一并緊密與液體載體或細分固體載體或這兩者結(jié)合，然后如果需要使產(chǎn)品形成需要的劑型。在藥物組合物中，以足夠?qū)膊〉倪^程或癥狀產(chǎn)生預期效果的量包含活性目標化合物。含有活性成分的藥物組合物可以是適合口服應用的形式，例如片劑、藥片、錠劑、水或油懸液、可分散的粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊或糖漿劑或酏劑。意欲用于口服應用的組合物可以根據(jù)藥物組合物制造領(lǐng)域任何已知的方法進行制備，并且這類組合物可以含有選自下列的一種或多種試劑甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑，以便提供藥學上精致和可口的制劑。片劑含有與藥學可接受的無毒賦形劑混合的活性成分，所述賦形劑適合于制造片劑。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸l丐或磷酸鈉；粒化或崩解劑，例如玉米淀粉或褐藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是沒有包衣的或者它們可以通過已知的技術(shù)包衣，以延遲在胃腸道崩解和吸收，并因此在更長的時期提供持續(xù)作用。例如，可以使用延時材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們也可被包衣以形成控制釋放的滲透性治療片劑。用于口服應用的制劑也可作為硬膠囊存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，所述惰性固體稀釋劑如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，或者用于口服應用的制劑也可作為軟膠囊存在，其中活性成分與水或油介質(zhì)混合，所述介質(zhì)如花生油、液體石蠟或橄欖油。水性懸液含有與適合制造水性懸液的賦形劑混合的活性成分。這類賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基-丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯-吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可以是天然發(fā)生的磷脂例如卵磷脂，或者是烯烴氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者是烯烴氧化物與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物例如十七碳乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或者氧化乙烯(ethyleneoxide)與從脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯(polyoxyethylenesorbitolmonooleate)，或者氧化乙烯與從脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚乙烯失水山梨糖醇一油酸酯(polyethylenesorbitanmonooleate)。水性懸液也可包含一種或多種防腐劑例如乙基或正-丙基對-羥基苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑，和一種或多種甜味劑例如蔗糖或糖精。油性懸液可以通過將活性成分懸浮于植物油而配制，所述植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或者懸浮于礦物油而配制，所述礦物油例如液體石蠟。油性懸液可含有增稠劑例如蜂蠟、固體石蠟或十六醇?？梢约尤朐龀韯┤缜懊媪谐龅哪切┖驼{(diào)味劑以提供可口的口服制劑?？梢酝ㄟ^加入抗氧化劑例如抗壞血酸，保存這些組合物。適合于通過加入水制備水性懸液的可分散粉末和顆粒，提供與分散劑或濕潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。適合的分散劑或濕潤劑和懸浮劑以上面已經(jīng)提到的那些作為實例。額外的賦形劑例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑也可以存在。糖漿劑或酏劑可以與甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖一起配制。這類劑型也可含有潤滑劑、防腐劑和調(diào)味劑以及著色劑。藥物組合物可以是無菌可注射水或油懸液?？梢愿鶕?jù)己知技術(shù)使用前面所述的適合的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配制該懸液。無菌可注射制劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸液，例如為1,3-丁二醇中的溶液。可以被使用的可接受的載體或溶劑是水、林格液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發(fā)性油傳統(tǒng)上被用作溶劑或懸浮介質(zhì)。因為這個原因，可以使用任何溫和的不揮發(fā)性油，其包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸可用于制備可注射劑(injectable)。本發(fā)明的化合物也可以栓劑的形式被施用以用于直腸給藥。通過混合藥物和適合的非刺激性的賦形劑——其在普通溫度下是固體，但是在直腸溫度下是液體，并因此在直腸融化釋放藥物——可以制備這些組合物。這樣的材料是可可脂和聚乙二醇。為了局部應用，使用含有本發(fā)明的化合物的乳膏、軟膏、凝膠劑、溶液或懸液等。(為了該應用，局部應用應該包括漱口劑類和含漱液)。根據(jù)本公開內(nèi)容的核酸——其編碼能干擾SALL4的多肽或肽一一可被用于基因治療方法，例如治療個體，其目標為防止或治愈(完全或部分)腫瘤例如癌癥，或涉及失去細胞循環(huán)和/或細胞生長的適當調(diào)控的其它病癥，或需要特異性細胞死亡的其它病癥。載體例如病毒載體已被用于本領(lǐng)域以將核酸引入寬范圍的不同靶細胞。典型地，將載體暴露于耙細胞，以便轉(zhuǎn)染可以在足夠比例的細胞中發(fā)生，以從期望多肽的表達提供有用的治療或預防效果。轉(zhuǎn)染的核酸可以被永久的引入每一靶向腫瘤細胞的基因組中，這提供長期持久的效果，或者可選地治療可能必須被周期性的重復。多種載體一一病毒載體和質(zhì)粒載體——在本領(lǐng)域是已知的，參見美國專利第5,252，479號和WO93/07282。具體而言，大量病毒已被用作基因轉(zhuǎn)移載體，包括乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、皰疹病毒屬包括HSV和EBV、以及逆轉(zhuǎn)錄病毒。在本領(lǐng)域許多基因治療方案已經(jīng)使用無能力的鼠科逆轉(zhuǎn)錄病毒。將核酸引入細胞的替代應用病毒載體的其它己知方法包括電穿孔、磷酸鈣共沉淀、機械技術(shù)例如微量注射、沖擊方法、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)移和直接DNA攝取以及受體介導的DNA轉(zhuǎn)移。受體介導的基因轉(zhuǎn)移一一其中將核酸通過多聚賴氨酸連接到蛋白質(zhì)配體，其中配體對在靶細胞表面上存在的受體是特異性的——是將核酸特異性靶向特定細胞的技術(shù)的一個實例。在對象的治療中——其中靶向細胞進行調(diào)節(jié)，適當劑量水平通常是每千克患者體重每天大約0.01到500mg，這可以以單一或多劑型施用。優(yōu)選地，劑量水平是每天大約0.1到大約250mg/kg;更優(yōu)選地，每天大約0.5到大約100mg/kg。適當?shù)膭┝克娇梢允敲刻齑蠹s0.01至IJ250mg/kg，大約0.05至U100mg/kg，或者大約0.1到50mg/kg。在該范圍內(nèi)，劑量可以是每天0.05到0.5、0.5到5或5到50mg/kg。對于口服給藥，組合物優(yōu)選以含有1.0到1000毫克活性成分特別是1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分的片劑形式提供，以根據(jù)待被治療的患者癥狀調(diào)節(jié)劑量?；衔锟梢园凑彰刻?到4次的方案給藥，優(yōu)選每天一次或兩次。然而，應該理解，對于任何特定患者具體的劑量水平和給藥頻率可以改變，這并將取決于多種因素，包括使用的具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用長度、年齡、體重、總體健康、性別、飲食、給藥模式和時間、排泄速率、藥物組合、具體病癥的嚴重性和宿主經(jīng)歷的治療。下面的實施例用于闡明而非限制本發(fā)明。實施例1方法分子克隆根據(jù)標準方法實施質(zhì)粒構(gòu)建和DNA測序。對于克隆SALL4同種型，基于基因組克隆RP5-1112F19(SEQIDNO:25)(GenBank登記號AL034420)，設(shè)計PCR引物。根據(jù)供應商的方案，使用源自人胎兒腎(BDBiosciencesClontech,PaloAlto,CA)的Marathon-ReadycDNA文庫克隆SALL4同種型。將擴增的PCR產(chǎn)物克隆入TA克隆載體(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)，并且通過DNA測序檢測核苷酸序列。通過PCR，并使用在每一端具有限制性內(nèi)切酶位點BamHI的5'引物和3'引物，產(chǎn)生GAL4-SALL4B構(gòu)建物5'引物5'-TTATCAGGATCCTGGTCGAGGCGCAAGCAGGCGAAACCC-3'(SEQIDNO:7);禾口3'引物5'-CCAGGATCCTTAGCTGACCGCCAATCTTGTTTC-3'(SEQIDNO:8)。期望GAL4-SALL4B構(gòu)建物編碼最小GALDNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和全長SALL4B的493氨基酸，除了第一個氨基酸甲硫氨酸。在不同組織中，確定另一種的剪接模式在成熟組織中，使用反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR評估SALL4的mRNA表達模式。從BDBiosciencesClontech購得一組(panel)八個標準化的源自不同成熟組織的第一鏈cDNA制品。在50卞1含有5pl的cDNA、10mMTrisHC1(pH8.3)、50mMKC1、2mMMgCl2、0.2mMdNTPs和1.25U的TaqDNA聚合酶(PerkinElmerLifeSciences,Boston,MA)的反應體積中，實施PCR擴增。在94。C下最初變性10分鐘后，在下面的條件下實施30個循環(huán)的擴增94'C下變性30秒、55。C下退火30秒、72'C下延伸30秒。循環(huán)后，在72'C下進行最后的7分鐘延伸。使用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA的擴增控制模板加載濃度。下面是對SALL4同種型特異性選擇的引物對1)SALL4A引物(有義引物5'-ATTGGCACCGGCAGTTACCACC(SEQIDNO:9);反義引物5'陽AGTACTCGTGGGCATATTGTC-3'(SEQIDNO:IO))和2)SALL4B引物(有義弓l物5'-ATGTCGAGGCGCAAGCAGGCGAAAC-3'(SEQIDNO:11);反義弓l物5'-丁TAGCTGACCGCAATCTTGTTTTCT-3'(SEQIDNO:12))。在1%瓊脂糖凝膠上，通過電泳分離PCR產(chǎn)物。也使用DNA測序來確認擴增產(chǎn)物?？贵w產(chǎn)生根據(jù)其潛在抗原性(氨基酸1-13)，選擇人SALL4的肽MSRRKQAKPQHIN(SEQIDNO:13)，并且使用其制備抗肽抗體。該區(qū)域也與小鼠SALL4的區(qū)域相同，所以可以期望產(chǎn)生的抗體與小鼠SALL4交叉反應。與LampireBiologicalLaboratoriesInc.(Pipersville,PA)合作，在兔中產(chǎn)生SALL4抗肽抗體。凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析根據(jù)Laemmli,在SDS10%w/v的聚丙基酰胺平板凝膠中，實行十二垸基硫酸鈉-聚丙基酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。如制造商(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)描述的，用電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，實施具有SALL4抗肽抗體(1:100)的兔免疫血清的免疫印跡。白血病和正常組織在核準的InstitutionalReviewBoard協(xié)議下，從UniversityofTexas和2004年之間的存檔(file)中，收集在石蠟塊或凍存在二甲基亞砜(DMSO)中的白血病和正常樣品。所有腫瘤的診斷基于根據(jù)FABClassificationforHematopoieticNeoplasms(造血瘤的FBA分類)的形態(tài)和免疫表型標準。從Cambrex購買CD34+新鮮細胞。實時定量RT-PCR在這些研究中，使用TaqMan5'核酸酶分析(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。使用RNeasy微型試劑盒(MiniKit)分離并用DNaseI(Qiagen)消化，源自正常骨髓和外周血、15個AML樣品和三個白血病細胞系的純化CD34+HSCs/HPCs的總RNA。使用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶和聚(dT)12-18引物(Irwitrogen)，在20中反轉(zhuǎn)錄RNA(lpg)。在加入80水并混合后，使用5屮L等份式樣(aliquots)進行每一TaqMan反應。使用引物表達軟件(PrimerExpresssoftware".5版本(AppliedBiosystems)設(shè)計TaqMan弓1物和探針。使用TaqManPCR核心試劑盒(corereagentkit)(AppliedBiosystems)和ABIPrism7700序列檢測系統(tǒng)(SequenceDetectionSystem)(PEAppliedBiosystems)，實施SALL4和GAPDH的實時PCR。在1xTaqManPCR緩沖液中，PCR反應混合物含有3.5mMMgCl2;0.2mM脫氧三磷酸腺苷(dATP)、脫氧三磷酸胞苷(dCTP)和脫氧三磷酸鳥苷(dGTP)的每一種；0.4mM脫氧三磷酸尿苷(dUTP);0.5^M正向引物；0.5pM反向引物；0.1TaqMan探針；0.25U尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡萄基酶；和0.625UAmpliTaqGold聚合酶。將cDNA(5pL)加入到PCR混合物中，并且PCR反應物的最終體積為25pL。所有的樣品運行兩次。使用GAPDH作為內(nèi)源性對照。熱循環(huán)儀條件是5CTC進行2min、95。C進行10min，并且對95。C進行0.30min和60。C進行1min作45個循環(huán)。使用序列檢測系統(tǒng)軟件(SequenceDetectionSystemsoftware)1.6.3版(AppliedBiosystems)分析數(shù)據(jù)。獲得結(jié)果作為循環(huán)閾值(Ct)的值。該軟件確定在基線熒光信號基礎(chǔ)上的閾值線，并且給出達到閾值的點作為Ct值。該Ct值與模板拷貝的起始數(shù)量呈反比。所有的測量實施兩次。TaqMan序列包括下列GAPDH正向引物(5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(SEQIDNO:14))和反向引物(5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(SEQIDNO:15))，TaqMan探針(5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC陽3'(SEQIDNO:16))禾卩SALL4正向引物(5'-CCTCCTAATGAGAGTATCTGGGTGAT-3'(SEQIDNO:17))和反向引物(5'-TTAAAACATACAGCGCATGATTGG-3'(SEQIDNO:18》。組織陣列(TissueArray)設(shè)計和構(gòu)建包括來自白血病樣品的三個腫瘤核心的組織陣列被切片(5pm厚)。使用手動組織陣列儀(BeecherInstruments,SilverSpring,MD)構(gòu)建該組織陣列。免疫組織化學根據(jù)標準技術(shù)實施免疫組織化學染色。簡單地說，將甲醛固定的、石蠟嵌入的4-nm-厚的組織切片脫蠟(deparafinized)并水合。用Tris緩沖液(pH9.9;DakoCorp.,Carpinteria,CA)和快速微波組織處理器(rapidmicrowavehistoprocessor)回收熱誘導的表位。在IOO'C下，培育10min后，在流動的自來水中洗滌載玻片5min，然后用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS;pH7.2)洗滌5min。然后在增濕的室中，在室溫下將組織切片與抗SALL4抗體(1:200)—起溫育5小時。在用PBS洗滌三次后，在室溫下將組織切片與抗小鼠免疫球蛋白G和過氧化物酶一起溫育30min。在用PBS洗滌三次后，將組織切片與3，3'-二氨基聯(lián)苯/H202(Dako)一起溫育進行顯色；使用蘇木精對該切片復染。當瘤細胞(贅生細胞)表現(xiàn)確定的核染色時，認為其對于SALL4陽性。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生SALL4BcDNA——相應于整個編碼區(qū)域，被亞克隆入pCEP4載體(IntroGene;現(xiàn)在Crucell，Leiden,TheNetherlands)以產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)基因試驗的CMV/SALL4B構(gòu)建物。隨后用Sail消化——這不會在SALL4BcDNA內(nèi)切割，釋放僅含有CMV啟動子、SALL4cDNA編碼區(qū)、SV40內(nèi)含子和多腺苷酸化信號的線性片段，而沒有額外的載體序列。通過在耶魯大學(YaleUniversity)的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗室實施前核注射(pronuclearinjection)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。SALL4B建立者(founder)小鼠識別和轉(zhuǎn)基因的傳遞通過PCR分析確定。用于基因分型的PCR引物跨越(span)5'SALL4BcDNA與CMV啟動子的結(jié)合區(qū)(有義引物5'誦CAGAGATGCTGAAGAACTCCGCAC-3'(SEQIDNO:19);反義引物5'-AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3'(SEQIDNO:20》。血液分析使用MascotHemavet細胞計數(shù)器(CDCTechnologies,Oxford,CT)確定自動差分全血細胞計數(shù)。對于祖細胞分析，將1.5xI04的骨髓細胞鋪于2份1.25-ml甲基纖維素培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物中補充有重組小鼠白介素-3(IL-3)(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、干細胞因子(SCF)(50ng/ml)和促紅細胞生成素(3U/ml)(M3434,StemCellTechnologies,Vancouver,BritishColumbia,Canada)。在第7天到第14天之間記錄集落(CFU-G、CFU-GM、CFU-M、CFU-GEMM和BFU-E)。用賴-吉染色(Wright-Giemsastain)將得自聚集的CFU細胞的外周血、骨髓涂片和細胞離心涂片(cistospin)染色。流式細胞術(shù)分析用與Gr-l、Mac-1,B220、Terl19、c-kit、CD34、CD45、CD41、CD19、CD5、CD3、CD4、CD8、碘化丙錠(PI)或膜鈣蛋白V(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)直接結(jié)合的抗體對細胞染色。在FACScan上獲得一萬散射門控(scatter-gated)紅細胞，并且用CellQuest軟件(BDBiosciencesClontech)進行分析。統(tǒng)計分析對于所有的統(tǒng)計分析，使用學生的t-試驗(student，st-Test),呈現(xiàn)正常的雙尾分布和不等的變量。細胞培養(yǎng)物HEK-293細胞(得自人胎兒腎臟)和細胞系KG.1、Kasumi-1和THP-1購自AmericanTypeCultureCollection(Manassas,VA)。在37°C下，具有5%二氧化碳和10%胎血清的增濕環(huán)境下，保持細胞。轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染24小時后，用100^熒光素酶細胞培養(yǎng)物裂解劑(PromegaCorp.,MadisonWi)提取細胞。用10pi的細胞提取物實施的P-半乳糖苷酶分析使用p-半乳糖苷酶酶分析系統(tǒng)(EnzymeAssaySystem)(Promega)和制造商提供的標準分析方案(除了lMTris基代替碳酸鈉被用作停止緩沖液)。對于熒光素酶分析(Promega)，根據(jù)制造商的用法說明使用5pl的提取物。在減去背景后，對于每一樣品，將熒光素酶活性(任意單位)標準化為卩-半乳糖苷酶活性(任意單位)。啟動子報告基因分析—般來說，用在HEK-293或COS-7細胞中表達SALL家族蛋白或OCT4蛋白的0.1嗎至0.12嗎之間的海腎質(zhì)粒禾n/或各種量(0-L0嗎)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染含有OCT4啟動子(SEQIDNO:26)的OCT4-Luc構(gòu)建物(PMOct4)或含有SALL家族蛋白(艮卩SALL1、SALL3、SALL4A或SALL4B)啟動子(即分別為SEQIDNO:27、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29，其中SALL4A和SALL4B共有相同的啟動子)的SALL-Luc構(gòu)建物。一般地，pcDNA3載體被用作對照。然后，在轉(zhuǎn)染后24小時，監(jiān)控轉(zhuǎn)染的細胞的熒光素酶活性。結(jié)果人SALL4的兩種可選剪接同種型的分子克隆通過5'和3'RACE-PCR(5'和3'cDNA端-聚合酶鏈式反應的快速擴增)，使用人胎兒腎Marathon-ReadycDNAs(BDBiosciencesClontech)作為模板，分離SALL4的兩個全長轉(zhuǎn)錄物。分離的較大cDNA片段的序列分析顯示單一、大的開放閱讀框架命名為SALL4A，其從強共有起始序歹U(strongconsensusinitiationsequence)開始，并且預期編碼1,053個氨基酸。SALL4另一個剪接變異體被命名為SALL4B，其缺乏相應于全長SALL4A的氨基酸385-820的區(qū)域(圖la)。假定被SALL4BcDNA編碼的蛋白預期由617個氨基酸組成。為了排除這兩個明顯的剪接變異體可能是人造產(chǎn)生的可能性，比對這兩種變異體的mRNA序列和相應的人基因組序列。SALL4A含有所有的外顯子(l-4)(圖la)，而SALL4B缺乏外顯子2的3'大的部分。外顯子-內(nèi)含子的剪接位點滿足G-T-A-G規(guī)則。這兩種剪切變異體具有相同的翻譯閱讀框，但是SALL4BmRNA編碼具有內(nèi)缺失的蛋白質(zhì)。SALL4A含有8個鋅指結(jié)構(gòu)域，而SALL4B具有3個鋅指結(jié)構(gòu)域。在人的組織中，SALL4同種型的表達模式通過在各種人組織中反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR，描述SALL4可選的剪接模式。擴增普遍存在的GAPDH基因cDNA的片段作為對照(圖lb)。315-bp片段代表更長的剪接變異體——SALL4A，被在一些組織中擴增，達到各種表達水平。SALL4B變異體以不同的表達水平存在于每一組織中。對于造血組織中SALL4表達的詳細研究在下面的結(jié)果中描述。SALL4抗體的產(chǎn)生和SALL4蛋白質(zhì)產(chǎn)物的識別為了識別SALL4基因產(chǎn)物并證實存在SALL4變異體，發(fā)展了對SALL4的合成肽(氨基酸l-13)的多克隆抗體。選擇該區(qū)域，是因為其是兩種SALL4變異體共有的。親和純化的SALL4肽抗體特異性識別人腎總?cè)馨a(chǎn)物內(nèi)的2種內(nèi)源性蛋白質(zhì)。這兩種蛋白大約為165kDa和95kDa，其分別與在Cos-7細胞中過表達的SALL4A和SALL4B的分子量相同(圖lc)。用該抗體的蛋白質(zhì)印跡證實SALL4同種型具有不同的組織分布，這與在mRNA水平觀察到的分布相似(圖lb-B)。在人初級AML和髓細胞性白血病細胞系中，SALL4沒有停止產(chǎn)生因為染色體部位20ql3——SALL4位于這里——經(jīng)常涉及腫瘤，所以檢査AML中SALL4mRNA表達。通過在源自AML樣品(N-15)的骨髓細胞、髓細胞性白血病細胞系(N二3)中實時RT-PCR，定量研究SALL4表達，并且將其與得自純化的CD34+干/祖先聚集(HSCs/HPCs，購自Cambrex)、正常骨髓(N-3)和正常外周血(N-3)的非瘤造血細胞的SALL4表達進行比較。隨著使用同種型特異性引物(參見圖2a),SALL4B禾Q/或SALL4A的一個或兩個在AML樣品和髓細胞性白血病細胞系中，沒有停止產(chǎn)生(SALL4B)或下調(diào)(SALL4A)。將數(shù)據(jù)標準化為GAPDH的內(nèi)源性表達，并且針對在純化的CD34+細胞中的SALL4A或SALL4B的表達水平進行校準。與在正常骨髓中完全缺乏SALL4B相反，在全部15個AML樣品中的13個和全部所有的三個髓細胞性白血病細胞系中，在初級AML中的表達沒有停止。在AML樣品中SALL4A的平均標準化水平比在正常骨髓中的SALL4A的平均標準化水平高40倍。在髓細胞性白血病細胞系KG.1、Kasumi-l和THP-1中，SALL4A表達水平分別比在正常骨髓中SALL4A表達水平高8-、25-和240-倍。有趣地是，與在正常骨髓中相比，在60。/。的AML樣品和所有的3個細胞系中，SALL4A和SALL4B表達水平增加。在剩下的40%的AML樣品中，SALL4A或SALL4B沒有被下調(diào)。在人初級AML中，SALL4蛋白的組成型表達為了研究觀察到的異常SALL4表達是否也在蛋白質(zhì)水平存在，檢査81個AML樣品，其范圍為AML類型Ml到M5(FAB分類):M1(N=20)、M2(N=27)、M3(N=8)、M4(N=16)、M5(N二3)和AML非特異性的(N-7);正常骨髓、胸腺和脾以及正常CD34+HSCs/HPCs的數(shù)個樣品。正常骨髓、脾臟和胸腺表示沒有可檢測到的SALL4蛋白表達，正常CD34+HSCs/HPCs表示陽性但是更弱的SALL4蛋白染色；然而，在白血病細胞的細胞核內(nèi)檢測到強的多的SALL4表達(圖2b-F)。所有81個AML樣品表現(xiàn)異常的SALL4表達，并且最強的染色見于AML-M1和-M2。這些發(fā)現(xiàn)與通過實時RT-PCR標明的SALL4mRNA表達水平相一致(圖2a)。數(shù)據(jù)表明SALL4存在于CD34+HSCs/HPCs中，并且在成熟粒細胞和淋巴細胞中被下調(diào)。結(jié)果，在白血病中SALL4的組成型表達防止了白血病胚細胞免于分化和/或獲得通常在HSC中所見的特性。組成型表達全長人SALL4B的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生為了直接檢測SALL4的組成型表達是否足夠誘導AML，產(chǎn)生SALL4轉(zhuǎn)基因小鼠模型。將CMV啟動子融合入編碼617個氨基酸的人SALL4B的cDNA(圖3a-A)，選擇SALL4B是因為在先前檢査的每一組織中，其被表達(圖lb-B)。CMV啟動子先前被用于在大多數(shù)小鼠器官中異位表達人基因。實施RT-PCR擴增以檢測野生型(WT)、全長SALL4B在轉(zhuǎn)基因小鼠中的過表達。在轉(zhuǎn)基因小鼠的多種組織中，檢測SALL4B轉(zhuǎn)錄物，所述組織包括腦、腎、肝、脾、外周血、淋巴結(jié)和骨髓(圖3a-B)。出生三周后，在多個系的20%的轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到異常歩態(tài)(abnormalgaits)和相關(guān)的腦積水；60%具有多囊腎。這些發(fā)現(xiàn)表明SALL4B在神經(jīng)和腎臟發(fā)育中起重要作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠中的MDS樣癥狀和AML在所有來自6系的14只轉(zhuǎn)基因小鼠組中的血液異常的監(jiān)控表明所有小鼠在6-8個月大時具有明顯的MDS掛特征。在外周血涂片上，可見幼稚胚細胞和非典型以及發(fā)育異常的白細胞一一包括多葉核嗜中性粒細胞和擬-Pelger-Huet-樣——數(shù)量的增加(圖3b)。核紅細胞和巨血小板也存在，以及紅細胞和巨核細胞發(fā)育異常的特征，例如雙核紅細胞前體和小葉過少的巨核細胞。這些14只小鼠的6只(43%)最終進展成為急性白血病(表1)。表1在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中，類MDS/AML的綜述。小鼠ID性別建立者大小表型AML涉及的結(jié)果和器官<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>許多器官——包括肺、腎、肝、脾和、淋巴結(jié)一一的白血病浸潤，增強疾病的攻擊(圖3c)?？紤]白血病胚細胞起源于骨髓，因為其對CD34、c-kit、Gr-l、Mac-l、MPO和非特異性酯酶是陽性的；它們對B細胞(B220和CD19)、T細胞(CD4、CD8、CD3禾nCD5)、巨核細胞(CD41)和紅細胞(Terll9)標記是陰性的(圖3d)。SALL4B-誘導的AML是可植入的在免疫缺陷NOD/SCID小鼠中，通過皮下注射連續(xù)植入SALL4B-誘導的AML，形成在大約6周開始的攻擊性的致死AML。植入疾病的特征為散布到多器官，并且就具有標記性的脾腫大和肝腫大(圖3e)。在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中，無效血細胞生成和過度凋亡對幼小的SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠(2-6個月大)的血液異常的研究顯示其外周血表現(xiàn)最小的脊髓發(fā)育不良的特征，而該特征是統(tǒng)計學顯著的白血病和嗜中性粒細胞減少以及中度貧血(表2)。表2.SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型對照的CBC<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>為了確定這些轉(zhuǎn)基因小鼠中血細胞減少癥的原因是否與生產(chǎn)問題相關(guān)，研究了它們的骨髓。與野生型對照相比，骨髓樣品顯示出增加的細胞構(gòu)成和增加的脊髓種群(圖3f)(在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中，Gr-1/Mac-1雙陽性種群67±16%，N=10對WT:55.3±4%，N=ll;P=0.048)。因為過量的凋亡在人MDS無效血細胞生成中起到重要作用，所以接下來在體內(nèi)和體外檢測SALL4轉(zhuǎn)基因小鼠的凋亡。在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中，觀察到增加的凋亡，對于初級骨髓(在轉(zhuǎn)基因小鼠的膜鈣蛋白V-陽性，PI-陰性種群中4.4±2.4%，N40對比WT:1.86±1.55%，N=7;P^.03)和7天CFUs(在轉(zhuǎn)基因小鼠的膜鈣蛋白V-陽性，PI-陰性種群中20.1士6。/。,N^0對比WT:10.9±4%,N=7;Pi.002)(圖3f和g)。這些發(fā)現(xiàn)可解釋以下事實盡管在骨髓中增加脊髓種群，這些轉(zhuǎn)基因小鼠在外周血具有統(tǒng)計上顯著低的嗜中性粒細胞計數(shù)，這相比于它們骨髓中的正在發(fā)生的無效髓細胞生成是次要的。在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中，也注意到幼稚細胞種群增加，對于初級骨髓(SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中c-kit-陽性種群10.2±1.3%,N=14對比WT:6.5±2.5%,N=10;P:O細)(圖3f)禾口7天CFUs(SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠中CD34-陽性種群11±2.2%,N=8對比WT:6.3±2.4%,N=7;PK).002)(圖3g)。相似的總集落在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠(平均=51,N40)和WT對照(平均=40^=6)中被觀察到。然而，與WT對照相比，在SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠CFU中，發(fā)現(xiàn)增加的脊髓和減少的紅細胞集落種群(圖3h),如已在人MDS患者和其它MDS小鼠模型中報道的。這些觀察表明，SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的缺陷在于影響造血分化(hematopoieticdifferentiation)的干細胞/祖細胞水平。在體外SALL4A和SALL4B與(3-聯(lián)蛋白的結(jié)合接下來，研究在白血病發(fā)生中SALL4可能影響的潛在信號通路。在果蠅中，印W(sal)是Wnt信號的下游靶。ALU——另一種SALL基因家族成員，可與P-聯(lián)蛋白相互作用。對于這種相互作用的高親和位點位于C末端雙鋅指結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)SALL1的該區(qū)域幾乎與SALL4的該區(qū)域完全相同。該發(fā)現(xiàn)促進了調(diào)查SALL4是否也能與)3-12聯(lián)蛋白結(jié)合。血細胞凝集素(HA)靶向的SALL4A和SALL4B的表達構(gòu)建物被產(chǎn)生。如在圖4a中所示的，HA-SALL4A和HA-SALL4B降低內(nèi)源性(3-聯(lián)蛋白，但是僅僅HA沒有這種影響。SALL4A和SALL4B活化Wnt/13-聯(lián)蛋白信號通路為了研究SALL4同種型和P-聯(lián)蛋白相互作用的功能性影響，使用含有多拷貝Wnt反應元件(Wnt-responsiveelements)的熒光素酶報告基因(TOPflash;UpstateUSA)以確定SALL4A和SALL4B活化規(guī)范(canonical)Wnt信號通路的能力。Wntl在多種細胞系中表明有效激活該報告構(gòu)建物。在HEL-293細胞系中，瞬時轉(zhuǎn)染TOPflash報告質(zhì)粒，其中Wnt和其Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路存在。也用SALL4A或SALL4B共轉(zhuǎn)染TOPflash報告質(zhì)粒。通過增加的熒光素酶活性，表明SALL4A和SALL4B明顯活化Wnt/p-聯(lián)蛋白信號通路(圖4b)。在CML的不同期，B-聯(lián)蛋白和SALL4的相似表達模式已知失調(diào)Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號涉及LSCs的形成。卩-聯(lián)蛋白涉及LSC自我更新的最好證明來自CML胚細胞轉(zhuǎn)化研究。已闡明Wnt信號在CML胚細胞期被活化，但是不在慢性期被活化，其中包括失調(diào)的Wnt信號如P-聯(lián)蛋白活化，可對CML的GMP賦予自我更新的能力，并導致它們的胚細胞轉(zhuǎn)化。在果蠅屬中，考慮在SALL4和(3-聯(lián)蛋白與spalt位置之間的潛在相互作用為Wnt信號的下游靶，檢測不同期的CML中的SALL4蛋白表達。SALL4表達存在于胚細胞-期CML(N42,75。/。)，但是不存在于慢性期(N41，100%)(圖4c)。在加速期(N-6，10%)——在該時期胚細胞數(shù)量增加，在未染色成熟脊髓細胞例如嗜中性粒細胞的背景上，觀察到表達SALL4的幼稚胚細胞。SALL4對0CT4啟動子的影響為了鑒別SALL4對OCT4啟動子的影響，用海腎質(zhì)粒和增加濃度的SALL4B共轉(zhuǎn)染OCT4-Luc構(gòu)建物(圖5)。如圖所示，增加SALL4B增加超過8倍的OCT4啟動子活性。為了確定OCT4是否刺激SALL基因成員啟動子的活性，在HEK-293細胞中，啟動子構(gòu)建物(pSALLl、pSALL3和pSALL4)和OCT4—起共轉(zhuǎn)染。如可從數(shù)據(jù)(圖6)所見的，在轉(zhuǎn)染后24小時后，當與pcDNA3載體對照相比時，OCT4過表達顯著刺激SALL基因成員SALL1、SALL3和SALL4的啟動子活性。同樣，存在少量過度的SALL4完全阻止了這種活化(圖10)。為了確定是否具有SALL家族成員蛋白對SALL啟動子的任何自調(diào)控，用SALL4-Luc和海腎報告基因一起共轉(zhuǎn)染，SALL4A或SALL4B表達質(zhì)粒是HEK-293和COS-7細胞(圖7)。如在該圖中所示，SALL4(A和B同種型)在不同的細胞系中抑制其自己的啟動子活性。進一步，該自抑制是計量依賴性的(參見圖8)。當SALL4A與SALL4啟動子比例達到6:1時，相對于基礎(chǔ)水平，啟動子活性降低大約3.5倍。該數(shù)據(jù)表明SALL4具有自抑制功能。這不是對于所有SALL成員都是事實，例如，SALL1沒有表明其啟動子的自抑制(圖12)。數(shù)據(jù)也表明外源性加入SALL4強烈活化SALL1和SALL3啟動子(參見，圖9)，這表明SALL4能調(diào)節(jié)涉及胚胎干細胞功能的SALL基因家族的其它成員。因為OCT4對SALL4啟動子的刺激可被SALL4完全抑制(圖10)，檢查SALL4以確定它是否抑制了OCT4對其它SALL成員啟動子的活化。如可在圖11中所見的，SALL4也抑制OCT4對其它SALL成員啟動子的活化。成體干細胞和胚胎瘤(embrvoniccarcinoma)中的SALL4組織干細胞集落的特性仍然難以弄清楚，因為沒有區(qū)分干細胞和分化后代的標記。對于許多組織，已經(jīng)開發(fā)出一組分子標記來限定干細胞細胞間隔。本數(shù)據(jù)表明在多潛能性和自我更新方面，SALL4是胚胎干細胞的主要調(diào)節(jié)劑。例如，胚胎瘤展示早期胚胎干細胞的表型，并且胚胎瘤具有多潛能性潛力。因此，通過免疫組織化學檢測該類型的腫瘤中SALL4蛋白的表達。免疫組織化學數(shù)據(jù)確定地表明胚胎瘤的所有腫瘤細胞示出核染色，而所有非腫瘤細胞是隱性的。這些觀察表明SALL4可被用作正常和惡性胚胎生殖細胞和胚胎干細胞的特異性標記。假定SALL4在非常早期胚胎干細胞中表達，并且胚胎瘤被報告產(chǎn)生自這些細胞的轉(zhuǎn)化，免疫組織化學也表明a)正常乳房小葉中的SALL4陽性細胞，占上皮細胞的2%以下，和b)乳腺癌樣品中，觀察到在細胞簇或分散的細胞中觀察到SALL4蛋白表達。此外，SALL4蛋白在正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞的細胞核中表達。而且，用SALL4抗體，在其它正常成熟組織例如前列腺和肺中、產(chǎn)生自這些組織的瘤中觀察到該多能性基因表達。觀察到在支氣管上皮細胞和前列腺腺泡中存在少量表達SALL4的細胞和它們的基質(zhì)細胞，以及發(fā)現(xiàn)SALL4在正常前列腺和肺以與在乳腺小葉上皮細胞內(nèi)表達相似的頻率進行表達。另外，通過用SALL4抗體的免疫組織化學研究，前列腺癌中分散的腫瘤細胞表達SALL4蛋白?？傊?，本樣品表明(l訴抗-SALL4抗體免疫染色是鑒別胚胎瘤的有用診斷工具，(2)在數(shù)種人干細胞和癌細胞中發(fā)現(xiàn)SALL4的表達；(3)在人組織中識別表達SALL4的細胞可被用來識別干細胞、它們的惡化前細胞和惡性細胞,和(4)SALL4代表胚胎干細胞、成體干細胞和腫瘤干細胞的理想標記。參考文獻1,Mu傷，G,，Ijst>A.F"Gore,S.D,&Ho，A,Y'Mydodysplasticsyiutcome.ilen說totogy(AmSocHcmatolEducProgram),176-99(2003).2.Giliiland，D*G"Jordan,C,T,&Felix,C.A,Themolecularbasisof〗ciikemia<Tfeomtoogy(八mSocHt'i加tolEducProgram),80-97(2004).3.Tenen，D*G,Disruptionofcliffereutiationinhumancancer:AMLshowstheway.Na￡HevCancer3,89-101(2003〕，4,Rosi"arin，入G"Yang*Z'&Resendes，K,KTnmscriptbna〗rcguktioninmydopoiesis:ilematopoitsticfktedioice，myeloiddiffeientiatkm，andlcukcmoge加sis.ExpHematol33，13143(2005),5,Friednian，A-D/TranscdptioHa!regtilalioiiofmyelopoicsis.IntJHem邁to]75,466-72(2002).6,OillilaiKl,DX3.Molccu，argeneticsofhuamnbukenidas:newinsightsintotherapy,SeminHe，]，atol39，6-11(2002).7.Bonnet，D.&Didc，J,E.Humanacutemydoidieultcmiaisorganizedasahierarchythatoriginatesfromaprimitive!honatopoieticcell,NatMed3730-7(1997).8.Huntly，B丄&Gi〗li1and，D.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包括在本發(fā)明的主旨和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由所附的權(quán)利要求所限定。權(quán)利要求1.抗體或抗體片段，其與實質(zhì)上由如SEQIDNO13所列出的氨基酸序列構(gòu)成的多肽相結(jié)合。2.治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將治療有效量的如權(quán)利要求1所述的抗體施用給所述對象。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。4.治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將含有多核苷酸的組合物施用給所述對象，所述多核苷酸選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體、SEQIDNO:5的補體和它們的片段組成的組，其中所述片段包括對在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出氨基酸序列進行編碼的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。6.治療對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括將含有多肽的組合物施用給患者，其中所述多肽選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6組成的組。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。8.診斷對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括(a)提供來自所述對象的生物樣品；(b)將所述生物樣品在雜交條件下與探針接觸，所述探針包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的補體、SEQIDNO:3的補體或SEQIDNO:5的補體列出序列的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；禾口(c)檢測所述探針和所述生物樣品之間的所述雜交，其中檢測雜交與MDS相關(guān)。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。10.診斷對象中骨髓增生異常綜合征(MDS)的方法，包括(a)提供來自所述對象的生物樣品；(b)將所述生物樣品與抗體接觸，所述抗體與包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所列出氨基酸序列的多肽結(jié)合；禾口(c)檢測所述抗體和所述樣品之間的結(jié)合，其中檢測結(jié)合與MDS相關(guān)。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述MDS是急性髓細胞性白血病(AML)。12.用于分離白血病干細胞的方法，包括.-從對象獲得細胞樣品；從不表達如SEQIDNO:13中所列出氨基酸序列的細胞分選表達包括所述氨基酸序列的多肽的細胞；和通過骨髓表面標記從表達包括如SEQIDNO:13中所列出氨基酸序列的多肽的細胞樣品選擇白血病干細胞。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述分選步驟包括通過熒光激活細胞分選法(FACS)進行分選。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述分選步驟包括通過磁珠分選法CMACS)進行分選。15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述標記是CD34、c-kit、Gr-l、Mac-l、MPO禾卩/或非特異性酯酶。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述白血病干細胞對于B細胞、T細胞、巨核細胞和紅細胞標記是陰性的。17.含有人SALL4基因的轉(zhuǎn)基因動物，其中修飾所述動物以表達含有對SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所列出氨基酸進行編碼的核苷酸的人SALL4基因的序列。18.如權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物組成性地表達插入的SALL4基因。19.如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述SALL4基因包括編碼SEQIDNO:4中列出氨基酸序列的核苷酸。20.制備含有人SALL4基因的轉(zhuǎn)基因動物的方法，其中修飾所述動物以組成性地表達含有對SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所列出氨基酸進行編碼的核苷酸的人SALL4基因的序列，所述方法包括a)將含有人SALL4基因的構(gòu)建物的核酸分子引入胚胎細胞，其中所述人SALL4基因含有編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所列出氨基酸的核苷酸；b)從源自步驟a)的所述細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物；c)飼養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因動物以得到對于人SALL4基因純合的轉(zhuǎn)基因動物；和d)檢測從所述轉(zhuǎn)基因動物的組織得到的人SALL4轉(zhuǎn)錄物。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述人SALL4基因的構(gòu)建物包括編碼SEQIDNO:4中列出氨基酸序列的核苷酸。22.識別具有多能性潛能的細胞的方法，包括a)使從內(nèi)細胞群(ICM)、腫瘤組織或腫瘤分離的細胞與檢測SALL家族成員蛋白表達的試劑接觸；和b)確定是否SALL家族成員蛋白在步驟(a)的細胞中表達，其中確定所述SALL家族成員蛋白的所述表達與在所述細胞中自我更新的誘導正相關(guān)，由此，這類表達指示多潛能性。23.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述SALL家族成員選自由SALL1、SAIX3禾卩SAIX4組成的組。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述SALL家族成員是SALL4。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中SALL4是SALL4A或SALL4B。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述試劑是針對所述SALL家族成員蛋白或與編碼所述SALL家族成員蛋白的mRNA互補的核酸的抗體。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述核酸與對選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24組成的組的SALL家族成員蛋白序列進行編碼的核酸互補。28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述核酸與選自由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:21和SEQIDNO:23組成的組的核酸序列的有義鏈互補。29.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細胞是胚胎干(ES)細胞、胚胎癌(EC)細胞、成體干細胞或腫瘤干細胞。30.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述組織來自對象的血漿或活組織樣品。31.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述對象是哺乳動物。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述對象是人。33.識別調(diào)控SALL家族成員蛋白對OCT4表達的影響的試劑的方法，包括a)用下列物質(zhì)共轉(zhuǎn)染細胞i)含有啟動子-報告基因構(gòu)建物的載體，其中所述構(gòu)建物含有可操作連接的OCT4啟動子和編碼基因表達報告蛋白的核酸，和ii)含有編碼SALL家族成員蛋白的核酸的載體；b)將步驟(a)所述細胞與試劑接觸；和c)確定在存在和不存在步驟(b)試劑的情況下啟動子-報告基因構(gòu)建物的活性，其中確定啟動子-報告基因構(gòu)建物的活性與所述試劑對SALL家族成員蛋白/OCT4相互作用的影響有關(guān)。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述啟動子區(qū)含有在SEQIDNO:26中列出的核酸序列。35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中步驟(a)(ii)所述核酸編碼選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24的蛋白質(zhì)序列。36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述表達報告蛋白是熒光素酶。37.診斷瘤性或增殖性疾病的方法，包括a)使對象的細胞與檢測SALL家族成員蛋白表達的試劑接觸；和b)確定SALL家族成員蛋白是否在步驟(a)的所述細胞中表達，其中確定所述SALL家族成員蛋白的表達與在所述細胞中自我更新誘導正相關(guān)，因此，這類表達表示瘤形成或增殖。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述試劑被標記。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中確定步驟包括通過將所述對象暴露于對所述試劑位置成像的儀器而檢測所述試劑。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中通過磁共振、X-射線或放射性核素發(fā)射產(chǎn)生所述圖像。41.治療瘤性或增殖性疾病的方法，其中對象的細胞表現(xiàn)自我更新的脫調(diào)節(jié)，所述方法包括給所述對象施用含有抑制SALL4表達的試劑的藥物組合物。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述試劑是核酸。43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述試劑是針對SALL4的抗體。44.識別具有多能性潛能的細胞的試劑盒，其包含a)用于檢測一種或多種SALL家族成員蛋白的試劑；b)為試劑-細胞相互作用和標記所述試劑提供足夠條件的反應物和緩沖液；c)標記所述檢測反應物和將所述試劑與所述細胞接觸的說明書；和d)含有所述成分(a)、(b)和(c)的容器。45.權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述SALL家族成員選自由SALL1、SALX3禾[lSAIX4組成的組。46.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述試劑是針對所述SALL家族成員蛋白或與編碼所述SALL家族成員蛋白的mRNA互補的核酸的抗體。47.分離細胞的方法，包括a)將所述細胞與針對SALL4的抗體接觸；b)將與所述抗體結(jié)合的細胞運用到表面分隔的腔，所述腔含有至少兩個用于流體和細胞的進入或外出的孔；和c)允許細胞和流體通過所述腔，其中在流體混合物中抗體結(jié)合的細胞通過光學或磁檢測器檢測出，并且其中將電壓或磁通量運用到流體從而所述電壓或磁通量將所述結(jié)合的細胞分配到一個或多個收集器中或所述腔內(nèi)。48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述方法是熒光激活細胞分選法(FACS)。49.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述方法是磁珠細胞分選法(MACS)。50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述細胞是胚胎干細胞、成體干細胞或腫瘤干細胞。51.如權(quán)利要求47所述的方法，其中SALL4是SALL4A或SALL4B。52.檢測與增殖性疾病或腫瘤細胞形成進展相關(guān)的細胞的方法，包括a)將所述細胞與針對SALL4的抗體接觸；b)將與所述抗體結(jié)合的細胞運用到表面分隔的腔，所述腔含有至少兩個用于流體和細胞的進入或外出的孔；和c)允許細胞和流體通過所述腔，其中在流體混合物中抗體結(jié)合的細胞由光學檢測器檢測，以及其中將電壓施加到所述流體從而所述電壓將所述結(jié)合的細胞分類到一個或多個收集器中。全文摘要本發(fā)明公開了SALL4(包括同種型SALL4A、SALL4B和SALL4C)——一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子——的核酸、蛋白質(zhì)和抗體。此外，公開了這樣的方法，其表明SALL4組成型表達增加模型動物系統(tǒng)的細胞中的致白血病能力。而且，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，選擇的同種型(例如SALL4B)組成型表達表明這些動物形成類骨髓增生異常綜合征(MDS)跡象和癥狀，包括急性髓細胞性白血病(AML)，其是可植入的。本公開內(nèi)容也提供識別和純化胚胎干細胞、成體干細胞或腫瘤干細胞——包括白血病干細胞——的方法，提供識別與SALL4結(jié)合和/或調(diào)節(jié)SALL4的物質(zhì)的方法，提供診斷對象中MDS的方法和提供治療存在MDS的對象的方法。文檔編號A01K67/027GK101415325SQ200680051783公開日2009年4月22日申請日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日發(fā)明者Y·馬申請人:內(nèi)華達腫瘤研究所