專利名稱：番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌株，具體是涉及一種番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。
背景技術(shù)：
灰霉病是由半知菌亞門灰葡萄孢屬(5Wo;/,、 Pers)真菌侵染所致，是一種世界性重
要病害。不僅對番茄的危害越來越重，而且目前已成為番茄、黃瓜、茄子、西葫蘆、菜豆、 萵筍、生菜、韭菜等蔬菜的主要病害，目前在生產(chǎn)上對番茄灰霉病的防治主要依靠噴灑化學(xué) 農(nóng)藥，現(xiàn)在具有較高活性的新型化學(xué)農(nóng)藥主要有嘧啶胺類、吡咯類以及酰胺類等。但若連續(xù) 使用化學(xué)藥劑，病菌會(huì)逐漸產(chǎn)生了抗藥性，防效逐年下降，而且化學(xué)農(nóng)藥影響番茄品質(zhì)、污 染環(huán)境、影響人類健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種不含有化學(xué)農(nóng)藥的嘧啶胺類、吡咯類以及酰胺類等成份、能對 治療番茄灰霉病具有良好應(yīng)用效果的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。其技術(shù)方案為
番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四個(gè)步驟步驟1從感染灰霉病的 土壤樣品中篩選到一株拮抗灰霉病的蠟樣芽孢桿菌，該細(xì)菌命名為B-04;步驟2培養(yǎng)含有 B-04細(xì)菌的菌液；步驟3依次用超純水、lmMHepes、電擊緩沖液洗；步驟4通過電擊的方 法將e -1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到B-04細(xì)菌內(nèi)，獲得拮抗菌株B-04-glu。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步驟2中將單個(gè)B-04細(xì)菌菌落接種到LB培養(yǎng) 基中，于26 32'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)6 20h,然后將生成的菌懸液與LB培養(yǎng)基按1: 10的 比例接種，再于26 32'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期2 3.5h。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步驟3中將步驟2最終獲得的菌液先冰浴20 40min，然后離心收集菌體，將收集的菌體依次用預(yù)冷的超純水洗至少1 3次，用濃度為 lmM、 pH為7.0的Hepes洗1 3次，用濃度為lmM的Hepes、含甘油10%且pH為7.0 的電擊緩沖液洗1 3次，然后懸浮到1.0 2.0ml電擊緩沖液中，分裝成每管10(Hi1，儲藏于 -70"的冰箱中。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步驟4中電擊轉(zhuǎn)化時(shí)取一管菌液放在冰上溶解，
3溶解后加入5 10^1質(zhì)粒DNA，冰上放置2 10min后轉(zhuǎn)移到電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊條件為800 1800V、電容25 50uF、電阻100 400Q、電擊杯內(nèi)徑2mm，電擊后將其菌液加入到500^1 1.5mlLB培養(yǎng)基中，在37。C培養(yǎng)0.5 24h后，取lOOpl菌液涂在含有相應(yīng)抗生素的平板上， 于26 32'C培養(yǎng)6 24h，即獲得拮抗菌株B-04-glu。所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu,以B-04為出發(fā)菌株，用e-l,3-葡聚糖酶基因構(gòu)建 工程菌B-04-glu， e -1,3-葡聚糖酶基因從質(zhì)粒pUC1940中酶切獲得。其工作原理為B-04細(xì)菌本身有較強(qiáng)的抗番茄灰霉病的功能，e-i,3-葡聚糖酶又能導(dǎo)致 菌絲細(xì)胞壁破裂，原生質(zhì)體外泄，從而殺死病原菌，因此通過電擊的方法將P-l,3-葡聚糖酶 基因轉(zhuǎn)化到B-04細(xì)菌內(nèi)，獲得的拮抗菌株B-04-glu與野生菌株相比，能大大提高了防治番 茄灰霉病的能力。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于是生物防治，不含有化學(xué)農(nóng)藥的嘧啶胺類、吡咯類以及酰 胺類等成份，所以具有無毒、不污染環(huán)境、不易產(chǎn)生抗藥性、無殘留、易生產(chǎn)、持效期長、 治病力強(qiáng)、應(yīng)用效果好、對非耙標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:步驟l:從感染灰霉病的土壤樣品中篩選到一株拮抗灰霉病的蠟樣芽孢桿菌，即B-04細(xì)菌；步驟2:將單個(gè)B-04細(xì)菌落接種到LB培養(yǎng)基中，于3(TC搖床劇烈振蕩培養(yǎng)20h，然后 將生成的菌懸液與LB培養(yǎng)基按1: IO的比例接種，再于30'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期 約3h;步驟3:將步驟2最終獲得的菌液冰浴20min，離心收集菌體，將收集的菌體依次用預(yù) 冷的超純水洗1次，用濃度為lmM、 pH為7.0的Hepes洗2次，用濃度為lmM的Hepes、 含甘油10%且pH為7.0的電擊緩沖液洗2次，然后懸浮到1.5ml電擊緩沖液中，分裝成每 管10(^1，儲藏于-7(TC的冰箱中；步驟4:電擊轉(zhuǎn)化時(shí)取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5^1質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA 為e-l,3-葡聚糖酶基因與質(zhì)粒連接產(chǎn)物，冰上放置3min后轉(zhuǎn)移到電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊條件為 電壓800V、電容50uF、電阻200Q、電擊杯內(nèi)徑2mm，電擊后將其菌液加入到800nl LB培 養(yǎng)基中，在37。C培養(yǎng)45min后，取100pl菌液涂在含有相應(yīng)抗生素的平板上，于3(TC培養(yǎng) 10h，獲得70個(gè)轉(zhuǎn)化子拮抗菌株B-04-glu。實(shí)施例2:其步驟l同實(shí)施例l的步驟l;
步驟2:將單個(gè)B-04細(xì)菌落接種到LB培養(yǎng)基中，于28'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)15h，然后 將生成的菌懸液與LB培養(yǎng)基按1: IO的比例接種，再于28'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期 約2.5h;
步驟3:將步驟2最終獲得的菌液冰浴30min,離心收集菌體，將收集的菌體依次用預(yù) 冷的超純水洗2次，用濃度為lmM、 pH為7.0的Hepes洗1次，用濃度為lmM的Hepes、 含甘油10%且pH為7.0的電擊緩沖液洗2次，然后懸浮到1.5ml電擊緩沖液中，分裝成每 管10(Hil，儲藏于-7(TC的冰箱中；
步驟4:電擊轉(zhuǎn)化時(shí)取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入8pl質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA 為e-l,3-葡聚糖酶基因與質(zhì)粒連接產(chǎn)物，冰上放置5min后轉(zhuǎn)移到電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊條件為 電壓1200V、電容25uF、電阻400Q、電擊杯內(nèi)徑2mm，電擊后將其菌液加入到800|il LB 培養(yǎng)基中，在37。C培養(yǎng)lh后，取10(^1菌液涂在含有相應(yīng)抗生素的平板上，于28。C培養(yǎng)15h， 獲得600個(gè)轉(zhuǎn)化子拮抗菌株B-04-gki。
實(shí)施例3:
其步驟l同實(shí)施例l的步驟l;
步驟2:將單個(gè)B-04細(xì)菌落接種到LB培養(yǎng)基中，于26X:搖床劇烈振蕩培養(yǎng)10h，然后 將生成的菌懸液與LB培養(yǎng)基按1: IO的比例接種，再于26'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期 約2h;
步驟3:將步驟2最終獲得的菌液冰浴40min，離心收集菌體，將收集的菌體依次用預(yù) 冷的超純水洗2次，用濃度為lmM、 pH為7.0的Hepes洗2次，用濃度為lmM的Hepes、 含甘油10%且pH為7.0的電擊緩沖液洗1次，然后懸浮到2.0ml電擊緩沖液中，分裝成每 管10(Hd，儲藏于-7(TC的冰箱中；
步驟4:電擊轉(zhuǎn)化時(shí)取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入10nl質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA 為e-l,3-葡聚糖酶基因與質(zhì)粒連接產(chǎn)物，冰上放置8min后轉(zhuǎn)移到電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊條件為 電壓1400V、電容50uF、電阻200Q、電擊杯內(nèi)徑2mm，電擊后將其菌液加入到800|al LB 培養(yǎng)基中，在37。C培養(yǎng)1.5h后，取lO(Hil菌液涂在含有相應(yīng)抗生素的平板上，于26。C培養(yǎng) 20h，獲得800個(gè)轉(zhuǎn)化子拮抗菌株B-04-glu。
權(quán)利要求
1、一種番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四個(gè)步驟步驟1從感染灰霉病的土壤樣品中篩選到一株高效拮抗灰霉病的蠟樣芽孢桿菌，該細(xì)菌命名為B-04；步驟2培養(yǎng)含有B-04細(xì)菌的菌液；步驟3依次用超純水、1mM Hepes、電擊緩沖液洗；步驟4通過電擊的方法將β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到B-04細(xì)菌內(nèi)，獲得拮抗菌株B-04-glu。
2、 如權(quán)利要求l所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于步驟2中，將單個(gè) B-04細(xì)菌菌落接種到LB培養(yǎng)基中，于26 32t;搖床劇烈振蕩培養(yǎng)6 20h，然后將生成的菌 懸液與LB培養(yǎng)基按1: IO的比例接種，再于26 32'C搖床劇烈振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期2 3.5h。
3、 如權(quán)利要求l所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于步驟3中，將步驟 2最終獲得的菌液先冰浴20 40min，然后離心收集菌體，將收集的菌體依次用預(yù)冷的超純 水洗至少1 3次，用濃度為lmM、 pH為7.0的Hepes洗1 3次，用濃度為lmM的Hepes、 含甘油10%且pH為7.0的電擊緩沖液洗1 3次，然后懸浮到1.0 2.0ml電擊緩沖液中，分 裝成每管10(Hd，儲藏于-7(TC的冰箱中。
4、 如權(quán)利要求l所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于步驟4中，電擊轉(zhuǎn) 化時(shí)取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5 10nl質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA為e-l，3-葡聚糖 酶基因與質(zhì)粒連接產(chǎn)物，冰上放置2 10min后轉(zhuǎn)移到電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊條件為800 1800V、電容25 50uF、電阻100 400Q、電擊杯內(nèi)徑2mm，電擊后將其菌液加入到500^1 L5mlLB培養(yǎng)基中，在37。C培養(yǎng)0.5 2h后，取菌液涂在含有相應(yīng)抗生素的平板上， 于26 32-C培養(yǎng)6~24h，即獲得拮抗菌株B-04-gki。
5、 如權(quán)利要求1所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于以B-04細(xì)菌為出 發(fā)菌株，用e -1，3-葡聚糖酶基因構(gòu)建工程菌B-04-glu， e -1,3-葡聚糖酶基因從質(zhì)粒pUC1940 中酶切獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供一種番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四個(gè)步驟步驟1從感染灰霉病的土壤樣品中篩選到一株高效拮抗灰霉病的蠟樣芽孢桿菌，該細(xì)菌命名為B-04；步驟2培養(yǎng)含有B-04細(xì)菌的菌液；步驟3依次用超純水、1mM Hepes、電擊緩沖液洗；步驟4通過電擊的方法將β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到B-04細(xì)菌內(nèi)，獲得拮抗菌株B-04-glu。本發(fā)明由于是生物防治，不含有化學(xué)農(nóng)藥的嘧啶胺類、吡咯類以及酰胺類等成份，所以具有無毒、不污染環(huán)境、不易產(chǎn)生抗藥性、無殘留、易生產(chǎn)、持效期長、治病力強(qiáng)、應(yīng)用效果好、對非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01N63/02GK101289649SQ200710014340
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者李桂霞, 馬匯泉 申請人:山東理工大學(xué)