專利名稱：短短小芽孢桿菌tw及防治水稻稻瘟病的活菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短短小芽孢桿菌TW及用該菌種制備的防治水稻稻瘟病的活菌制劑。
背景技術(shù)：
水稻稻瘟病(Blast Fungus)，是全世界稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害之一。該病一年四季均可對(duì)水稻造成危害，其危害遍及水稻的各個(gè)部位，有苗稻瘟、葉瘟、葉枕瘟、節(jié)稻瘟、穗頸瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。一般造成水稻減產(chǎn)10％～20％。該病在我國(guó)年發(fā)生面積均在380萬hm2以上，年損失稻谷達(dá)數(shù)億kg。目前，水稻抗瘟性品種的利用和化學(xué)農(nóng)藥的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但因抗瘟品種的單一化、稻瘟病菌生理小種遺傳的復(fù)雜性和致病性的多樣性，以及化學(xué)農(nóng)藥的毒性和病原菌的抗藥性，水稻抗瘟性品種和化學(xué)農(nóng)藥使用在生產(chǎn)上都受到一定的限制。為此，水稻稻瘟病的生物防治特別是生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)是水稻生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的需要。微生物農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的選擇壓力較小，且不易使靶標(biāo)病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此，生物源農(nóng)藥的研究將會(huì)為人們提供更安全更高效的防治水稻稻瘟病的途徑。
近年來，對(duì)農(nóng)藥的要求除了安全無毒外，還應(yīng)對(duì)環(huán)境有較小的選擇壓力。生物農(nóng)藥最能體現(xiàn)上述防治的特點(diǎn)，它的作用靶標(biāo)或?qū)Σ≡淖饔靡话愣际嵌嘁蜃拥模蚍Q多效的，故不易使靶標(biāo)菌產(chǎn)生抗藥性。在保證水稻產(chǎn)量的前提下，生物農(nóng)藥的使用是不可缺少的。目前，對(duì)稻瘟病生物防治手段有(1)直接施用抗生素，如春雷霉素、春日霉素、滅瘟素-S、Blasticidin、慶豐霉素(其微生物來源春日鏈霉菌、Streptomyces kasugensis Umezawa、灰色產(chǎn)色鏈霉菌、GriseochromogenesFukunaga、慶豐鏈霉菌、放線菌)；(2)生防細(xì)菌和真菌制劑，如芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、Bacillus amyloliquef aciens RC-2、蠟狀芽孢桿菌、假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa PR3(NRRL B-18602)和木霉屬真菌。但到目前為止，尚沒有用短短小芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)防治水稻稻瘟病的報(bào)道和相關(guān)專利申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，公開一種短短小芽孢桿菌TW，并提供一種包含短短小芽孢桿菌TW并對(duì)水稻稻瘟病有較好防治效果的防治水稻稻瘟病的活菌制劑。
本發(fā)明的微生物是一種在野生細(xì)菌中篩選獲得的對(duì)水稻稻瘟病有強(qiáng)烈拮抗作用的短短小芽孢桿菌TW(拉丁文屬名為Brevibacillus brevis)，該菌種已于2006年2月9日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM207014。
上述菌種具有如下特征1、形態(tài)特征細(xì)菌呈直桿狀，具圓端或方端，菌落形態(tài)圓型，隆起，邊緣光滑，黃白色至乳白色菌落；2、生理生化特征革蘭氏陽性，好氧，周生鞭毛，能產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形或柱狀；3、發(fā)酵液能產(chǎn)生多種抗菌肽；4、發(fā)酵液能拮抗水稻稻瘟病菌，水稻紋枯病菌，小麥紋枯病菌和油菜菌核病菌等多種植物病真菌。
本發(fā)明的防治水稻稻瘟病的活菌制劑的一種形式為固體制劑，其成份中包含短短小芽孢桿菌菌種1.0×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g，還包含有的添加劑，添加劑的成份及重量比為防紫外輻射劑0.05％～0.10％，濕潤(rùn)劑0.5％～1.5％，保護(hù)劑1.0％～5.0％，防腐劑0.5％-1.5％，其余為固體填充物。
本發(fā)明的防治水稻稻瘟病的活菌制劑的另一種形式為液體制劑，其成份中包含短短小芽孢桿菌菌種1.0×1010cfu/ml～2.0×1010cfu/ml，還包含有添加劑，添加劑的成份及重量體積比為防腐劑0.5％～1.5％，防凍劑0.5％～1.5％，粘稠防滲劑5.0％～10.0％，濕潤(rùn)劑0.5％～1.5％，其余為緩沖液。
本發(fā)明其優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下1、室內(nèi)拮抗活性測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明短短小芽孢桿菌TW對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑菌活性，EC50值為6.1008mg/L(95％置信限為0.2801～20.3491mg/L)，而具有廣譜性拮抗活性的對(duì)照藥劑臘質(zhì)芽孢桿菌的EC50值為92.6835mg/L(95％置信限為65.8516～129.7483mg/L)。兩種藥劑EC50值的95％置信限不重疊，說明藥劑間差異顯著；2、本發(fā)明的活菌制劑的大田示范防效果表明，該菌劑對(duì)稻瘟病防治效果達(dá)83％以上；3、由于本發(fā)明的活菌制劑是生物制劑，沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列環(huán)境和安全問題，因而保證水稻稻瘟病這種惡性病害的無公害防治，同時(shí)可以減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，為農(nóng)民節(jié)省開支。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的短短小芽孢桿菌TW(Brevibacillus brevis)菌株由鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所獨(dú)家保存。
本發(fā)明的防治水稻稻瘟病的活菌制劑可采用液體制劑和固體制劑，其制備過程的具體實(shí)施例如下
實(shí)施例一，液體制劑的制備包括以下步驟(1)一級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)挑取一個(gè)生長(zhǎng)于R2A培養(yǎng)基上的短短小芽孢桿菌TW單菌落斑，于裝有50mlR2A培養(yǎng)液(即R2A培養(yǎng)基中不加瓊脂)的250ml三角瓶中，置30℃，200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)16h。
(2)二級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)將一級(jí)種子培養(yǎng)液按1∶50放大接種于R2A培養(yǎng)液中，置相同條件培養(yǎng)24h。
(3)上罐發(fā)酵將二級(jí)種子培養(yǎng)液按1∶200放大接種于發(fā)酵培養(yǎng)液(成份葡萄糖1.0％、黃豆餅粉2.50％、蛋白胨0.4％、NaCl 0.2％、(NH4)2SO40.6％、CaCO30.4％、MgSO40.4％)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH7.2，溶氧為100％，攪拌轉(zhuǎn)速為350rmp，30℃，24h出酵。
(4)離心收集菌體，用0.01M磷酸緩沖液重新懸浮菌體。
(5)液體制劑獲得將上述重新懸浮液調(diào)成1.0×1010cfu/ml后，按一定比例加入添加劑，即0.1％(W/V)羅丹明B，1.0％(W/V)苯甲酸鈉，0.5％丙二醇(W/V)，和5.0％(W/V)黃原膠，木質(zhì)素磺酸鈉0.5％～1.5％(W/V)，用0.01M磷酸緩沖液補(bǔ)足至100％，無菌瓶分裝。
實(shí)施例二，固體制劑的制備步驟包括與實(shí)施例一相同的一級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)、上罐發(fā)酵、離心收集菌體步驟，在離心后的懸浮液中加入保護(hù)劑蔗糖1.0％后冷凍干燥(或60℃干燥)成固體后氣流粉碎得母菌粉。按比例加入添加劑，即0.1％(W/W)羅丹明B，1.0％(W/W)苯甲酸鈉，和1.0％木質(zhì)素磺酸鈉(W/W)，用陶土調(diào)節(jié)菌濃度為1.0×1010cfu/g，無菌袋分裝。
本發(fā)明活菌制劑的大田施用方式為800-1000倍稀釋液，細(xì)噴霧。
本發(fā)明的實(shí)施效果如下一(一)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，短短小芽孢桿菌TW對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑菌活性，EC50值為6.1008mg/L(表2)，95％置信限為0.2801～20.3491mg/L，而具有廣譜性拮抗活性的對(duì)照藥劑臘質(zhì)芽孢桿菌的EC50值為92.6835mg/L，95％置信限為65.8516～129.7483mg/L。兩種藥劑EC50值的95％置信限不重疊，說明藥劑間差異顯著。
表1 短短小芽孢桿菌TW對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率測(cè)定(原始記錄數(shù)據(jù))

表2 短短小芽孢桿菌TW對(duì)稻瘟病菌室內(nèi)抑菌活性測(cè)定的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

(二)大田防治示范試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌制劑固體制劑對(duì)稻穗頸瘟的防效，在兩種水稻品種上的防效均在80％以上；液體制劑在兩種水稻品種上防效均在90％以上。液體制劑與化學(xué)藥劑(三環(huán)唑)間的防效差異不顯著。
表3 2006年水稻穗頸瘟句容后白農(nóng)場(chǎng)示范防治結(jié)果

注防治時(shí)間為水稻破口期，防治一次。TW指短短小芽孢桿菌TW
權(quán)利要求
1.一種短短小芽孢桿菌TW(拉丁文屬名為Brevibacillus brevis)，保藏號(hào)為CCTCC NOM207014.
2.一種防治水稻稻瘟病的活菌制劑，其特征是它為固體制劑，其成份中包含短短小芽孢桿菌菌種1.0×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g，還包含有的添加劑，添加劑的成份及重量比為防紫外輻射劑0.05％～0.10％，濕潤(rùn)劑0.5％～1.5％，保護(hù)劑1.0％～5.0％，防腐劑0.5％-1.5％，其余為固體填充物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治水稻稻瘟病的活菌制劑，其特征是是所述防紫外輻射劑RDB為羅丹明B，所述濕潤(rùn)劑為木質(zhì)素磺酸鈉，所述防腐劑為苯鉀酸鈉，所述保護(hù)劑為蔗糖。
4.一種防治水稻稻瘟病的活菌制劑，其特征是是它為液體制劑，其成份中包含短短小芽孢桿菌菌種1.0×1010cfu/ml～2.0×1010cfu/ml，還包含有添加劑，添加劑的成份及重量體積比為防腐劑0.5％～1.5％，防凍劑0.5％～1.5％，粘稠防滲劑5.0％～10.0％，濕潤(rùn)劑0.5％～1.5％，其余為緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治水稻稻瘟病的活菌制劑，其特征是是所述防腐劑為苯鉀酸鈉，所述防凍劑為丙二醇，所述粘稠防滲劑為黃原膠，所述濕潤(rùn)劑為木質(zhì)素磺酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短短小芽孢桿菌TW及用該菌種制備的防治水稻稻瘟病的活菌制劑。其短短小芽孢桿菌TW的保藏號(hào)為CCTCC NOM207014。本發(fā)明活菌制劑的固體制劑的成份中包含短短小芽孢桿菌菌種1.0×10
文檔編號(hào)A01N63/02GK101063094SQ200710021509
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日
發(fā)明者楊敬輝, 朱桂梅, 潘以樓 申請(qǐng)人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所