專利名稱：魚類精子超低溫冷凍保存簡易方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到魚類精子超低溫冷凍保存方法背景技術(shù)當(dāng)前，魚類精子超低溫冷凍保存采用有三種方法一種是小丸顆粒冷凍法，另一種是安瓿瓶冷凍法，第三種是麥細(xì)管冷凍法。其小丸顆粒冷凍法是將魚類精子直接滴入干冰內(nèi)或用液氮蒸氣冷凍成精子小顆粒，然后轉(zhuǎn)入液氮罐中，用程序降溫儀或計算機(jī)控制程序降溫儀控制魚類精子的冷凍速度，使魚類精子冷凍溫度達(dá)到-196℃進(jìn)行保存。這種冷凍方法不足之處在于每次保存的精子量很少，而且解凍需要合適的解凍液，因此很少有人采用。安瓿瓶冷凍法是將魚類精子裝入安瓿瓶中，然后再轉(zhuǎn)入液氮罐內(nèi)，用程序控制降溫儀或計算機(jī)控制程序降溫儀控制魚類精子冷凍速度，使其魚類精子冷凍溫度達(dá)到-196℃進(jìn)行保存。麥細(xì)管冷凍法是將魚類精子裝入麥細(xì)管中，然后再轉(zhuǎn)入液氮罐內(nèi)，用程序控制儀或計算機(jī)控制程序降溫儀控制魚類精子冷凍速度，使其魚類精子冷凍溫度達(dá)到-180℃進(jìn)行保存。安瓿瓶冷凍法和麥細(xì)管冷凍法的優(yōu)點是可以避免精子與冷凍劑的直接接觸，但安瓿瓶冷凍法不足的是安瓿瓶體積較大，降溫難以均勻，而且操作比較復(fù)雜。以上三種方法均是在實驗室中進(jìn)行，其程序控制降溫儀或計算機(jī)控制程序降溫儀對降溫過程的控制相當(dāng)準(zhǔn)確。在對魚類精子進(jìn)行冷凍保存時，特別是對珍稀和瀕危魚類精子的冷凍保存時，采集精子的地點往往是野外。而魚類精子一旦被采集，其活力就處于一種隨時間衰減的狀態(tài)，這種衰減的狀態(tài)直接影響冷凍后的精子復(fù)蘇效果。珍稀魚類精子的采集往往幾年、甚至幾十年才可能有一次采集精子的機(jī)會，一旦錯過，很難再采集到。而野外離實驗室太遠(yuǎn)，有時甚至需要1-2天才能回到實驗室，這樣，采集到的精子待回到實驗室時均已死亡。而程序降溫儀或計算機(jī)控制程序降溫儀體積較大，很笨重，不便于搬到野外進(jìn)行工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在離實驗室很遠(yuǎn)的野外條件下，不用程序降溫儀或計算機(jī)控制程序降溫儀實現(xiàn)對魚類精子快速、簡便、超低溫冷凍保存。
本發(fā)明技術(shù)方案是以如下方式實現(xiàn)的1、取性腺發(fā)育成熟的親魚(雄性)，將親魚腹部用干毛巾擦干凈，擠下腹部，用干凈的注射器在生殖孔處吸取精子；2、用預(yù)先配制好的稀釋液，不同的魚種，其稀釋液的成分和濃度均不相同，其精子與稀釋液之間按1∶1～5的比例稀釋精子；3、稀釋后的精子放在溫度為4℃的冰箱內(nèi)平衡20～30分鐘；4、平衡后的精子用0.5毫升麥細(xì)管分裝；5、將液氮加入一個帶蓋的泡沫箱內(nèi)，其內(nèi)的中空泡沫板的中空寬度為10厘米，0.5毫升的麥細(xì)管正好橫在上面，長度可依據(jù)泡沫箱的大小而定，越長，一次放的麥細(xì)管越多，泡沫板浮在液氮表面，蓋上蓋保持2分鐘；6、打開泡沫箱蓋，將分裝好的麥細(xì)管迅速橫放在泡沫板上，每只麥細(xì)管之間要保持一定的距離，由于泡沫板的厚度為2.5～3cm，其麥細(xì)管正好位于液氮面2.5～3cm處，蓋上泡沫箱蓋，保持20分鐘；7、打開泡沫箱，將泡沫板一端往上提起，使細(xì)麥管迅速滾入泡沫箱內(nèi)的液氮中；8、5分鐘后即可將麥細(xì)管轉(zhuǎn)入液氮罐在溫度為-196℃中永久保存。
本發(fā)明的優(yōu)點是
1、本發(fā)明與采用程序降溫儀對10種魚類精子的冷凍效果進(jìn)行比較，其效果優(yōu)于程序降溫儀。下表為兩種方法的比較

2、能在野外不用程序降溫儀或者計算機(jī)程序控制降溫儀實現(xiàn)對魚類精子快速、簡便、超低冷凍保存。
3、操作簡便易行，成本低。


圖泡沫箱結(jié)構(gòu)圖
具體實施例方式實施例1圖中，泡沫箱2的上面有一個箱蓋1，泡沫箱2內(nèi)有液氮4，液氮4的上面有泡沫板3，泡沫板3為中空板，共厚度為25毫米，長為25厘米，寬為100毫米，泡沫板3上放有9支麥細(xì)管5。
實施例2下面以冷凍10毫升鯉魚精子為例，說明簡易冷凍方法的具體操作過程(1)鮮精采集10毫升鯉魚精子后，放置于溫度為4℃的冰箱內(nèi)，每次取5毫升鮮精，加入20毫升稀釋液于30毫升指管瓶中混勻，總體積為25毫升，在溫度為4℃冰箱內(nèi)平衡30分鐘，其稀釋液為8克NaCl，0.5克KCl，15克葡萄糖，蒸餾水定溶至1000毫升，pH6.0；(2)平衡完成后，加入2.16毫升DMSO(二甲砜抗凍劑)，使其抗凍劑的濃度達(dá)到8％，混勻后，立即用0.5毫升麥細(xì)管分裝，50支麥細(xì)管即可全部分裝完成，分裝時間越短越好，一般只需30-60秒；(3)將分裝好的麥細(xì)管橫放在泡沫箱液氮面上的泡沫板上，泡沫板中空寬10厘米，長20厘米，厚2.5厘米時，可放50支以上的麥管；(4)蓋上泡沫箱蓋，保持20分鐘，同時重復(fù)1～3的過程，20分鐘后，提起泡沫板一端，使麥管滾入下面液氮中，再放第二批分裝好的麥細(xì)管，如此重復(fù)，直到全部精子冷凍完；(5)5分鐘后，將泡沫箱內(nèi)液氮中的麥細(xì)管全部轉(zhuǎn)入液氮罐中，在溫度為-196℃中長期保存。
實施例3以下用冷凍20毫升胭脂魚精子，說明冷凍方法的具體操作過程(1)鮮精采集后，放置于4℃的冰箱中，每次取10毫升鮮精，加入30毫升稀釋液于50毫升指管瓶中搖勻，總體積為40毫升，在4℃冰箱內(nèi)平衡30分鐘，其稀釋液8克NaCl，0.5克KCl，15克葡萄糖，蒸餾水定溶至1000毫升，pH7.0；(2)平衡完成后，加入3.26毫升DMSO(二甲砜抗凍劑)，使其抗凍劑的濃度達(dá)到8％，混勻后，立即用0.5毫升麥管分裝，約80支麥管即可全部分裝完成，分裝時間越短越好，一般只需30-60秒；(3)將分裝好的麥管橫放在泡沫箱液氮面上的泡沫板上，泡沫板中空寬10厘米，長30厘米，厚3厘米時，可放80支以上的麥細(xì)管；
(4)蓋上泡沫箱蓋，保持20分鐘，同時重復(fù)1～3的過程，20分鐘后，提起泡沫板一端，使麥細(xì)管滾入下面液氮中，再放第二批分裝好的麥細(xì)管，如此重復(fù)，直到全部精子冷凍完；(5)5分鐘后，將泡沫箱內(nèi)液氮中的麥管全部轉(zhuǎn)入液氮罐中，在溫度為-196℃中長期保存。
權(quán)利要求
1.魚類精子超低溫冷凍保存簡易方法，其特征是取性腺發(fā)育成熟的親魚(雄性)，將親魚腹部用干毛巾擦干凈，擠壓腹部，用干凈的注射器在生殖孔處吸取精子；用預(yù)先配制好的稀釋液，不同的魚種，其稀釋液的成分和濃度均不相同，其精子與稀釋液之間按1∶1～5的比例稀釋；稀釋后的精子放在溫度為4℃的冰箱內(nèi)平衡20～30分鐘，然后加入一定濃度的抗凍劑；平衡后的精子用0.5毫升麥細(xì)管分裝；將液氮加入一個帶蓋的泡沫箱內(nèi)，其內(nèi)的中空泡沫板的中空寬度為10厘米，厚度為2.5～3厘米，0.5毫升的麥細(xì)管正好橫在上面，長度可依據(jù)泡沫箱的大小而定，越長一次放的麥細(xì)管越多，泡沫板浮在液氮表面，蓋上蓋保持2分鐘；打開泡沫箱蓋，將分裝好的麥細(xì)管迅速橫放在泡沫板上，每只麥細(xì)管之間要保持一定的距離，蓋上泡沫箱蓋，保持20分鐘；打開泡沫箱，將泡沫板一端往上提起，使麥細(xì)管迅速滾入泡沫箱內(nèi)的液氮中；5分鐘后即可將麥細(xì)管轉(zhuǎn)入液氮罐在溫度為-196℃中永久保存。
全文摘要
魚類精子超低溫冷凍保存簡易方法，它是將魚類精子取出后，將精子與稀釋液按1∶1～5的比例稀釋放入4℃冰箱內(nèi)平衡20－30分鐘，再加入一定濃度的抗凍劑，然后用0.5毫升麥細(xì)管分裝后，放入泡沫箱內(nèi)液氮面上厚2.5～3厘米，寬10厘米沫板上，20分鐘后，將泡沫板上的麥細(xì)管滑入液氮中，5分鐘后再將所有的麥細(xì)管轉(zhuǎn)入溫度為－196℃的液氮罐中內(nèi)冷凍保存。本發(fā)明能在離實驗室很遠(yuǎn)的野外條件下，以及沒有程序降溫儀或計算機(jī)控制程序降溫儀的情況下，實現(xiàn)對魚類精子快速、簡便、超低溫冷凍保存，其操作簡便易行，冷凍效果好，成本低。
文檔編號A01N1/00GK101088511SQ20071005159
公開日2007年12月19日 申請日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者柳凌, 張潔明, 危起偉, 郭峰, 朱永久 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所