專利名稱：一種水浮蓮體外再生及繁殖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領域，特別是采用離體無菌培養(yǎng)通過愈傷組織誘導獲得水浮蓮的體外再生及繁殖的方法。
背景技術：
水浮蓮(Pistia stratiotes L.)又稱大漂，為天南星科植物，是一種漂浮性水生植物，與水葫蘆(Eichhornia crassipes)為不同科植物。水浮蓮被認為是世界上生長繁殖最快的水生植物，一株植物在90天內可以無性繁殖出25萬株，其遺傳穩(wěn)定性好，對人體無毒。水浮蓮主要生物量是葉片，經測定含有豐富的蛋白質、胡蘿卜素、總黃酮和微量元素等，其中必需氨基酸占50％左右。不僅可作飼料和肥料等多種用途，而且具有極強的抗污染能力，能夠凈化水體中的N、P、K、酚、氰、有機物和重金屬等污染物質，在污水凈化和富營養(yǎng)化水體治理中具有十分重要的作用。
由于水浮蓮的快速生長特性，利用植物組織培養(yǎng)系統可以研究水浮蓮對水體中污染物質的吸收、聚集、降解和轉運，闡明凈化的生化機制和污染物對水浮蓮自身生長代謝的影響以及細胞耐受性等問題，還可以通過植物組織培養(yǎng)系統將外源基因在水浮蓮表達，例如，表達富集重金屬和其它污染物的降解基因可以用于污染水體的生物修復，對于降低水體的富營養(yǎng)化和保護生態(tài)環(huán)境等方面都很有意義。此外，還可以將該植物作為生物反應器生產目標蛋白，特別是具有重要應用價值的藥用蛋白。因此建立水浮蓮的體外再生系統在基礎研究和實際應用兩方面都有重要意義。
但根據文獻報道，目前只有1篇文獻涉及水浮蓮的體外繁殖。該方法是將水浮蓮整株植物消毒后接種在液體培養(yǎng)基進行繁殖。由于該方法沒有經過誘導愈傷組織階段，因此只可以將培養(yǎng)的無菌苗用于生物化學方面的研究，而不能采用該方法進行遺傳轉化。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種水生植物水浮蓮體外再生及繁殖的方法。該方法采用水浮蓮的莖為材料誘導愈傷組織，再通過愈傷組織獲得完整再生之植物。該方法可以用于再生之植物的遺傳轉化與改良，對該植物用于污染環(huán)境的生物修復以及生產有用化合物如藥用蛋白必將產生深遠的影響。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是利用水浮蓮的莖誘導愈傷組織，然后通過愈傷組織再生出苗，以及采用液體培養(yǎng)基擴大繁殖。具體包括以下步驟a.外植體消毒選取水浮蓮莖，對其洗凈和消毒，獲得無菌的外植體；b.愈傷組織誘導將莖切成薄片，然后置于含有植物激素2，4-D和BA的MS培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織；
c.植株再生將愈傷組織轉移至含有植物激素BA的MS培養(yǎng)基再生為苗，苗進一步生根獲得完整的再生植株；d.液體擴大繁殖將再生植株轉移到SH液體培養(yǎng)基進行繁殖。
本發(fā)明與現有技術相比，具有以下顯著效果1.誘導愈傷組織所需要的時間短，能夠在2周左右的時間獲得愈傷組織。
2.從愈傷組織獲得再生完整植株所需要的時間短，且遺傳穩(wěn)定性好。
3.在液體培養(yǎng)條件下生長迅速，生物量大，能夠在短期內無性繁殖獲得大量的植株。
本發(fā)明提供的水浮蓮體外再生及繁殖的方法可用于該植物的遺傳轉化及基因工程研究，通過表達外源基因應用于污染環(huán)境的生物修復，以及作為生物反應器生產有用物質如藥用蛋白等，具有廣闊的應用價值。


圖1是從水浮蓮莖誘導的愈傷組織。
圖2是從圖1的愈傷組織再生出叢生苗。
圖3是從圖2的叢生苗誘導生根形成的完整植株。
圖4是再生苗在固體培養(yǎng)基繁殖的情況。
圖5是再生苗在液體培養(yǎng)基繁殖的情況。
具體實施例方式
本發(fā)明建立了一種通過水浮蓮的莖誘導愈傷組織，再通過愈傷組織再生出苗，以及采用液體培養(yǎng)基進行擴大繁殖的全新的水浮蓮體外再生的方法，該方法將廣泛用于基礎及應用研究兩方面。
本發(fā)明提供的是一種水浮蓮體外再生的方法，其包括以下步驟a.外植體消毒選取水浮蓮莖，對其洗凈和消毒，獲得無菌的外植體。消毒步驟是首先在5％的次氯酸鈉的消毒液中處理10分鐘，再轉移到0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘，隨后用無菌水清洗3次。
b.愈傷組織誘導將莖切成薄片，然后置于含有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，簡稱2，4-D)和6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，簡稱BA)的Murashige和Skoog(簡稱MS)培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織。所述培養(yǎng)基具體是指含有0.5mg/L2，4-D和0.2mg/L BA的MS培養(yǎng)基。
c.植株再生將愈傷組織轉移至含有植物激素BA的MS培養(yǎng)基再生為苗，苗進一步生根獲得完整的再生植株。MS培養(yǎng)基是指含有1mg/LBA的MS培養(yǎng)基。
d.液體擴大繁殖將再生植株轉移到Schenk和Hildebrandt(簡稱SH)液體培養(yǎng)基進行擴大繁殖。
下面結合具體實驗對本發(fā)明提供的方法作進一步說明。
實驗一.愈傷組織的誘導選取水浮蓮葉片和莖用無菌水洗凈，首先在5％的次氯酸鈉的消毒液中處理10分鐘，再轉移到0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘，隨后用無菌水清洗3次，將葉片切成1厘米左右的小塊，將莖切成薄片，置于MS基本培養(yǎng)基附加植物激素0.5mg/L2，4-D，0.2mg/L BA誘導愈傷組織。其中葉片在該培養(yǎng)基上不能形成愈傷組織，而莖在培養(yǎng)2星期后形成淡黃色的愈傷組織(見圖1)。在本實驗過程中消毒方法起非常關鍵的作用。我們嘗試了不同的消毒方法及消毒時間，發(fā)現消毒如果不徹底，外植體容易產生污染而得不到愈傷組織；如果消毒時間過長，外植體則會被殺死，也不能夠誘導出愈傷組織。
實驗二.植株再生實驗一誘導的愈傷組織轉到含有1mg/L BA的MS培養(yǎng)基，2-3星期后從愈傷組織形成綠色的叢生苗(見圖2)。這些叢生苗再轉移到相同的MS培養(yǎng)基后，可以形成完整的植株(見圖3)。
實驗三.固體及液體擴大繁殖將實驗二獲得的完整植株轉移到不添加任何植物激素的MS固體培養(yǎng)基上，可以形成新的植株，但繁殖速度慢(見圖4)。為了快速繁殖，將實驗二獲得的完整植株轉移到SH液體培養(yǎng)基，其繁殖速度可以大大提高(見圖5)。
實驗四.液體擴大培養(yǎng)條件的優(yōu)化為了進一步提高液體擴大繁殖的速度，從實驗三液體培養(yǎng)選擇無菌苗，置于不同的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中含有2倍大量元素的SH培養(yǎng)基(簡稱2×SH培養(yǎng)基)生長效果最好(見附表1)。進一步試驗了不同pH條件下在2×SH液體培養(yǎng)基的生長情況，發(fā)現pH在6.0左右最適合水浮蓮無菌苗的生長繁殖，無論是再生的新植株數量還是鮮重都比其它pH要高(見附表2)。
附表表1不同液體培養(yǎng)基再生效果比較

表2液體培養(yǎng)基不同pH對植物繁殖的效果

權利要求
1.一種水浮蓮體外再生及繁殖的方法，其特征是一種利用水浮蓮的莖誘導愈傷組織，然后通過愈傷組織再生出苗，以及采用液體培養(yǎng)基繁殖的方法，包括以下步驟a.外植體消毒選取水浮蓮莖，對其洗凈和消毒，獲得無菌的外植體；b.愈傷組織誘導將莖切成薄片，然后置于含有植物激素2，4-D和BA的MS培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織；c.植株再生將愈傷組織轉移至含有植物激素BA的MS培養(yǎng)基再生為苗，苗進一步生根獲得完整的再生植株；d.液體擴大繁殖將再生植株轉移到SH液體培養(yǎng)基進行繁殖。
2.根據權利要求1所述的水浮蓮體外再生及繁殖的方法，其特征在于水浮蓮外植體的消毒步驟是首先在5％的次氯酸鈉的消毒液中處理10分鐘，再轉移到0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘，隨后用無菌水清洗3次。
3.根據權利要求1所述的水浮蓮體外再生及繁殖的方法，其特征在于所述的誘導愈傷組織的培養(yǎng)基是指含有0.5mg/L 2，4-D和0.2mg/L BA的MS培養(yǎng)基。
4.根據權利要求1所述的水浮蓮體外再生及繁殖的方法，其特征在于所述的植株再生的培養(yǎng)基是指含有1mg/L BA的MS培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明是一種水浮蓮體外再生及繁殖的方法，具體是一種利用水浮蓮的莖誘導愈傷組織，然后通過愈傷組織再生出苗，以及采用液體培養(yǎng)基擴大繁殖的方法。其步驟包括選取水浮蓮莖對其洗凈和消毒，獲得無菌的外植體；將莖切成薄片，然后置于含有植物激素2，4－D和BA的MS培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織；將愈傷組織轉移至含有植物激素BA的MS培養(yǎng)基再生為苗，苗進一步生根獲得完整的再生植株；將再生植株轉移到SH液體培養(yǎng)基進行擴大繁殖。本發(fā)明誘導愈傷組織和從愈傷組織獲得再生完整植株所需要的時間短，且遺傳穩(wěn)定性好，能夠在無菌條件下短期內無性繁殖獲得大量的植株。
文檔編號A01G31/00GK101023736SQ20071005170
公開日2007年8月29日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權日2007年3月20日
發(fā)明者陳士云, 張勇, 楊寶玉, 王瑤, 王友如 申請人:中國科學院武漢病毒研究所