專利名稱：魚(yú)類(lèi)干擾素基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體涉及一種鯽魚(yú)干擾素(Interferon，IFN)的核苷酸序列和氨基酸序列，同時(shí)涉及到該基因表達(dá)產(chǎn)物在培養(yǎng)細(xì)胞抗病毒作用中的用途，同時(shí)還可作為抗病毒生物制劑、漁用抗病毒藥物和藥用飼料添加劑中的用途。
背景技術(shù)：
在致病微生物導(dǎo)致的疾病中，由病毒引發(fā)的疾病，如時(shí)常小范圍流行的西尼羅腦炎(WNV)和埃博拉出血熱(EBV)，在全世界廣泛傳播的獲得性免疫缺陷綜合癥(HIV)，以及2003年爆發(fā)流行的嚴(yán)重急性呼吸道癥候群(SARS)，2006年在全世界流行的禽流行性感冒(AIV，如H5N1型)等正嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康(Kawai and Akira，2006)。漁業(yè)養(yǎng)殖同樣面臨病毒性疾病的嚴(yán)重威脅。如十幾年前由草魚(yú)出血病病毒(GCHV)引起的出血病曾使我國(guó)的草魚(yú)養(yǎng)殖面臨毀滅性打擊(死亡率最高達(dá)到90％)，流行于歐美的鯉春病毒(SVC)也使該地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖損失慘重。
干擾素系統(tǒng)是脊椎動(dòng)物抵抗病毒入侵的第一道防線，能在病毒感染后的幾小時(shí)內(nèi)就迅速起啟動(dòng)，在非特異性抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，同時(shí)介導(dǎo)機(jī)體隨后啟動(dòng)特異性的抗病毒免疫反應(yīng)(Pulendran and Ahmed，2006)。早先在哺乳類(lèi)的研究表明，干擾素蛋白本身沒(méi)有抗病毒作用，其機(jī)制在于與宿主細(xì)胞的特異受體結(jié)合后通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)一系列的抗病毒蛋白來(lái)抑制病毒的復(fù)制，最終達(dá)到保護(hù)細(xì)胞抵抗病毒入侵的目的(Stark et al，1998)。一旦宿主細(xì)胞受到病毒感染，宿主就能通過(guò)模式識(shí)別受體(Pattern-recognition receptors，PPRs)，如TLR3/7/8/9(Toll-like receptor)，RIG-I(retinoic acid inducible gene I)，MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)識(shí)別，然后啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)途徑誘導(dǎo)一系列基因的表達(dá)，其中就包括干擾素(Sen and Sarkar，2005；Kawai andAkira，2006；Arika and Takeuchi，2006)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素再經(jīng)過(guò)自分泌和旁分泌與細(xì)胞膜上的干擾素受體結(jié)合，激活干擾素誘導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路，最后啟動(dòng)一系列干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表達(dá)，包括抗病毒基因的表達(dá)。產(chǎn)生的抗病毒蛋白建立宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)，抑制和清除病毒在細(xì)胞中的復(fù)制(Samuel，2001；Malmgaard et al.，2004；Schultz et al.，2004)。
經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的研究，特別是近二十年來(lái)的努力，已經(jīng)鑒定了在干擾素反應(yīng)發(fā)揮抗病毒作用的幾個(gè)有效途徑第一，干擾素誘導(dǎo)和激活細(xì)胞Mx(myxovirus-resistant)蛋白，抑制RNA病毒(如流感病毒)衣殼蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)或病毒RNA的合成(Leong et al.，1998)；第二，誘導(dǎo)活化細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶PKR，磷酸化細(xì)胞內(nèi)的eIF2α，從而抑制多肽鏈的翻譯起始，細(xì)胞蛋白合成停止，其中包含病毒自身蛋白，病毒的繁殖因此受阻(Sarkar and Sen，2004；Garcia et al.，2006)；第三，活化細(xì)胞2`，5`-寡聚核酸酶(2`，5`-OAS)，使細(xì)胞產(chǎn)生大量的2`，5`-Oligo A，從而激活內(nèi)切核酸酶L(RNase L)，水解入侵病毒的RNA(Samuel，2001)；第四，干擾素啟動(dòng)RNA編輯(RNA editing)機(jī)制。ADAR是一種由干擾素誘導(dǎo)的特異RNA的腺苷酸脫氨酸酶，通過(guò)催化腺苷酸C6的脫氨基作用，使腺苷酸(A)轉(zhuǎn)化成次黃嘌啉(I)，導(dǎo)致dsRNA結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定的AU配對(duì)變成IU組合。在翻譯過(guò)程中密碼子中的I很容易被當(dāng)作G而改變蛋白質(zhì)的氨基酸組成，使病毒的基因攜帶的遺傳信息產(chǎn)生錯(cuò)誤，無(wú)法成功翻譯出正確的有正常功能的病毒蛋白(Samuel，2001)。
1965年，在哺乳類(lèi)發(fā)現(xiàn)干擾素8年后，Gravell和Malsberger首次在傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)誘導(dǎo)的魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞FHM中檢測(cè)到魚(yú)類(lèi)干擾素活性。雖然此后在多種魚(yú)類(lèi)發(fā)現(xiàn)了魚(yú)類(lèi)干擾素的存在，魚(yú)類(lèi)病毒性疾病問(wèn)題的解決也因此一度展現(xiàn)出美好前景(Eaton，1990)，但不幸的是，當(dāng)人類(lèi)干擾素的研究從實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)探索走向臨床應(yīng)用時(shí)，魚(yú)類(lèi)干擾素的研究和應(yīng)用一直沒(méi)有大的進(jìn)展。申請(qǐng)人在1996年也開(kāi)始了鯽魚(yú)干擾素的研究工作。草魚(yú)出血病病毒(GCHV)是我國(guó)分離的第一種魚(yú)類(lèi)病毒，主要引起草魚(yú)在魚(yú)種階段發(fā)生出血病，死亡率可達(dá)60％以上。GCHV也能夠感染如青魚(yú)、麥穗魚(yú)、稀有鮈鯽等其他多種魚(yú)類(lèi)。我們?cè)谠缙诎l(fā)現(xiàn)，紫外線滅活的GCHV能高效誘導(dǎo)鯽魚(yú)囊胚培養(yǎng)細(xì)胞(CAB)產(chǎn)生干擾素(王鐵輝等，1999；張義兵等，2000)，在此工作基礎(chǔ)之上，申請(qǐng)人利用建立的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，克隆鑒定了鯽魚(yú)干擾素基因，表達(dá)特征分析表明為魚(yú)類(lèi)I型干擾素。利用鯽魚(yú)干擾素基因的原核表達(dá)蛋白作用于魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞，證明能保護(hù)細(xì)胞抗GCHV感染?；蜣D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素基因的細(xì)胞株，抗病毒實(shí)驗(yàn)同樣表明干擾素基因的表達(dá)產(chǎn)物能有效抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種魚(yú)類(lèi)干擾素基因的核苷酸序列和氨基酸序列。在病毒感染的細(xì)胞中，該干擾素基因能顯著表達(dá)，并表現(xiàn)出類(lèi)似于哺乳類(lèi)干擾素基因的表達(dá)特征。實(shí)驗(yàn)證明該基因在魚(yú)類(lèi)抗病毒免疫反應(yīng)中的具有重要作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及該魚(yú)類(lèi)干擾素基因的原核表達(dá)蛋白在制備治療或預(yù)防魚(yú)類(lèi)病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明再一個(gè)目的涉及該魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞中制備治療或預(yù)防魚(yú)類(lèi)病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個(gè)目的涉及該魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)機(jī)體中制備治療或預(yù)防魚(yú)類(lèi)病毒感染的生物制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及魚(yú)類(lèi)干擾素基因的表達(dá)產(chǎn)物在魚(yú)類(lèi)機(jī)體中制備治療或預(yù)防漁用飼料中的應(yīng)用。
哺乳類(lèi)干擾素抗病毒作用機(jī)制的研究證明，干擾素是抵抗病毒入侵的第一道防線。因此，當(dāng)哺乳類(lèi)干擾素基因被成功克隆后，利用基因工程的方法，哺乳類(lèi)干擾素得到了大量的制備，并迅速運(yùn)用到各種病毒病的防治中。魚(yú)類(lèi)受病毒感染后也產(chǎn)生干擾素，但是長(zhǎng)期以來(lái)，魚(yú)類(lèi)干擾素基因的克隆鑒定研究一直沒(méi)有突破，限制了魚(yú)類(lèi)干擾素在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。可見(jiàn)，成功克隆鑒定干魚(yú)類(lèi)干擾素基因，并證實(shí)魚(yú)類(lèi)干擾素在培養(yǎng)細(xì)胞中的抗病毒作用是將魚(yú)類(lèi)干擾素作為漁用抗病毒藥物和藥用飼料添加劑推向市場(chǎng)的重要前期步驟。申請(qǐng)人在已經(jīng)建立的一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，以感染GCHV的鯽魚(yú)囊胚培養(yǎng)細(xì)胞建立了一個(gè)SMAR cDNA文庫(kù)，從該文庫(kù)中克隆出鯽魚(yú)干擾素基因，同時(shí)進(jìn)行序列分析、病毒誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)特征分析，最后對(duì)干擾素基因原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)產(chǎn)物在培養(yǎng)細(xì)胞的抗病毒效果進(jìn)行了檢測(cè)。本發(fā)明介紹了一種制備鯽魚(yú)干擾素基因的方法，同時(shí)利用原核表達(dá)技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)證明鯽魚(yú)干擾素基因的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)，抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案1魚(yú)類(lèi)干擾素基因的克隆鑒定經(jīng)過(guò)多年的研究，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，GCHV病毒經(jīng)紫外線滅活后，能高效誘導(dǎo)鯉科魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，表明魚(yú)類(lèi)干擾素基因在病毒誘導(dǎo)后已經(jīng)表達(dá)。因此，本發(fā)明首先將GCHV在緩慢搖動(dòng)的搖床上用30W普通紫外燈照射5min滅活，然后用滅活后的GCHV誘導(dǎo)鯽魚(yú)囊胚培養(yǎng)細(xì)胞(Carassius auratus blastulaeembryonic cells，CAB)，16h后分離細(xì)胞mRNA，建立病毒誘導(dǎo)CAB細(xì)胞的SMART cDNA文庫(kù)(根據(jù)Clontech公司的SMART cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒的一種全長(zhǎng)cDNA文庫(kù))。然后，根據(jù)斑馬魚(yú)干擾素基因的cDNA序列(Altmann et al.，2003)，在脊椎動(dòng)物干擾素蛋白的保守區(qū)域合成引物，利用RACE-PCR(用于cDNA末端快速擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法從SMART cDNA文庫(kù)中克隆鯽魚(yú)干擾素基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2魚(yú)類(lèi)干擾素基因的序列分析哺乳類(lèi)的研究表明，干擾素可以將它們分為I型干擾素和II型干擾素，其中I型干擾素在抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA有1226bp，5’非編碼區(qū)有53bp，3’非編碼區(qū)長(zhǎng)630bp，有多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴Poly(A)。另外，在鯽魚(yú)干擾素的3’UTR發(fā)現(xiàn)了10個(gè)AU(ATTTA)序列。AU序列與mRNA的壽命(穩(wěn)定性)直接相關(guān)。氨基酸的同源性比較發(fā)現(xiàn)，鯽魚(yú)干擾素與最近報(bào)道的斑馬魚(yú)(Danio rerio)干擾素α和干擾素β同源性最高(69％和70％)，與河豚(Tetraodon nigroviridis)干擾素的同源性卻很低，只有27％。在哺乳類(lèi)干擾素蛋白中，與鯽魚(yú)干擾素同源性最高的是小鼠(Musmusculus)干擾素α4，同源性值為23％。另外同源性比較發(fā)現(xiàn)，包括鯽魚(yú)干擾素在內(nèi)的魚(yú)類(lèi)干擾素與哺乳類(lèi)干擾素α和干擾素β的同源性值沒(méi)有顯著差別(請(qǐng)見(jiàn)表1)。鯽魚(yú)干擾素為一個(gè)180氨基酸的蛋白，等電點(diǎn)為9.7，分子量21441Dalton。如同其他所有已知的干擾素蛋白，其N(xiāo)端前22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，但是整個(gè)序列中找不到一個(gè)合適的糖基化位點(diǎn)，因此鯽魚(yú)干擾素不可能是一個(gè)糖蛋白(附圖1)。
對(duì)已知的干擾素蛋白用Mega2軟件(Kumar et al.，2001)構(gòu)建了NJ系統(tǒng)樹(shù)(Neighbour-Joining tree)。結(jié)果顯示哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的干擾素蛋白分別構(gòu)成兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分枝，4種魚(yú)類(lèi)干擾素蛋白(鯽魚(yú)干擾素蛋白，河豚干擾素蛋白以及兩種斑馬魚(yú)干擾素蛋白)形成另外一個(gè)獨(dú)立的自然分枝，表明魚(yú)類(lèi)干擾素有更遙遠(yuǎn)的進(jìn)化歷史。另外，由于魚(yú)類(lèi)干擾素與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)有幾乎相同的同源性，因此，魚(yú)類(lèi)干擾素基因可能與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)干擾素基因之間有幾乎相同遙遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。同樣，與同源性比較一致的是，三種魚(yú)類(lèi)干擾素基因之間，鯽魚(yú)和斑馬魚(yú)之間有比較近的親緣關(guān)系，而河鲀干擾素基因表現(xiàn)出較大程度的分化(附圖2)。但是結(jié)果最后表明，鯽魚(yú)干擾素應(yīng)該屬于I型干擾素。
3病毒誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)干擾素基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)分析要想知道克隆得到的鯽魚(yú)干擾素基因是否真正具有抗病毒作用，一個(gè)很重要的前期工作是研究其表達(dá)特征。如果魚(yú)類(lèi)干擾素基因的表達(dá)特征與哺乳類(lèi)干擾素一致，就可以推斷其在病毒感染中發(fā)揮的作用可能與哺乳類(lèi)一致。本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR的方法分析了滅活病毒誘導(dǎo)鯽魚(yú)干擾素基因在CAB細(xì)胞中的表達(dá)(附圖3)。哺乳類(lèi)I型干擾素基因的表達(dá)有一定的規(guī)律型，即在病毒感染的細(xì)胞中迅速啟動(dòng)表達(dá)，隨著時(shí)間的推移，表達(dá)達(dá)到最高，然后降低。本實(shí)驗(yàn)在分析鯽魚(yú)干擾素的表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似于哺乳類(lèi)干擾素的表達(dá)特征，即經(jīng)病毒誘導(dǎo)后，鯽魚(yú)干擾素基因呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)周期曲線。用滅活GCHV誘導(dǎo)細(xì)胞4h就能檢測(cè)到明顯干擾素基因的轉(zhuǎn)錄，24小時(shí)到達(dá)峰值，然后逐漸降低。
4魚(yú)類(lèi)干擾素原核表達(dá)蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中的抗病毒作用既然魚(yú)類(lèi)干擾素基因具有與哺乳類(lèi)干擾素一致的表達(dá)特征，其原核表達(dá)蛋白就可能具有抗病毒作用。本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)技術(shù)，將鯽魚(yú)干擾素基因的ORF連接到原核表達(dá)質(zhì)粒建立一個(gè)原核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌DE3(Promega公司)，利用IPTG(異丙基-b-D-硫代半乳糖苷，Sigma公司)誘導(dǎo)表達(dá)。將原核表達(dá)的干擾素蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)單純化后，首先10000倍稀釋，然后再三倍系列稀釋加入到CAB細(xì)胞的199培養(yǎng)基(GIBCO公司)中，8h后，加入攻擊病毒GCHV，然后檢測(cè)在加入鯽魚(yú)干擾素原核表達(dá)蛋白后的CAB細(xì)胞中的病毒復(fù)制情況。與細(xì)胞培養(yǎng)基中沒(méi)有加入鯽魚(yú)干擾素原核表達(dá)蛋白的CAB細(xì)胞相比，加入鯽魚(yú)干擾素原核表達(dá)蛋白后的CAB細(xì)胞中的病毒滴度顯著降低。在顯微鏡下，很容易發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有加入鯽魚(yú)干擾素原核表達(dá)蛋白的CAB細(xì)胞中由于GCHV的復(fù)制，產(chǎn)生了大量的細(xì)胞病變(CPE)，而加入鯽魚(yú)干擾素原核表達(dá)蛋白后，細(xì)胞的抗病毒能力顯著增強(qiáng)(附圖3)。魚(yú)類(lèi)干擾素原核表達(dá)蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中具有抗病毒作用表明，可以通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)，大量制備魚(yú)類(lèi)干擾素原核表達(dá)蛋白作為漁用抗病毒飼料和飼料添加劑用于魚(yú)類(lèi)病毒病的防治。
5魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)干擾素后的抗病毒效果通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，由于缺少正確的蛋白修飾等，因此表達(dá)蛋白的活性會(huì)有所降低。而真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白可以解決這樣的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)就是在真核細(xì)胞中表達(dá)魚(yú)類(lèi)干擾素基因，直接驗(yàn)證魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞中的抗病毒功能。首先將鯽魚(yú)干擾素基因的ORF連接到真核表達(dá)質(zhì)粒(pTARGETTM，Promega公司)建立一個(gè)真核表達(dá)載體，然后利用Genejuice(Novagen)等基因轉(zhuǎn)染的方法，將魚(yú)類(lèi)干擾素基因轉(zhuǎn)染到CAB細(xì)胞中。接著在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抗生素G418(GIBCO公司)，篩選穩(wěn)定整合干擾素基因的細(xì)胞。原理是pTARGETTM載體上有neo基因，其表達(dá)產(chǎn)物能中和G418的毒性。如果細(xì)胞基因組中沒(méi)有整合鯽魚(yú)干擾素基因，就沒(méi)有表達(dá)真核表達(dá)載體pTARGETTM上的neo基因，因此，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中含有藥物G418時(shí)，G418就能殺死這些細(xì)胞。而穩(wěn)定整合了鯽魚(yú)干擾素基因的CAB細(xì)胞，當(dāng)然也整合并且表達(dá)了真核表達(dá)載體上的neo基因，而neo基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠分解藥物G418的毒性，因此就能夠在加入G418的培養(yǎng)基中生存下來(lái)。
由于在基因轉(zhuǎn)染中，干擾素基因的整合是隨機(jī)性的，也就是在經(jīng)篩選后得到的穩(wěn)定整合表達(dá)干擾素基因的細(xì)胞中，干擾素基因在細(xì)胞基因組中的位置是不同的，在有的細(xì)胞中，處于這個(gè)部位，而在另外的細(xì)胞中，干擾素基因可能整合在基因組的另外一個(gè)部位，因此由藥物G418篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素基因的CAB細(xì)胞實(shí)際上是一個(gè)混合型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素的細(xì)胞系。由于干擾素整合在基因組中的不同部位可能會(huì)影響它的表達(dá)，導(dǎo)致影響隨后的抗病毒作用，因此在獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素的CAB細(xì)胞后，又通過(guò)細(xì)胞系列稀釋法，即在96孔的微孔板(Facon公司)中，將穩(wěn)定表達(dá)干擾素基因的細(xì)胞稀釋成一個(gè)孔只含有1-5個(gè)細(xì)胞，最后得到每個(gè)孔的細(xì)胞都是由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂后擴(kuò)增得來(lái)的細(xì)胞克隆。這樣，就可以得到許多轉(zhuǎn)植干擾素基因的細(xì)胞株(CAB-IFN)，每個(gè)細(xì)胞株的所有細(xì)胞中，干擾素基因都整合在細(xì)胞基因組的同一個(gè)部位。得到這些細(xì)胞株后，再比較這些不同細(xì)胞株的抗病毒作用。對(duì)照細(xì)胞采用轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株(CAB-pTARGETTM，即直接轉(zhuǎn)染沒(méi)有插入干擾素基因ORF的真核表達(dá)載體pTARGETTM)。微量細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)干擾素細(xì)胞具有顯著抑制病毒在細(xì)胞中復(fù)制的作用(附圖5)。
6鯽魚(yú)干擾素制劑在防治草魚(yú)出血病中的作用鯽魚(yú)干擾素基因是從紫外線滅活GCHV誘導(dǎo)的CAB細(xì)胞中分離出來(lái)的，而且申請(qǐng)人在早期已經(jīng)證明紫外線滅活GCHV能誘導(dǎo)CAB細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)利用紫外線滅活GCHV誘導(dǎo)CAB細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素制劑，腹腔注射干擾素制劑到草魚(yú)魚(yú)體，或用干擾素制劑浸泡草魚(yú)魚(yú)體兩種方法，來(lái)驗(yàn)證鯽魚(yú)干擾素制劑在防治草魚(yú)出血病中的作用。
在腹腔注射干擾素制劑的實(shí)驗(yàn)中，分別在人工感染草魚(yú)出血病病毒的前一天、當(dāng)天和后一天各對(duì)一組受試草魚(yú)注射干擾素制劑，然后人工感染GCHV，結(jié)果這三個(gè)試驗(yàn)組分別有55％、44％、42％的草魚(yú)存活下來(lái)，并且在染毒前一天使用干擾素制劑的效果好于在染毒當(dāng)天及染毒后一天使用干擾素制劑，而感染對(duì)照組的草魚(yú)死亡率達(dá)到了100％(附表2)。這個(gè)結(jié)果可以說(shuō)明，作為一種預(yù)防措施，通過(guò)腹腔注射鯽魚(yú)干擾素制劑確能有效降低草魚(yú)出血病的危害；作為一種防治手段，亦可以在草魚(yú)出血病病毒感染的早期，對(duì)草魚(yú)出血病表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)寞熜?。在用干擾素制劑浸泡草魚(yú)魚(yú)體的實(shí)驗(yàn)中，一組僅在染毒前一天浸泡干擾素制劑一次，而第二組和第三組分別用逐日連續(xù)浸泡和隔日連續(xù)浸泡干擾素制劑的方式處理。結(jié)果第二、第三組的存活率均超過(guò)50％，明顯好于第一組(附圖6)。這說(shuō)明用鯽魚(yú)干擾素制劑浸泡處理防治草魚(yú)出血病時(shí)，存在著某種劑量依賴效應(yīng)，干擾素制劑用量大時(shí)其防治效果亦較好。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)和效果。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，魚(yú)類(lèi)病毒病一直無(wú)法有效控制，以前采用的方法都是利用病毒疫苗進(jìn)行病毒病的預(yù)防。而采用病毒疫苗有很多限制制備的疫苗費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且目前成功制備的病毒疫苗非常少，在生產(chǎn)實(shí)踐中獲得應(yīng)用的病毒疫苗更是鳳毛麟角；即使成功制備了病毒疫苗，也只能通過(guò)注射魚(yú)體產(chǎn)生抗體以后才能夠預(yù)防，效果比較緩慢；注射疫苗是一個(gè)非常費(fèi)力費(fèi)時(shí)的工程，對(duì)于大面積的水產(chǎn)養(yǎng)殖是無(wú)法有效進(jìn)行的，因此無(wú)法大規(guī)模運(yùn)用；成功制備的病毒疫苗往往會(huì)因?yàn)椴《镜淖儺惗鴮?dǎo)致疫苗效果減退甚至無(wú)效。但是本發(fā)明具有很多優(yōu)點(diǎn)和效果如采用的干擾素基因是魚(yú)類(lèi)自身的干擾素基因，因此產(chǎn)生出來(lái)的干擾素制劑的效果非常顯著；本發(fā)明利用了多種方法在多種層面上進(jìn)行了鯽魚(yú)干擾素的抗病毒實(shí)驗(yàn)，因此可以從原核細(xì)胞表達(dá)、魚(yú)類(lèi)細(xì)胞表達(dá)和酵母細(xì)胞表達(dá)等多個(gè)層面上進(jìn)行鯽魚(yú)干擾素基因的利用和開(kāi)發(fā)，不僅可以利用鯽魚(yú)干擾素進(jìn)行生物制劑的開(kāi)發(fā)，還可以將表達(dá)干擾素基因的酵母直接作為飼料添加劑，應(yīng)用前景廣泛；本發(fā)明抗病毒作用迅速并且顯著，使用方便，因此投入少，效果顯著。


圖1示鯽魚(yú)干擾素與斑馬魚(yú)和河豚干擾素氨基酸序列的比較。用ClustalW軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，相同氨基酸用(*)指示，相似性的氨基酸用(.和)指示。存在于哺乳類(lèi)干擾素中的保守氨基酸用黑框表示。結(jié)果表明，在鯽魚(yú)干擾素蛋白序列中的相同位置能找到與斑馬魚(yú)干擾素和哺乳類(lèi)干擾素保守的氨基酸位點(diǎn)，如位于23和119位置的兩個(gè)半胱氨酸等。鯽魚(yú)干擾素不是一個(gè)糖蛋白，因?yàn)檎也坏揭粋€(gè)合適的糖基化位點(diǎn)。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，鯽魚(yú)干擾素蛋白與斑馬魚(yú)干擾素一樣都為強(qiáng)堿性，等電點(diǎn)都為9.7，分子量也十分相近，分別為21441Dalton和21987Dalton。
圖2示魚(yú)類(lèi)干擾素與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)代表性種類(lèi)的TypeI干擾素的系統(tǒng)樹(shù)分析。用Mega2軟件中的鄰接法(NJ)建立38種干擾素蛋白的無(wú)根系統(tǒng)樹(shù)，魚(yú)類(lèi)包括鯽、河豚和斑馬魚(yú)三種，鳥(niǎo)類(lèi)包括雞、火雞和鴨三種，哺乳類(lèi)有人、鼠、鹿、牛、羊、馬、貓等17個(gè)種類(lèi)。干擾素在GenBank中的登陸序列號(hào)在括號(hào)中標(biāo)出。系統(tǒng)樹(shù)中結(jié)點(diǎn)處數(shù)值代表1000次評(píng)估的自舉檢驗(yàn)置信度。結(jié)果顯示哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的干擾素蛋白分別構(gòu)成兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分枝，4種魚(yú)類(lèi)干擾素蛋白形成另外一個(gè)獨(dú)立的自然分枝，表明魚(yú)類(lèi)干擾素有更遙遠(yuǎn)的進(jìn)化歷史。另外，由于魚(yú)類(lèi)干擾素與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)有幾乎相同的同源性，因此，魚(yú)類(lèi)干擾素基因可能與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)干擾素基因之間有幾乎相同遙遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。同樣，與同源性比較一致的是，三種魚(yú)類(lèi)干擾素基因之間，鯽魚(yú)和斑馬魚(yú)之間有比較近的親緣關(guān)系，而河鲀干擾素基因表現(xiàn)出較大程度的分化。
圖3示滅活GCHV誘導(dǎo)鯽魚(yú)干擾素與CaMx1和CaMx2基因的表達(dá)時(shí)序分析。用滅活GCHV處理CAB細(xì)胞2，4，6，8，16，24，32，48h后提取細(xì)胞總RNA，分別用引物CaIFN-F和CaIFN-R、CA473-F和CA473-R、CA890-F和CA890-R通過(guò)RT-PCR分析鯽魚(yú)干擾素與CaMx1，CaMx2的表達(dá)。PCR檢測(cè)不同時(shí)期β-actin基因的轉(zhuǎn)錄水平并平衡模板cDNA的濃度。PCR檢測(cè)鯽魚(yú)干擾素基因時(shí)反應(yīng)32個(gè)循環(huán)，檢測(cè)CaMx1和CaMx3時(shí)為28個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析鯽魚(yú)干擾素的表達(dá)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)顯著特點(diǎn)一是經(jīng)病毒誘導(dǎo)后，呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)周期曲線。用滅活GCHV誘導(dǎo)細(xì)胞4h就能檢測(cè)到明顯Ca干擾素轉(zhuǎn)錄，24小時(shí)到達(dá)峰值，然后逐漸降低。二是相對(duì)于其他同期表達(dá)的干擾素系統(tǒng)基因，鯽魚(yú)干擾素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量很低。同時(shí)檢測(cè)鯽魚(yú)干擾素與抗病毒基因CaMx1和CaMx3的表達(dá)，經(jīng)過(guò)32個(gè)PCR循環(huán)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的鯽魚(yú)干擾素水平不高，而在檢測(cè)CaMx1和CaMx3兩個(gè)基因的表達(dá)時(shí)，即使只使用28個(gè)循環(huán)，也能檢測(cè)到顯著表達(dá)。
圖4示原核表達(dá)的干擾素蛋白在CAB細(xì)胞中的抗GCHV感染作用。根據(jù)已經(jīng)獲得的鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)N端引物CaIFN-F5TCCATGGCTTGCGAATGGCTCGGCC(在5’端引入了NcoI位點(diǎn))和C端引物CaIFN-R5ACTCGAGACAAGTCATTCATCTGTCATTATGTC(在3’端引入XhoI位點(diǎn))，擴(kuò)增出鯽魚(yú)干擾素基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)(除去編碼信號(hào)肽的序列)。將得到的片斷插入原核表達(dá)載體pET32a(Invitrogene公司)，構(gòu)建鯽魚(yú)干擾素基因的原核表達(dá)載體。加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，以SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)蛋白。由于融合蛋白帶有his-tag，因此利用柱層析中金屬離子和his-tag的親和作用純化蛋白。同時(shí)以SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化蛋白。將純化好的蛋白首先10000倍稀釋，然后以三倍的系列稀釋利用微量病變抑制法檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗病毒活性。結(jié)果表明，通過(guò)原核表達(dá)產(chǎn)生的鯽魚(yú)干擾素蛋白具有顯著的抗病毒作用，抗病毒滴度可以達(dá)到1×105U/mL。
圖5示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素基因的CAB細(xì)胞的抗GCHV感染作用。根據(jù)已經(jīng)獲得的鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)N端引物CaIFN-F3GCTACTACTACCTGAATACAAAGATG(在5’端引入了NcoI位點(diǎn))和C端引物CaIFN-R3ACAAGTCATTCATCTGTCATTATGTC(在3’端引入XhoI位點(diǎn))，擴(kuò)增出鯽魚(yú)干擾素基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)(保留編碼信號(hào)肽的序列)，連接到pTARGETTM載體(Promega公司)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。Genejuice(Novagen公司)轉(zhuǎn)染CAB細(xì)胞，300μg/mL G418(GIBCO公司)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞。然后利用系列稀釋法得到不同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素基因的細(xì)胞克隆。利用GCHV攻擊細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的抗病毒能力。結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)干擾素基因的CAB細(xì)胞的抗病毒滴度可以達(dá)到1×103U/mL。
圖6示鯽魚(yú)干擾素在防治草魚(yú)出血病中的作用。近一齡草魚(yú)(體長(zhǎng)4210±510mm，平均體重510g)分成四組。一組在染毒前一天浸泡干擾素，第二組在染毒前一天和染毒后連續(xù)三天各浸泡一次，第三組在染毒后隔日連續(xù)浸泡三次，第四組為感染對(duì)照組。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)四個(gè)組的草魚(yú)均為30尾，試驗(yàn)期間水溫27～29℃。人工感染時(shí)將已制備好的含有病毒的病魚(yú)組織勻漿按1∶5000釋釋，對(duì)受試草魚(yú)以濃度50單位/mL的干擾素制劑稀釋液浸泡1h。浸泡用干擾素系用紫外線滅活的草魚(yú)出血病病毒誘導(dǎo)的鯽魚(yú)干擾素，效價(jià)為10000單位/mL。結(jié)果顯示用干擾素浸泡草魚(yú)魚(yú)體也具有很高的保護(hù)作用。連續(xù)浸泡三次的草魚(yú)組，保護(hù)率達(dá)到56％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1病毒滅活及鯽魚(yú)囊胚細(xì)胞CAB干擾素的誘導(dǎo)鯽魚(yú)囊胚細(xì)胞系(CAB)和草魚(yú)腎細(xì)胞系(CIK)用10％新生牛血清(使用前56℃滅活30min)的199培養(yǎng)基(GIBCO公司)置28℃常規(guī)培養(yǎng)。GCHV在CIK細(xì)胞上擴(kuò)增并檢測(cè)病毒滴度。GCHV用紫外線滅活前先經(jīng)差速離心純化4×103g離心20min除去細(xì)胞殘?jiān)?，上清液?jīng)1×105g超速離心1.5h沉淀病毒，病毒沉淀用適量無(wú)血清199培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)1.5×103g離心20min取上清得純化病毒。滅活裝置使用30W普通紫外線殺菌燈，固定在超凈工作臺(tái)上，與搖床的垂直距離為16cm。滅活前，GCHV滴度為1×109TCID50。滅活時(shí)，3mL純化的GCHV置于放在搖床上直徑為6cm的平皿中，紫外線照射5min可使病毒完全失活。滅活時(shí)啟動(dòng)搖床緩慢搖動(dòng)，使樣品照射均勻。
CAB細(xì)胞傳代4天后進(jìn)行干擾素誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)瓶(25cm2)直接加滅活病毒500μL，3瓶對(duì)照細(xì)胞加500μL無(wú)血清199培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)4h后棄病毒，無(wú)血清199培養(yǎng)基洗3次，然后再加入8mL無(wú)血清199培養(yǎng)基28℃繼續(xù)培養(yǎng)12h。收獲細(xì)胞用于提取總RNA。這個(gè)實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)了鯽魚(yú)干擾素蛋白，即表明了在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞中如何制備鯽魚(yú)干擾素的一種方法。
實(shí)施例2感染病毒的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞總RNA提取和mRNA純化滅活GCHV誘導(dǎo)的CAB細(xì)胞和或未經(jīng)病毒誘導(dǎo)的對(duì)照CAB細(xì)胞在相同條件下采用CsTFA(三氟醋酸銫，Pharmacia公司)超速離心法提取總RNA。細(xì)胞經(jīng)病毒誘導(dǎo)后，用PBS洗3次，然后，每瓶細(xì)胞加4mL extraction buffer破碎細(xì)胞，5000g，15℃高速離心20min除去細(xì)胞殘?jiān)锨逵?號(hào)針頭抽吸10次，然后超速離心。超速離心時(shí)，6個(gè)14×89mm的離心管(實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞各3個(gè))中分別加入6.65mL CsTFA，每管加抽提液樣品約3.5mL，125000g，15℃，用SW41型號(hào)的轉(zhuǎn)頭超速離心16h。離心后，每個(gè)離心管加入100μL的TE(10mMTris-Cl，pH 7.51mM EDTA)溶解RNA沉淀，65℃下10min，吸出上清，再加入50μLTE/管溶解沉淀。最后，用50μLTE清洗沉淀，這樣，從滅活GCHV誘導(dǎo)的CAB細(xì)胞和或未經(jīng)病毒誘導(dǎo)的對(duì)照CAB細(xì)胞中各得500μL RNA。電泳檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量。
mRNA用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)探針和鏈親合素包裹的磁珠(Promega公司)純化。500μl RNA 65℃水浴10min，加入3μl生物素標(biāo)記的寡聚dT探針和13μL的20×SSC，混勻后室溫(20-25℃，以下相同)冷卻完全。重懸鏈親和素包裹的磁珠，用磁架捕獲磁珠(約30秒)后吸去上清。依上述方法，每次用0.3mL的0.5×SSC洗磁珠3次。洗完后，加入退火的寡聚dT探針和RNA的雜交體溶液與磁珠混合，室溫放置10min，每間隔1-2min輕輕重懸磁珠。用磁架捕獲磁珠，小心去掉上清，然后用1×SSC洗磁珠4次，每次0.3mL。最后，加入100μL無(wú)RNA酶水洗脫mRNA，重懸磁珠，用磁架捕獲后，小心吸取含mRNA的上清，以同樣的方法再加入100μL水洗脫，將兩次的mRNA集中到一管，加入等量異丙醇，14000g，4℃，離心20min沉淀mRNA，沉淀干燥后用6μL水溶解，取0.5μl用分光光度計(jì)測(cè)定mRNA濃度。這個(gè)實(shí)驗(yàn)成功成功獲得了制備鯽魚(yú)干擾素基因過(guò)程中建庫(kù)用mRNA。
實(shí)施例3感染病毒的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞SMART cDNA的合成依據(jù)Clontech SMART PCR Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)所確立的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。其步驟為1μgPolyA+RNA與cDNA合成引物(CDS primer)和SMART II寡聚核苷酸引物各1μL混合，補(bǔ)水到終體積為5μL，PCR儀72℃2min后置冰上，然后加入5×第一鏈反應(yīng)緩沖液2μL，DTT 1μL，50×dNTP 1μL，PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶1μL，42℃保溫1h合成第一鏈cDNA。然后取2μL于100μl體系以LD-PCR進(jìn)行第二鏈合成。PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性1min，然后95℃5s，65℃5s，68℃6min反應(yīng)13個(gè)循環(huán)。該P(yáng)CR產(chǎn)物可用于RACE-PCR擴(kuò)增特異表達(dá)基因的全長(zhǎng)cDNA。這個(gè)實(shí)驗(yàn)成功成功獲得了制備鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。
實(shí)施例4魚(yú)類(lèi)干擾素基因的克隆通過(guò)比較哺乳類(lèi)和斑馬魚(yú)干擾素基因，確定保守區(qū)域，合成了一對(duì)簡(jiǎn)并引物zfIFN-F(5’-TCTCTGAACCTGCTCAAGAATATG-3’)和zfIFN-R(5’-GCTCCCATGCTTCAGCACT-3’)。將zfIFN-R與引物SMART-F(5’-AACGCAGAGTACGCGGG-3’)組合從SMART cDNA文庫(kù)中成功擴(kuò)增出鯽魚(yú)干擾素基因的5’序列。然后又根據(jù)獲得的鯽魚(yú)干擾素的5’序列合成了一對(duì)特異引物CaIFN-F(5’-GCTCTGCTTGCGAATGGCT-3’)和CaIFN-R(5’-AGGCGTCCTGGAAATGACA-3’)，以CaIFN-F和SMART-R(5’-CAGAGTACT16-3’)組合用來(lái)擴(kuò)增和鑒定鯽魚(yú)干擾素基因的3’端，最后獲得鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
實(shí)施例5干擾素分子進(jìn)化樹(shù)分析目前干擾素基因只在哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)克隆成功。將鯽魚(yú)、河豚和斑馬魚(yú)三種魚(yú)類(lèi)的干擾素蛋白與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)有代表性的、包括雞、火雞、鴨、人、鼠、鹿、牛、羊、馬、貓等共20個(gè)種類(lèi)動(dòng)物的干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素δ、干擾素κ、干擾素τ等六種Type I干擾素蛋白用Mega2軟件(Kumar et al.，2001)構(gòu)建了NJ系統(tǒng)樹(shù)(Neighbour-Joining tree)(圖2，圖3)。結(jié)果顯示哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的干擾素蛋白分別構(gòu)成兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分枝，鯽魚(yú)、河豚和斑馬魚(yú)干擾素蛋白形成另外一個(gè)獨(dú)立的自然分枝，表明魚(yú)類(lèi)干擾素有更遙遠(yuǎn)的進(jìn)化歷史。另外，由于魚(yú)類(lèi)干擾素與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)有幾乎相同的同源性(表1)，因此，魚(yú)類(lèi)干擾素基因可能與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)干擾素基因之間有幾乎相同遙遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。
表1魚(yú)類(lèi)干擾素蛋白與哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)干擾素的同源性和遺傳距離比較

實(shí)施例6魚(yú)類(lèi)干擾素基因的表達(dá)分析及抗病毒功能檢測(cè)CAB細(xì)胞的前期處理與CAB干擾素誘導(dǎo)方法同。CAB細(xì)胞傳代3天后用滅活GCHV處理CAB細(xì)胞2h，無(wú)血清199培養(yǎng)基洗三次，然后加無(wú)血清199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在病毒誘導(dǎo)后2、4、6、8、16、24、32和48h取樣，一步法(OMEGA BIOTEK公司，一種簡(jiǎn)便提取細(xì)胞總RNA的方法)抽提細(xì)胞總RNA。對(duì)照細(xì)胞用等量199無(wú)血清培養(yǎng)基代替誘導(dǎo)病毒處理?？俁NA直接以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，以β-actin基因做陽(yáng)性對(duì)照RT-PCR確定單鏈cDNA模板濃度。
實(shí)施例7原核表達(dá)魚(yú)類(lèi)干擾素蛋白對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的抗病毒作用根據(jù)已經(jīng)獲得的鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)N端引物CaIFN-F5TCCATGGCTTGCGAATGGCTCGGCC(在5’端引入了NcoI位點(diǎn))和C端引物CaIFN-R5ACTCGAGACAAGTCATTCATCTGTCATT ATGTC(在3’端引入XhoI位點(diǎn))，擴(kuò)增出鯽魚(yú)干擾素基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)(除去編碼信號(hào)肽的序列)。將得到的片斷插入原核表達(dá)載體pET32a(Invitrogen公司)，構(gòu)建鯽魚(yú)干擾素基因的原核表達(dá)載體。加入IPTG(Sigma公司)進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，以SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)蛋白。由于融合蛋白帶有his-tag，因此利用柱層析中金屬離子和his-tag的親和作用純化蛋白(Invitrogen公司)。同時(shí)以SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化蛋白。
將純化好的蛋白首先用無(wú)血清199培養(yǎng)基10000倍稀釋，然后以三倍的系列稀釋利用微量病變抑制法檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗病毒活性。具體方法是；將培養(yǎng)細(xì)胞以約5000細(xì)胞/孔的密度接種96孔板，24h即長(zhǎng)成單層；去掉培養(yǎng)基，用無(wú)血清199培養(yǎng)基洗三次；待測(cè)干擾素樣品用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋(本實(shí)驗(yàn)中一般為3×系列稀釋)。向96孔板加入系列稀釋的干擾素樣品，每個(gè)稀釋度3孔，每孔0.1mL，28℃培養(yǎng)至少8h。在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)不加干擾素樣品的病毒對(duì)照與不加病毒的正常細(xì)胞對(duì)照；然后每孔直接加入10000 TCID50/mL的GCHV 0.1mL，置入24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變情況。待病毒對(duì)照完全(約48h)，細(xì)胞固定、染色；計(jì)算待測(cè)樣品干擾素滴度，以抑制細(xì)胞出現(xiàn)50％CPE時(shí)的最高稀釋度作為1個(gè)干擾素單位。該實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)制備的鯽魚(yú)干擾素蛋白具有顯著的抗病毒作用。
實(shí)施例8在CAB細(xì)胞組成型表達(dá)魚(yú)類(lèi)干擾素基因的抗病毒作用根據(jù)已經(jīng)獲得的鯽魚(yú)干擾素基因的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)N端引物CaIFN-F3GCTACTACTACCTGAATACAAAGATG(在5’端引入了NcoI位點(diǎn))和C端引物CaIFN-R3ACAAGTCATTCATCTGTCATTATGTC(在3’端引入XhoI位點(diǎn))，擴(kuò)增出鯽魚(yú)干擾素基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)(保留編碼信號(hào)肽的序列)，連接到pTARGETTM載體(Promega公司)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。Genejuice(Novagen公司)轉(zhuǎn)染CAB細(xì)胞，300μg/mL G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞。然后利用系列稀釋法得到不同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾素基因的細(xì)胞克隆。利用GCHV攻擊細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的抗病毒能力。方法是將CAB細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔的密度接種96孔板，1天后長(zhǎng)成單層，去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10000TCID50/孔的GCHV。同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染空載體的CAB細(xì)胞對(duì)照。24℃培養(yǎng)2天后，固定、染色。以抑制50％CPE出現(xiàn)的最高稀釋度作為1個(gè)干擾素單位。該實(shí)驗(yàn)證明魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)具有顯著的抗病毒作用。
實(shí)施例9魚(yú)類(lèi)干擾素制劑防治草魚(yú)出血病的作用首先利用紫外線滅活的草魚(yú)出血病病毒誘導(dǎo)CAB細(xì)胞產(chǎn)生鯽魚(yú)干擾素，微量細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)干擾素的抗病毒效價(jià)為10000單位/mL。人工病毒感染采用高滲浸泡法感染，將待感染的草魚(yú)用2％NaCl溶液浸泡15min左右，再將草魚(yú)直接轉(zhuǎn)入病毒液中浸泡60min，用曝氣自來(lái)水沖洗后，置于60cm×45cm×30cm的水箱中飼養(yǎng)，逐日觀察。
(1)腹腔注射干擾素制劑本次實(shí)驗(yàn)所用的草魚(yú)種體長(zhǎng)(6810±510)mm，平均體重912g，飼養(yǎng)水溫23～27℃，人工感染時(shí)將已制備好的含有病毒的病魚(yú)組織勻漿用PBS按1∶1000的比例稀釋后進(jìn)行人工感染，劑量為0.3mL/尾。對(duì)受試草魚(yú)由腹腔注射干擾素制劑，劑量為0.3mL/尾(10000單位/mL)。為探討在感染前后不同時(shí)期干擾素的作用效果，本次實(shí)驗(yàn)分別在人工感染病毒的前一天、當(dāng)天和后一天對(duì)三組草魚(yú)使用干擾素處理。感染對(duì)照組只予感染病毒，不進(jìn)行干擾素處理。空白對(duì)照組在感染對(duì)照組染毒的同時(shí)注射等量PBS鹽水，不予感染病毒。結(jié)果表明腹腔注射干擾素能有效控制草魚(yú)出血病病毒的感染。
附表2腹腔注射干擾素制劑對(duì)草魚(yú)出血病的防治效果

注第一組在染毒前一天注射干擾素制劑，第二組在染毒當(dāng)天注射干擾素制劑，第三組在染毒后一天注射干擾素制劑。感染對(duì)照組只予感染病毒，不進(jìn)行干擾素制劑處理?？瞻讓?duì)照組在感染對(duì)照組染毒的同時(shí)注射等量PBS鹽水，不予感染病毒。試驗(yàn)期間水溫23～27℃。(2)干擾素制劑浸泡草魚(yú)魚(yú)體本次實(shí)驗(yàn)所用的草魚(yú)種體長(zhǎng)(3910±410)mm，平均體重312g，飼養(yǎng)水溫27～30℃，人工感染時(shí)將已制備好的含有病毒的病魚(yú)組織勻漿按1∶5000釋釋，劑量為0.3mL/尾。對(duì)受試草魚(yú)以濃度50單位/mL的干擾素制劑稀釋液浸泡1h。本次試驗(yàn)的目的是為探討浸泡方式處理的效果。一組在染毒前一天浸泡干擾素，第二組在染毒前一天和染毒后連續(xù)三天各浸泡一次，第三組在染毒后隔日連續(xù)浸泡三次，第四組為感染對(duì)照組。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)四個(gè)組的草魚(yú)均為30尾。以上實(shí)驗(yàn)證明魚(yú)類(lèi)干擾素可以作為生物制劑，或漁用抗病毒飼料和飼料添加劑，加入到魚(yú)類(lèi)飼料中后直接投喂用于魚(yú)類(lèi)病毒病的防治。
根據(jù)以上的實(shí)施，本發(fā)明得到魚(yú)類(lèi)干擾素基因的原核表達(dá)產(chǎn)物具有抗病毒作用；在魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞中組成型表達(dá)魚(yú)類(lèi)干擾素也具有抗病毒作用；利用誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素制劑也能有效防治草魚(yú)出血?。桓蓴_素基因的表達(dá)產(chǎn)物能作為漁用飼料添加劑用于生產(chǎn)實(shí)踐。因此本發(fā)明中鑒定的鯽魚(yú)干擾素基因具有漁用抗病毒藥物和藥用飼料添加劑的用途。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所<120>魚(yú)類(lèi)干擾素基因及其用途<130>魚(yú)類(lèi)干擾素基因及其用途<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1226<212>DNA<213>Carassius auratus<400>1gcaacattct ctcgagcgac agtgtagaaa gctactacta cctgaataca aagatgaaaa60ctcaaatgtg gacgtatatg tttgtaatgt ttttaactct gcagggtcaa tgctctgctt120gcgaatggct cggccgatac aggatgataa gcaacgagtc tttgagcctc ctgaaggaaa180tgggtggaaa atatcctgag ggtaccaagg tgtcatttcc aggacgcctg tacaacatga240tagacaatgc caaggtggag gaccaggtga agtttcttgt cctgacctta gatcatatca300tccgcctcat ggatgccaga gagcacatga attcagtgca gtggaaccta cagactgtag360agcattttct aactgtcctg aacaggcagt catctgatct taaagaatgt gtggcccgat420accagccatc acataaggag tcctacgaga aaaagataaa cagacacttc aagattttaa480agaagaatct aaagaaaaaa gaatatagtg ctcaagcatg ggagcagatc cggagagctg540tgaaacatca ccttcagagg atggacatca tcgcaagcat tgccaacaga cgataagaca600taatgacaga tgaatgactt gtgacacatt ccatggagtg aagaaaagtt aatgtaaaca660atgccttaaa agctaaaact gaatgtaaca aatatttatt tacatgactg tattttattt720caactagagt tgaaagtttt gcctaatgtc tggtgtttta atatagagtt taccttatgt780gtttcctatg aaaacttgaa gtaatctgat caagcaagct aattatgttt cttacaaaaa840cctgtgaaac cttttattta ttttattttg gtgcaaatag gcctatgtgc ctaaactata900ctcagatttt ttgctgaatg tgaaaaaaat gtttaaaaaa acaagcatgc catgtatttc960aagtcatgta tttattaacg gtcagtcagt tatgttgtga tgcacatgaa tattaggtat1020gttttgtgat tgtttcagat atttattata cttaatttaa tttatatatt gttgtgcaca1080atttttgtat ctctgaatat ttattgtttt tatatgtact gttatttata gttatttatt1140tgctctattt gcttgcaaaa tatttttgta cttttaaata aaaaattgat tgaaactagc1200aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1226
<210>2<211>180<212>PRT<213>Carassius auratus<400>2Met Lys Thr Gln Met Trp Thr Tyr Met Phe Val Met Phe Leu Thr Leu1 5 10 15Gln Gly Gln Cys Ser Ala Cys Glu Trp Leu Gly Arg Tyr Arg Met Ile20 25 30Ser Asn Glu Ser Leu Ser Leu Leu Lys Glu Met Gly Gly Lys Tyr Pro35 40 45Glu Gly Thr Lys Val Ser Phe Pro Gly Arg Leu Tyr Asn Met Ile Asp50 55 60Asn Ala Lys Val Glu Asp Gln Val Lys Phe Leu Val Leu Thr Leu Asp65 70 75 80His Ile Ile Arg Leu Met Asp Ala Arg Glu His Met Asn Ser Val Gln85 90 95Trp Asn Leu Gln Thr Val Glu His Phe Leu Thr Val Leu Asn Arg Gln100 105 110Ser Ser Asp Leu Lys Glu Cys Val Ala Arg Tyr Gln Pro Ser His Lys115 120 125Glu Ser Tyr Glu Lys Lys Ile Asn Arg His Phe Lys Ile Leu Lys Lys130 135 140Asn Leu Lys Lys Lys Glu Tyr Ser Ala Gln Ala Trp Glu Gln Ile Arg145 150 155 160Arg Ala Val Lys His His Leu Gln Arg Met Asp Ile Ile Ala Ser Ile165170175Ala Asn Arg Arg180
權(quán)利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種魚(yú)類(lèi)干擾素基因的原核表達(dá)蛋白在制備治療或預(yù)防魚(yú)類(lèi)病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
4.一種魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞中制備治療或預(yù)防魚(yú)類(lèi)病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
5.一種魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)機(jī)體中制備治療或預(yù)防魚(yú)類(lèi)病毒感染的生物制劑中的應(yīng)用。
6.一種魚(yú)類(lèi)干擾素基因在魚(yú)類(lèi)機(jī)體中制備治療或預(yù)防漁用飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類(lèi)干擾素基因及其用途。一種分離的基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。該基因在病毒感染的細(xì)胞中及在穩(wěn)定轉(zhuǎn)植干擾素基因的細(xì)胞株中能顯著表達(dá)。該基因表達(dá)產(chǎn)物在培養(yǎng)細(xì)胞和魚(yú)類(lèi)機(jī)體中具有抗病毒感染的用途。可以利用原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)(如魚(yú)類(lèi)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))等在多個(gè)層面上進(jìn)行鯽魚(yú)干擾素基因的利用和開(kāi)發(fā)，還可作為抗病毒生物制劑，具有漁用抗病毒藥物和藥用飼料添加劑中的用途，使用方便，抗病毒作用迅速，效果顯著。
文檔編號(hào)A23K1/16GK101054584SQ20071005180
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月5日
發(fā)明者張義兵, 桂建芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所