專利名稱：：一種以大豆子葉節(jié)再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
。是一種以大豆子葉節(jié)為外植體進行大豆器官發(fā)生和植株再生的方法。
背景技術(shù)：
：大豆植株再生系統(tǒng)是實現(xiàn)大豆基因遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件。良好的大豆植株再生系統(tǒng)應(yīng)該具有高效的種子消毒技術(shù)、適宜的種子萌發(fā)培養(yǎng)基和叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、伸長培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及必要的無菌苗馴化培養(yǎng)技術(shù)等。從20世紀80年代初，人們選擇了幼胚、幼胚子葉或胚軸為外植體，用異常高濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，建立了大豆的體細胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生再生系統(tǒng)。隨后用成熟胚子葉、子葉節(jié)、初生葉和初生葉節(jié)等相繼獲得了較高頻率的源于不定芽的再生植株，80年代末期原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得突破。研究表明，不同的外植體再生頻率差異較大，其中以子葉節(jié)的再生頻率較高，是進行大豆植株再生培養(yǎng)最有效的途徑和方法。目前，已有很多關(guān)于大豆子葉節(jié)再生植株的報道(Owens,1985;Mauto，1995;Trick，1997,1998;蘇彥輝，1999;周思軍，2000)。雖然大豆植株再生系統(tǒng)中外植體的來源已比較明確，但是在組織培養(yǎng)過程對種子消毒、器官發(fā)生過程中各種培養(yǎng)基的應(yīng)用還比較混亂，對植株再生頻率也產(chǎn)生了很大的影響。無菌苗的獲得離不開有效的種子消毒方法，常用的消毒劑有次氯酸鈉、過氧化氫和升汞等，在大豆組織培養(yǎng)中以應(yīng)用升汞和次氯酸鈉居多。在組織培養(yǎng)過程中，尤其重要的是培養(yǎng)基的選擇及其激素的添加，這對外植體叢生芽誘導(dǎo)、伸長和生根都有重要的影響，是決定外植體器官發(fā)生和植株再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在萌發(fā)培養(yǎng)基中，一般要添加6-BA以提高無菌苗的質(zhì)量。在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中要添加適宜配比的6-BA和GA3，以促進子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)分化和伸長。在伸長培養(yǎng)基中要添加6-BA、Glu、GA3和ZT以提高叢生芽的伸長率。而在生根培養(yǎng)基中也要添加IBA或NAA，以提高叢生芽的生根能力。所有這些激素添加與否以及劑量的大小對無菌苗的生長和叢生芽誘導(dǎo)、伸長和生根產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用。因此，要建立完善的子葉節(jié)器官發(fā)生途徑再生系統(tǒng)，必須在相應(yīng)培養(yǎng)基中添加必要的生長激素，并確定合理添加濃度。為此，我們針對上述問題，對大豆子葉節(jié)器官發(fā)生途徑再生系統(tǒng)進行完善和優(yōu)化，研究出本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明從以上技術(shù)背景出發(fā)，以大豆子葉節(jié)作為外植體進行大豆器官發(fā)生和植株再生研究，包括無菌苗的獲得、子葉的獲得、叢生芽的誘導(dǎo)、伸長、生根和馴化，直至植株結(jié)莢成熟的整個過程。具體操作程序如下a.無菌苗的獲得取表面潔凈的大豆種子用自來水沖洗15min后，放入70%乙醇溶液中處理50s，0.P/。HgCl2溶液中處理5min，然后取出用無菌水洗4-5次，接到萌發(fā)培養(yǎng)基屮。萌發(fā)培養(yǎng)基為B5-A鹽、B5-B鹽、MS-C鹽、B5有機物、3%蔗糖、0.8%瓊脂粉、2.0mg/L6-BA，pH值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光周期16/8h。b.子葉節(jié)的獲得取萌發(fā)5-7d子葉鮮綠、子葉節(jié)處膨大的大豆無菌苗，在子葉節(jié)下3-4mm處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側(cè)芽和種子根，每株無菌苗可獲得來兩個子葉節(jié)外植體。c.叢生芽的誘導(dǎo)將子葉按近軸面朝上插入添加l.7mg/L6-BA和0.2mg/LGA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基本成分為MS無機物、B5有機物和500mg/L谷氨酰胺。培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光周期16/8h。d.叢生芽的伸長待叢生芽可見時，將外植體轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接時切去子葉及下胚軸基部的老化組織，每10d繼帶一次。培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光周期16/8h。芽伸長的培養(yǎng)基為B5鹽、MS-C、B5-D、0.lmg/LIAA、10mg/L硝酸銀、3%蔗糖、0.8%瓊脂粉，0.34mg/L6-BA、50mg/LGlu、0.5mg/LAG3、0.5mg/LZT,pH值為5.8。e.叢生芽的生根與馴化帶叢生芽長到3-4cm時，切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待叢生芽根生出并達到了3-4cm后，洗凈根部的培養(yǎng)基，將生根的小植株移入液體生根培養(yǎng)基中煉苗3-5d，并打開瓶口，使無菌苗適應(yīng)有菌的外界環(huán)境。然后將小植株取出移至營養(yǎng)缽的土壤中(蛭石草炭土細土=1:2:2)培養(yǎng)馴化，套袋以保濕，然后逐漸降低濕度、增強光照。待小苗成活后，轉(zhuǎn)入正常土壤中栽培，保持溫、濕度和正常的光照直至結(jié)莢成熟。叢生芽生根培養(yǎng)基為1/2MSB、0.37mg/LNAA、2%蔗糖和0.8%瓊脂粉，pH值為5.8。具體實施例方式本發(fā)明在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所的"大豆高維生素E合成基因遺傳轉(zhuǎn)化"課題中得到了應(yīng)用。在課題實施過程中采用本發(fā)明對生產(chǎn)上應(yīng)用較多的黑農(nóng)35、合豐35、合豐25和綏農(nóng)14等品種進行了高維生素E合成基因遺傳轉(zhuǎn)化研究，對于本課題的完成和高維生素E大豆育種都起到了有效的技術(shù)支撐。下面列出了大豆子葉節(jié)基因型篩選結(jié)果大豆子葉節(jié)基因型篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據(jù)大豆子葉節(jié)基因型篩選結(jié)果可以看出，合豐25的叢生芽分化率最高，為94.20%，其次是黑農(nóng)35，叢生芽分化率為92.65%，合豐35、綏農(nóng)IO、東生1號和綏農(nóng)14叢生芽分化率分別為85.48%、83.08%、80.95%和68.33%。每個外植體的叢生芽數(shù)以合豐35最多，為4.85個，合豐25和綏農(nóng)14次之，分別為3.86和3.80個，黑農(nóng)35、東生l號和綏農(nóng)10分別為3.19、2.12和0.57。從總體上看，應(yīng)用此發(fā)明所有基因型的分化率均在60%以上，每個外植體的叢生芽數(shù)也在2-5之間，因此可以斷定除了綏農(nóng)10以外，其它4個品種應(yīng)用子葉節(jié)作為外植體進行器官發(fā)生和植株再生是比較理想的，這與文獻報道的基本上是一致的，可見本方法不僅是可行的，而且對大豆遺傳改良上具有重要的推動作用。權(quán)利要求1.一種以大豆子葉節(jié)為外植體進行大豆器官發(fā)生和植株再生的方法，其特征在于采用了以下的方法與程序a.無菌苗的獲得取表面潔凈的大豆種子用自來水沖洗15min后，放入70％乙醇溶液中處理50s，0.1％HgCl2溶液中處理5min，然后取出用無菌水洗4-5次，接到萌發(fā)培養(yǎng)基中，萌發(fā)培養(yǎng)基為B5-A鹽、B5-B鹽、M5-C鹽、B5有機物、3％蔗糖、0.8％瓊脂粉、2.0mg/L6-BA，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，光周期16/8h；b.子葉節(jié)的獲得取萌發(fā)5-7d子葉鮮綠、子葉節(jié)處膨大的大豆無菌苗，在子葉節(jié)下3-4mm處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側(cè)芽和種子根，每株無菌苗可獲得來兩個子葉節(jié)外植體；c.叢生芽的誘導(dǎo)將子葉按近軸面朝上插入添加1.7mg/L6-BA和0.2mg/LGA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基本成分為MS無機物、B5有機物和500mg/L谷氨酰胺，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，光周期16/8h；d.叢生芽的伸長待叢生芽可見時，將外植體轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接時切去子葉及下胚軸基部的老化組織，每10d繼帶一次，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，光周期16/8h，芽伸長的培養(yǎng)基為B5鹽、MS-C、B5-D、0.1mg/LIAA、10mg/L硝酸銀、3％蔗糖、0.8％瓊脂粉，0.34mg/L6-BA、50mg/LGlu、0.5mg/LAG3、0.5mg/LZT，pH值為5.8；e.叢生芽的生根與馴化帶叢生芽長到3-4cm時，切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待叢生芽根生出并達到了3-4cm后，洗凈根部的培養(yǎng)基，將生根的小植株移入液體生根培養(yǎng)基中煉苗3-5d，并打開瓶口，使無菌苗適應(yīng)有菌的外界環(huán)境，然后將小植株取出移至營養(yǎng)缽的土壤中(蛭石∶草炭土∶細土＝1∶2∶2)培養(yǎng)馴化，套袋以保濕，然后逐漸降低濕度、增強光照。待小苗成活后，轉(zhuǎn)入正常土壤中栽培，保持溫、濕度和正常的光照直至結(jié)莢成熟，叢生芽生根培養(yǎng)基為1/2MSB、0.37mg/LNAA、2％蔗糖和0.8％瓊脂粉，pH值為5.8。全文摘要本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
。是一種以大豆子葉節(jié)為外植體進行大豆器官發(fā)生和植株再生的方法。本發(fā)明在傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以大豆子葉節(jié)為外植體進行器官發(fā)生途徑再生系統(tǒng)的完善，在篩選有效的大豆種子消毒技術(shù)的基礎(chǔ)上，突出了各種培養(yǎng)基成分的改進與優(yōu)化，通過常規(guī)大豆品種的組織培養(yǎng)驗證，可有效促進叢生芽的誘導(dǎo)、伸長和生根，提高無菌苗的質(zhì)量和叢生芽的分化率，能夠很好實現(xiàn)多數(shù)品種子葉節(jié)器官發(fā)生和植株再生過程，為大豆遺傳轉(zhuǎn)化和分子改良提供了堅實的技術(shù)支撐，對我國大豆高效育種和健康生產(chǎn)將具有重要的現(xiàn)實意義。文檔編號A01H4/00GK101176427SQ200710056390公開日2008年5月14日申請日期2007年12月6日優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日發(fā)明者張鳳蕓,張秋英,李艷華,潘相文,王國棟,邢海軍申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所