專利名稱：殺滅土壤線蟲微生態(tài)菌制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種殺滅土壤線蟲微生態(tài)菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前我國的土壤生態(tài)系統(tǒng)己經(jīng)或正在受到嚴(yán)重破壞，土壤線蟲顯著增多，植物病害的種 類和范圍不斷增加，這都是土壤生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞的明證。其中土壤線蟲是直接影響農(nóng)作物 產(chǎn)量的土壤害蟲，尤其是種植花生、紅薯的土壤，線蟲可以把整塊整塊土地的花生、紅薯吃 光或破壞，幾乎絕收。以前只是尋求化學(xué)殺蟲劑，但其第一年有效，第二年則幾乎無效，而 且它所造成的土壤污染幾十年都消除不掉。所以，研究開發(fā)微生物制劑殺滅線蟲勢在必行。 國內(nèi)外己有一些研究，但是，還未見高密度、高活性，能大面積使用的微生態(tài)菌制劑的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高密度、高活性的殺滅土壤線蟲微生態(tài)菌制劑 及其制備方法。
本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
以巨大芽孢桿菌(AS 1.217， Ba"'〃w megaten'wm)為主，輔以適量細(xì)黃鏈霉菌 (AS4.891， ^reptow少c^ wz'cn y^vM^，并吸附固定化于麥麩上制備成菌制劑。兩株菌種 均購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。
殺滅土壤線蟲微生態(tài)菌制劑是上述巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌優(yōu)化組合的復(fù)合微生物組 成，其中各組分的重量百分比為巨大芽孢桿菌60% 80%，細(xì)黃鏈霉菌20% 40%。
殺滅土壤線蟲微生態(tài)菌制劑的制備方法包括下述步驟
1. 將保存的各斜面菌種活化，分別搖瓶培養(yǎng)。巨大芽孢桿菌和細(xì)黃鏈霉菌都用可溶性淀 粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH7.0 7.5， 12rC高壓滅菌20-30分鐘；巨大芽孢桿菌，35 40 。C培養(yǎng)20 24小時；細(xì)黃鏈霉菌，28 3CTC培養(yǎng)36 50小時。
2. 用玉米淀粉培養(yǎng)基， 一級液體擴(kuò)大培養(yǎng)巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌；接種量5% 10%。
3. 用玉米淀粉培養(yǎng)基，二級液體擴(kuò)大培養(yǎng)巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌；接種量5% 10%。
4. 以麥麩為載體分別固體擴(kuò)大培養(yǎng)并固定化于麥麩上。麥麩滅菌前加入10%玉米淀粉的 培養(yǎng)液，固體擴(kuò)大培養(yǎng)條件30 37°C，不斷攪拌并通入凈化的空氣。
5. 將巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌經(jīng)30 45'C溫?zé)犸L(fēng)干燥，然后粉碎。
6. 將吸附于麥麩上的巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌混合，各菌組分的重量百分比為巨大 芽孢桿菌60% 80%，細(xì)黃鏈霉菌20% 40%。
本發(fā)明的有益效果
1)復(fù)合菌固定化于麥麩上，使每克復(fù)合菌制劑的有效菌菌落數(shù)(CFU)可高達(dá)100個億， 幾乎達(dá)到了最大可能數(shù)，至今還未見如此高含菌量菌制劑的報道.麥麩不僅能為所培養(yǎng)菌提供
一些營養(yǎng)成分，還由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積，所以能在單位體積內(nèi)附著吸附固 定化較多的菌體。所以，有效菌一旦施入土壤可以很快形成優(yōu)勢菌群，發(fā)揮殺滅線蟲的作用， 殺滅率接近100%。還有殺滅或驅(qū)除蠐螬(金龜子的幼蟲)的作用，殺滅率或驅(qū)除率達(dá)95% 以上。
2) 土壤線蟲的腸壁細(xì)胞含有較多的幾丁質(zhì)，而巨大芽孢桿菌能分泌較多的幾丁質(zhì)酶。所 以，土壤線蟲一旦遇到巨大芽孢桿菌，由于其腸壁遭到巨大芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的破壞，最后 必死亡。巨大芽孢桿菌還具有把土壤固定化的磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的作用，可溶性磷是植物和 微生物可利用的磷。
細(xì)黃鏈霉菌，能產(chǎn)生抗生素抗病驅(qū)蟲，分泌刺激素，促進(jìn)植物生長，轉(zhuǎn)化礦物質(zhì)。 二者相互配合，不僅殺蟲驅(qū)蟲而且促進(jìn)、修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
按下列步驟進(jìn)行-
1) 將4'C保存的各斜面菌種活化，分別搖瓶培養(yǎng)。巨大芽孢桿菌和細(xì)黃鏈霉菌都用可溶 性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配方如下可溶性淀粉20g， KNO:, lg,NaCl 0. 5g, K, 0. 5g, MgS04. 7H20 0. 5g, FeS04 0, Olg,蒸餾水lOOOmL， pH7. 2， 12rC高壓滅菌20分鐘。巨大 芽孢桿菌，37匸培養(yǎng)24小時；細(xì)黃鏈霉菌，3(TC培養(yǎng)48小時。
2) —級液體擴(kuò)大培養(yǎng)(巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌分別單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基用玉米淀 粉，培養(yǎng)條件同上)；接種量5%。
3) 二級液體分別擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同上；接種量5%。
4) 以麥麩為載體分別固體擴(kuò)大培養(yǎng)并固定化于麥麩上。麥麩滅菌前加入10%玉米淀粉培 養(yǎng)液，固體擴(kuò)大培養(yǎng)條件30 37°C，不斷攪拌并通入凈化的空氣。
5) 將上述兩種菌35。C溫?zé)犸L(fēng)干燥，含水率20%以下，然后粉碎，將吸附于麥麩上的各 菌按重量百分比混合巨大芽孢桿菌600g，細(xì)黃鏈霉菌400g，充分混合，即可得到本發(fā) 明的菌制劑。
實(shí)施例2
按下列步驟進(jìn)行-
1) 將4'C保存的各斜面菌種活化，分別搖瓶培養(yǎng)。巨大芽孢桿菌和細(xì)黃鏈霉菌都用可溶 性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配方如下可溶性淀粉20g， K亂lg,NaCl 0.5g, K2,4 0. 5g, MgS04. 7H20 0. 5g， FeS04 0. Olg,蒸餾水lOOOml， pH7. 2， 121。C高壓滅菌20分鐘。巨大 芽孢桿菌，37t:培養(yǎng)24小時；細(xì)黃鏈霉菌，3(TC培養(yǎng)48小時。
2) —級液體擴(kuò)大培養(yǎng)(巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌分別單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基用玉米淀 粉，培養(yǎng)條件同上)；接種量10%。
3) 二級液體分別擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同上；接種量10%。
4) 以麥麩為載體分別固體擴(kuò)大培養(yǎng)并固定化于麥麩上。麥麩滅菌前加入10%玉米淀粉培 養(yǎng)液，固體擴(kuò)大培養(yǎng)條件30 37°C，不斷攪拌并通入凈化的空氣。
5) 將上述兩種菌45'C溫?zé)犸L(fēng)干燥，然后粉碎，將吸附于麥麩上的各菌按重量百分比混 合巨大芽孢桿菌80kg，細(xì)黃鏈霉菌20kg，充分混合，封裝于有聚乙烯內(nèi)襯的包裝袋內(nèi)，含 水率20°/。，有效期一年。
實(shí)施例3
按下列步驟進(jìn)行
1) 將4'C保存的各斜面菌種活化，分別搖瓶培養(yǎng)。巨大芽孢桿菌和細(xì)黃鏈霉菌都用可溶 性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配方如下可溶性淀粉20g， KNQ, lg，NaCl 0. 5g， K2HP04 0. 5g， MgS04. 7H20 0. 5g, FeS04 0. Olg，蒸餾水1000ml, pH7. 2， 121。C高壓滅菌20分鐘。巨大 芽孢桿菌，37'C培養(yǎng)24小時；細(xì)黃鏈霉菌，3(TC培養(yǎng)48小時。
2) —級液體擴(kuò)大培養(yǎng)(巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌分別單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基用玉米淀 粉，培養(yǎng)條件同上)；接種量10%。
3) 二級液體分別擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同上；接種量5%。
4) 以麥麩為載體分別固體擴(kuò)大培養(yǎng)并固定化于麥麩上。麥麩滅菌前加入10%玉米淀粉培 養(yǎng)液，固體擴(kuò)大培養(yǎng)條件30 37°C，不斷攪拌并通入凈化的空氣。
5) 將上述兩種菌45t:溫?zé)犸L(fēng)干燥，然后粉碎，將吸附于麥麩上的各菌按重量百分比混 合巨大芽孢桿菌750kg，細(xì)黃鏈霉菌250kg，充分混合，封裝于有聚乙烯內(nèi)襯的包裝袋內(nèi)， 含水率20%，有效期一年。
實(shí)施例4:測定分離土壤線蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用離心浮選法，這種方法能夠有效的分離土壤中包括線蟲卵及死體、非游動性線
蟲在內(nèi)的大部分線蟲。步驟如下
取過20目篩土壤樣品10g放在離心管內(nèi)，加水10 15毫升充分震蕩，混合； 將比重為1.20的蔗糖水溶液(蔗糖800g溶于l升水中)IO毫升，用移液管或加樣器放 進(jìn)離心管底部；
2500g,離心5min。溶液分成兩層，線蟲聚集在交界層，用滴管吸取交界層的線蟲至10 毫升表皿內(nèi)。
將表皿置于解剖鏡下計數(shù)。
該方法的優(yōu)點(diǎn)只需要一次離心，收集的線蟲水液清，容易辨別線蟲的形態(tài)。 注意事項1) 土壤樣品往往會混有植物碎屑，為了減少對線蟲的混攪，最好在取樣前將 土壤樣品過20目篩；
2)因加入的蔗糖液多少和離心速度的關(guān)系，有時交界層不十分清晰，遇到這種情況時，
可以適當(dāng)多取些水溶液，以免丟失線蟲。
權(quán)利要求
1.一種殺滅土壤線蟲的微生態(tài)菌制劑，其特征在于該菌制劑由巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和細(xì)黃鏈霉菌(Staestomyces microflavus)優(yōu)化組合的復(fù)合微生物組成，其中各菌組分的重量百分比為巨大芽孢桿菌60％～80％，細(xì)黃鏈霉菌20％～40％。
2. 如權(quán)利要求1所述的殺滅土壤線蟲的微生態(tài)菌制劑的制備方法，其特征在于它 包括下述步驟1) 將保存的各斜面菌種活化，分別搖瓶培養(yǎng)；巨大芽孢桿菌和細(xì)黃鏈霉菌都用 可溶性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH7.0 7.5, 115 121。C高壓滅菌20 30 分鐘；巨大芽孢桿菌，35 40'C培養(yǎng)20 24小時；細(xì)黃鏈霉菌，28 30'C培 養(yǎng)36 50小時；2) 巨大芽孢桿與細(xì)黃鏈霉菌的一級液體擴(kuò)大培養(yǎng)(20 L罐)；接種量5% 10%;3) 巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌的二級液體擴(kuò)大培養(yǎng)(200 1^罐)；接種量5% 10%;4) 以麥麩為載體分別進(jìn)行固體擴(kuò)大培養(yǎng)并固定化于麥麩上。固體擴(kuò)大培養(yǎng)條件: 30 37°C，不斷攪拌并通入凈化的空氣；5) 將巨大芽孢桿菌和細(xì)黃鏈霉菌分別在30 45'C溫?zé)犸L(fēng)干燥，然后粉碎；6) 將巳干燥的巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌混合，各菌組分的重量百分比為巨大芽孢桿菌60% 80%，細(xì)黃鏈霉菌20% 40%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺滅土壤線蟲微生態(tài)菌制劑及其制備方法。殺滅土壤線蟲的微生態(tài)菌制劑是巨大芽孢桿菌與細(xì)黃鏈霉菌優(yōu)化組合的復(fù)合微生物，其中各組分的重量百分比為巨大芽孢桿菌60％～80％，細(xì)黃鏈霉菌20％～40％。本發(fā)明的積極效果在于菌制劑經(jīng)活化，施入土壤中能很快形成微生態(tài)優(yōu)勢菌群，殺滅土壤線蟲效率接近100％，驅(qū)除蠐螬率達(dá)95％以上。菌制劑的有效菌落數(shù)高，適應(yīng)性強(qiáng)，對修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境具有明顯的作用。
文檔編號A01P5/00GK101099492SQ20071005842
公開日2008年1月9日 申請日期2007年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月30日
發(fā)明者曼 劉, 吉雪瑩, 崔合香, 崔小會, 張清敏 申請人:南開大學(xué)