專利名稱：用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蘭花新品種的培育方法，特別是用種子類原球莖(PLBs)培育四倍體秋 石斛蘭新品種的方法。
技術(shù)背景秋石斛蘭(De"c/ra6/w^;7.)又稱蝴蝶石斛，多是以原產(chǎn)于新幾內(nèi)亞的熱帶原生種蝴 蝶石解(DendrobiumPhalaen叩sis)為親本育成的雜交品種。秋石斛蘭是一種新型的高檔 切花蘭花品種，具有很高的欣賞性，市場(chǎng)需求量較大，在國(guó)際和國(guó)內(nèi)花卉產(chǎn)業(yè)中占有重 要地位。近年我國(guó)大陸引進(jìn)了不少秋石斛蘭品種。但是，迄今為止，國(guó)內(nèi)外秋石斛蘭花 均為二倍體品種，尚未見(jiàn)多倍體秋石斛蘭花的報(bào)道。多倍化后最直接的效應(yīng)是植物的根、 莖、葉、和花的變大，因此，多倍化育種在觀賞園藝中是最有效的育種方法之一，通過(guò) 多倍體育種可以獲得大花型蘭花新品種。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用種子類原球莖(PLBs)培育四倍體秋石斛蘭新品種的方 法，可以克服通常多倍體誘變頻率低的缺點(diǎn)。方法簡(jiǎn)單，而且大幅度地提高了多倍體誘 變頻率高，供選種之用，應(yīng)用價(jià)值高。本發(fā)明提供的一種用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法包括以下步 驟采用人工授粉后胚齡的未成熟秋石斛蘭種子，在1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行非共生萌 發(fā)培養(yǎng)，在培養(yǎng)60天后，換入含有0.02%Oryzalin (C12H18N406S)的1/2MS液體培養(yǎng)中 處理，后轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上，光照下，繼續(xù)培養(yǎng)，直至秋石斛蘭苗形成，按常規(guī) 的方法進(jìn)行秋石斛蘭栽培移植和管理，直至開(kāi)花。本發(fā)明提供的一種用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法包括以下歩驟1) 秋石斛蘭的人工授粉秋石斛蘭按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，在開(kāi)花后的5 10 天進(jìn)行人工授粉，授粉后的秋石斛蘭，放在通風(fēng)、半透光條件下進(jìn)行管理，溫度保持在15 20°C，濕度30 50%，防止落花、落果。2) 秋石斛蘭種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)在人工授粉后150 180天，當(dāng)秋石斛蘭蒴果發(fā) 育正常(如圖l所示)，取秋石斛蘭種子，用剪刀剪下蒴果(用消過(guò)毒的解剖刀)，在超 凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精消毒1分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗5 遍，沿果實(shí)縱軸方向切開(kāi)，將秋石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中振動(dòng)或靜止非共 生萌發(fā)培養(yǎng)；3) 秋石斛蘭多倍體誘導(dǎo)將非共生萌發(fā)的秋石斛蘭種子轉(zhuǎn)入含有0.02%OryZalin (C12Hl8N406S)的1/2MS液體培養(yǎng)基中，誘變處理。 4) 秋石斛蘭多倍體幼苗培養(yǎng)將誘變處理后的秋石斛蘭種子轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng) 基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至秋石斛蘭苗形成。 '5) 秋石斛蘭苗多倍體的鑒定在瓶苗移栽時(shí)，按株編號(hào)，分別取薪生長(zhǎng)的根尖，放 入對(duì)二氯代苯飽和水溶液中，前處理4小時(shí)，后轉(zhuǎn)入甲醇冰醋酸(3: 1，體積)固定 液中固定4小時(shí)以上，4。C冰箱中保存?zhèn)溆?；用壓片法制備染色體標(biāo)本，用卡寶品紅染 色液染色，顯微鏡觀察染色體數(shù)目，選取染色體數(shù)目為2n^76的幼苗，是加倍成功的同 源四倍體秋石斛幼苗；其他染色體數(shù)目的幼苗為非整倍體，不是加倍成功的四倍體，不 能使用。6) 四倍體秋石斛蘭的栽培管理將加倍成功的秋石斛蘭苗，進(jìn)行移植，待瓶苗長(zhǎng)至 3-4片葉時(shí)，將瓶蓋打開(kāi)，進(jìn)行練苗3-5天，然后用清水輕輕地冼凈培養(yǎng)基，將瓶苗移 栽在蘭花土 +火燒土 +松針土 (重量比為1: 1: 1)基質(zhì)中，放在陰涼處，按常規(guī)的秋 石斛蘭進(jìn)行栽培管理，防止病蟲(chóng)害，直至開(kāi)花。步驟1)在秋石斛蘭花開(kāi)花5 10天內(nèi)進(jìn)行人工雜交授粉，取自花或同株異花花粉進(jìn)行授粉。步驟2)所述的非共生萌發(fā)培養(yǎng)是在黑暗或弱光下，室溫25 27°C條件下進(jìn)行非共 生萌發(fā)培養(yǎng)60天。步驟3)所述的誘變處理是在培養(yǎng)60天后，當(dāng)種子類原球莖(PLBs)發(fā)育成球形時(shí)， 即原胚期，進(jìn)行多倍體誘變處理150-180小時(shí)?？娠@著地提高了多倍誘變頻率，可以獲 得大量四倍體秋石斛蘭苗。步驟4)所述的繼續(xù)培養(yǎng)是在光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫25 27。C 條件下進(jìn)行。步驟5)所述的移植方法待瓶苗長(zhǎng)至3-4片真葉后，打開(kāi)瓶蓋進(jìn)行練苗3-5天，然后用清水輕輕地洗去培養(yǎng)基，移栽在蘭花土 +火燒土 +松針土 (重量比為1: 1: 1)基質(zhì)中，放在陰涼處，按一般石斛蘭花進(jìn)行精心管理，防止病蟲(chóng)害。本發(fā)明提供的一種用種子類原球莖(PLBs)培育四倍體秋石斛蘭新品種的方法，可 以克服通常多倍體誘變頻率低的缺點(diǎn)。四倍體秋石斛蘭根、莖、葉和花等都明顯大或高 于原二倍體秋石斛蘭，苗壯，種苗品質(zhì)好，具更好的欣賞性。本發(fā)明在秋石斛蘭種子非 共生萌發(fā)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在種子類原球基(PLBs)時(shí)期，用低濃度Oryzalin，進(jìn)行較長(zhǎng) 時(shí)間處理(150 180小時(shí))，不但方法簡(jiǎn)單易行，而且大幅度地提高了多倍體誘變頻率 (60%以上)， 一次就可獲得足夠數(shù)量的多倍體群體(數(shù)百株以上)，供選種之用，應(yīng)用 價(jià)值高。本發(fā)明可以規(guī)?；a(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高的優(yōu)勢(shì)。


圖1:秋石斛蘭開(kāi)花與授粉；圖2:人工授粉后發(fā)育正常的朔果；
圖3:非共生萌發(fā)培養(yǎng)秋石斛蘭種子； 圖4:多倍體誘導(dǎo)時(shí)期種子原球莖； 圖5:加倍成功的多倍體秋石斛蘭幼苗; 圖6:四倍體秋石斛蘭染色體(211=76); 圖7:四倍體秋石斛蘭幼苗。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明可以通過(guò)以下實(shí)例得到具體體現(xiàn)出來(lái)，但它不會(huì)對(duì)本發(fā)明作任何限制。 實(shí)施例2003年10月初從山東省兗州三益公司購(gòu)入秋石斛蘭，于當(dāng)年10目16日進(jìn)行同株 異花人工授粉，授粉后的秋石斛蘭放在20 25。C，自然光照條件下，至2004年6月22 日(246天)，剪下蒴果，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用75%酒精消毒1分鐘，再用0.1%升汞 消毒10分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗5遍，沿蒴果縱軸方向，用無(wú)菌解剖刀將蒴果切開(kāi)，將 秋石斛種子接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，在20 25。C條件下，間歇振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng) 60天后，轉(zhuǎn)入含有0.02XOryzalin (氨磺靈)的1/2MS液體培養(yǎng)基中，誘變處理150 180小時(shí)，后轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上，在光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫 20 25°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至秋石斛蘭幼苗分化。在瓶苗移栽時(shí)，按株分別取新生 長(zhǎng)的根尖，放入對(duì)二氯代苯飽和水溶液中前處理4小時(shí)，后將根尖放入體積比為3: 1 甲醇冰醋酸固定液中固定4小時(shí)以上，4。C冰箱中保存?zhèn)溆?。用壓片法制備染色體標(biāo) 本，卡寶品紅染色液染色，顯微鏡觀察，染色體數(shù)目211=76的幼苗為加倍成功的四倍體 秋石斛蘭幼苗，其他染色體數(shù)目的幼苗為非整倍體，不能使用。四倍體秋石斛蘭幼苗， 按一般二倍體秋石斛蘭進(jìn)行栽培管理，直至開(kāi)花。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-7。
權(quán)利要求
1、一種用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其特征在于包括以下步驟采用人工授粉后胚齡的未成熟秋石斛蘭種子，在1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)，在培養(yǎng)60天后，換入含有0.02％Oryzalin(C12H18N4O6S)的1/2MS液體培養(yǎng)中處理，后轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上，光照下，繼續(xù)培養(yǎng)，直至秋石斛蘭苗形成，按常規(guī)的方法進(jìn)行秋石斛蘭栽培移植和管理，直至開(kāi)花。
2、 一種用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其特征在于包括以下 步驟1) 秋石斛蘭的人工授粉秋石斛蘭按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，在開(kāi)花后的5 10 天進(jìn)行人工授粉，授粉后的秋石斛蘭，放在通風(fēng)、半透光條件下進(jìn)行管理，溫度保持 在15 20。C，濕度30 50%;2) 秋石斛蘭種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)在人工授粉后150 180天，取秋石斛蘭種子， 用剪刀剪下蒴果，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精消毒1分鐘，再用0.1%升汞消毒10 分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗5遍，沿果實(shí)縱軸方向切開(kāi)，將秋石斛蘭種子接種在1/2MS 液體培養(yǎng)基中振動(dòng)或靜止非共生萌發(fā)培養(yǎng)；3) 秋石斛蘭多倍體誘導(dǎo)將非共生萌發(fā)的秋石斛蘭種子轉(zhuǎn)入含有0.02%OryZalin (Ci2Hi8N406S)的1/2MS液體培養(yǎng)基中，誘變處理。4) 秋石斛蘭多倍體幼苗培養(yǎng)將誘變處理后的秋石斛蘭種子轉(zhuǎn)入1/2MS固體培 養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至秋石斛蘭苗形成。5) 秋石斛蘭苗多倍體的鑒定在瓶苗移栽時(shí)，按株編號(hào)，分別取新生長(zhǎng)的根尖， 放入對(duì)二氯代苯飽和水溶液中，前處理4小時(shí)，后轉(zhuǎn)入甲醇冰醋酸(3: 1，體積> 固定液中固定4小時(shí)以上，4。C冰箱中保存?zhèn)溆茫挥脡浩ㄖ苽淙旧w標(biāo)本，用卡寶 品紅染色液染色，顯微鏡觀察染色體數(shù)目，選取染色體數(shù)目為211=76的幼苗，是加倍 成功的同源四倍體秋石斛幼苗；6) 四倍體秋石斛蘭的栽培管理將加倍成功的秋石斛蘭苗，進(jìn)行移植，按常規(guī)的 秋石斛蘭栽培管理，直至開(kāi)花。
3、 按照權(quán)利要求2所述的用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其 特征在于步驟l)在秋石斛蘭花開(kāi)花5 10天內(nèi)進(jìn)行人工雜交授粉，取自花或同株異 花花粉進(jìn)行授粉。
4、 按照權(quán)利要求2所述的用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其 特征在于步驟2)所述的非共生萌發(fā)培養(yǎng)是在黑暗或弱光下，室溫25 27°C條件下 進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)60天。
5、 按照權(quán)利要求2所述的用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其 特征在于步驟3)所述的誘變處理是在培養(yǎng)60天后，當(dāng)種子類原球莖(PLBs)發(fā)育 成球形時(shí)，即原胚期，進(jìn)行多倍體誘變處理150-180小時(shí)。
6、 按照權(quán)利要求2所述的用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其 特征在于歩驟4)所述的繼續(xù)培養(yǎng)是在光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫25 27。C條件下進(jìn)行。
7、 按照權(quán)利要求2所述的用種子類原球莖誘導(dǎo)四倍體秋石斛蘭新品種的方法，其 特征在于步驟6)所述的移植方法待瓶苗長(zhǎng)至3-4片真葉后，打開(kāi)瓶蓋進(jìn)行練苗3-5天，然后用清水輕輕地洗去培養(yǎng)基，移栽在蘭花土 +火燒土 +松針土(重量比為1: 1:1)基質(zhì)中，放在陰涼處，按一般石斛蘭花進(jìn)行精心管理，防止病蟲(chóng)害。
全文摘要
本發(fā)明涉及用種子類原球莖(PLBs)培育四倍體秋石斛蘭新品種的方法。采用人工授粉后胚齡的未成熟秋石斛蘭種子，在1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)60天，換入含有0.02％Oryzalin的1/2MS液體培養(yǎng)中處理后轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至秋石斛蘭苗形成，按常規(guī)的方法進(jìn)行秋石斛蘭栽培移植和管理，直至開(kāi)花。本發(fā)明可以克服通常多倍體誘變頻率低的缺點(diǎn)，具更好的欣賞性。方法簡(jiǎn)單易行，而且大幅度地提高了多倍體誘變頻率(60％以上)，一次就可獲得足夠數(shù)量的多倍體群體(數(shù)百株以上)，供選種之用，應(yīng)用價(jià)值高。本發(fā)明可以規(guī)?；a(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A01G1/00GK101124889SQ20071006122
公開(kāi)日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者宋文芹, 李秀蘭, 力 陳, 陳成彬, 陳瑞陽(yáng) 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)