專利名稱：：誘導(dǎo)植物胚囊染色體加倍選育三倍體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種選育植物多倍體的方法，尤其涉及一種誘導(dǎo)植物胚囊(雌配子體)染色體加倍選育三倍體的方法，屬于植物遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：自然界植物多倍體的發(fā)生均來自于細(xì)胞核內(nèi)染色體組的倍數(shù)變異，即體細(xì)胞分裂過程中偶然發(fā)生的染色體加倍以及減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生未減數(shù)配子。人工誘導(dǎo)染色體加倍可采取秋水仙堿溶液等化學(xué)誘導(dǎo)方法以及異常溫度等物理誘導(dǎo)方法。而人工獲得多倍體的途徑包括體細(xì)胞染色體加倍、不同倍性體間雜交、天然或人工未減數(shù)配子雜交、胚乳培養(yǎng)與細(xì)胞融合等?？迪蜿柕?2004)對(duì)授粉一定時(shí)期的銀腺楊(尸c^w/wa仿axPg/朋cMosfl)等雌花序進(jìn)行秋水仙堿溶液處理,獲得了一批白楊雜種三倍體植株，三倍體誘導(dǎo)最高得率達(dá)57.1%(康向陽、，張平冬，高鵬，等.秋水仙堿誘導(dǎo)白楊三倍體新途徑的發(fā)現(xiàn).北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(1):1-4)，為三倍體誘導(dǎo)找到了一條新的途徑。但是，該研究?jī)H僅指出在當(dāng)時(shí)的時(shí)空條件下，銀腺楊授粉后24-36h施加秋水仙堿溶液持續(xù)處理24h可以獲得三倍體，但其中存在諸多關(guān)鍵技術(shù)問題值得進(jìn)一步研究。如白楊授粉后24-36h的雌配子形成與發(fā)育時(shí)期究竟處于什么階段？在雌配子形成與發(fā)育的哪一個(gè)時(shí)期處理是三倍體的最佳誘導(dǎo)時(shí)期？如何在實(shí)際操作中，針對(duì)不同植物生物學(xué)特點(diǎn)判別誘導(dǎo)三倍體的有效處理時(shí)期？此外，因大多植物雌蕊柱頭的可授期比較長(zhǎng)，不同操作人員對(duì)雌蕊柱頭是否具有可授性的判斷標(biāo)準(zhǔn)不同，導(dǎo)致授粉有早有遲，包括銀腺楊在內(nèi)的一些植物在具體雜交授粉時(shí)甚至可以相差l-2d，這種沒有一個(gè)明確的處理起始參照點(diǎn)，而僅單純以授粉后24-36h等作為有效處理時(shí)期確定的標(biāo)準(zhǔn)也是不符合實(shí)際的，存在失敗的風(fēng)險(xiǎn)，也需要從技術(shù)層面上有針對(duì)性地加以解決。由于上述技術(shù)問題未能得到有效解決，使該方法的應(yīng)用受到限制。同樣是對(duì)銀腺楊施加同樣的技術(shù)處理流程，具體操作人員不同、材料的取樣時(shí)間不同或培養(yǎng)的環(huán)境條件不同時(shí)，其處理結(jié)果存在顯著差異，表明僅僅通過時(shí)間控制的風(fēng)險(xiǎn)性較大，更不可能拓展到楊屬植物及其以外的植物種。因此，解決授粉后施加秋水仙堿溶液處理誘導(dǎo)植物三倍體的細(xì)胞學(xué)時(shí)期以及相關(guān)技術(shù)問題，形成有效的三倍體誘導(dǎo)技術(shù)支撐體系，對(duì)于實(shí)現(xiàn)授粉后施加秋水仙堿處理誘導(dǎo)銀腺楊三倍體的穩(wěn)定性和高效率，以及將該方法引入其它楊樹或其它植物的三倍體誘導(dǎo)等具有重要的實(shí)際價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和效率更高的選育植物三倍體的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種誘導(dǎo)植物胚囊染色體加倍選育植物三倍體的方法，包括對(duì)發(fā)育至適宜時(shí)期的植物雌花序進(jìn)行授粉，對(duì)授粉后一定時(shí)期的雌花施加秋水仙堿溶液進(jìn)行處理，用清水沖洗解除處理，果序管理，收獲種子，播種育苗，染色體檢測(cè)等步驟，其中，所述的授粉是指當(dāng)植物雌花序處于最佳授粉時(shí)期進(jìn)行授粉；所述的處理是指當(dāng)植物雌配子處于二核與四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)(更優(yōu)選為四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi))，施加0.10.6%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。上述選育植物三倍體的方法，所述的植物優(yōu)選為楊屬(尸opw/M)植物。作為本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案，具體如下一種誘導(dǎo)楊樹胚囊染色體加倍選育三倍體的方法，包括對(duì)發(fā)育至適宜時(shí)期的楊樹雌花序進(jìn)行授粉，對(duì)授粉后一定時(shí)期的雌花施加秋水仙堿溶液進(jìn)行處理，用清水沖洗解除處理，果序管理，收獲種子，播種育苗，染色體檢測(cè)等步驟，其中，所述的授粉是當(dāng)楊樹雌花序符合下述條件時(shí)進(jìn)行授粉在體視顯微鏡下觀察雌蕊柱頭表面充分展開，乳突細(xì)胞發(fā)達(dá)；用聯(lián)苯胺-過氧化氫染色后柱頭變藍(lán)并有大量氣泡產(chǎn)生；所述的處理是指當(dāng)楊樹雌配子的胚囊發(fā)育處于二核與四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期(即距最佳授粉時(shí)期時(shí)授粉后1296h)內(nèi)，施加0.10.6%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。上述方法中，優(yōu)選的，所述的處理是指當(dāng)楊樹雌配子的胚囊發(fā)育處于四核胚囊為主的時(shí)期(即距最佳授粉時(shí)期時(shí)授粉后5466h)內(nèi)，施加0.30.5%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。其中，所述的四核胚囊為主是指四核胚囊的數(shù)量高于單核、二核或八核胚囊的數(shù)量。所述的楊樹母本優(yōu)選為毛新楊(尸opw/wtomewtoMfxP^Z/eawa)、銀腺楊(i^a〃axPg/(3"c/w/ora)、銀毛楊(i3.fl/6ax戶,omewtosa)、響葉楊(/!a^few/;70i/wMazim)、小青楊(■P/weMi/o-w'mom'/Kitag.)或哲弓l3號(hào)楊(P/we"c/os/mom7xJR-w/gravar.lica)，更優(yōu)選是哲弓l3號(hào)楊(/^wei^/o-w'附o""xp"/gravar.lica)為楊豐對(duì)母本；所述的楊樹父本優(yōu)選以毛白楊(Pto附e"to^)、口向卩十楊(Mazim)、北京楊(Ppjra/mV/flfcx/!ca^ay(2"acv.Beijingensis，)、小青楊(/^m^/。-Wm婦YKitag.)等為父本，更優(yōu)選為北京豐湯(i^yra附zV/afe:x/^c"Aa少""acv.Beijingensis，)為楊豐對(duì)父本。對(duì)于如何確定植物雌花序是否處于最佳授粉時(shí)期，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過觀察柱頭的形態(tài)再結(jié)合一些本領(lǐng)域的常規(guī)方法從而可以判定目標(biāo)植物的雌花序是否處于最佳授粉時(shí)期。至于如何確定植物雌配子的胚囊發(fā)育是否處于單核胚囊向八核成熟胚囊發(fā)育的時(shí)期或四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)，可通過常規(guī)切片等方法進(jìn)行判定或確認(rèn)，這些方法或技術(shù)均為本領(lǐng)域人員所習(xí)知或熟練掌握。本發(fā)明選育植物三倍體的方法明確設(shè)置以最佳授粉時(shí)期為實(shí)施誘導(dǎo)胚囊染色體加倍處理的起始參照點(diǎn)，在柱頭發(fā)育到最佳授粉時(shí)期時(shí)，適時(shí)授粉，并進(jìn)一步確定雌花發(fā)育至四核胚囊距最佳授粉時(shí)期的時(shí)間差，更為精確的控制胚囊染色體加倍的處理時(shí)間，可增加授粉后施加秋水仙堿處理誘導(dǎo)植物胚囊染色體加倍的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，提高三倍體的誘導(dǎo)效率，并且還可以節(jié)約處理用的化學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)材料等。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)當(dāng)指出，這些實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的例證，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。具體實(shí)施方式實(shí)施例用毛新楊(尸o—w,麵e"toyafxPZ)fl〃efl"fl)、銀腺楊(尸.fl〃"xpg/朋(/w/o(3)、銀毛楊(戶.fl/6ax_pto附ewtora)、響葉楊(_Pa^/e"http://od"Mazim)、小青楊(P/wei/c/o-Wmom./Kitag.)、哲弓|3號(hào)楊(Z^wewJo-w'mo""xPm'gravar.lica)等為母本，以毛白楊(/^omewtosa)、卩向葉楊Mazim)、(北京楊(/!/jram/i/afcx/lca^/a[y朋(2cv.Beijingensis，)、小青楊(尸.戸eiw/o-Wmom'ZKitag.)等為父本，采用對(duì)處于最佳授粉時(shí)期的雌花序進(jìn)行授粉后，通過常規(guī)切片觀察雌配子的胚囊發(fā)育，雌配子的胚囊為二核胚囊與四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)(距最佳授粉時(shí)期時(shí)授粉后1296h)用0.30.5%秋水仙堿溶液浸泡處理雌花序630h，三倍體得率介于30%70%之間。以哲引3號(hào)楊x北京楊為例(表1)，哲引3號(hào)楊雌花序的最佳授粉時(shí)期為體視顯微鏡下觀察雌蕊柱頭表面充分展開，乳突細(xì)胞發(fā)達(dá)，用聯(lián)苯胺-過氧化氫染色后柱頭變藍(lán)并有大量氣泡產(chǎn)生等；在哲引3號(hào)楊達(dá)到最佳授粉時(shí)期時(shí)授粉，授粉后通過常規(guī)切片觀察雌配子的胚囊發(fā)育，當(dāng)雌配子的胚囊位于二核胚囊與四核胚囊的時(shí)期內(nèi)(2496h)施加0.30.5%秋水仙堿溶液浸泡處理雌花序630h;由于哲引3號(hào)楊胚囊發(fā)育的不同步性，實(shí)驗(yàn)各處理均能得到了一定數(shù)量的三倍體植株，其中尤以距最佳授粉時(shí)期授粉后四核胚囊時(shí)期為主(距最佳授粉時(shí)期時(shí)授粉之后5466h)時(shí)施加處理誘導(dǎo)三倍體的效果最好，約占獲得的三倍體總數(shù)的2/3，三倍體得率最高達(dá)66.7%。表1授粉后施加秋水仙堿處理誘導(dǎo)哲引3號(hào)楊x北京楊三倍體及其與胚囊發(fā)育關(guān)系統(tǒng)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種誘導(dǎo)植物胚囊染色體加倍選育植物三倍體的方法，包括對(duì)發(fā)育至適宜時(shí)期的植物雌花序進(jìn)行授粉，對(duì)授粉后一定時(shí)期的雌花施加秋水仙堿溶液進(jìn)行處理，用清水沖洗解除處理，果序管理，收獲種子，播種育苗，染色體檢測(cè)等步驟，其特征在于所述的授粉是指當(dāng)植物雌花序處于最佳授粉時(shí)期進(jìn)行授粉；所述的處理是指當(dāng)植物雌配子發(fā)育處于二核與四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)，施加0.1～0.6％的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。2、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的處理是指當(dāng)植物雌配子的發(fā)育處于四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)，施加0.30.5%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。3、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的植物是楊屬(Popw/w)植物。4、一種誘導(dǎo)楊樹胚囊染色體加倍選育三倍體的方法，包括對(duì)發(fā)育至適宜時(shí)期的楊樹雌花序進(jìn)行授粉，對(duì)授粉后一定時(shí)期的雌花施加秋水仙堿溶液進(jìn)行處理，用清水沖洗解除處理，果序管理，收獲種子，播種育苗，染色體檢測(cè)等步驟，其特征在于所述的授粉是當(dāng)楊樹雌花序符合下述條件時(shí)進(jìn)行授粉在體視顯微鏡下觀察雌蕊柱頭表面充分展開，乳突細(xì)胞發(fā)達(dá)；用聯(lián)苯胺-過氧化氫染色后柱頭變藍(lán)并有大量氣泡產(chǎn)生；所述的處理是指楊樹雌配子的胚囊發(fā)育處于二核與四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)，施加0.10.6%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。5、按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述的處理是指當(dāng)楊樹雌配子發(fā)育處于四核胚囊占多數(shù)的時(shí)期內(nèi)，施加0.30.5%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時(shí)。6、按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述的楊樹母本選自毛新楊(Po/^/mZ謹(jǐn)ewtosflxP6a〃e朋a)、銀腺楊(尸a〃flx尸g/a"^/w/oya)、銀毛楊(i3.a腸xptomewtoya)、響葉楊(Pflcfew/pod"Mazim)、小青楊(P/wet^/o-57,mo""Kitag.)或哲弓l3號(hào)楊；所述的楊樹父本選自毛白楊(i^ome"towz)、響葉楊(i^tfe"/;(^"Mazim)、北京楊(i^pyraim/c/a/^x^ca^a_yawacv.Beijingensis，)或,J、青豐湯(/^wei^/o-w'wzcwzYKitag.)。7、按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述的楊樹母本為哲引3號(hào)楊(^P/wet^/cKS7'附o肌7xi^var.lica)，豐湯禾對(duì)父本是;l匕京豐湯(/^pyra^mWafo1x_p.cfl^a_yawacv.Beijingensis，)。全文摘要本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)植物胚囊染色體加倍選育植物三倍體的方法，包括對(duì)植物雌花序授粉，用秋水仙堿進(jìn)行處理，解除處理，果序管理，收獲種子，播種育苗，染色體檢測(cè)等步驟，其中，所述的授粉是當(dāng)植物雌花序處于最佳授粉時(shí)期進(jìn)行授粉；所述的處理是植物雌配子的胚囊發(fā)育處于由單核向八核發(fā)育的時(shí)期內(nèi)，施加秋水仙堿處理雌花。本發(fā)明方法明確設(shè)置以最佳授粉時(shí)期為實(shí)施誘導(dǎo)胚囊染色體加倍處理的起始參照點(diǎn)，在柱頭發(fā)育到最佳授粉時(shí)期時(shí)適時(shí)授粉，并進(jìn)一步確定雌花發(fā)育至四核胚囊距最佳授粉時(shí)期的時(shí)間差，可以精確的控制胚囊染色體加倍的處理時(shí)間，從而增加胚囊染色體加倍的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，提高三倍體的誘導(dǎo)效率，節(jié)約化學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)材料。文檔編號(hào)A01H1/06GK101147465SQ20071006471公開日2008年3月26日申請(qǐng)日期2007年3月23日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者康向陽,張平冬,李艷華,君王申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)