專利名稱：離子注入誘變甜菜高糖突變體的獲得及其驗(yàn)證技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物遺傳育種及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種利用離子注入誘變甜菜獲得高糖突變體及DNA分子驗(yàn)證技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國在80年代中期由中國科學(xué)院等離子體物理研究所余增亮研究員等一批科技工作者開創(chuàng)的新的研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)了離子注入生命體的生物學(xué)效應(yīng)將各種不同離子注入細(xì)胞內(nèi)，通過電能質(zhì)的共同作用，不僅可以影響細(xì)胞的生理功能，更重要的是它可以使細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變；由于能量的作用和質(zhì)量的摻雜，會(huì)形成大量的自由基，能夠造成生命細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA氫鍵斷裂、雙鏈分開、染色體畸變等，從而誘導(dǎo)和激發(fā)細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù)和重組作用，導(dǎo)致生物體發(fā)生變異。
離子注入作物改良和生物效應(yīng)研究，是物理學(xué)和生物學(xué)相結(jié)合的新興的交叉學(xué)科，用離子注入對(duì)作物種子進(jìn)行離子束激發(fā)和誘變，可獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將預(yù)期的受控離子注入遺傳物質(zhì)某一薄層內(nèi)，通過能量交換、離子摻雜過程，引起基因突變和重組，在新的基礎(chǔ)上穩(wěn)定表達(dá)，以達(dá)到作物改良、獲得優(yōu)良品種的目的，這是一條提高作物產(chǎn)量、改進(jìn)品質(zhì)和抗性的行之有效的新途徑。近年來中國科學(xué)院等離子體物理研究所、安徽農(nóng)學(xué)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)等已將此技術(shù)應(yīng)用于水稻、棉花等育種領(lǐng)域，并有新品系通過鑒定并在生產(chǎn)上已推廣600萬畝，取得巨大經(jīng)濟(jì)效益。
中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用離子束介導(dǎo)法將碳4循環(huán)紫玉米的總DNA導(dǎo)入水稻品種獲得了一批穩(wěn)定遺傳的變異株系，不僅根系發(fā)達(dá)，而且在莖干等部位表現(xiàn)出供體玉米的紫色性狀，其中農(nóng)藝性狀較好的8個(gè)株系的光合速率平均比早秈213提高84％。河南省離子束生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用離子束介導(dǎo)法將兩個(gè)大豆品種的總DNA分別導(dǎo)入兩個(gè)小麥栽培品種獲得了兩個(gè)蛋白質(zhì)含量分別為20.46％和25.35％的高蛋白小麥株系。
實(shí)踐證明，離子束介導(dǎo)外源DNA的遺傳轉(zhuǎn)化為遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣物種間的基因交流提供了一種途徑，為實(shí)現(xiàn)多基因的轉(zhuǎn)移和協(xié)調(diào)表達(dá)提供了可能性。
目前，由于諸多因素造成甜菜含糖量和產(chǎn)量下降，病害嚴(yán)重，為此急需解決提高甜菜產(chǎn)量、含糖量和抗病能力問題，解決高糖品種合理布局，但因甜菜育種種質(zhì)資源缺乏。甜菜育種通常通過雜交轉(zhuǎn)育產(chǎn)生新的基因源，存在周期太長，在沒有基因來源的情況下，無法獲得新的甜菜創(chuàng)新材料，這制約著甜菜育種的發(fā)展。在甜菜理化誘變領(lǐng)域，曾先后應(yīng)用航天、鈷60等誘變方法，但效果均不明顯。離子注入技術(shù)具有定向性、多樣性及安全性，有較高的突變率和較寬的突變譜。作為一種新的誘變?cè)?，在棉花、水稻、小麥、番茄、谷子等作物育種應(yīng)用上已取得了有效的進(jìn)展。在生物學(xué)研究領(lǐng)域中，如何優(yōu)化甜菜等經(jīng)濟(jì)作物種子，通過探討離子束作為誘變?cè)矗固鸩朔N子內(nèi)部發(fā)生生理突變，提高突變酶活化，促使基因活化形成變異遺傳具有重要的意義。
DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)不僅可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因時(shí)的識(shí)別難問題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。歐美等國近年都投入巨資開展這方面的工作。已經(jīng)鑒定到水稻、小麥、玉米、棉花、大豆等作物的一些農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種也取得進(jìn)展。對(duì)于探討離子束誘變甜菜后獲得的親本資源，通過分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證通過離子束誘變獲得親本資源的特性具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前國內(nèi)外尚未展開對(duì)甜菜親本用離子束誘變技術(shù)進(jìn)行處理獲得相應(yīng)親本資源的現(xiàn)狀。本發(fā)明將離子注入誘變技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)有效地結(jié)合應(yīng)用在甜菜中，獲得甜菜高糖突變體親本基因源。
本發(fā)明提供了一種甜菜純合自交系7202親本材料，是一種多胚種子。
本發(fā)明還提供了一種利用離子注入誘變甜菜7202親本材料獲得優(yōu)良高糖突變體S系-2材料及其驗(yàn)證技術(shù)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，甜菜(BEta Vulgaris L)屬藜科(Chenopodiaceae)甜菜屬，是兩年生作物，栽培甜菜分為四個(gè)變種，分別為糖用、飼用、食用和葉用，根據(jù)甜菜類型的多樣性和植株形態(tài)、細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)特性所表現(xiàn)出的明顯差異，將其又分類為二倍體、單胚或多胚和花粉可育；四倍體、單胚或多胚和花粉可育。
具體的，本發(fā)明提供的甜菜7202親本材料，是經(jīng)發(fā)明人多年多點(diǎn)篩選出的穩(wěn)定的純合自交系、多胚種子、花粉可育，四倍體(4n＝36)，一般含糖率在16-17.3％，塊根產(chǎn)量3538kg/畝，生育期在185天左右，塊根根型為錐型，最大根莖為13cm左右(所在位置在塊根的1/4處)，根皮白色，根肉白色，根溝深淺中等，葉叢直立，葉片呈犁鏵型，葉緣中波，葉片綠色，葉叢高度63cm，葉片皺褶，千粒重30g，種株緊密型，花藥黃色。該自交系具有幼苗頂土能力強(qiáng)、易保苗、含糖率較高、適應(yīng)性較強(qiáng)的特點(diǎn)，是我們多年育種工作中選用的骨干自交系，其過氧化物酶同工酶譜圖和RAPD核酸電泳圖參見附圖1、2。
本發(fā)明提供的甜菜高糖突變體的獲得包括以下幾個(gè)步驟(1)、通過不同的離子注入方式、能量和劑量應(yīng)用甜菜的試驗(yàn)，確定了獲得優(yōu)良甜菜高糖突變體的最佳離子注入方式、能量和劑量的具體方案；(2)、通過細(xì)胞學(xué)、過氧化物同工酶生理檢測(cè)和RAPD分子生物學(xué)的檢測(cè)、驗(yàn)證獲得甜菜親本資源屬高糖突變體。
本發(fā)明具體提供的一種利用離子注入誘變甜菜獲得優(yōu)良高糖突變體S系-2材料，是利用如上提供的純合自交系7202親本材料，經(jīng)過上述提供的步驟而獲得甜菜高糖突變體。獲得的甜菜高糖突變體是四倍體(4n＝36)，含糖率為16.49-17.57％，較對(duì)照提高0.27-0.90度，塊根產(chǎn)量3928kg/畝，生育期在185天左右，塊根根型為錐型，最大根莖為15cm左右(所在位置在塊根的1/5處)，根皮白色，根肉白色，根溝深淺中等，葉叢直立，葉片呈犁鏵型，葉緣中波，葉片綠色，葉叢高度59.6cm，葉片皺褶，千粒重30.7g，種株緊密型，花藥杏黃色，該突變體具有幼苗頂土能力強(qiáng)、易保苗、含糖率高、抗旱性強(qiáng)的特點(diǎn)，其過氧化物同工酶譜圖和RAPD核酸電泳圖參見附圖1、2。
本發(fā)明具體通過選用甜菜純合自交系7202親本材料多粒和單粒干種子。以能量選用為25-70Kev的N+離子進(jìn)行甜菜種子注入，其注入劑量為2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40-60次。多粒種進(jìn)行破殼和未破殼處理。處理后的種子裝入紗布袋，用20℃溫水浸種18小時(shí)，人工精量點(diǎn)播。生育期觀察記載形態(tài)變化，通過綜合觀測(cè)其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、葉片過氧化物酶同工酶。收獲時(shí)測(cè)定春播、夏播母根長、寬、重及糖度。并于片真葉期取第五片葉進(jìn)行觀察低劑量離子注入對(duì)甜菜植株酶性變化及酶帶出現(xiàn)情況，并進(jìn)行同工酶和RAPD分子生物學(xué)的檢測(cè)。
本發(fā)明具體通過離子注入誘變甜菜7202親本材料，將在離子的一定能量范圍，按不同注入方式、不同注入劑量，并且選用不同類型的離子對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行多種樣本的注入試驗(yàn)，本發(fā)明具體選用不同的N+能量20Kev、25Kev、30Kev、35Kev、40Kev、45Kev、50Kev、55Kev、60Kev、65Kev、70Kev、75Kev；選用注入不同的劑量2×1016N+/cm2、3×1016N+/cm2、4×1016N+/cm2、5×1016N+/cm2、6×1016N+/cm2、7×1016N+/cm2、8×1016N+/cm2；選用不同脈沖次數(shù)30、35、40、45、50、55、60、65、70分別注入誘變甜菜7202親本材料。研究和分析以上不同作法對(duì)甜菜的生物學(xué)特性及品質(zhì)產(chǎn)生的影響和誘變效果，確定離子束注入的方式、能量范圍、注入劑量。確定了甜菜親本材料在離子注入作用下的生物效應(yīng)和作物改良的關(guān)系。
本發(fā)明設(shè)置了“離子束一次處理試驗(yàn)”、“離子束二次處理試驗(yàn)”和“離子束親本材料處理試驗(yàn)”及采種試驗(yàn)，先后進(jìn)行了250個(gè)處理項(xiàng)次，取得了3670個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過研究分析，證明了通過利用離子注入誘變甜菜可獲得高糖突變體。
本發(fā)明獲得高糖突變體具體的步驟如下(1)、注入能量、劑量、方式實(shí)驗(yàn)。首先選用較為成熟的N+離子在離子的低能范圍，7202(多粒)、97-S1(單粒)、7202-1(多粒)、新寧13等親本材料，按連續(xù)或間斷不同的脈沖方式、不同的劑量進(jìn)行多種的注入試驗(yàn)。通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)，第一次篩選劑量、能量范圍的分析驗(yàn)證，證明了采用N+離子的25Kev-70Kev，連續(xù)脈沖或間斷脈沖方式，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2劑量注入甜菜品種可獲得高糖甜菜親本材料S系-2。
(2)、通過田間對(duì)比種植試驗(yàn)，確定最佳離子注入能量、劑量和方式。對(duì)多個(gè)處理樣本安排相同環(huán)境條件的比較種植試驗(yàn)，從播種到收獲詳細(xì)記載處理材料的農(nóng)藝性狀和生物學(xué)性狀，對(duì)品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)試分析、以確定最佳的35Kev N+離子，注入方式為連續(xù)脈沖，注入能量為4.0×1016N+/CM2、脈沖次數(shù)為40次或注入能量為6.0×1016N+/CM2、脈沖次數(shù)為60次。
(3)、通過離子注入誘變優(yōu)良甜菜品種前后的變化，通過獲得高糖突變體親本材料與對(duì)照樣對(duì)比進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、過氧化物同工酶生理檢測(cè)和RAPD分子生物學(xué)的檢測(cè)，逐步純化有益變異株系，獲得的優(yōu)良高糖突變體親本材料S系-2。具體通過葉片過氧化物酶同工酶檢測(cè)，尋找離子注入生物體后，產(chǎn)生的生物效應(yīng)和作物改良之間的關(guān)系，結(jié)合品質(zhì)檢測(cè)，篩選有突出誘變效果的處理材料，將母根保存，第二年收獲的種子分別進(jìn)行一年生種植，品質(zhì)檢測(cè)和處理種子的繁殖保存，篩選具有優(yōu)異性狀的親本材料，證實(shí)了獲得的最優(yōu)高糖突變體親本材料S系-2。
(4)、通過試驗(yàn)驗(yàn)證，通過甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的高糖突變體不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。
本領(lǐng)域所熟知，DNA分子標(biāo)記(DNA Molecular markers)是物種遺傳變異在DNA水平上的直接反映，與傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記相比，它具有既不受生物的組織、器官、細(xì)胞類型及發(fā)育時(shí)期的影響，且數(shù)量豐富，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而廣泛地在資源與育種研究中得到利用。DNA是形態(tài)學(xué)、同工酶、核型特征的遺傳基礎(chǔ)，其位點(diǎn)和數(shù)量十分豐富，是準(zhǔn)確進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定的依據(jù)。
本發(fā)明以離子注入誘變技術(shù)獲得的甜菜高糖突變體S系-2和未做誘變處理的材料7202為對(duì)照材料，提取DNA并進(jìn)行RAPD分析，選取800條RAPD隨機(jī)引物對(duì)S系-2和對(duì)照組7202進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，S系-2和對(duì)照之間在DNA水平上存在差異。從800條隨機(jī)引物中篩選到57條在S系-2和對(duì)照中存在差異，存在差異的引物占所用引物數(shù)的5.6％，表明S系-2和對(duì)照組相似性很高。本發(fā)明以離子注入誘變獲得的高糖突變體和未經(jīng)誘變處理的對(duì)照材料7202，將為構(gòu)建分子標(biāo)記作圖群體，定位與早熟性狀相關(guān)基因奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。
本發(fā)明充分利用新疆地區(qū)光照充足地域廣的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)室與田間試驗(yàn)交替進(jìn)行。
本發(fā)明經(jīng)過多年的試驗(yàn)研究表明，離子注入對(duì)甜菜有明顯的誘變效果，并與其它理化誘變效應(yīng)有明顯的區(qū)別，離子注入甜菜種子后出現(xiàn)高糖變異性狀。
N+注入甜菜葉片中過氧化物酶同工酶的動(dòng)態(tài)研究表明，在單粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)增多，酶的著色逐漸變淺。而在多粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)和注入劑量的增多，酶的著色逐漸變深，其糖度和其它性狀值都有明顯增加。說明N+注入引起植物過氧化物酶同工酶活性發(fā)生變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素改變。分子圖譜也相應(yīng)出現(xiàn)了與大田地對(duì)照不同的譜帶，證明了其種子遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，也證明了離子注入對(duì)甜菜獲得高糖突變體具有廣泛的大田實(shí)用性。
本發(fā)明經(jīng)過多年的試驗(yàn)研究表明，離子注入對(duì)甜菜有明顯的誘變效果，并與其它理化誘變效應(yīng)有明顯的區(qū)別，離子注入甜菜種子后出現(xiàn)高糖變異性狀。
將離子注入后產(chǎn)生效果的甜菜種子通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、葉片過氧化物酶同工酶檢測(cè)，田間農(nóng)藝性狀觀測(cè)及品質(zhì)測(cè)定，證實(shí)篩選出有優(yōu)異突變性狀的親本材料。
利用RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增S系-2和對(duì)照組7202的DNA，經(jīng)多次重復(fù)，得出RAPD技術(shù)在甜菜研究中具有一定的穩(wěn)定性，可以作為構(gòu)建連鎖遺傳圖譜的分子標(biāo)記。
作為一種新的誘變?cè)?，離子注入誘變已在多種作物上取得成效。甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的高糖突變體，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。表明離子注入誘變確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。
通過本發(fā)明的技術(shù)方案，證明了離子注入對(duì)甜菜有明顯的誘變效果，并與其它理化誘變效應(yīng)有明顯的區(qū)別，有益效果明顯
1、離子注入甜菜種子后出現(xiàn)高糖變異性狀，獲得高糖親本創(chuàng)新材料S系-2，經(jīng)過連續(xù)兩代兩次處理甜菜種子，含糖率增加和產(chǎn)量增加這兩個(gè)性狀的變異較突出，獲得高糖親本基因源。
2、首次開展了離子注入甜菜種子誘變親本資源材料的研究，并分析研究了離子注的最佳能量、劑量，為作物改良、創(chuàng)新親本基因源提供了理論依據(jù)。
3、離子束注入與生物體相互作用和傳統(tǒng)的電離輻射(α，β，η，ρ，γ射線等)、離子束注入在高激發(fā)性、劑量集中性和可控性方面與其它誘變方法相比都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，使誘變的種子損傷輕、成苗率高、突變率高、突變譜廣等優(yōu)點(diǎn)，可獲得不同遺傳基礎(chǔ)的突變材料，使這些突變材料直接在育種上應(yīng)用和操作以獲得理想的新基因型。
4、甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的高糖突變體，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。表明離子注入誘變確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。
5、N+注入甜菜種子后當(dāng)代的輻照損傷表現(xiàn)較為明顯，種子的萌發(fā)受到抑制，目測(cè)出苗率明顯較對(duì)照低。7202處理后，葉片數(shù)、葉長、葉片鮮重有明顯增加，以葉片鮮重尤為突出，從性狀調(diào)查結(jié)果表明，以注入劑量4×1016、脈沖次數(shù)40次或注入劑量6×1016、脈沖次數(shù)60次對(duì)葉片生長勢(shì)和生長量促進(jìn)最大。
6、N+注入引起植物過氧化物酶同工酶活性發(fā)生變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素改變。在單粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)增多，酶的著色逐漸變淺；而在多粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)和注入劑量的增多，酶的著色逐漸變深。無論是單粒種處理或多粒處理，都有雙帶增加的現(xiàn)象，其糖度和其它性狀值都有明顯增加。說明同工酶活性和酶譜的改變對(duì)作物育種具有一定的參考價(jià)值，但也有酶帶未發(fā)生變化的有益變異在甜菜處理中出現(xiàn)。
7、首次采用連續(xù)兩代兩次處理，獲得含糖率增加、產(chǎn)量也增加的突變性狀，并獲得綜合性狀優(yōu)良的親本材料，產(chǎn)糖量較對(duì)照分別增加8.22％和50.4％。連續(xù)兩代兩次處理方法在其它作物研究中尚未出現(xiàn)。
8、離子注入處理甜菜種子，獲得的M2代親本材料普遍表現(xiàn)含糖率增加。增加糖度在0.27-0.9度，含糖率是通過常規(guī)育種不易解決的一個(gè)主要經(jīng)濟(jì)性狀。表明，離子注入處理糖度的變化是一種有益變異。


圖1為高糖突變體甜菜的葉片過氧化物酶譜帶。
圖2為RAPD隨機(jī)引物篩選擴(kuò)增條帶，圖中的1、3、5、7、9、11、13、15為離子注入誘變高糖突變體S系-2，2、4、6、8、10、12、14、16為對(duì)照7202；圖中Mmaker引物順次為W5 Q4 Ai20 N18 AL20 AM16 AM20 J1。
具體實(shí)施例方式
下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量百分比。
本發(fā)明中涉及到概念簡(jiǎn)要解釋如下RAPDRandom Amplified PolymorphicDNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；DNA脫氧核糖核酸；M1為純合自交系群體自交繁殖第一代；M2為純合自交系群體自交繁殖第二代。
實(shí)施例1離子束一次處理7202甜菜親本的M1代鑒定試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料參試株號(hào)9個(gè)編號(hào)均為7202、97-S1系列，本試驗(yàn)具體包括97-70、97-71、97-72、97-73、97-74、97-75、97-76、97-77、97-78(包括多粒和單粒)，采用N+離子的25Kev-70Kev，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2劑量注入這些試驗(yàn)親本材料后，小區(qū)長6米，3行區(qū)，行距50厘米，穴距20厘米，重復(fù)3次，每穴播2-3粒。每年7月中旬調(diào)查各個(gè)處理的葉叢高度、葉數(shù)、葉片的長和寬等生理指標(biāo)。
二、試驗(yàn)結(jié)果參見表1、表2單粒種鑒定材料中，每年的7月中旬田間調(diào)查3個(gè)處理的各項(xiàng)生理指標(biāo)低于對(duì)照；但含糖率3個(gè)處理均比對(duì)照分別提高1.04度、1.04度、0.9度。
多粒種鑒定材料中，每年的7月中旬田間調(diào)查，有3個(gè)處理的一些生理指標(biāo)高于對(duì)照，但對(duì)產(chǎn)量和產(chǎn)糖量影響不大；含糖率5個(gè)處理中3個(gè)處理高于對(duì)照，97-70、97-74、97-77含糖率分別高于對(duì)照0.28度、0.55度、0.90度。從同工酶檢測(cè)酶帶上，多粒種酶帶都發(fā)生明顯變化。
表1 離子束一次處理7202甜菜親本的M1代鑒定試驗(yàn)

表2 離子束一次處理M1代鑒定試驗(yàn)


實(shí)施例2離子注入在甜菜育種中的誘變?cè)囼?yàn)材料與方法1.供試材料為甜菜優(yōu)良親本材料為7202和97-S1干種子，以能量分別為20Kev、25Kev、30Kev、35Kev、40Kev、45Kev、50Kev、55Kev、60Kev、65Kev、70Kev、75Kev、80Kev不同的N+注入甜菜種子，選用注入分別為2×1016N+/cm2、3×1016N+/cm2、4×1016N+/cm2、5×1016N+/cm2、6×1016N+/cm2、7×1016N+/cm2、8×1016N+/cm2不同的劑量，脈沖次數(shù)分別選用為30、35、40、45、50、55、60、65、70次。每處理3行，行長6米，株行距50×20cm，間比排列。
2.將M1代種子進(jìn)行田間觀察鑒定。參試材料9份，小區(qū)長6米，3行區(qū)，株行距50×20厘米，重復(fù)三次，隨機(jī)區(qū)組。
3.將3份7202和97-S1一年生M1種子以能量按上述設(shè)定不同的N+進(jìn)行了二次處理，注入劑量和脈沖次數(shù)同上。每份材料4個(gè)處理，共12份處理材料，設(shè)對(duì)照、行長、間距同上，間比排列。
生育期觀察記載形態(tài)變化，收獲時(shí)測(cè)定產(chǎn)量、含糖率、產(chǎn)糖量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析離子注入甜菜種子M1種子收獲時(shí)，發(fā)現(xiàn)S系-2二代M2進(jìn)行動(dòng)態(tài)含糖積累狀況測(cè)定結(jié)果表明，離子注入處理純合自交系7202親本材料，獲得S系-2的M2代親本材料普遍表現(xiàn)含糖率增加。增加糖度在0.27-0.9度，含糖率是通過常規(guī)育種不易解決的一個(gè)主要經(jīng)濟(jì)性狀。表明，離子注入處理糖度的變化是一種有益變異。
本試驗(yàn)及相關(guān)系列試驗(yàn)表明，通過按照不同的N+離子能量，不同的注入劑量，不同的脈沖次數(shù)注入甜菜進(jìn)行對(duì)比分析獲得的親本材料。確定以N+離子的能量為25-70Kev，注入劑量為2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40-60次注入甜菜可明顯獲得甜菜早熟突變體。
實(shí)施例3二次離子處理7202甜菜親本材料試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料試驗(yàn)材料將第一年第一次處理后收獲的種子繁殖后今年再次處理，材料共3份，每份材料4次處理，采用N+離子的25Kev-70Kev，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2劑量注入這些試驗(yàn)親本材料后，共15個(gè)(包括對(duì)照)，編號(hào)均為7202系列，本試驗(yàn)具體包括S455-S1a-69，每個(gè)材料行長6米，1行區(qū)，行距50厘米，穴播，穴距20厘米，每穴2-3粒種球，用間比法。
二、試驗(yàn)結(jié)果參見表3編號(hào)97-S1單a-65-69材料中，S1單a-66(破)處理畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)5.49％，產(chǎn)糖量比對(duì)照增產(chǎn)2.39％；S1單a-68(破)處理畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)6.71％，產(chǎn)糖量比對(duì)照提高8.22％，編號(hào)97-S1單a4個(gè)處理中含糖率比對(duì)照提高有3個(gè)處理，S1單a-67、S1單a-68、S1單a-69的含糖率分別比對(duì)照提高0.69度、0.27度、0.27度。從同工酶帶上看出，67、68、69有變化。
97-S10-60-64材料中，S10-64處理的畝產(chǎn)量和產(chǎn)糖量均比對(duì)照增產(chǎn)，畝產(chǎn)量比對(duì)照增加48.28％，產(chǎn)糖量比提高50.40％，含糖率比對(duì)照提高的處理3個(gè)，S10-62、S10-63、S10-64分別提高0.27度、0.90度、0.27度。
表3 二次離子處理試驗(yàn)

實(shí)施例4離子束親本材料處理試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料親本處理材料3個(gè)，采用N+離子的25Kev-70Kev，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2劑量注入這些試驗(yàn)親本材料后，做8次處理共26個(gè)材料(包括對(duì)照)，編號(hào)均為7202系列，本試驗(yàn)具體包括26E-28-安1-54，每個(gè)材料行長6米，1行區(qū)，行距50厘米，穴播，每穴播種2-3粒，用間比法，16葉期做同工酶檢測(cè)。參見表4。
二、試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)54E-37-45材料中畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)的處理是54E-39、54E-41、54E-42、54E-44、54E-45，其中54E-39畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)33.62％，產(chǎn)糖量比對(duì)照提高35.83％；54E-42畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)59.48％，產(chǎn)糖量比對(duì)照提高37.80％；54E-45畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)11.21％，產(chǎn)糖量比對(duì)照增產(chǎn)7.39％，54E-41和54E-44畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)0.86％和9.48％，但產(chǎn)糖量比對(duì)照減產(chǎn)7.72％和9.16％。
含糖率54E-37-45材料中含糖率比對(duì)照提高的處理是54E-39，比對(duì)照提高0.27度，從同功酶檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)編號(hào)54E-39、54E-41、54E-43、54E-44有酶帶變化。
安1-46-53材料中，畝產(chǎn)量和產(chǎn)糖量比對(duì)照增產(chǎn)的處理是安1-49畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)59.21％，產(chǎn)糖量比對(duì)照增產(chǎn)35.33％，安1-51畝產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)54.61％，產(chǎn)糖量比對(duì)照增產(chǎn)46.88％。
含糖率安1-53處理的含糖率高于對(duì)照0.56度。
表4 離子束親本材料處理試驗(yàn)

實(shí)施例5離子注入在甜菜育種中的誘變功效材料與方法1.1供試材料均為7202系列，采用N+離子的25Kev-70Kev，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2劑量注入這些試驗(yàn)親本材料后，本試驗(yàn)優(yōu)先以能量為35KevN+注入甜菜種子。每處理3行，行長6米，株行距50×20CM，間比排列。
1.2將M1代種子進(jìn)行田間觀察鑒定。參試材料9份，小區(qū)長6米，3行區(qū)，株行距50×20厘米，重復(fù)三次，隨機(jī)區(qū)組。
1.3將3份M1種子(97-S4、97-S1、97-S10)以能量為35Kev的N+進(jìn)行了二次處理，注入劑量和脈沖次數(shù)同上。每份材料4個(gè)處理，共12份處理材料，設(shè)對(duì)照、行長、間距同上，間比排列。
生育期觀察記載形態(tài)變化，收獲時(shí)測(cè)定產(chǎn)量、含糖率、產(chǎn)糖量。
2、結(jié)果與分析2.1離子注入對(duì)M1代一年生出苗率及葉片生長的影響N+注入甜菜種子后當(dāng)代的輻照損傷表現(xiàn)較為明顯，種子的萌發(fā)受到抑制，目測(cè)出苗率明顯較對(duì)照低。97-S1處理后，隨著注入劑量與脈沖次數(shù)的增加，除葉片數(shù)有減少趨勢(shì)外，葉長、葉寬、葉片鮮重等性狀值都有明顯增加。7202處理后，葉片數(shù)、葉長、葉片鮮重有明顯增加，以葉片鮮重尤為突出，見表5，從性狀調(diào)查結(jié)果表明，以注入劑量4×1016和脈沖次數(shù)40次或注入劑量6×1016和脈沖次數(shù)60次對(duì)葉片生長勢(shì)和生長量促進(jìn)最大。
表5 離子注入對(duì)葉部的影響

2.2離子注入對(duì)M1代二年生種子的影響將N+注入處理過的兩品系共10個(gè)處理材料進(jìn)行二年生采種，調(diào)查結(jié)果表明處理材料與對(duì)照相比；種子重量較對(duì)照減輕，發(fā)芽率明顯下降，種子大小除97-S2和97-S9、97-S10三個(gè)處理的種子變小之外，其余處理的種子均增大，見表6。這種現(xiàn)象表明其輻照損傷在傳遞。離子束輻射使種子萌發(fā)能力受到抑制，可以認(rèn)為染色體損傷與細(xì)胞輻射敏感性有關(guān)，作為遺傳物質(zhì)載體的染色體畸變，可導(dǎo)致基因的缺失、重復(fù)、突變、重組等遺傳學(xué)效應(yīng)。
表6 離子注入對(duì)M1代的影響

2.3離子注入對(duì)M2代主要經(jīng)濟(jì)性狀的影響在97-S1鑒定材料中，三個(gè)處理的葉部各項(xiàng)生理指標(biāo)明顯低于對(duì)照，這是目前育種中所需的有益變異，其中97-78的葉叢高度變矮，葉數(shù)和枯葉數(shù)均減少。而7202鑒定材料中，四個(gè)處理的葉部生長生理指標(biāo)高于對(duì)照，葉叢高度生長勢(shì)旺盛，葉片數(shù)增多，地上部分生長高于對(duì)照，處理后的材料產(chǎn)量明顯低于對(duì)照，其下降幅度在16.91％～32.49％，但含糖率普通增加，增加幅度在0.28～1.04個(gè)糖度，以97-78處理綜合性狀最優(yōu)，雖然產(chǎn)量下降16.91％，產(chǎn)糖量下降12.19％，但含糖增加0.9個(gè)糖度。含糖率是通過常規(guī)育種不易解決的一個(gè)主要經(jīng)濟(jì)性狀，為此，離子注入處理糖度的變化是一種有益變異，參見表7。
在田間觀察鑒定的同時(shí)，進(jìn)行了葉片過氧化物酶同工酶的分析結(jié)果表明，97-73和97-75有明顯的酶帶變化。
表7 離子注入對(duì)M2代的影響

2.4二次離子處理注入對(duì)主要經(jīng)濟(jì)性狀的影響通過表8可以看出，對(duì)M1代甜菜種子再次處理后，有2個(gè)處理的產(chǎn)量與含糖率出現(xiàn)了明顯的變化，97-S1單a-68較對(duì)照增產(chǎn)6.71％，含糖率增加0.27個(gè)糖度，產(chǎn)糖量增加8.22％，97-S10-64處理綜合性狀最為突出，較對(duì)照增產(chǎn)48.28％，含糖率增加0.27個(gè)糖度，產(chǎn)糖量增加50.4％。其余處理有6個(gè)處理的含糖率較對(duì)照增加，有一個(gè)處理的產(chǎn)量和產(chǎn)糖率較對(duì)照增加。
葉片過氧化物酶同工酶檢測(cè)的12個(gè)處理中，97-S1單a-68出現(xiàn)酶帶變化，編號(hào)57、58、61、62、67、68、69出現(xiàn)酶帶變化，其余未發(fā)生變化，即過氧化物酶同工酶活性發(fā)生變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素改變。
表8 二次離子注入對(duì)產(chǎn)量性狀的影響

3、結(jié)論1.1對(duì)M1代甜菜種子再次處理后，有2個(gè)處理的產(chǎn)量與含糖率出現(xiàn)了明顯的變化多7202、97-S1(單)較對(duì)照增產(chǎn)6.71％，含糖率增加0.27個(gè)糖度，產(chǎn)糖量增加8.22％；7202處理綜合性狀最為突出，較對(duì)照增產(chǎn)48.28％，含糖率增加0.27度，產(chǎn)糖量增加50.4％。其余有6個(gè)處理的含糖率較對(duì)照增加，有一個(gè)處理的產(chǎn)量和產(chǎn)糖率較對(duì)照增加。經(jīng)試驗(yàn)表明，經(jīng)過連續(xù)兩代兩次處理甜菜種子，增加含糖率和產(chǎn)量性狀的變異較突出。
2.2離子注入處理甜菜種子，到M2代親本材料表現(xiàn)含糖率增加處理后的材料產(chǎn)量明顯低于對(duì)照，其下降幅度在16.91％～32.49％，但含糖率普通增加，增加幅度在0.28～1.04個(gè)糖度。其中以7202處理綜合性狀最優(yōu)，雖然產(chǎn)量下降16.91％，產(chǎn)糖量下降12.19％，但含糖增加0.9個(gè)糖度。含糖率是通過常規(guī)育種不易解決的一個(gè)主要經(jīng)濟(jì)性狀，為此，離子注入處理糖度的變化是一種有益變異。
實(shí)施例6葉片中過氧化物酶、同工酶和N+注入的關(guān)系過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，它與作物的生長代謝有密切關(guān)系，從甜菜葉片的過氧化物酶譜帶的分析中，發(fā)現(xiàn)N+注入與對(duì)照的酶帶存在明顯差異。
從附圖1所示圖譜表明，以字母編號(hào)A(單)4×1016、40次，B(單)4×1016、40次，C(單)4×1016、60次，H(多)6×1016、40次，I(多)4×1016、40次，L(多破)6×1016、60次處理均多了幾條帶。在單粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)增多，酶的著色逐漸變淺。而在多粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)和注入劑量的增多，酶的著色逐漸變深。無論是單粒種處理或多粒處理，都有雙帶增加的現(xiàn)象，其糖度和其它性狀值都有明顯增加。說明N+注入引起植物過氧化物酶同功酶活性發(fā)生變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素改變。
實(shí)施例7甜菜離子注入誘變高糖突變體的RAPD分子標(biāo)記篩選1.材料甜菜離子注入誘變高糖突變體S系-2，未經(jīng)誘變的種質(zhì)材料7202、97-S1。
2.方法2.1采用本領(lǐng)域熟知的CTAB法作為甜菜RAPD分子標(biāo)記研究的DNA提取方法。
2.2PCR反應(yīng)采用常規(guī)PCR反應(yīng)程序，終反應(yīng)體積為25ul，反應(yīng)體系見表9。
表9 RAPD反應(yīng)體系中的試劑及用量

PCR擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性1min，37℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，44個(gè)循環(huán)后，在72℃條件下再延伸5min。4℃條件下保存?zhèn)溆谩?br> 2.3電泳及染色電泳條件采用1％瓊脂糖凝膠電泳；電壓3.5v/cm。溴乙錠染色，在Bio-Rad自動(dòng)凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
2.4統(tǒng)計(jì)以0、1為標(biāo)記，建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，0表示無條帶，1表示有條帶。
3結(jié)果分析3.1總DNA提取結(jié)果的檢測(cè)采用此方法其主帶整齊一致，無降解現(xiàn)象，符合進(jìn)行RAPD分析是用。
3.2RAPD隨機(jī)引物篩選以S系-2、7202為材料，采用本發(fā)明建立的的甜菜RAPD分子標(biāo)記技術(shù)體系，從800條RAPD引物中篩選出擴(kuò)增帶型有差異且清晰、穩(wěn)定的45條引物；從附圖2可以看出離子注入誘變高糖突變體S系-2和7202在用引物AL17和BD3擴(kuò)增的結(jié)果有顯著的不同，表明S系-2和7202存在著DNA水平上的差異。
3.3帶型統(tǒng)計(jì)分析利用RAPD引物對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行“指紋”分析。在相同遷移率位置上，以1、0標(biāo)記擴(kuò)增片段的有和無，形成每個(gè)材料對(duì)應(yīng)的指紋數(shù)碼。錄入EXCEL數(shù)據(jù)庫并管理，為甜菜分子標(biāo)記作準(zhǔn)備，見表10。
表10 5個(gè)RAPD引物對(duì)應(yīng)的S系-2、7202的DNA指紋

4.結(jié)論利用RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增S系-2和對(duì)照組7202的DNA，經(jīng)多次重復(fù)，得出RAPD技術(shù)在甜菜研究中具有一定的穩(wěn)定性，可以作為構(gòu)建連鎖遺傳圖譜的分子標(biāo)記。
甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的高糖突變體，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。表明離子注入誘變確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。
權(quán)利要求
1.一種甜菜純合自交系7202親本材料。
2.一種利用離子注入誘變權(quán)利要求1所述的親本材料獲得高糖突變體S系-2。
3.如權(quán)利要求2所述的甜菜高糖突變體S系-2，其特征在于，以N+離子的能量為25-70Kev，注入劑量為2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40-60次注入甜菜，獲得甜菜高糖突變體。
4.如權(quán)利要求3所述的甜菜高糖突變體S系-2，其特征在于，以N+離子的能量?jī)?yōu)選為35Kev，注入劑量為6×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為60次注入甜菜，獲得優(yōu)良甜菜高糖突變體。
5.如權(quán)利要求3所述的甜菜優(yōu)良高糖突變體S系-2，其特征在于，以N+離子的能量?jī)?yōu)選為35Kev，注入劑量為4×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40次注入甜菜，獲得優(yōu)良甜菜高糖突變體。
6.如權(quán)利要求3所述的甜菜優(yōu)良高糖突變體材料，其特征在于，甜菜種子經(jīng)過連續(xù)兩代兩次離子注入誘變處理，其高糖突變體材料含糖率和產(chǎn)量同步增加，獲得高糖親本基因源。
7.如權(quán)利要求4、5或6任意所述獲得的高糖突變體親本材料，其特征在于，通過葉片過氧化物酶同工酶檢測(cè)，結(jié)合品質(zhì)檢測(cè)，篩選有突出誘變效果的處理材料，將母根保存，第二年收獲的種子分別進(jìn)行一年生種植，品質(zhì)檢測(cè)和處理種子的繁殖保存，篩選具有優(yōu)異性狀的親本材料，逐步純化有益變異株系而獲得優(yōu)良高糖突變體親本材料。
8.一種優(yōu)良高糖突變體材料的驗(yàn)證技術(shù)，其特征在于，以N+離子注入誘變技術(shù)獲得的甜菜高糖突變體，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異，離子注入誘變甜菜引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。
全文摘要
本發(fā)明提供了甜菜純合自交系7202親本材料，并公開了一種利用離子注入誘變甜菜7202親本材料獲得高糖突變體，通過離子注入甜菜種子后的田間種植獲得高糖突變體親本材料，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析驗(yàn)證了在DNA水平存在差異，離子注入誘變甜菜確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變。本發(fā)明具體通過在甜菜作物上開展離子注入誘變，探索了離子注入甜菜種子的最佳能量和最佳劑量對(duì)雜交種、親本材料的影響，甜菜種子經(jīng)過連續(xù)兩代兩次離子注入誘變處理，其高糖突變體材料含糖率和產(chǎn)量同步增加，獲得高糖親本基因源，為甜菜產(chǎn)區(qū)合理布局選育甜菜新品種、創(chuàng)新親本材料資源開辟了一條新途徑。
文檔編號(hào)A01H1/06GK101057560SQ20071010338
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月19日
發(fā)明者王燕飛, 曾憲賢, 符子華, 劉華君, 沙紅, 張立明, 曲延英, 高衛(wèi)時(shí), 劉軍, 高文偉, 楊洪澤, 白曉山 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所