專(zhuān)利名稱(chēng)：：對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高效的蘇云金芽孢桿菌cry8H基因、蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，本發(fā)明涉及對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高毒力的cry8H基因的核苷酸序列，涉及對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高毒力的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，涉及，人工設(shè)計(jì)合成的可以在植物中表達(dá)的cry8H基因的核苷酸序列，涉及該人工設(shè)計(jì)的cry8H基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列，涉及含有cry8H基因的重組菌株，涉及使用該基因構(gòu)建表達(dá)載體，還涉及利用上述基因序列進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化的方法。技術(shù)背景金龜子屬于鞘翅目金龜總科(Scarabaeidae)，其幼蟲(chóng)(俗稱(chēng)蠐螬，本發(fā)明以下也簡(jiǎn)稱(chēng)為"蠐螬")是一類(lèi)重要的世界性分布地下害蟲(chóng)，可危害糧食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、煙草、牧草、花卉、草坪草、果樹(shù)等多種植物。大量調(diào)査表明，蠐螬在地下害蟲(chóng)中的危害居首位，其中主要以鰓金龜科和麗金龜科幼蟲(chóng)為主，占總地下害蟲(chóng)量的70-80%以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全國(guó)蠐螬發(fā)生面積約1億畝，嚴(yán)重年份曾達(dá)3億2千萬(wàn)畝，產(chǎn)量損失高達(dá)20%以上，有些地塊甚至絕產(chǎn)。近年發(fā)生面積最大、發(fā)生量最多的為黃淮海地區(qū)，主要危害糧食、油料等作物；其它地區(qū)的危害情況也很?chē)?yán)重，如危害甘蔗的蠐螬，在廣東、廣西、云南、四川、福建等地普遍發(fā)生在西藏、青海、甘肅、新疆等西部地區(qū)，蠐螬的發(fā)生也很?chē)?yán)重(魏鴻鈞等，《中國(guó)地下害蟲(chóng)》，上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989，1-41;王永祥等，"冀中平原區(qū)蠐螬種類(lèi)及綜合防治技術(shù)"，《河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)》(自然科學(xué)版)，1998，22(2):268-270)。以在我國(guó)油料作物中種植面積僅次于油菜居第二位的花生為例。我國(guó)的花生產(chǎn)量占世界花生總產(chǎn)量的35%左右，居世界首位，年出口收入達(dá)207億美元，2001年全國(guó)花生面積(500萬(wàn)公頃)和總產(chǎn)(1450萬(wàn)噸)均達(dá)到歷史最高水平。但鱭螬對(duì)花生的危害十分嚴(yán)重。為控制蠐螬的危害，一般采用農(nóng)業(yè)、化學(xué)、物理等綜合防治策略，這雖有一定成效，卻難以達(dá)到持續(xù)控制的效果。因此，尋找新的有效防治方法，已成為當(dāng)務(wù)之急。在獲得對(duì)蠐螬高毒力Bt基因的基礎(chǔ)上，培育殺蠐螬的轉(zhuǎn)基因植物是一條值得探索的新的防治途徑。蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。它在形成芽抱的同時(shí)，能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的伴孢晶體(parasporalcrystal)，對(duì)鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hy國(guó)optera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲(chóng)，以及線(xiàn)蟲(chóng)、螨類(lèi)和原生動(dòng)物具有特異性的殺蟲(chóng)活性(Schn印f，E.N.etal，Microbiol.AndMolecularBiologyReview,1998,62:3775-806)。這種殺蟲(chóng)晶體蛋白(InsecticidalCrystalProteins,ICPs)又稱(chēng)S-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，因而B(niǎo)t在害蟲(chóng)的生物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。目前人們已經(jīng)克隆了近400種編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白的Bt殺蟲(chóng)基因，它們分屬157種模式基因。近年國(guó)際上cry8類(lèi)基因的研究動(dòng)向引人矚目。研究表明，這類(lèi)基因?qū)瘕斪涌?、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)作用。1992年，Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對(duì)金龜子幼蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性的新菌株(B.t.subsp.JaponensisBuiBui)(0hba，M.etal.，AuniqueisolateofBacillusthuringiensisserovarjaponensiswithahighlarvicidalactivityspecificforscarabaeidbeetles,LettersinAppliedMicrobiology,1992.14:54-57)，1994年Sato等從中克隆出一種新的殺蟲(chóng)基因cry8C(Sato，R.etal,Cloning,heterologousexpression,andlocalizationofanovelcrystalproteingenefromBacillusthuringiensisserovarjaponensisstrainbuibuitoxictoscarabaeidinsects,Curr.Microbiol,1994.28:15-19.4)。目前已發(fā)現(xiàn)11種cry8類(lèi)基因，編碼的蛋白由1160-1210個(gè)氨基酸組成，分子量在128-137kDa之間。詳細(xì)的信息見(jiàn)表1(Asano，S.，Yamanaka,S,andTakeuchi,K.,Proteinhavinginsecticidalactivity,DNAencodingtheprotein,andcontrollingagentandcontrollingmethodofnoxiousorganisms,2002,JP2002045186-AandJP2002045186-A/2))。其中美國(guó)Mycogen公司分離的Cry8Aal和Cry8Bal對(duì)金龜科的多種害蟲(chóng)具有明顯的殺蟲(chóng)活性(TracyE.Michaels,etal.，Bacillusthuringiensistoxinsactiveagainstscarabpests,1994,USP5554534)。美國(guó)從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bbl和cry8Bcl基因，發(fā)現(xiàn)對(duì)西方玉米根葉甲(Westerncornrootworm)具有顯著的殺蟲(chóng)效果并已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米的丌發(fā)(Abad,Andre,R.,DuckNicholas,B.，F(xiàn)eng,Xiang,FlannaganRonald,D.,Kahn,Theodore,W.，Sims,Lynne，E.Genesencodingnovelproteinswithpesticidalactivityagainstcoleopterans,2002,W002/34774A2)。在我國(guó)，河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)近年來(lái)先后篩選獲得多株對(duì)黃褐麗金龜(Anomalaexoleta)和銅綠麗金龜(A.corpulenta)幼蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性的Bt菌株，室內(nèi)生測(cè)死亡率均達(dá)100%(馮書(shū)亮等，"一株對(duì)金龜子類(lèi)幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性的蘇云金桿菌新分離株"，《中國(guó)生物防治》，2000，16(2):74-78)。表1蘇云金芽孢桿菌Cry8類(lèi)殺蟲(chóng)晶體蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種對(duì)大黑鰓金龜?shù)惹食崮恐匾οx(chóng)具有高毒力的蘇云金芽孢桿菌cry8H模式基因序列，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲(chóng)的毒性，并克服、延緩害蟲(chóng)對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。蘇云金芽孢桿菌菌株BT-SU4，其保藏號(hào)為CGMCC2071。對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高效的蘇云金芽孢桿菌cry8Hal基因，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。一種工程菌菌株BioT8H，其特征在于含有cry8Hal基因。對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高效的蘇云金芽孢桿菌cry8Hal蛋白，由上述cry8Hal基因所編碼，其氨基酸序列如SEQIDN02所示。cry8Hal蛋白在制備殺害鞘翅目害蟲(chóng)藥劑中的應(yīng)用。一種蛋白，具有上述蛋白相同的功能，其氨基酸序列如SEQIDN04所示.一種人工改造合成的mcry8Hal基因，其編碼上述的蛋白，其核苷酸序列如SEQIDN03所示。一種植物表達(dá)載體p3300U8H，其特征是該植物表達(dá)載體由mcry8Hal基因序列、組成型表達(dá)啟動(dòng)子或根特異性啟動(dòng)子、終止子和一種能在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭的雙元載體所構(gòu)建。mcry8Hal基因在植物抗鞘翅目害蟲(chóng)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將含有mcry8Hal基因的植物表達(dá)載體p3300U8H轉(zhuǎn)化植物或微生物，使之產(chǎn)生抗鞘翅目害蟲(chóng)的毒性。所述植物是草坪草。所述應(yīng)用為將mcry8Hal基因表達(dá)的蛋白制備成藥劑，用于殺滅鞘翅目害蟲(chóng)。本發(fā)明從河北土壤分離得到菌株BT-SU4，其保藏編號(hào)為CGMCC2071，其生物學(xué)特性為在生長(zhǎng)周期中可以產(chǎn)生芽胞，并且同時(shí)產(chǎn)生有毒殺作用的伴胞晶體。根據(jù)cry8類(lèi)基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物SN5un85—-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3、SN3un85'-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3、PCR擴(kuò)增鑒定BT-SU4菌株，擴(kuò)增結(jié)果(見(jiàn)附圖l)，其顯示條帶與己知cry8類(lèi)基因(見(jiàn)表3)均不同，表明菌株BT-SU4中可能含有新的cry8殺蟲(chóng)基因。設(shè)計(jì)一對(duì)全長(zhǎng)基因引物cry8H5/cry8H3用來(lái)擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。并且引入BamHI/Sail用于克隆與表達(dá)，弓l物對(duì)cry8H5/cry8H3的序列如下cry8H5:ggaattcgatgagtccgaataatcagaatcry8H3:cgcgtcgacttacatttcttctacaatcaattc以菌株BT-SU4的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果(見(jiàn)附圖2)顯示擴(kuò)增出約3.5Kb的條帶，與載體pET21b連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMllO，得到重組質(zhì)粒pSASSU4(附圖2)。對(duì)插入片斷進(jìn)行測(cè)序分析，得到序列SEQIDNO1為pSASSU4中BamHI/Sail雙酶切片段，序列全長(zhǎng)3672bps，分析表明其含有開(kāi)放閱讀框，0RF1的位置是1-3672，GC含量為38.%，編碼1223個(gè)氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測(cè)定，其氨基酸序列為SEQIDNO2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類(lèi)蛋白具有較高同源性，表4為其同源性數(shù)據(jù)。由于與已知的Cry8類(lèi)蛋白氨基酸同源性均低于7鄉(xiāng)，最高只有58.2鬼(Cry8Bbl)，被Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白命名委員會(huì)命名為Cry8Hal。引物cry8H5/cry8H3分別引入BamHI和Sail位點(diǎn)，以菌株BT-SU4質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增得到全長(zhǎng)基因，插入Bt表達(dá)載體pSTK中得到重組質(zhì)粒pSK08H(見(jiàn)附圖3)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCSllO，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化Bt無(wú)晶體突變株HD-73-中(該突變株來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，可以向公眾提供，見(jiàn)李海濤等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)2005Vol.13No.6P,787-791)，得到工程菌BioT8H。將上述工程菌BioT8H于30'C于牛肉膏培養(yǎng)基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，12rC，20分鐘高壓蒸汽滅菌)中培養(yǎng)，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(方法參見(jiàn)Sambrook,J.etal，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.1989)，結(jié)果(見(jiàn)附圖4)。結(jié)果表明工程菌BioT8H中的cry8Hal基因獲得了表達(dá)，表達(dá)物的分子量為130kDa左右。Cry8Hal蛋白的活性測(cè)定表明，表達(dá)的Cry8Hal具有殺華北大黑鰓金龜和暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)的活性。根據(jù)微生物和植物對(duì)密碼子偏好的不同，對(duì)cry8Hal基因的l-2010bp的序列進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明按照cry8Hal基因的人工改造序列進(jìn)行了全基因合成，新基因見(jiàn)SEQIDNO3所示的核苷酸序列，對(duì)應(yīng)蛋白序列見(jiàn)SEQIDNO4。cry8Hal基因與mcry8Hal(modifiedcry8Hal)基因的核苷酸序列同源性只有86.88%，G+C含量也由原來(lái)cry8Hal的37.6%提高為50.1%。調(diào)整了Cry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率，使mCry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近，將cry8Ha基因的人工改造序列兩端引入BamHI和Sacl位點(diǎn)(見(jiàn)SEQIDNO3),連至pUC57載體(該載體為常用載體，GenBank登錄號(hào)為Y14837)，重組質(zhì)粒命名為pUC57-tncry8H。用BamHI和Sacl酶切質(zhì)粒pUC57-mcry8H(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存)回收2.0kb片段，用同樣的內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pCAMBIA3300(該載體為常用載體，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存，見(jiàn)張曉國(guó)等武漢植物學(xué)研究，2000Vol.18No.1P.15-20)，回收10kb片段，將兩個(gè)片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，把此新構(gòu)建質(zhì)粒命名為p3300U8H。該質(zhì)粒含有組成型表達(dá)的啟動(dòng)子Ubiquitin(即一段DNA序列，可以驅(qū)動(dòng)所連接的基因片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì)，組成型表達(dá)的啟動(dòng)子可以調(diào)控基因在生長(zhǎng)發(fā)育的任何階段和任何組織都有表達(dá))、mcry8Ha基因和N0S終止子(一段DNA序列，含有基因表達(dá)的終止信號(hào))。質(zhì)粒構(gòu)建圖見(jiàn)附圖5,該質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。。將人工合成改造的基因mcry8Hal農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，制備得到陽(yáng)性克隆，再轉(zhuǎn)化草坪草，轉(zhuǎn)基因草坪草的生物活性檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了良好的抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能。轉(zhuǎn)基因草坪草的抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能是因?yàn)樵谥参矬w中有啟動(dòng)子啟動(dòng)人工改造的mcry8Hal基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)了Cry8H蛋白，雙元載體中的表達(dá)盒——組成型啟動(dòng)子、人工改造的mcry8Hal和終止子只有整合到草坪草的基因組中才能表達(dá)外源基因，所以可以用此雙元載體轉(zhuǎn)化任何已建立農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法的植物，獲得的轉(zhuǎn)基因植物都具有抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiapamllela)性能。生物保藏信息微生物名稱(chēng)(屬、種的學(xué)名)芽孢桿菌屬蘇云金芽孢桿菌^Jc/7A/5^力"r/z^/e/75"is保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏日期2007年6月1R保藏編號(hào)CGMCC2071圖1:菌株BT-SU4的PCR-RFLP圖譜。其中M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1.PCR產(chǎn)物2.PCR產(chǎn)物酶切圖2:重組質(zhì)粒pSASSU4酶切圖譜。其中M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1.PCR產(chǎn)物BamHI/Sa11酶切2.載體pET21bBamHI/SalI酶切3.重組質(zhì)粒pSASSU4BamHI/Sa11酶切圖譜圖3:重組質(zhì)粒pSK08H酶切圖譜。其中M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1.PCR產(chǎn)物B咖HI/Sa11酶切2.重組質(zhì)粒pSK08HBamHI/Sa11酶切圖譜3.載體pSTKBamHI/SalI酶切圖4:cry8Hal基因在Bt無(wú)晶體突變株中的表達(dá)。其中M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1.HD-73-2.BioT8H3.BT-SU4圖5:p3300U8H質(zhì)粒構(gòu)建圖圖6:轉(zhuǎn)化草坪草的分子檢測(cè)，其中M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1至5.為部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例11.1菌株BT-SU4中cry基因鑒定根據(jù)cry8類(lèi)基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物SN5un8-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3'SN3un85'-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3'表2是這些基因與引物的同源序列，表3是用這對(duì)引物預(yù)測(cè)的cry8基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段大小，通過(guò)這種PCR-RFLP方法可以分別鑒定出將這些基因。表2引物與cry8各基因的保守區(qū)配對(duì)情況及配對(duì)區(qū)在基因上的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>用下列PCR反應(yīng)體系(5(^L)鑒定了Bt菌株185:10xPCRbuffer5pLMgCL(20mM)6pLdNTP(10mM)1jiL引物對(duì)(10mM)lpL/個(gè)模板luLTaq聚合酶(5U/VU0.5pL超純水補(bǔ)至50faL，混勻離心，加石蠟油30nL。擴(kuò)增循環(huán)94'C變性1分鐘，54。C退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，25個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸IO分鐘。對(duì)PCR產(chǎn)物利用Kpnl和Dral酶切分析，結(jié)果(附圖1)顯示條帶是2058bp,106bp，與已知cry8類(lèi)基因的圖譜(表3)不同，表明菌株BT-SU4中可能含有新的cry8殺蟲(chóng)基因.1.2菌株BT-SU4中cry8H基因的克隆設(shè)計(jì)了一對(duì)全長(zhǎng)基因引物cry8H5/cry8H3用來(lái)擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。并且引入BamHI/Sail用于克隆與表達(dá)，引物對(duì)cry8H5/cry8H3的序列如—hcry8H5:ggaattcgatgagtccgaataatcagaatcry8H3:cgcgtcgacttacatttcttctacaatcaattc以菌株BT-SU4的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，用如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>超純水補(bǔ)至50)aL，混勻離心，加石蠟油30pL。擴(kuò)增循環(huán)94t:變性1分鐘，54。C退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，25個(gè)循環(huán)，最后72r延伸10分鐘。結(jié)果(見(jiàn)附圖2)顯示擴(kuò)增出3.5Kb的條帶，與載體pET21b連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMllO，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子pSASSU4。對(duì)插入片斷進(jìn)行測(cè)序分析，得到序列SEQIDNO1為pSASSU4中BamHI/Sail雙酶切片段，序列全長(zhǎng)3472bps,分析表明其含有開(kāi)放閱讀框，0RF1的位置是1-3472，GC含量為38J，編碼1157個(gè)氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測(cè)定，其氨基酸序列為SEQIDNO2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類(lèi)蛋白具有較高同源性，表4為其同源性數(shù)據(jù)。由于與已知的Cry8類(lèi)蛋白氨基酸同源性均低于78°/。，最高只有58.2%(Cry8Bbl)，被Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白命名委員會(huì)命名為Cry8Hal。表4Cry8Hal與Cry8蛋白同源比較數(shù)據(jù)Cry8AalCry8BalCry8CalCry8DalCry犯alCry8FalCry8GalCry8Hal53524855564948本發(fā)明進(jìn)一步分析了Cry8Hal蛋白的氨基酸組成(見(jiàn)表6),得知其分子量為131.56kDa，等電點(diǎn)為pH4.735(見(jiàn)表5)，分析了蛋白的生化指標(biāo)(見(jiàn)表5)表5Cry8Hal蛋白的生化特性分析內(nèi)容數(shù)據(jù)蛋白全長(zhǎng)1223a3分子量137502.97m.w.1毫克蛋白摩爾數(shù)7.273pMolesl摩爾蛋白消旋系數(shù)187500lodA，的蛋白濃度0.73mg/ml1mg/mlA卿吸收值1.36AU等電點(diǎn)5.06pH7時(shí)帶電荷值-30.91_表6Cry8Hal蛋白的氨基酸組成_MHil質(zhì)量百分頻率百分?jǐn)?shù)數(shù)1.3cry8H基因的表達(dá)32732.0813712.0110510.8342235.2039231.20784.3650.38715.92666.09505.18864.05141.36615.02363.30867.07242.24907.45433.10706.41697.53915.991007.47997.27182.30667.4916113.3813612.50Charged(RKHYCDE)Acidic(DE)Basic(KR)Polar(NCQSTY)Hydrophobic(AILFWV)AAlaCCysDAspEGluFPheGGlyHHis'suetsnoIn93rirrp'r5XX409158110934943662244897062213311UKLMNPQRSTVWYBZ引物cry8H5/cry8H3分別引入BamHI和Sail位點(diǎn)，以含全長(zhǎng)cry8Hal的菌株BT-SU4質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增得到全長(zhǎng)基因，插入Bt表達(dá)載體pSTK(見(jiàn)附圖3)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCSllO，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化Bt無(wú)晶體突變株HD-73-中，得到工程菌BioT8H。分別將上述兩株工程菌3(TC于牛肉膏培養(yǎng)基中培養(yǎng)30小時(shí)，取500j_iL菌液至Eppendorf管中，超聲波破碎30秒鐘(B.BraunULabsonic，230V,T間隔=0.5秒);取lOO^L加入25pL新配0.5NNa0H，25。C作用5分鐘；加入65HL3X樣品緩沖液(925pL上樣緩沖液+75pLp-巰基乙醇)，100'C煮沸5分鐘。離心除去沉淀。上樣10uL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。結(jié)果(附圖4)表明，工程菌BioT8H中的cry8Hal基因均獲得了表達(dá)，表達(dá)物的分子量為130kDa左右。1.4Cry8H蛋白的活性測(cè)定將Bt工程菌株接種在普通細(xì)菌瓊脂克氏瓶培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天。將野生菌株HD-73-接種在普通細(xì)菌瓊脂克氏瓶培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天。將培養(yǎng)物洗下，2倍梯度濃度稀釋?zhuān)瑢?0ml菌懸液加入到200g有均勻粗細(xì)土豆絲的細(xì)土(紫外線(xiàn)滅菌)中，混勻，使土壤含水量保持在18%-20%。接入金龜子齡幼蟲(chóng)20頭，以加入清水的處理為空白對(duì)照，28t:感染詞養(yǎng)，14天檢査死蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率。結(jié)果(見(jiàn)表7)表明工程菌株對(duì)華北大黑鰓金龜(Holotrich;iaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)具有極高的毒殺活性。其表達(dá)的Cry8H蛋白具有殺華北大黑鰓金龜、銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜蟲(chóng)的活性。表7Bt工程菌和BT-SU4菌株對(duì)華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)幼蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例22.1人工設(shè)計(jì)合成的可以在植物中表達(dá)的cry8H基因的核苷酸序列根據(jù)微生物和植物對(duì)密碼子偏好的不同，對(duì)cry8Hal基因的1-2010bp的序列進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明按照cry8Hal基因的人工改造序列進(jìn)行了全基因合成，新基因見(jiàn)SEQIDNO3所示的核苷酸序列。cry8Hal基因與mcry8Hal(modifiedcry8Hal)基因的核苷酸序列同源性只有87.08%,G+C含量也由原來(lái)cry8Hal的37.6%提高為50.1%(表8)。調(diào)整了Cry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率，使mCry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近說(shuō)明書(shū)第11/17頁(yè)(表9)。將cry8Ha基因的人工改造序列兩端引入BamHI和Kpnl位點(diǎn)，連至pUC57載體，重組質(zhì)粒命名為pUC57-mcry8H。表8cry8Hal基因與mcry8HalG+C含量比較與聚腺苷酸化的信號(hào)序列情況加/7<^7優(yōu)化結(jié)果1堿基數(shù)百分率堿基堿基數(shù)百分率GC含量備注A67532.14C33115.76G45821.81T63630.29A52625.05C55726.52G49623.62T52124.81古去除10個(gè)聚腺^SS'^苷酸化的信號(hào)達(dá)到50.1%序列表9植物、Cry8Hal及mCry8Hal中蛋白的氨基酸密碼子使用頻率氨基酸密碼子植物使用頻率Cry8Ha使用個(gè)數(shù)使用頻率mCry8Ha使用個(gè)數(shù)使用頻率AlaGCA25%2649%1325%AlaGCC27%713%2242%AlaGCG6%713%00%AlaGCT42%1325%1834%ArgAGA30%2356%1127%ArgAGG25%25%1434%ArgCGA8%4腦00%ArgCGC11%12%512%ArgCGG5%410%00%ArgCCT21%717%1127%AsnAAC55%614%2763%AsnAAT45%3786%1637%AspGAC42%822%2465%AspGAT58%2978%1335%CysTGC56%00%1100%CysTGT44%1100%00%GinCAA59%2370%1958%GinCAG41%1030%1442%GluGAA49%1864%1346%GluGAG51%1036%1554%GlyGGA38%2341%1527%GlyGGC16%24%1425%GlyGGG12%814%713%GlyGGT34%2341%2036%HisCAC46%110%10100%HisCAT54%990%00%lieATA18%1438%38%lieATC37%38%1951%lieATT45%2054%1541%LeuCTA8%714%00%LeuCTC9%12%816%LeuCTG19%00%918%l>euCTT28%1224%1122%LeuTTA10%2347%5腦LeuTTG26%612%1633%LysAAA39%1365%420%lysAAG61%735%1680%MetATG100%14100%14100%PheTTC55%719%2467%PheTTT45%2981%1233%ProCCA42%1554%1450%ProCCC17%14%725%ProCCG9%518%00%ProCCT32%725%725%SerAGC18%35%1323%SerAGT14%1730%712%SerTCA190/o916%916%SerTCC18%35%1425%SerTCG6%59%00%SerTCT25%2035%1425%ThrACA27%3056%00%Thr八CC30%12%3565%ThrACG8%47%00%ThrACT35%1935%1935%TrpTGG100%11100%11100%TyrTAC57%411%36100%TyrTAT43%3289%00%ValGTA12%2748%00%ValGTC20%47%1120%ValGTG29%611%2138%Va]GTT39%1934%2443%EndTAA48%1100%1100%EndTAG19%00一EndTGA18%0一0一2.2植物表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHI和Sacl酶切質(zhì)粒pUC57-mcry8H(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存)回收2.0kb片段，用同樣的內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pCAMBIA3300(該載體為常用載體，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存，見(jiàn)張曉國(guó)等武漢植物學(xué)研究，2000Vol.18No.1P.15-20)，回收l(shuí)Okb片段，將兩個(gè)片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，把此新構(gòu)建質(zhì)粒命名為p3300U8H。該質(zhì)粒含有組成型表達(dá)的啟動(dòng)子Uhiquitin(即一段DNA序列，可以驅(qū)動(dòng)所連接的基因片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì)，組成型表達(dá)的啟動(dòng)子可以調(diào)控基因在生長(zhǎng)發(fā)育的任何階段和任何組織都有表達(dá))、mcry8Ha基因和N0S終止子(一段DNA序列，含有基因表達(dá)的終止信號(hào))。質(zhì)粒構(gòu)建圖見(jiàn)附圖5，該質(zhì)?？梢栽谥参镏斜磉_(dá)外源基因。2.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化取一管200y1農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，加入1ugp3300U8H質(zhì)粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37t:恢復(fù)培養(yǎng)5分鐘，加入lralLB液體培養(yǎng)基，28。C慢速振蕩(〈100rpm)6小時(shí)，4，000rpm離心5分種，棄上清，加入100y1LB液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素lOOng/ml、利福平層yg/ml和鏈霉素100yg/ml的LB培養(yǎng)基的平板上，28。C培養(yǎng)48小時(shí)。將LB抗性培養(yǎng)基平板上的克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。2.4草評(píng)草轉(zhuǎn)化將含有p3300U8H質(zhì)粒的農(nóng)桿菌克隆接種于含有卡那霉素100ug/ml、利福平100ng/ml和鏈霉素100ug/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8，1/100接種于含有卡那霉素100ug/ml、利福平100ug/ml和鏈霉素100ng/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，；將草坪草愈傷浸于菌液中，農(nóng)桿菌侵染15分鐘；取出草坪草愈傷，用滅菌濾紙吸干菌液，放置到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+OOymol/m;i乙酰丁香酮+3mg/l2,4-D)中，28'C暗培養(yǎng)2天，2天后將草坪草愈傷轉(zhuǎn)移至MS篩選分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+150ug/1草丁磷+500ug/ml羧芐霉素+3mg/12，4-D)，28。C,光/暗=16小時(shí)/8小時(shí)，2周后，愈傷點(diǎn)分化成小植株，將小植株切下移至生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+700wg/ml草丁磷+500^§/1111羧芐霉素)生根，根部發(fā)育健壯后，移至花盆在土中繼續(xù)生長(zhǎng)(普通土營(yíng)養(yǎng)土蛭石=2:1:1)。2.5轉(zhuǎn)化草坪草的分子檢測(cè)提取轉(zhuǎn)化草坪草的基因組DNA，取1yg基因組DNA做模板，引物序列如下8HF1:5'-TGGACACCAAGGGCATTAAGAG8HR1:5'-AGTAGCCTGAGTGGCGTAAAGAPCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C，IO分鐘，l個(gè)循環(huán)；94°C,1分鐘，54°C,1分鐘，72°C，l分鐘，30個(gè)循環(huán)。把產(chǎn)物電泳。如圖6所示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株擴(kuò)增出大小為600bp的片段。2.6轉(zhuǎn)基因草坪草的生物活性檢測(cè)從田間采集華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)3種在我國(guó)北方危害比較嚴(yán)重的金龜子成蟲(chóng)群體，帶回室內(nèi)，分別放入40X40X50cm的飼養(yǎng)盒中，盒底放5-8cm厚的潮濕過(guò)篩細(xì)土，飼喂新鮮榆樹(shù)葉片，26-28'C飼養(yǎng)。待其產(chǎn)卵后，將卵挑出，放在潮濕土中使孵化。將剛孵化的幼蟲(chóng)挑出，每個(gè)小飼養(yǎng)盒(08cm，H5cm)放幼蟲(chóng)5頭，飼喂土豆塊和新鮮的玉米嫩根，待幼蟲(chóng)長(zhǎng)到一定齡期后供生測(cè)用。采用群體種植和群體接蟲(chóng)的方法，進(jìn)行生物測(cè)定。在大田土中采用分別種植及混合種植轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)化植株的種植方法，每個(gè)處理12株。按照建立的危害程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)幼蟲(chóng)對(duì)供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度、危害指數(shù)統(tǒng)計(jì)如下，見(jiàn)表IO。表10.轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因株的危害統(tǒng)計(jì)。株系p3300U8H株j7非轉(zhuǎn)基因植株危害等級(jí)~~SS1~~危害指數(shù)"~危害等級(jí)~~植株數(shù)~~危害指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從表10統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，轉(zhuǎn)p3300U8H植株的危害率為62.5%，危害指數(shù)為22.9;非轉(zhuǎn)基因植株危害率100%,危害指數(shù)為72.9。轉(zhuǎn)p3300U8H植株表現(xiàn)出了良好的抗暗黑鰓金龜(〃。7ofr/c力iapa2-a^7e/a)的特性。華北大黑鰓金龜0foA^/7'c力/s幼蟲(chóng)對(duì)供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度統(tǒng)計(jì)如下。轉(zhuǎn)p3300U8H植株危害率為75%，危害指數(shù)為28.4，低于非轉(zhuǎn)基因植株危害率為100%，未轉(zhuǎn)化植株危害指數(shù)75.0?？梢?jiàn)轉(zhuǎn)p3300U8H植株表現(xiàn)出了良好的抗華北大黑鰓金龜(〃Wotric^'aoWita)特性。銅綠麗金龜"/ww^sfor/w&"ta)幼蟲(chóng)對(duì)供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度統(tǒng)計(jì)如下。轉(zhuǎn)p3300U8H植株危害率為45%,危害指數(shù)為16.5，低于非轉(zhuǎn)基因植株危害率為100%，未轉(zhuǎn)化植株危害指數(shù)75.0?？梢?jiàn)轉(zhuǎn)p3300U8H植株表現(xiàn)出了良好的抗銅綠麗金龜(力/w/za7aco/p^e^a)的特性。根據(jù)以上信息，利用可以在根部特異轉(zhuǎn)錄基因的啟動(dòng)子，可以使該基因在植物根部得到表達(dá)，從而只在植物根部獲得對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)華北大黑鰓金龜(〃Wo^i'c/u'ao力7Wa)、銅綠麗金龜(力/o鵬7aco/';wJe/7fa)和暗黑鰓金龜(〃aotn'c/j'apara^e2a)的抗性。附本發(fā)明所涉及的DNA序列和蛋白質(zhì)序列SEQIDNO1(c/r5fe7基因的核苷酸,序列)1^ATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGG61GATCCGAATTCGATGAGTCCGAATAATCAGAATGAATATGAAATTATAGATACACCATCT121CGTACGTCTGTATCCAATGATTCTGTCAGATATCCTTTCGCAAGCGATCCAACAACTGAT181TTAAACAATATGAATTATAAAGATTTCCTTAMACAGTAAATGGTTACAATACTGGAGAT241CTTTCTGGATCTGAGGCATTTATCAGTCAAACTGCAATTAATACTGCAGGTAAAGCTGTA301GGTACAGTACTCGGTTTATTGGGTGTTCCATTAGCCGGAGCAGTTGGCCCCTTAATATCC361TTCTATGGTGCCGTTGCCCTATTATTTTGGGGGCCGGGAGATCCATGGCAAGCTTTTATG421ACCCAAGTAGAGGCATTAGTTAACCAAAAAATAGCAGATTATGCAAGAAATAAAGCAATT481GCAGAATTACAAGGGTTAAGGAATATTCTTGATTTATATCGTTTAGCACTTATAGAATGG541GAAGAGAACCCAACAAGAACAAGATCACTAACAAATATCCGTCTTMATTTGAAGATGTT601AATCAGTTTTTCGAATATCAAATGCCATCTTTTGCAGTAGGAGGTTATGAGGTTCCATTA661TTAGCAGTATATGCACAGGCAGCAAATCTTCATTTGTCAGTATTAAGAGATGCCGCGATA721TTCGGAGAACAGTGGGGAATGTCTCAAACTGCTATTMTAACATATATGACCTTCAGCAG781AGAAGAACTGCTGAGTATATTAATCATTGTGTGAAATGGTATAATAATGGTTTAGATAAA841TTAAGAGGTTCGAATGCTGGGCAATGGGTTAATTTTAATCGCTACCGTAGAGAGATGACA901CTAATGGTATTGGATATTGTAGCGATATTTCCAAACTATGATACACGTACGTATCCMGT961GGAATTGGAACTAGTGTCCAACTTACAAGAGAAGTATATACGGATCCTATTGGTCCGACA贈(zèng)TCAACACMGGTGGCGTTTCTTGGTATGACGACGCACCTTCTTTTACAGCTATTGAMGT醒TCCGTGGTTCGACCACTTCACTTATTTGATTTACTAACAGGGGTTACAGTCTATGCCGCT1141AGTAGTTCTTGGGATTCAAGTCATTATTTTAGATTTTGGAATGGGCATAAAGTAGACACA1201AAGGGAATTAAGAGTTCTGTTCAATATAGTAATGTATATGGTTCTACTAGTAATGCGGTT1261AGTACAACTATTATACCATTTTCGGGTTTTGACGTTTATAGAGTCTTTTCGCTAGCTGGT1321GTACTATTTGCTTGGACAACAAGATACTTTGGAGCCCCTGAAGTTTATTTTC嵐GAGTA1381GACCATAATTCTGGGATTGATGTTGGATACGATATAGCGTTTAGCGAAAGGTATGCAGGG1441ATTGGAGAACAACAMAGGATTCACTTGATGAATTACCTTTACAAACAGAAGGGCCGGCA1501TATAGATCTTATAGTCATAGATTGAATCATATTTCAATGGTTCCACAAACTGTACGAACA1561CGGAATGTACCTGTATTTTCTTGGTCGCATCGGAGTGCGGATATTGACAATAGAATTTTT腿CAGGATAGAATTAATCAAATTCCGGTAGTAAAGGGACATACATTAGGTCCAGGTGCTTCT腿GTTATGGCAGGTCCTGGATTTACAGGAGGAAATATAGTGACTAGAACAAGTCCAGGTGTA1741GTAGTTTTTTCTGGAGTTACTATAAAGAATGCATTATCACAACGATATCGTGTGAGAATA1801CGGTATGCTTCTACTACTGACTTCCGATTTTTCTCTACACTTTCAGGAACTCGTCTTTAT1861GCCACTCAGGCTACTMAACTATGAATAMGGACAACAATTAACATATGAATCATTTCAG簡(jiǎn)TATGCAACAATTGGTTCTACATTTACATTTGAGAATGTAAATGATAGTTTGACAATAGGT1981GCAGATCMTTTCTAAGTGGTGAGCAAGTATATGTAGATAGATATGAAGTAATCCCAGTG2041GATGCAACGTTTGAAGCGGAGAACGATTTAGAGGTGGCAA歸AAGCAGTMATAATTTG2101TTTACGAATGCAAAAGATGCCTTACAGACGGATGTTACAGATTATCAAGTAAATCAAGCA2161GCTAATTTAGTAGAATGCCTATCAAGTGAGTTATATCCAAATGAAAAACGTTTGTTATTT2221GATGCGGTGAAAGAGGCAAAACGACTGGATCAAGCACGTAACTTACTTCAAGATACACAG2281TTTMTGAGATGAATGGAGAAAACGGATGGAATGGGAGCACAGGTGTTGAGATTGTTGAA2341GATGATGTCTTCTTTAAGGACCGCTCAATTCGATTATCTAGCGCGCGAGAAGCGGGGACA2401GAAMCTCCCCAACGTATCTGTACCAAAAAATAGATGAATCTCGCTTAAAACCATACACT2461AGATATAGTCTGAGAGGGTTTGTAAGAAGTAGTCAAAATTTAGAGATATATGTCACTCGT2521TACCAAACACAGCGAGTGGTCAAAAATATAGTAGACAATTTCTTACCAGATATGTATGCT2581GTTMCGCCTGCGGAGGAATTGATAGATGCGGAGMCAAAAGCATGTGAATACTATGTTA2641GGATTAG磁ATAATGTACCAAATGGAAATACAGTGTCTGACTCTCATGAGTTTTCAATT2701CCTGTAGATACAGGGGAGCTGAATTATAATGAGGATACGGGTATTTGGGTTGTATTTAAA2761ATCACAACCACGGATGGATACGCAACACTTGGAAATCTTGAATTGGTAGAAGAGGGACCG2821TTATCTGGAGAAACATTAGAACGTGTGAAAAATCAAGGAAAGCAGTGGCAGGACCAMTG2881GCAAGAAGACGTGCGGAAACAGATACAAGATACGGGACAGCAAAACAAGCCATTGATCGT2941TTATTTGTAGACTATCAGGATCAACAATTATCTCCTAGTATAGAAATATCAGATTTGACT3001GCGGCACAAAATCTGGTACAGTCCATCCCTTACGTATATAATGATACGTTACCAGAAATA3061CCGGGGATGAACTATACAAGTGTTACAGAGTTAACAAACAGACTCCAACAAGCATGGAAT3121TTGTATGACTTGAGMATAGCATACAA證GGTGATTTCCGMATGATGTAAGTAATTGG3181AATGTTACACCTGGAGTCAATATTCAACAAATGAATCATACGTCTGTTCTTGTGATTCCA3241AATTGGGATTCACAAGCGTCACAACAAATTACCGTTCAACC磁TCGAAGATATGTGTTA3301CGTGTTACCGCAAGAAAAGAAGGA虹GGAGATGGATACGTMCCATCCGTGATGGAGCA3361AAATATACAGAAACGCTGACATTTAATACATGTGATTATAATGGAAGTAGTGTATATCAG3421GAGCMGCATTGTATACAAATGATGTATACAATACGCAATCCGTTAACATACAGGGTTCG3481AATAGTGCGTATCATACACAAGCAACCAATACCGATAGATATAATATGAATGGTATGTAT3541AATGATCAAACTAGCTATGTTACAAAAACAGTAGAATTTATTCCGTATACGGAGCAAGTC3601TGGATTGAGATGAGCGAAACCGAGGGCGTATTCTATATAGAGAGTGTAGAATTGATTGTA3661GAAGAAATGTAASEQIDNO2(Cry8Hal蛋ft的氨基酸序列)1證K(;GK腿SMTGGQQMGRDPNSMSPNNQNEYEIIDTPSRTSVSNDSVRYPFASDPTTD61LN畫(huà)NYKDFLKTVNGYNTGDLSGSEAFISQTAINTAGKAVGTVLGLLGVPLAGAVGPLIS121FYGAVALLFWGPGDPWQAFMTQVEALVNQKIADYARNKAIAELQGLRNILDLYRLALIEW181EENPTRTRSLT,LKFEDVNQFFEYQMPSFAVGGYEVPLLAVYAQAANLHLSVL腿AI241FGEQ腦SQTA雇IYDLQQRR丁AEYINHCV認(rèn)NNGLDKLRGSNAGQWVNFNRYRREMT301LMVLDIVAIFPNYDTRTYPSGIGTSVQLTREVYTDPIGATSTQGGVSWYDDAPSFTAIES361SVVRPLHLFDLLTGVTVYAASSSWDSSHYFRFWNGHKVDTKGIKSSVQYSNVYGSTSNAV421STTIIPFSGFDVYRVFSLAGVLFAWTTRYFGAPEVYFQRVDHNSGIDVGYDIAFSERYAG481IGEQQKDSLDELPLQTEGPAYRSYSHRLNHISMVPQTVRTRNVPVFSWSHRSADTDNRIF541QDRINQIPVVKGHTLGPGASVMAGPGFTGGNIVTRTSPGVVVFSGVTIKNALSQRY跳I601RYASTTDFRFFSTLSGTRLYATQATKT廳KGQQLTYESFQYATIGSTFTFENVNDSLTIG661ADQFLSGEQVYVDRYEVIPVDATFEAENDLEVAKKAV亂FTNAKDALQTDVTDYQVNQA721ANLVECLSSELYPNE亂LFDAVKEAKRLDQARNLLQDTQFNEMNGENGWNGSTGVEIVE781DDVFFKDRSIRLSSAREAGTENSPTYLYQKIDESRLKPYTRYSLRGFVRSSQNLEIYVTR841YQTQRV糊IVDNFLPDMYA麗CGG皿CGEQ服麵LGLE麗PNGNTVSDSHEFSI901PVDTGELNYNEDTGIWVVFKITTTDGYATLGNLELVEEGPLSGETLE跳NQGKQWQDQM961A,AETDTRYGTAKQA皿LFVDYQDQQLSPSIEISDLTAAQNLVQSIPYVYNDTLPEI1021PGMNYTSVTELTNRLQQAWNLYDLRNSIQNGDFRNDVSIWNVTPGVNIQQMNHTSVLVIP1081麗DSQASQQITVQPNRRYVLRVTARKEGSGDGYVTIRDGAKYTETLTFNTCDYNGSSVYQ1141EQALYT隨YNTQSVNIQGS歸YHTQATNTDRYNMNGMYNDQTSYVTKTVEFIPYTEQV體WIEMSETEGVFYIESVELIVEEM*SEQIDNO3(人工設(shè)計(jì)基因的核苷酸序列)1GGATCCATGATCAGAMGGGCGGCAGGAAGATGGCCAGCATGACTGGTGGACAGCAGATG61GGTCGTGATCCCAACTCCATGAGCCCCAACAACCAGAATGAGTACG磁TCATCGACACC121CCATCTCGTACCTCTGTGTCCAACGACTCTGTCAGATACCCTTTCGCCAGCGATCCAACC181ACTGACTTGAACAACATGAACTACAAGGATTTCCTTAAGACCGTTAACGGTTACAACACT241GGAGACCTTTCTGGATCTGAGGCATTCATCAGCCAAACTGCCATTAACACTGCAGGTAAG301GCTGTCGGGACCGTTCTCGGTTTGTTGGGTGTTCCATTGGCCGGCGCCGTTGGCCCCCTG361ATCTCCTTCTACGGTGCCGTTGCCCTCTTGTTCTGGGGCCCCGGAGATCCCTGGCAGGCC421TTCATGACCCAAGTGGAGGCACTGGTTAACCAGAAAATCGCCGACTACGCAAGGAACAAG481GCCATTGCAGAGTTACAAGGGTTGAGGAACATACTGGATTTGTACCGTCTGGCCCTTATC541GAATGGGAAGAGAACCCAACCAGAACCAGGTCACTCACCAACATCCGTCTTAAATTCGAG601GACGTTAACCAGTTTTTCGAATACCAAATGCCATCTTTCGCAGTCGGAGGTTACGAGGTT661CCACTGTTAGCCGTTTACGCACAGGCCGCAAACCTTCACTTGTCAGTGTTGAGAGATGCC721GCTATCTTCGGCGAACAGTGGGGAATGTCCCAAACTGCTATTAACAACATCTACGACCTT781CAGCAGAGGAGAACTGCTGAGTACATCAACCACTGCGTGAAGTGGTACAACAACGGTCTG841GACMGTTAAGGGGTTCCAATGCTGGCCAATGGGTTAACTTCAATCGCTACCGTAGAGAG901ATGACCCTCATGGTGTTGGATATTGTGGCTATCTTCCCAAACTACGACACCCGTACCTAC961CCAAGCGGAATTGGCACTAGTGTCCAACTTACCAGGGAAGTTTACACCGATCCTATAGGC簡(jiǎn)GCTACCTCAACCCAAGGTGGCGTTTCTTGGTACGACGACG'CCCCTTCTTTTACCGCTATT藤GAGTCCTCCGTGGTTCGCCCACTTCACTTGTTCGACCTGCTCACCGGGGTTACCGTCTAC1141GCCGCTAGTAGCTCCTGGGATTCAAGTCACTACTTTAGATTCTGGAATGGGCACAAGGTG1201GACACCAAGGGCATTAAGAGTTCTGTTCAGTACAGTAATGTGTACGGCTCTACTAGCAAT1261GCTGTTAGTACCACTATTATCCCATTTTCCGGTTTCGACGTTTACAGGGTCTTTTCCCTC1321GCTGGTGTGCTCTTCGCTTGGACCACCAGATACTTTGGAGCCCCTGAAGTTTACTTCCAA1381AGGGTGGACCACAATTCCGGGATTGACGTTGGATACGACATCGCTTTTAGCGMAGGTAC1441GCAGGGATTGGAGAACAACAAAAGGACTCACTTGATGAATTACCTTTGCAAACCGAGGGG1501CCCGCCTACAGGTCTTACAGCCACAGGTTGAATCACATTTCAATGGTTCCACAAACTGTT1561CGCACCCGTAATGTCCCTGTGTTCTCTTGGTCCCACCGTAGTGCTGACATAGACAATAGA1621ATTTTTCAGGATAGGATTAACCAGATTCCCGTGGTCAAGGGCCACACCCTGGGTCCAGGT1681GCTTCCGTTATGGCAGGTCCTGGATTCACCGGAGGCAATATCGTGACTAGAACCAGCCCA1741GGTGTGGTCGTTTTTTCTGGAGTTACTATCAAGAATGCCTTATCACAACGCTACCGTGTG醒AGGATTCGTTACGCTTCTACTACTGACTTCCGCTTCTTCTCCACCCTTTCAGGAACTCGT1861CTTTACGCCACTCAGGCTACTAAAACTATGAATAAGGGACAACAATTGACCTACGAATCA1921TTTCAGTACGCAACCATCGGTTCCACCTTCACCTTTGAGAATGTGAATGACAGTTTGACC1981ATCGGTGCCGATCAATTCCTCAGCGGTGAGCAAGTGTACGTCGACAGATACGAAGTGATC2041CCAGTGGATGCAACCTTTGAAGCTGAGAACGACCTGGAGGTGGCCAAGAAAGCAGTCAAT2101AACTTGGAGCTCSEQIDNO4(人工設(shè)計(jì)基因mCry8Hal蛋白的氨基酸序列)1MIRKGGR藤SMTGGQQMGRDPNSMSPNNQNEYEIIDTPSRTSVSNDSVRYPFASDPTTD61LNNMNYKDFLKTVNGYNTGDLSGSEAFISQTAINTAG譜GTVLGLLGVPLAGAVGPLIS121FYGAVALLFWGPGDPWQAFMTQVEALVNQKIADYARNKAIAELQGLRNILDLYRLALIEW181EENPTRTRSLTNIRLKFEDVNQFFEYQMPSFAVGGYEVPLLAVYAQAANLHLSVL歸AI241FGEQWGMSQTAINNIYDLQQRRTAEYINHCVKWYNNGLDKLRGSNAGQWVNFNRYRREMT301LMVLDIVAIF而DTRTYPSGIGTSVQLTREVYTDPIGATSTQGGVSWYDDAPSFTAIES361SVVRPLHLFDLLTGVTVYAASSSWDSSHYFRF麗GHKVDTKGIKSSVQYSNVYGSTSNAV421STTIIPFSGFDVYRVFSLAGVLFAWTTRYFGAPEVYFQRVDHNSGIDVGYDIAFSERYAG481IGEQQKDSLDELPLQTEGPAYRSYS服LNHISMVPQTVRTRNVPVFSWSHRSADIDNRIF541QDRINQIPVVKGHTLGPGASVMAGPGFTGGNIVTRTSPGVVVFSGVTIKNALSQRYRVRI601RYASTTDFRFFSTLSGTRLYATQATKTMNKGQQLTYESFQYATIGSTFTFENVNDSLTIG661A叫FLSGEQVYVDRYEVIPVDATFEAENDLEVAKKAVNNL權(quán)利要求1.蘇云金芽孢桿菌菌株BT-SU4，其保藏號(hào)為CGMCC2071。2.對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高效的蘇云金芽孢桿菌c/r《〃a7基因，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。3.—種工程菌菌株BioT8H，其特征在于含有權(quán)利要求2所述的c/y《/fe7基因。4.對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高效的蘇云金芽孢桿菌c/76^a/蛋白，由權(quán)利要求2所述的cr/Sfe7基因所編碼，其氨基酸序列如SEQIDN02所示。5.權(quán)利要求4所述的c/y6^a7蛋白在制備殺害鞘翅目害蟲(chóng)藥劑中的應(yīng)用。6.—種蛋白，具有權(quán)利要求4所述的蛋白相同的功能，其氨基酸序列如SEQIDN04所示.7.—種人工改造合成的歷c/y^/fe7基因，其編碼權(quán)利要求6所述的蛋白，其核苷酸序列如SEQIDN03所示。8.—種植物表達(dá)載體p3300U8H，其特征是該植物表達(dá)載體由權(quán)利要求7所述的歷"7《fe7基因序列、組成型表達(dá)啟動(dòng)子或根特異性啟動(dòng)子、終止子和一種能在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭的雙元載體所構(gòu)建。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因在植物抗鞘翅目害蟲(chóng)中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是將含有權(quán)利要求7所述的歷c/yS^7基因的植物表達(dá)載體p3300U8H轉(zhuǎn)化植物或微生物，使之產(chǎn)生抗鞘翅目害蟲(chóng)的毒性。11.權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述植物是草坪草。12.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是將權(quán)利要求7所述的歷c/yS/fe7基因表達(dá)的蛋白制備成藥劑，用于殺滅鞘翅目害蟲(chóng)。全文摘要本發(fā)明涉及“對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高效的蘇云金芽孢桿菌cry8H基因、蛋白及其應(yīng)用”屬于生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)高毒力的cry8H基因的核苷酸序列，如SEQIDNO1所示，人工設(shè)計(jì)合成的可以在植物中表達(dá)的cry8H基因的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。該人工設(shè)計(jì)的cry8H基因轉(zhuǎn)化植物，獲得的轉(zhuǎn)基因植物都具有抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能。文檔編號(hào)A01N63/02GK101130762SQ200710120020公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年8月7日優(yōu)先權(quán)日2007年8月7日發(fā)明者馮書(shū)亮,宋福平,杰張,束長(zhǎng)龍,王容燕,郎志宏,黃大昉申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所