專利名稱：：一種新的植酸酶及其編碼基因以及包含該酶的細(xì)胞和飼料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有高穩(wěn)定性和高水解功效的植酸酶及其編碼基因以及包含該酶的宿主細(xì)胞和飼料添加劑。
背景技術(shù)：
：全世界的動(dòng)物生產(chǎn)都是以植物性日糧為基礎(chǔ)，而植物性日糧中都存在大量的植酸，其中植酸磷占總磷量的50-70%，甚至更高。由于在消化道中植酸酶的活性過低，因此單胃動(dòng)物如雞和豬、以及人類都不能利用植酸磷。這些未消化的植酸螯合各種離子，如Ca2+、Fe2+、Zn2+和Mg2+，降低了這些重要礦物元素的吸收利用。同時(shí)消化道中的植酸還與攝取的蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)形成復(fù)合物，阻礙相關(guān)消化酶的作用，影響這些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。此外，在畜牧業(yè)生產(chǎn)集中的領(lǐng)域，大多數(shù)未被消化的植酸磷排泄到周圍環(huán)境中會(huì)污辯水源和其他生態(tài)系統(tǒng)，帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題。植酸酶(肌醇六磷酸酶；EC3.1.3.8和3.1.3.26)是一類能夠從植酸中水解釋放無機(jī)磷的酶的總稱。為了充分利用植酸磷和被植酸螯合的養(yǎng)分，微生物來源植酸酶首次被添加到以玉米、豆粕為基礎(chǔ)的雞的日糧中，用于水解植酸，解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，并且取得了明顯的效果。然后，大量的實(shí)驗(yàn)表明，向單胃動(dòng)物日糧中添加微生物來源的植酸酶，可提高磷的利用率，提高動(dòng)物的生長速率。同時(shí)，補(bǔ)充植酸酶也提高礦物元素的活性，減少磷的排泄量高達(dá)50%，這將有助于對環(huán)境的保護(hù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已闡明了動(dòng)物的胃是真菌和細(xì)菌植酸酶從植酸中釋放無機(jī)磁的主要功能部位。為了提高植酸磷的利用，飼料中的植酸酶必須具有強(qiáng)的催化活性，然而，在胃內(nèi)，pH值從攝入食物后，先是急劇上升至5.5，其后慢慢減低到2.0。胃蛋白酶的前體在酸性條件下會(huì)被分泌的鹽酸激活，具有強(qiáng)的蛋白水解能力。因此，植酸酶必須抵制酸性條件下的變性，蛋白質(zhì)的水解，并且在生理溫度和酸性條件需要具有高的活性。目前，黑曲霉植酸酶和大腸桿菌植酸酶已被廣泛地應(yīng)用于飼料工業(yè)，以改善磷的利用率，減少磷對環(huán)境的污染。然而在消化道中的水解能力，它們與"理想植酸酶"還有一段差距。為了接近"理想植酸酶"，商業(yè)酶的性能，如在酸性pH值下的催化功效和穩(wěn)定性，以及胰蛋白酶抗性等，都需要通過蛋白質(zhì)工程的方法加以改進(jìn)優(yōu)化，或者找一些性質(zhì)更優(yōu)良的植酸酶取而代之。在過去十年中，已有多種微生物的植酸酶被分離定性。此外，在植酸酶的研究中的一個(gè)重要趨勢是篩選分離性質(zhì)更優(yōu)良的植酸酶。由于目前使用的植酸酶存在的一些缺陷，不能真正在胃腸道中充分發(fā)揮功能，因此，人們希望能夠找到這樣一種新的植酸酶其具有非常好的穩(wěn)定性，在動(dòng)物胃腸道中有非常高的活性，并且該植酸酶還能夠通過發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)，這樣可以使其成本大幅度的降低，從而能夠進(jìn)一步推廣該植酸酶的使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種具有高穩(wěn)定性和高水解功效的植酸酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植酸酶的基因。本發(fā)明的再一目的是提供含有上述基因的DNA重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供含有上述基因的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一目的是提供含有上述酶的飼料添加劑。根據(jù)本發(fā)明的植酸酶，其具有如SEQIDN0.1所示的氨基酸序列，其理論分子量46.1kDa，最適pH在4-5之間，最適溫度在50-60。C之間，比活在2400U/mg以上，在pH1.55.5之間都具有高的活性，且在pH110之間都具有良好的pH穩(wěn)定性。在人工胃液中具有良好的穩(wěn)定性和強(qiáng)的植酸水解能力。所述植酸酶可分離自耶爾森菌屬微生物(&wZ"ia)，優(yōu)選為羅氏耶爾森菌(;reW"iara/7^i)。本發(fā)明還提供了編碼上述植酸酶的基因，優(yōu)選地，其具有如SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供的植酸酶可以是a)具有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽；或b)由SEQIDNO.l所示的多肽序列經(jīng)過110氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生且具有植酸酶活性的多肽；或c)由SEQIDN0.2所示的核酸分子或其簡并序列所編碼的多肽；或一d)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDN0.2所示核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的核酸編碼且具有植酸酶活性的多肽；或e)與SEQIDNO.l所示的多肽序列具有至少70%同源性且具有植酸酶活性的多肽。具體地，本發(fā)明的植酸酶可由SEQIDNO.l所示的多肽序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(例如，一個(gè)或兒個(gè)，包括具體的點(diǎn)值，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者是處于中間的任一范圍，如2-3個(gè)、7-8個(gè)等等)氨基酸的取代、缺失和/或插入獲得，并仍然具有植酸酶活性。例如，一個(gè)常見的策略是保守氨基酸取代，即將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。.具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基在本領(lǐng)域己有明確定義。再如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因的克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如，在重組蛋白的表達(dá)策略中，為構(gòu)建融合蛋白、令重組蛋白分泌到胞外、增強(qiáng)其表達(dá)、便于純化或純化后與融合部分分離等目的，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、6His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、或蛋白水解酶(如Xa因子、凝血酶、腸激酶)識(shí)別位點(diǎn)等等。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解由于自然變異所致的遺傳多態(tài)性可在群體中的個(gè)體間存在。此類自然變異所產(chǎn)生的等位基因或天然變體一般可在植酸酶基因核苷酸序列中導(dǎo)致1~5%的差異。任何這種自然變異產(chǎn)生的等位基因或天然變體所編碼的相應(yīng)植酸酶蛋白活性不改變的此類氨基酸多態(tài)性也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也就是說，本發(fā)明也涉及由SEQIDN0.2所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽。另外，植酸酶蛋白可以為這樣的活性多肽，.優(yōu)選地，其包含至少83%、84%、85%、86%、87%、88%、或89%、90%、91%、92%、93%、94%,更優(yōu)選地，包含至少95%、96%、97%、98%、99%或更高地同源于本發(fā)明SEQIDNO.l所示的全長氨基酸序列的氨基酸序列，且其具有植酸酶活性。除上述具體點(diǎn)值之外，上述值中間的范圍和同一性值也包括在本發(fā)明中。例如，也包括使用任一上述值作為上限和/或下限組合而成的同一性值范圍。在兩個(gè)序列間比較序列并確定百分同源性為本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可利用任何數(shù)學(xué)算法完成，既有作為軟件可商購獲得的，也有整合在公共數(shù)據(jù)庫中的，例如多序列比對程序CLUSTALW和模塊分析程序BLOCKS,或NCBI的GenBank中所采用的BLAST服務(wù)器http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了針對所分析的具體序列如何優(yōu)化各程序中相應(yīng)的參數(shù)設(shè)置(如分值、字長、缺口罰分、權(quán)重等等)，可以獲得預(yù)期的同源性或同一性比對結(jié)果。利用GenBank中BLAST的缺省參數(shù)設(shè)置，本發(fā)明植酸酶蛋白與其它已知家族成員的序列比對結(jié)果如下表1:本發(fā)明植酸酶蛋白與已知植酸酶蛋白的一致性比較結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>另一方面，本發(fā)明涉及包含SEQIDN0.2所示核苷酸序列的植酸酶基因。本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于本發(fā)明的核苷酸序列之一，但其與本發(fā)明SEQIDN0.2所示核苷酸序列編碼相同的植酸酶蛋白。本發(fā)明也涉及由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDN0.2所示核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的核酸。優(yōu)選是由于天然變異所致的等位基因或天然變體。另外，本發(fā)明的核酸分子也可以具有這樣的核苷酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)具有如序列表中SEQIDNO.l所示的氨基酸序列。本發(fā)明的核酸分子可以是例如與SEQIDN0.2具有至少77%、78%、79%、80%、81°/。、82%、83%、84%,更優(yōu)選至少85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%,甚至更優(yōu)選地至少95%、96%、97%、98%、99%或更高地同源于本發(fā)明的核苷酸序列，其中包括使用任一上述點(diǎn)值作為上限和/或下限組合而成的同源性或同一性值范圍。利用GenBank中BLAST的缺省參數(shù)設(shè)置，本發(fā)明的植酸酶基因與其它已知家族成員的序列比對結(jié)果如下表2:本發(fā)明植酸酶基因與已知植酸酶基因的一致性比較結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明還提供了含有上述植酸酶編碼基因的DNA重組載體。術(shù)語"載體"是指這樣的核酸分子，其可轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸，例如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、粘粒等。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式包含本發(fā)明的核酸，這就是說重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)與目的核酸有效連接的調(diào)節(jié)序列。其中，"有效連接"是指目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后在宿主細(xì)胞中表達(dá))的方式連接。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、阻遏物結(jié)合位點(diǎn)、激活物結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控元件(例如，終止子、多聚腺苷酸化信號(hào)、或具有mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的其它元件)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解到表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于如對欲轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生由此處所述核酸所編碼的植酸酶蛋白質(zhì)，包括融合蛋白。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、酵母(如畢赤酵母、黑曲霉)、昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞、家蠶細(xì)胞，例如使用桿狀病毒表達(dá)載體)或植物細(xì)胞(如擬南芥、煙草、玉米等，如使用農(nóng)桿菌載體)中表達(dá)。從而，本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為任何原核或真核細(xì)胞，其包括但不限于上述的那些宿主細(xì)胞。優(yōu)選畢赤酵母細(xì)胞。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種甲醇酵母，能夠以甲醇作為唯一碳源進(jìn)行代謝。這個(gè)系統(tǒng)因?yàn)榫哂蟹浅８叩漠愒吹鞍妆磉_(dá)能力而聞名。作為一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有非常多的優(yōu)點(diǎn)，特別是后加工處理方面。如今已有許多的植酸酶基因在其中成功地表達(dá)，同樣本發(fā)明提供的新的植酸酶基因也得到成功表達(dá)。在搖瓶水平，誘導(dǎo)48h后在培養(yǎng)基上清植酸酶活性達(dá)到429U/mL,因此在發(fā)酵罐水平大量生產(chǎn)該植酸酶將會(huì)比較容易。同時(shí)本發(fā)明也提供了一個(gè)生產(chǎn)該植酸酶的畢赤酵母工程菌株。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以為真核生物細(xì)胞、優(yōu)選畢赤酵母細(xì)胞，或原核生物細(xì)胞、優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞)可用于產(chǎn)生(即表達(dá))植酸酶蛋白。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生植酸酶蛋白的方法。該方法包括在適于植酸酶表達(dá)的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已導(dǎo)入了編碼植酸酶蛋白的重組表達(dá)載體，或其基因組中已導(dǎo)入了編碼野生型或改變的植酸酶蛋白的基因)，直至產(chǎn)生植酸酶蛋白。該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離植酸酶蛋白。所以，本發(fā)明提供了在畢赤酵母中表達(dá)的重組植酸酶。為了測定該重組植酸酶的性質(zhì)，表達(dá)的植酸酶經(jīng)過了一系列的方法純化，最終達(dá)到電泳純。純的重組植酸酶分子量在46kDa，對植酸(鹽)底物具有高達(dá)2456±97U/mg活性。該重組酶的最適pH在4-5之間，最適溫度在50-6(TC。此酶在pH2~10之間都具有良好穩(wěn)定性，處理一小時(shí)后還保留有95%以上的活性。此重組酶對胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常強(qiáng)的抗性。以上性質(zhì)決定了該植酸酶將會(huì)有一個(gè)較好的應(yīng)用前景。進(jìn)一步，本發(fā)明的發(fā)明人將得到的羅氏耶爾森氏菌植酸酶基因連接到pGEM-Teasy載體上，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌JM109中，從而獲得'含有上述羅氏耶爾森氏菌植酸酶基因的大腸桿菌菌株，該大腸桿菌Eco//JM109-Y9己于2007年7月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2121。本發(fā)明還提供一種飼料添加劑，其包含上述植酸酶和/或宿主細(xì)胞，因此，本發(fā)明還涉及所述植酸酶在制備飼料添加劑中的用途，以及相應(yīng)的詞料添加劑，所述飼料添加劑以所述植酸酶多肽、表達(dá)植酸酶多肽的宿主細(xì)胞作為有效成分。所述詞料添加劑的有效成分可以是所述植酸酶多肽、表達(dá)植酸酶多肽的宿主細(xì)胞。所述飼料添加劑可制備為干粉或液體制劑，并且可額外地包括一種或多種酶制品，如角蛋白酶、脂解酶(如脂肪水解酶)、淀粉酶、磷酸酶、麥芽糖酶、轉(zhuǎn)化酶、木聚糖酶、羧甲基纖維素酶等等。除了植酸酶和/或產(chǎn)植酸酶微生物，本發(fā)明的飼料添加劑還可額外包括其它非致病性的有益微生物，例如益生菌乳酸菌、雙歧桿菌等，有助于消化和飼料吸收的酵母菌，有助于增重的米曲霉菌，能夠產(chǎn)生有益蛋白酶的枯草芽孢桿菌等等。根據(jù)以上所述，本發(fā)明所提供的新的植酸酶具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)高比活，合適的作用pH，強(qiáng)的植酸水解能力，良好的熱穩(wěn)定性，強(qiáng)的蛋白酶抗性，容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點(diǎn)都意味著新發(fā)現(xiàn)的植酸酶作為飼料添加劑，比以前所報(bào)道的植酸酶將會(huì)更有應(yīng)用價(jià)值。第一、高比活和強(qiáng)的植酸水解能力意味著生產(chǎn)同樣量的酶蛋白，可以降解更多的植酸，即降解同樣量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也將更低。第二、合適的作用pH意味著該植酸酶可以更好的在動(dòng)物腸道內(nèi)發(fā)揮作用。第三、良好的熱穩(wěn)定性意味著該酶在制粒加工的過程中不容易失活。第四、強(qiáng)的蛋白酶抗性意味著該植酸酶在動(dòng)物腸道內(nèi)可以穩(wěn)定的存在，而不被蛋白酶降解。最后，容易發(fā)酵生產(chǎn)說明，可以通過簡單的工業(yè)發(fā)酵大量生產(chǎn)該植酸酶，并用于飼料行業(yè)。我們所發(fā)明的來源于1^^'"&ra/^d新的植酸酶可以克服通常所使用的植酸酶的缺陷。因此，我們所發(fā)明的植酸酶將會(huì)帶來比較大的商業(yè)價(jià)值。圖1說明了重組酶的最適pH和pH穩(wěn)定性，縱坐標(biāo)表示相對活力(％)，以活性最高的和未處理的作為100%。圖2說明了重組酶的A:最適溫度和B:溫度穩(wěn)定性，縱坐標(biāo)表示相對活力(％)，以活性最高的和未處理的作為100%。.圖3說明了蛋白酶的穩(wěn)定性。圖4說明了蛋白酶人工胃液中的穩(wěn)定性。圖5:人工胃液中降解豆粕植酸。本發(fā)明所提供的攜帶羅氏植酸基的菌株(￡.co/z'JM109-Y9)已于2007年7月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2121。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，而并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1zy^^/植酸酶基因的克隆通常，同一家族的基因在蛋白和核酸序列上通過比對，可以找到部分比較保守的序列。所以在獲取同一家族的其他希望所獲得的基因序列時(shí)，相似性克隆是一種非常有效簡單的方法。根據(jù)植酸酶的分類，可以得到大部分細(xì)菌來源的植酸酶都屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。通過多序列比對程序CLUSTALW和模塊分析程序BLOCKS(http:〃blocks.fhcrc.org/blocks/make—blocks.html),在對大量組氨酸酸性磷酸酶進(jìn)行分析時(shí)，我們找到了組氨酸酸性磷酸酶蛋白序列中兩個(gè)保守區(qū)域RHGXRXP和HD區(qū)域?；谶@兩個(gè)保守區(qū)域，我們設(shè)計(jì)了如<1-1>所述的簡并引物用于從羅氏耶爾森氏菌基因組DNA中擴(kuò)增部分植酸酶序列。<1-1>部分植酸酶基因序列的獲得我們根據(jù)上述兩個(gè)保守區(qū)域RHGXRXP和HD、部分旁側(cè)序列以及密碼子偏好性，設(shè)計(jì)合成了如下的簡并性引物FI,5'-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3'(20mer)禾口RI,5'-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3'(20mer)，并以羅氏耶爾森氏菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。整個(gè)PCR的反應(yīng)條件為l個(gè)循環(huán)，95"，2分鐘；30個(gè)循環(huán)，95°C，30秒/退火溫度，44°C，30秒/72'C，1分鐘；最后在72。C延伸5分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)一系列的片段，即這些簡并引物擴(kuò)增出了許多片段。接下來對這些條帶進(jìn)行分析，通過TaKaRa.的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收與估計(jì)目的條帶大小(卯0bp左右)相符的片段，并用單引物對該回收的片段進(jìn)行檢測，確信該片段是由雙引物所擴(kuò)增出來的片段，再將其連結(jié)pGEMTeasy(Promega)載體，接著轉(zhuǎn)化大腸菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。篩選轉(zhuǎn)化子，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取檢測，并將含有目的片段的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA序列的測定。結(jié)果確定了901bp的DNA序列為目標(biāo)片段。<1-2>完整的植酸酶序列的克隆為了獲得完整的植酸酶基因序列，以上所獲得的901bp目的片段上游和下游的序列，分別通過熱不對稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)克隆得到。根據(jù)以上所獲得的目的片段序列，設(shè)計(jì)了用于TAIL-PCR的巢式特異性引物，它們分別為上游特異性引物(usp,upspecialprimer):uspl(5'-CTACCCCATCAAGAAAGGCCTGCCCTG-3');usp2(5'-CGGGTTCGCTGATCTATGTCTGCTTG-3');usp3(5'-CTCTGGGCGTTAAATACCCGGC-3');下游特異性弓i物(dsp，downspecialprimer):dsplC5'隱GTTGCCTGGCACCGCCTGAGTGGTG-3');dsp2。'隱CGCCCGCCATAAAGGCACTCCTTTGC-3');dsp3(5'-CCAAAGTGCTTTTCCTTGGTG-3')。另外一端的非特異性引物(AD，arbitrarydegenerateprimers)序列如下AD1(5'-NTCGASTWTSGWGTT誦3');AD6(5'-CAWCGICNGAIASGAA-3')。TAIL-PCR的反應(yīng)條件基本與Liuetal.1995(Liu，Y.G.，andR.F.Whittier.1995.ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomewalking.Genomics25:674~681)相同，故在此不再贅述。在整個(gè)循環(huán)過程中交錯(cuò)地使用高的、低的退火溫度，產(chǎn)物的一端是特異性引物，而另一端是AD引物。通過瓊脂糖凝膠電泳分析TAIL-PCR的產(chǎn)物，結(jié)果表明已知的901bp的上游我們獲得一段650bp的片段，下游我們也獲得了一段約780bp的片段。所獲得的這兩條片段，分別通過TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并將所回收的片段連接到pGEM-Teasy(Promega)載體。接著轉(zhuǎn)化大腸菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。篩選轉(zhuǎn)化子，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取檢測，并將含有目的片段的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA序列分析。以上所獲得的兩條片段序列和已知的片段序列都被輸入DNASTAR軟件，并通過序列拼接程序，將以上三條序列拼接成一條完整的序列。再使用ORFfind程序找到完整的植酸酶開放閱讀框。該閱讀框由1326bp組成，含有一段信號(hào)肽序列和成熟蛋白序列。<1-3>所獲得完整序列的分析所獲得的完整片段全長中含有一個(gè)完整的開放閱讀框1326bp(SEQIDN0.2)。該開放閱讀框編碼一段24aa的信號(hào)肽序列和417aa的成熟蛋白序列。通過SignalP程序[http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]，預(yù)測了信號(hào)肽，其最可能的切除位點(diǎn)在N端Ala24-Pro25之間。利用PeptideMass程序[http:〃cn.expasy.org/tools/peptide-masshtml]，還預(yù)測了除信號(hào)肽之外的成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的預(yù)測分子量為46.1kDa,歸屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。在NCBI的GenBank中利用BLAST服務(wù)器[http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]，對該基因序列進(jìn)行了相似性研究。結(jié)果表明該蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO.l)與GenBank中所有的蛋白質(zhì)序列相比，一致性最高的是來源于中間型耶爾森氏菌(7e^/m'a/",wwe&a)的植酸酶，一致性為82.4%。同時(shí)核酸序列也于GenBank中的核酸，列進(jìn)行了比對，一致性最高的也是來源于中間型耶爾森氏菌(:r^w力/a/"^meAa)的植酸酶基因，一致性為76.8%。因此可以確定這個(gè)來源于羅氏耶爾森氏菌的開放閱讀框編碼了一個(gè)新的植酸酶，所獲得的植酸酶基因?yàn)樾碌幕颉：推渌闹菜崦敢粯?，該植酸酶被命名為AppA(AcidPhosphataseA)。本發(fā)明的植酸酶及其編碼基因的序列分別為SEQIDNO.lDNHQRYVAVKMFYQTMDQL脂VEKLNLTTNPAGIIPIAVEGCENMGDDKLCQLETFEKKIAqVIEPACHISEQIDNO.2AAAATAGCCCAAGTGATAGAGCCAGCCTGCCATATTTAA<1-4>含植酸酶基因的菌種保藏羅氏耶爾森氏菌植酸酶基因的完整序列連接到pGEM-Teasy中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。該重組菌株被命名為Y9(五"/2er/c/n'flco//JM109-Y9)。己于2007年7月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2121。實(shí)施例2植酸酶AppA在畢赤酵母中的表達(dá)<2-1>表達(dá)載體的構(gòu)建為了獲得成熟蛋白的編碼區(qū)，設(shè)計(jì)合成了引物(YmF和YmR)。'帶有EcoRI禾tlNotl限制性酶切位點(diǎn)的引物YmF和YmR的序列在表4中列出。成熟蛋白的編碼區(qū)用引物YmF和YmR自羅氏耶爾森氏菌基因組DNA中擴(kuò)增。通過五coRI和iVwI酶切位點(diǎn)連接進(jìn)入表達(dá)載體pPIC9(Invitrogen,SanDiego)，構(gòu)建成酵母表達(dá)載體pPIC9-AppA。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于制備重組質(zhì)粒。表達(dá)質(zhì)粒載體DNA進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母。表4:擴(kuò)增成熟蛋白全長的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母菌株GS115(Irwitrogen)，根據(jù)畢赤酵母表達(dá)操作手冊，制備感受態(tài)細(xì)胞GS115。約8微克的表達(dá)質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶Sg/II進(jìn)行線性化，線性化的表達(dá)載體中加入80uL感受態(tài)細(xì)胞GS115,混合均勻，用Bio-RadGenePulser電擊儀電擊。電擊結(jié)束后立即加入lmL浴冷的1M的山梨醇，取300uL涂布于RDB培養(yǎng)基上。通過RDB平板篩選在基因組中插入了///S4的轉(zhuǎn)化子。RDB平板上沒有組氨酸，GS115中///S4也被破壞了，所以只有在GS115插入了///S4的轉(zhuǎn)化子才能在ROB平板上生長。在RDB平板上培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)化子被接種到BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)。接著培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)移到BMMY進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶。<2-3>轉(zhuǎn)化子植酸酶活性的檢測通過硫酸亞鐵鉬藍(lán)法，總共120個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了植酸酶活性的檢測。其測定過程如下在950PL的底物溶液(4uM的植酸鈉，溶解在0.25M的乙酸鈉緩沖液中，pH為4.5)加入50UL稀釋的酶，并混合均勻，在37°C反應(yīng)30分鐘。接著在以上反應(yīng)體系中加入lmL10。/。的TCA(三氯乙酸)使酶蛋白變性，終止以上反應(yīng)。對于空白對照而言，在酶液中先加入1mL10%的TCA，使酶蛋白失活，接著在加入950ixL的底物溶液，37'C放置30分鐘。等反應(yīng)終止后，再加入2mL的顯色液(0.576摩爾的硫酸，1%的鉬酸銨，7.32%的七個(gè)結(jié)晶水硫酸亞鐵，配置新鮮的使用)放置10分鐘。在700nm下檢測吸光值，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活單位。一個(gè)酶活單位指37'C時(shí)，1分鐘釋放lyM無機(jī)磷所需的酶蛋白的量。經(jīng)過兩天的甲醇誘導(dǎo)后，120個(gè)轉(zhuǎn)化子中有53轉(zhuǎn)化子被檢測到植酸酶活性，在培養(yǎng)基上清的酶活單位范圍約在41-429U/mL之間。明顯以上所獲得的開放閱讀框?yàn)橐粋€(gè)新的有功能的植酸酶基因，編碼一個(gè)新的具有植酸酶活性的蛋白。這個(gè)由以上開放閱讀框編碼的在酵母中表達(dá)的蛋白，被命名為r-AppA。實(shí)施例3重組植酸酶r-AppA的制備和純化為了純化酵母表達(dá)的重組植酸酶r-AppA，上清液酶活為429U/mL的轉(zhuǎn)化子在較優(yōu)的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下通過搖瓶培養(yǎng)。經(jīng)過兩天的誘導(dǎo)之后，利用實(shí)施例4所描述的方法檢測植酸酶活性，上清液的酶活達(dá)到927U/mL。經(jīng)過12000g離心10分鐘，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌體被去除。用0.22um的濾膜對上清液進(jìn)行抽真空處理，去掉上清液中其他的雜質(zhì)。對處理過的上清進(jìn)行硫酸銨沉淀，硫酸銨粉末被加入到上清液中，到達(dá)80%的飽和度，攪拌過夜。離心收集沉淀，沉淀用O.IM、pH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解。對溶解的沉淀溶液，再次離心，除去其中一些不溶的物質(zhì)。將所獲得的溶液裝入透析袋中，透析袋懸浮在O.IM、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，過夜透析處理，除去大量的鹽離子。透析后的樣品通過PEG8000進(jìn)一步濃縮處理后，2ml的濃縮液通過陰離子交換HiTrapQSepharoseXLFPLCcolumn(AmershamPharmaciaBiotech,Sweden)進(jìn)一步純化。O.IM、pH8.0的Tris-HCl含有1MNaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集目的峰尖的洗脫液5mL。將收集液電泳檢測，表明目的蛋白已被純化。實(shí)施例4萆組植酸酶r-AppA酶學(xué)性質(zhì)分析<4-1>重組植酸酶r-AppA的最適pH和pH穩(wěn)定性在不同的溫度和pH條件下，對純化的重組植酸酶r-AppA進(jìn)行了植酸酶活性研究。pH值對植酸酶的影響被確定了利用以下緩沖液甘氨酸-鹽酸pH1.5-3.5;乙酸鈉-乙酸pH3.5-6.0;Tris-鹽酸pH6.0-8.5;和甘氨酸-氫氧化鈉pH8.5-10。所有這些對純化的植酸酶溶液進(jìn)行稀釋的緩沖液中都含有0.05%BSA和0.05%Triton。取50nL稀釋好的酶液，分別在pH1.5-10.0測定酶活。如圖1所示植酸酶的活性隨pH值的變化而變化，計(jì)算相對酶活確定最適pH。測定條件下，重組酶的最適pH為4.0-5.0，pH4.5時(shí)酶活達(dá)到最大值。pH2.0-8.0之間都可檢測到活性。重組植酸酶的pH穩(wěn)定性如圖l所示。將純化的重組植酸酶稀釋到一定濃度，取10uL在pH1-10的緩沖液中，37t:放置lh。然后再在37°C、pH4.5的條件下測定酶活，通過計(jì)算相對酶活來比較重組酶對pH的穩(wěn)定性。該酶在pH2-10都非常穩(wěn)定，處理一小時(shí)后還保留有95%以上的活性。該酶具有極好的pH穩(wěn)定性，即使在pH1.0時(shí)仍然具有約80X的活性，即在動(dòng)物偏酸的條件下，pH對該酶的穩(wěn)定性沒有影響。<4-2>重組植酸酶r-AppA的最適溫度和熱穩(wěn)定性將純化的重組酶r-AppA稀釋到所示濃度，取50uL分別在10、20、30、40、45、50、55、60、70、8(TC溫度下測定酶活，計(jì)算相對酶活，以確定該酶的最適溫度。其結(jié)果如圖2A所示，該酶的最適溫度在50-60'C之間，優(yōu)選55"C。在20-7(TC之間保持較好的活性。將純化的重組酶r-AppA純酶稀釋到所示濃度，取2mL在8(TC保溫。接著分別在2、4、6、8、10min取出100PL酶液稀釋到所示濃度。在37°C，pH4.5的條件下測定酶活，以未處理的原酶液作為100%的對照，其測定結(jié)果如圖2B所示。<4-3>蛋白酶對重組植酸酶r-AppA活性的影響為了確定蛋白酶對重組植酸酶r-AppA活性的影響，純化的重組酶(0.1mg/mL)與0.01mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶等體積混合，保溫在37。C。接著分別在5、10、20、30、60、90、120min取樣。在37°C，pH4.5的條件下測定酶活性。以未用蛋白酶處理酶液做為100%的對照，計(jì)算相對酶活力。其結(jié)果如圖3所示，該重組植酸酶r-AppA對胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很強(qiáng)的抗性。因此，該植酸酶能夠穩(wěn)定的在動(dòng)物胃腸道中存在，不會(huì)被腸道蛋白酶降解。<4-4>重組植酸酶r-AppA比活的測定為了確定該植酸酶r-AppA的比活，首先通過Lowry方法確定了純化的重組酶r-A卯A的酶蛋白的濃度。并且重組酶r-A卯A酶活力單位，在37。C，pH4.5的條件下，通過硫酸亞鐵鉬藍(lán)法確定。通過計(jì)算，該重組植酸酶r-AppA的比活為2456±97U/mg。實(shí)施例5比較重組植酸酶r-AppA與商業(yè)化的植酸酶為了比較該植酸酶r-AppA與商業(yè)化的植酸酶，大腸桿菌植酸酶、黑曲霉植酸酶以及該重組植酸酶在畢赤酵母中表達(dá)后，分別進(jìn)一步被純化達(dá)到電泳純。因?yàn)槲甘侵菜崦钢饕l(fā)揮水解植酸釋放無機(jī)磷的部位，在胃液中的活性可以正確的反映植酸酶的水解能力。因此，被純化的酶蛋白進(jìn)一步分別研究了在人工胃液中的穩(wěn)定性及水解植酸的能力。<5-1>在人工胃液中的穩(wěn)定性比較相同單位的植酸酶分別加入到人工胃液中，植酸酶的終濃度為1U/ml人工胃液，在37'C處理20分鐘后，分別在最適pH條件下檢測剩余的植酸酶活性。結(jié)果表明羅氏耶爾森氏菌植酸酶剩余的植酸酶活性最高，達(dá)到75%的活性；大腸桿菌植酸酶只剩下30%的活性；黑曲霉植酸酶僅剩下最初酶活的20%左右(圖4)。因此，該植酸酶能夠更能穩(wěn)定的存在于單胃動(dòng)物的胃終存在，因?yàn)槟軌虻挚箯?qiáng)的酸性條件下的變性作用，同時(shí)又能抵抗高濃度的蛋白酶的水解作用。<5-2>在人工胃液中水解植酸能力的比較一克豆粕日糧溶解在9ml的人工胃液中，37。C振蕩20分鐘后，加入1ml用人工胃液稀釋好的植酸酶溶液(整個(gè)稀釋操作在冰上，以防止植酸酶在人工胃液中的降解)，37"C振蕩反應(yīng)1小時(shí)。通過檢測釋放的無機(jī)磷來衡量植酸酶的水解能力。為了進(jìn)一步模擬胃中的作用環(huán)境，同時(shí)做了pH梯度累積效果試驗(yàn)。結(jié)果表明羅氏耶爾森氏菌植酸酶釋放的無機(jī)磷是黑曲霉植酸酶的10.7倍，是大腸桿菌植酸酶的3.2倍(圖5)。羅氏耶爾森氏菌植酸酶釋放的無機(jī)磷都明顯大大高于目前兩個(gè)重要的商品化的植酸酶。因此，在強(qiáng)酸性和高蛋白酶濃度下該植酸酶對植酸有非常強(qiáng)的水解能力。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所〈120〉一種新的植酸酶及其編碼基因以及包含該酶的細(xì)胞和飼料添加劑<160>2<210〉1.〈211〉441<212>PRT<213>羅氏耶爾森菌(Yersiniarohdei)<400〉1MTVASYRLRLTPDKWPQWPVRLTGQAFLDGTLSQRYAKPFALSSTLAEIFLQQINTALVLGGLVFELWQHLCQLETFEKKPALALMLSSFKAGYLTPRGAVAPGCGLEVHAQMGEVLNFALLQNSQAMPDQRDAQGQTLPTO,RYVAVIAQVIEPACHALGAAPVITAQLVTLLGAFYYQADLKKTDPESPFCKSLQQVA冊RLSGAELSPQTKVLFL匿YQTMDQLIPAGYTLERVVGEYFRSQGLLLFHPVEAGVCKGKTCDFATFNWVSLLSLHNGGH圓IANIRNVEKLNLTTILSRHGVRSPPAGCPPEGTVKVDLAQTRQAAANEIDVNKDAQFDLMAKTPAGMLGANWQLNPAGIIPIAVTKQTQLMNEVYAQADIDQRTVEQRLGGPLTGTKISLTGPLYIARHKGTPLPQQPDNTPPGEGCE腦DDK60120180240300360420441<210〉2<211>1326<212>腿〈213〉羅氏耶爾森菌(Yersiniarohdei)〈400〉2atgacagtaggctcttggtgattttgagtc3C3CCtgatacaattagttacccgccggttcgcctaacagtatcaagctgaaggtagattacattgagccgaatctccttgcggccaatggcgctgtcatgttgcctggcgcccaatttgctgcaacagattatcaccgcgcagggatgtggggggttggaaaatgttttaatcctgccgctttgtcagcatttc犯gttatcgcggccccggtgtcatggtgtaatggccacaccctgttggggcccgccagaggcaggcctttagcccaaacagcgttatgctttgtaagtcaaattgacgtcaaccttggcaccgcctgagattt3atggcttaataccgctgggggcgaatatttgagctatcaaacaatggattattccttgagacttttctgcgattagataaccgcatcgttccccgatggccggtaggcattctataggtacggtttcUgatgggaactgacccgtcgtcaggcccaaaccttttactacaacaggaataaagactgagattttctggtgcggwc犯肌cgcctattggtattggcttttccttttggcaattattggcagcacggatcagctacattgcggttcga朋鄧a犯cccgcgctagccggccggttaaagccgggtggtgaatact"tstgcacaaggtagcaccagctattccaccgttgagcaacgctc卿tgggggEica^sattgttacaaaaattgggttttatatcgccccagcgcgatgggtggccatgccacaacaacccggataacccggaatgttggaaggttgtgatagcccaagccttaatgttatactttggacacagttaatatttaacgcctccgcagtcacagacstagagttgcggcctcggtggaagcggttgggagggag犯gtgctcctgtgattttctcgctaacactcgcaggccattattatcgccat犯aggctcaggggcaataccaatatcggataatacatcagcggtatgatagagccaagtagttttgcgcgtggttg朋tgaggtac哪ggcgcgggggttattgtcagcgaaccgg鄉(xiāng)tacatgggtgtttgtgcct"ttaaccgaattttgcttgccacctttggggccgctgcatgccggatgctgcataatcactcctttgaacattgccttgccaatattcccgccaggttgtggcsgtgcctgacaacttgatgacaagagcctgccat60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320132權(quán)利要求1.一種新的植酸酶，其特征在于，具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2、如權(quán)利要求1所述的植酸酶，其特征在于，所述植酸酶分離自耶爾森菌屬微生物。3、如權(quán)利要求2所述的植酸酶，其特征在于，所述植酸酶分離自羅氏耶爾森菌。4、編碼權(quán)利要求1所述植酸酶的基因。5、如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，具有如SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。6、一種DNA重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的基因。7、一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含如權(quán)利要求4所述的基因或如權(quán)利要求6所述的DNA重組載體。8、如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為真核生物細(xì)胞或原核生物細(xì)胞。9、如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。10、如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。11、如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2121。12、一種詞料添加劑，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的植酸酶和/或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明微生物涉及工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有高穩(wěn)定性和高水解功效的植酸酶及其編碼基因以及包含該酶的宿主細(xì)胞和飼料添加劑。該植酸酶具有如下性質(zhì)比活高達(dá)3456±97U/mg，良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，最適pH4.5，最適溫度55℃，強(qiáng)的蛋白酶抗性，且易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明也涉及含有所述基因的重組載體，含有所述載體的宿主細(xì)胞，利用基因工程方法產(chǎn)生植酸酶的方法。文檔編號(hào)A23K1/165GK101368175SQ20071012034公開日2009年2月18日申請日期2007年8月16日優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日發(fā)明者于會(huì)民,斌姚,昆孟,楊培龍,王亞茹,羅會(huì)穎,黃火清申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所