專利名稱：一種防治農(nóng)作物土傳病害的生防菌復(fù)配劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于防治農(nóng)作物土傳病害的生防菌復(fù)配劑及制備 方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，以溫室、大棚為主的設(shè)施 農(nóng)業(yè)發(fā)展迅速。土壤有害生物侵染農(nóng)作物根部和莖基部，造成農(nóng)作物 猝倒、根腐、立枯、枯萎等土傳病害的發(fā)生面積逐年擴(kuò)大。溫室、大 棚的多種蔬菜、水果、花卉等常年連作，土壤的溫、濕度、營養(yǎng)條件有利于土傳病菌繁殖，造成的損失通常達(dá)30%-40%，甚至絕產(chǎn)。由于 引起土傳病害的病原菌種類多，多數(shù)屬于兼性寄生菌，寄主范圍廣泛， 對土壤環(huán)境的適應(yīng)能力強，存活方式多樣，因此針對多種病原菌選育 具有廣譜抗性的抗病品種十分困難。利用化學(xué)農(nóng)藥處理土壤往往受到 地力、化學(xué)因素等影響而難以發(fā)揮作用，且污染嚴(yán)重，農(nóng)產(chǎn)品的安全 性難以得到保證。施用廣譜土壤熏蒸劑，會同時殺死土壤有益微生物， 失去自然控制的土傳病原菌會更加猖獗。因此，土傳病害己經(jīng)成為設(shè) 施農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要障礙。生物防治是控制土傳病害的有效方法，是通過調(diào)控根際有益和 有害微生物間的相互作用而達(dá)到防治土傳病害目的的，是一種對環(huán)境
友好、經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的方法。細(xì)菌和木霉菌在土傳病害的生物防治中 占有非常重要的地位。生防菌的重要優(yōu)勢在于它的種類和數(shù)量眾多， 在植物根際和地上部分都大量存在，幾乎每一種植物病原真菌都都能 找到一種或幾種有防治作用的細(xì)菌或木霉菌；它們作用方式較廣，可 以通過競爭作用、拮抗作用、寄生作用和誘導(dǎo)植物的抗性等對病原菌 產(chǎn)生影響；生防菌的優(yōu)勢還在于它具有驚人的繁殖速度，在適宜的條 件下，幾十分鐘就能分裂一次，這對于它們占領(lǐng)空間和生存競爭非常 有利；許多細(xì)菌和木霉菌存在于植物的根際和地上部分，與植物建立 了密切的聯(lián)系，在生物防治中具有很大的優(yōu)勢；細(xì)菌和木霉菌均可以 人工培養(yǎng)，便于控制研究和生產(chǎn)實踐中的操作。可用于植物病害生防 菌的種類很多，其中芽孢桿菌和木霉菌研究最為廣泛。我國利用枯草芽孢桿菌防治植物病害現(xiàn)已開發(fā)成功并投人生產(chǎn) 的商品制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等。利用哈氏木霉菌防治 植物病害現(xiàn)已開發(fā)成功并投人生產(chǎn)的商品制劑有特立克等。但到目前為止，尚未見有高效枯草芽孢桿菌與綠色木霉的微生物 復(fù)配制劑，也未見有大面積應(yīng)用于農(nóng)田防治土傳病害的微生物復(fù)配菌 制劑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服目前生產(chǎn)上防治土傳病害已 有技術(shù)的不足，通過篩選大量農(nóng)作物根際土壤拮抗微生物，分離出有 拮抗作用的枯草芽孢桿菌和有拮抗作用的綠色木霉菌，將枯草芽孢桿
菌和綠色木霉菌復(fù)配成微生物復(fù)配制劑。同時，研制出這種微生物復(fù) 配農(nóng)藥的制備方法。本發(fā)明技術(shù)解決方案的要點是利用從作物根際土壤分離出的枯草芽孢桿菌 (^g"77〃s s〃力"7i's)和綠色木霉菌(7yic力oafei7z s WnWe)，將其分別純化后轉(zhuǎn)致試管斜面內(nèi)作母菌劑。將枯草芽孢桿菌和綠色木霉菌的母菌劑在三角瓶內(nèi)分別進(jìn)行振 蕩發(fā)酵培養(yǎng)作為二級菌種。再將枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵制成發(fā)酵 液?？莶菅挎邨U菌和綠色木霉菌所采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基各種成分重 量比均為蔗糖30，酵母浸粉或酵母浸膏5，加水成1000，滅菌溫 度12rC、時間26分鐘，發(fā)酵溫度27。C-3CTC，發(fā)酵時間3-5天，枯 草芽孢桿菌濃度達(dá)到2X 10'" cfu / mL即可；綠色木霉孢子濃度達(dá)到 孢子含量1X10"個/ mL即可；將綠色木霉菌接種在燒杯內(nèi)固體培養(yǎng)基上，每100克固體培養(yǎng)基 接種10毫升二級菌種，發(fā)酵培養(yǎng)成種子粉。所采用的固體培養(yǎng)基成 分重量比為玉米碎粒10. 3、麥麩15. 5、稻殼5. 2、脲0. 1、水68. 9。， 滅菌溫度121°C、時間30分鐘，發(fā)酵溫度25°C-27。C，發(fā)酵時間7-10 天，以固體培養(yǎng)基表面全部長出綠色木霉孢子粉，培養(yǎng)基干透即可。防治土傳病害的生防菌復(fù)配劑組成成分按重量比為枯草芽孢桿菌(^2ci"^sWt^/is)發(fā)酵液(芽孢菌濃度2X10'" cfu / mL) 7-9;綠色木霉孢子粉(孢子含量1X1()8個/ g) 7-9;
硅藻土或輕質(zhì)碳酸鈣 60-80; 磷酸氫二鉀 1-3;木質(zhì)素磺酸鈉 2-5。利用從作物根際土壤分離到的枯草芽孢桿菌，采用液體發(fā)酵的方法制得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；利用從作物根際土壤分離到的綠色木霉 菌，采用先液體發(fā)酵、后固體發(fā)酵的方法制得綠色木霉孢子粉，用孢 子分離器吹掃并收集綠色木霉孢子粉；之后，先將枯草芽孢桿菌發(fā)酵 液按重量比7-9加入重量比為60-80的藻土或輕質(zhì)碳酸鈣，充分混 勻，再先后加入重量比為7-9的綠色木霉孢子粉、重量比為1-3的磷 酸氫二鉀、重量比為2-5的木質(zhì)素磺酸鈉，充分混合均勻；制成防治 土傳病害的生防菌復(fù)配劑。本發(fā)明微生物復(fù)配農(nóng)藥的有益效果如下1 、依據(jù)微生態(tài)學(xué)原 理，通過引進(jìn)微生物菌劑，操縱管理作物根圍生態(tài)環(huán)境中微生物群落 的合理分布，惡化病原菌的生存環(huán)境，結(jié)合栽培管理、農(nóng)業(yè)和化學(xué)防 治措施，形成一個穩(wěn)定的、平衡的、生物多樣化的作物生態(tài)系統(tǒng)，從 而有效地、較持久地控制土傳病害的流行。2 、微生物農(nóng)藥具有化 學(xué)藥劑所不具備的優(yōu)點，其控病作用機制主要為①優(yōu)勢種群的競 爭作用枯草芽孢桿菌和木霉菌均具有在作物植株上定殖能力強、繁 殖快的特點，能與病原菌有效競爭侵染位點，減少土傳病發(fā)病機率(參 見表1、表2)。②拮抗菌抗生作用枯草芽孢桿菌能分泌產(chǎn)生拮 抗素，能有效抑制土傳菌的生長、侵染和蔓延。③拮抗菌的誘導(dǎo)抗
性作用枯草芽孢桿菌和綠色木霉菌在施用后，均可以誘導(dǎo)作物植株 內(nèi)大量產(chǎn)生與抗病性有關(guān)的酶類，從而增強了作物植株抵御病原菌侵 入、蔓延的能力。3、可以將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與綠色木霉孢子粉 以任意比例進(jìn)行復(fù)配，選取恰當(dāng)?shù)膹?fù)配比例，就可以使本發(fā)明農(nóng)藥的 應(yīng)用達(dá)到既能發(fā)揮最佳藥效作用、又能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量和使用 次數(shù)、盡可能保持作物天然品質(zhì)的目的。4、經(jīng)測試表明，本發(fā)明復(fù) 配農(nóng)藥產(chǎn)品中的綠色木霉孢子粉與枯草芽孢桿菌的菌落數(shù)形成無相 互干擾作用，產(chǎn)品具有藥效穩(wěn)定、保持時間可達(dá)兩年。經(jīng)試驗表明， 本發(fā)明產(chǎn)品對環(huán)境安全，對人、畜無致病性，對農(nóng)作物病蟲害天敵安 全。


圖1為防治土傳病害的生防菌復(fù)配劑生產(chǎn)加工工藝流程圖。
具體實施方式
實施實例1:取作物根際土壤10克，加無菌水振蕩后梯度稀釋 至1萬倍制成土壤懸浮液，取1毫升此懸浮液加入9毫升含硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000 毫升)制成平板，在26。C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離純化獲得綠色木霉 菌(7yic力oflfe/7ag i/2>j'flfe)禾口枯草芽抱桿菌(5sciJJiAS si/^tiJj's), 轉(zhuǎn)移至試管斜面作母菌保存?？莶菅挎邨U菌和綠色木霉菌所用的二級菌種發(fā)酵液的培養(yǎng)基配 方均為酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法為分別
稱取酵母膏5克、蔗糖30克于大燒杯中，加入少量水并加熱使之完全溶化，再加水至1000毫升。滅菌溫度121'C、時間26分鐘，綠色 木霉菌發(fā)酵溫度為25t:，發(fā)酵時間為10天、枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度 為27"，發(fā)酵時間5天。分別制得兩種菌的懸浮液作為二級菌種。然后，將綠色木霉的二級菌種接種在500毫升燒杯內(nèi)固體培養(yǎng)基 上，每100克固體培養(yǎng)基接種10毫升二級菌種，用紙封口，發(fā)酵培 養(yǎng)成種子粉。所采用的固體培養(yǎng)基成分重量比為玉米碎粒10.3克、 麥麩15. 5克、稻殼5.2克、脲O. l克、水68.9毫升。滅菌溫度121 °C、時間30分鐘，發(fā)酵溫度25匸，發(fā)酵時間10天，以固體培養(yǎng)基 表面全部長出綠色木霉孢子粉，培養(yǎng)基干透即可。按重量比將制得的 枯草芽孢桿菌菌懸液(芽孢菌濃度2X10"'cfu / mL) 7克，加至60 克硅藻土中，使之充分吸附，再與綠色木霉孢子粉7克、磷酸氫二鉀 l克、木質(zhì)素磺酸鈉2克充分混勻，即制成防治土傳病害的生防菌復(fù) 配劑。將防治土傳病害的生防菌復(fù)配劑于播種時1: 50和1: 60拌土穴施，防治瓜類病害，防效分別達(dá)80%以上和75%以上。實施實例2:取作物根際土壤10克，加無菌水振蕩后梯度稀釋 至1萬倍制成土壤懸浮液，取1毫升此懸浮液加入9毫升含硫酸鏈霉 素的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000 毫升)制成平板，在26。C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離純化獲得綠色木霉 菌(7>\z'cAooferffla w>ic/e)禾口禾古草芽抱桿菌(5scj'JJys1 sl^WJj'5")，
轉(zhuǎn)移至試管斜面作母菌保存?？莶菅挎邨U菌和綠色木霉菌所用的二級菌種發(fā)酵液的培養(yǎng)基配 方均為酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法為分別 稱取酵母膏5克、蔗糖30克于大燒杯中，加入少量水并加熱使之完全溶化，再加水至1000毫升。滅菌溫投12rC、時間26分鐘，綠色 木霉菌發(fā)酵溫度為27°C，發(fā)酵時間為5天、枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度 為30°C，發(fā)酵時間3天。分別制得兩種菌的孢子懸浮液作為二級菌種。然后，將綠色木霉的二級菌種接種在500毫升燒杯內(nèi)固體培養(yǎng)基 上，每100克固體培養(yǎng)基接種10毫升二級菌種，用報紙封口，發(fā)酵 培養(yǎng)成種子粉。所采用的固體培養(yǎng)基成分重量比為玉米碎粒10.3 克、麥麩15. 5克、稻殼5. 2克、脲O. l克、水68.9毫升。滅菌時間 12rC、 30分鐘，發(fā)酵溫度26。C,發(fā)酵時間9天，以固體培養(yǎng)基表面 全部長出綠色木霉孢子粉，培養(yǎng)基干透即可。按重量比將制得的枯草芽孢桿菌菌懸液(芽孢菌濃度2X10'"cfu / mL) 8克，加至70克硅藻土中，使之充分吸附，再與綠色木霉孢 子粉8克、磷酸氫二鉀2克、木質(zhì)素磺酸鈉4克充分混勻，即制成防 治土傳病害的生防菌復(fù)配劑。將防治土傳病害的生防菌復(fù)配劑400倍液灌根處理，防治蔬菜土 傳病害，防效達(dá)70。/^以上。實施實例3:取作物根際土壤10克，加無菌水振蕩后梯度稀釋
至1萬倍制成土壤懸浮液，取1毫升此懸浮液加入9毫升含硫酸鏈霉 素的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000 毫升)制成平板，在26。C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離純化獲得綠色木霉 菌(7>\z'c/70<3fe_rffla i/ihcfe)禾口枯草芽抱桿菌(5sc272〃s 5"w/^j7is)， 轉(zhuǎn)移至試管斜面作母菌保存。二級菌種發(fā)酵液的培養(yǎng)基配方為酵母膏5克、蔗糖30克，水 1000毫升。制作方法為分別稱取酵母膏5克、蔗糖30克于大燒杯 中，加入少量水并加熱使之完全溶化，再加水至1000毫升。滅菌溫 度121°C、時間26分鐘，綠色木霉菌發(fā)酵溫度為27。C發(fā)酵時間為5 天、枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度為29°C，發(fā)酵時間4天。分別制得兩種 菌的孢子懸浮液作為二級菌種。然后，將綠色木霉的二級菌種接種在500毫升燒杯內(nèi)固體培養(yǎng)基 上，每100克固體培養(yǎng)基接種10毫升二級菌種，用報紙封口，發(fā)酵 培養(yǎng)成種子粉。所采用的固體培養(yǎng)基成分重量比為玉米碎粒10.3 克、麥麩15. 5克、稻殼5. 2克、脲0. 1克、水68. 9毫升。滅菌溫度 121°C、時間30分鐘，發(fā)酵溫度27t:，發(fā)酵時間9天，以固體培養(yǎng) 基表面全部長出綠色木霉孢子粉，培養(yǎng)基干透即可。按重量比將制得的枯草芽孢桿菌菌懸液(芽孢菌濃度2X10'Vfu / mL) 9克，加至80克硅藻土中，使之充分吸附，再與綠色木霉孢 子粉9克、磷酸氫二鉀3克、木質(zhì)素磺酸鈉5克充分混勻，即制成防 治土傳病害的生防菌復(fù)配劑。
將防治土傳病害的生防菌復(fù)配劑于播種時l: 50拌土穴施，防治 防效蔬菜土傳病害，防效達(dá)80%以上。實施實例4:取作物根際土壤10克，加無菌水振蕩后梯度稀釋 至1萬倍制成土壤懸浮液，取1毫升此懸浮液加入9毫升含硫酸鏈霉素的PM培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000 毫升)制成平板，在26X:下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離純化獲得綠色木霉 菌(7>_z'c/7(9ofera7a pa'j^'(ie)禾口'枯草芽抱桿菌(SsciWiAS sw^tih'50， 轉(zhuǎn)移至試管斜面作母菌保存?？莶菅挎邨U菌和綠色木霉菌所用的二級菌種發(fā)酵液的培養(yǎng)基配方均為酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法為分別稱取酵母膏5克、蔗糖30克于大燒杯中，加入少量水并加熱使之完全溶 化，再加水至1000毫升。滅菌溫度12rC、時間26分鐘，綠色木霉 菌發(fā)酵溫度為27'C發(fā)酵時間為5天、枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度為3(TC， 發(fā)酵時間3天。分別制得兩種菌的孢子懸浮液作為二級菌種。然后，將綠色木霉的二級菌種接種在500毫升燒杯內(nèi)固體培養(yǎng)基 上，每100克固體培養(yǎng)基接種10毫升二級菌種，用報紙封口，發(fā)酵 培養(yǎng)成種子粉。所采用的固體培養(yǎng)基成分重量比為玉米碎粒10.3 克、麥麩15. 5克、稻殼5. 2克、脲0. 1克、水68. 9毫升。滅菌溫度 12rC、時間30分鐘，發(fā)酵溫度27"C，發(fā)酵時間7天，以固體培養(yǎng) 基表面全部長出綠色木霉孢子粉，培養(yǎng)基干透即可。按重量比將制得 的枯草芽孢桿菌菌懸液(芽孢菌濃度2Xl(Tcfu / mL) 8.5克，加至78克輕質(zhì)碳酸鈣中，使之充分吸附，再與綠色木霉孢子粉8.5克、 磷酸氫二鉀2克、木質(zhì)素磺酸鈉4克充分混勻，即制成防治土傳病害 的生防菌復(fù)配劑。將防治土傳病害的生防菌復(fù)配劑于播種時1: 50拌土穴施，防治 經(jīng)濟(jì)作物土傳病害，防效達(dá)70%以上。
權(quán)利要求
1、一種用于防治農(nóng)作物土傳病害的生防菌復(fù)配劑，其特征是所含各種成分及重量比如下枯草芽孢桿菌(Bacillus，ubtilis)發(fā)酵液(芽孢菌濃度2×1010cfu/mL)7-9；綠色木霉孢子粉(孢子含量1×108個/g)7-9；硅藻土或輕質(zhì)碳酸鈣60-80；磷酸氫二鉀1-3；木質(zhì)素磺酸鈉 2-5。
2、 一種如上述權(quán)利要求1所述的用于防治農(nóng)作物土傳病害的生防菌復(fù)配劑的制備方法，其特征是利用從作物根際土壤分離到的枯 草芽孢桿菌，采用液體發(fā)酵的方法制得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；利用從 作物根際土壤分離到的綠色木霉菌，采用先液體發(fā)酵、后固體發(fā)酵的 方法制得綠色木霉孢子粉，用孢子分離器吹掃并收集綠色木霉孢子 粉；之后，按重量比，先將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液按重量比7-9加入 重量比為60-80的藻土或輕質(zhì)碳酸鈣，充分混勻，再先后加入重量比 為7-9的綠色木霉孢子粉、重量比為1-3的磷酸氫二鉀、重量比為 2-5的木質(zhì)素磺酸鈉，充分混合均勻；其中枯草芽孢桿菌和綠色木霉菌液體發(fā)酵所用的二級菌種培 基成分及重量比均為蔗糖30，酵母浸粉或酵母浸膏5，加水成1000， 滅菌溫度12rC、時間26分鐘，發(fā)酵溫度27。C-30°C，發(fā)酵時間3-5 天，枯草芽孢桿菌濃度達(dá)到2X10"'cfu / mL即可，綠色木霉孢子濃 度達(dá)到孢子含量lXl(f個/ mL即可；綠色木霉固體發(fā)酵所用的培養(yǎng)基各種成分及重量比為玉米碎粒 10.3、麥麩15. 5、稻殼5. 2、脲O. 1、水68. 9,滅菌溫度12rC、時 間30分鐘，發(fā)酵溫度25"C-27°C，發(fā)酵時間7-IO天，以固體培養(yǎng)基 表面全部長出綠色木霉孢子粉，培養(yǎng)基干透即可。
全文摘要
一種用于防治農(nóng)作物土傳病害的生防菌復(fù)配劑，其特征是所含各種成分及重量比如下枯草芽孢桿菌發(fā)酵液7-9；綠色木霉孢子粉7-9；硅藻土或輕質(zhì)碳酸鈣60-80；磷酸氫二鉀1-3；木質(zhì)素磺酸鈉2-5。通過對枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，再將具有一定菌含量的發(fā)酵液和綠色木霉孢子粉進(jìn)行復(fù)配，以硅藻土為載體，加入適量營養(yǎng)元素，制成微生物復(fù)配農(nóng)藥?？莶菅挎邨U菌與綠色木霉形成優(yōu)勢互補的作用，用于防治腐霉菌和鐮刀菌引起的猝倒病、立枯病、根腐病、枯萎病等農(nóng)作物土傳病害。產(chǎn)品無公害、藥效穩(wěn)定持久。
文檔編號A01N59/26GK101124915SQ20071015743
公開日2008年2月20日 申請日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者楊 張, 李興海, 王英姿, 祁之秋, 紀(jì)明山, 谷祖敏, 魏松紅 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)