專利名稱：：一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌s187的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187，其屬于微生物學中放線菌領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：放線菌是一類高(G+C)n/。的革蘭氏陽性細菌，由于其擁有獨特的合成多種結(jié)構(gòu)復雜的次級代謝產(chǎn)物的能力引起了人們的廣泛關(guān)注。許多放線菌的次級代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護方面的用途，已廣泛用作抗細菌、抗真菌和抗腫瘤藥物?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬種微生物來源的生物活性物質(zhì)中，約有70%是由放線菌所合成的。然而隨著從土壤放線菌中發(fā)現(xiàn)新的天然活性物質(zhì)的減少，再加上耐性菌的不斷產(chǎn)生，海洋放線菌資源成為發(fā)現(xiàn)新藥的新的來源。海洋約占地球表面積的71%，其中蘊藏著豐富的微生物資源，特殊復雜的海洋環(huán)境(高鹽度、高壓力、低溫及特殊的光照等)賦予海洋微生物產(chǎn)生不同于陸地微生物的特殊產(chǎn)物。在這些所謂生命的極限環(huán)境中，海洋放線菌已發(fā)展出獨特的代謝方式，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也提供了產(chǎn)生新穎抗生素的潛力。因此，海洋環(huán)境將成為放線菌和放線菌代謝產(chǎn)物的重要新來源。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有放線菌領(lǐng)域存在的問題，本發(fā)明利用海洋微生物資源，提供一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌，該海洋鏈霉菌對葡萄球菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母，黑曲霉和枯草芽孢桿菌等都具有良好的抗菌活性。本發(fā)明所涉及的一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌(拉丁文分類命名Streptomyces，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，CGMCC號2251，保藏日期2007年11月12日)分離自海泥樣品中，預處理方法為分散與差速離心法(DDC)，分離培養(yǎng)基為寡營養(yǎng)培養(yǎng)基M5，純化培養(yǎng)基為Bennett培養(yǎng)基，海洋鏈霉菌S187有黃色的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及白色的孢子，不產(chǎn)可溶性色素。海洋鏈霉菌S187具有廣譜抗菌活性，對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母和黑曲霉都有抗菌活性。海洋鏈霉菌S187從其基因組中擴增出I型聚酮合酶(PKSI)基因，并能產(chǎn)生聚酮化合物。為進一步對其其他的生物活性的研究機組和生物合成創(chuàng)造新的抗生素提供了基礎(chǔ)。上述的海洋鏈霉菌S187是從近海水域下20米處取得海泥樣品，采用分散與差速離心法(DDC)預處理方法及特異性的寡營養(yǎng)分離培養(yǎng)基(M5)分離出一株海洋鏈霉菌S187。通過對16SrDNA的鑒定結(jié)合生理生化試驗確定其種屬分類，對六種模式菌的抗菌試驗確定其抗菌活性，對其聚酮合酶I(PKSI)基因的擴增確定其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。采用分散與差速離心的方法，能夠有效地打散海泥樣品中集結(jié)的顆粒，使放線菌及其孢子能夠有效地釋放出來；使用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基M5(只含有瓊脂和海水)，能夠避免快速生長的細菌及其它放線菌的干擾，這與海洋環(huán)境寡營養(yǎng)的條件是一致的。本發(fā)明的有益效果是(1)海洋鏈霉菌S187具有廣譜抗菌活性，對供試菌株金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母，黑曲霉和枯草芽孢桿菌都有很好的抗菌活性。(2)從海洋鏈霉菌S187中擴增出的聚酮合酶I(PKSI)基因揭示了其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。圖1表明S187在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置。具體實施例方式一、分離海洋鏈霉菌S187及對其進行研究的工作步驟如下第一步菌種的分離2006年8月間從大連小平島海域水下20米處取得海泥樣品，樣品保存于冰盒中并立即帶回實驗室進行處理。樣品采用分散與差速離心(DDC)的方法，采用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基M5作為分離培養(yǎng)基，于28'C下培養(yǎng)一周，分離得到海洋鏈霉菌S187，采用Bennett培養(yǎng)基作為純化培養(yǎng)基。第二步抗菌活性抗菌活性測定培養(yǎng)基細菌用營養(yǎng)肉湯瓊脂，白色假絲酵母為麥芽汁瓊脂，霉菌采用察氏瓊脂。細菌于37'C培養(yǎng)24小時，真菌于32X:下培養(yǎng)48小時，采用瓊脂塊法初篩和發(fā)酵液復篩法進行抗菌活性測定，并記錄抑菌圈的大小。供試菌株金黃色葡萄球菌(1.89)，大腸桿菌(1.797)，銅綠假單胞菌(1.2031)，白色假絲酵母(2.538)，黑曲霉(3.2915)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(括號內(nèi)為菌種編號)，枯草芽孢桿菌由韓國明知大學徐胄源教授贈送。第三步菌種鑒定提取海洋鏈霉菌S187基因組DNA，采用細菌通用引物擴增16SrDNA并純化測序，測序結(jié)果通過NCBI的Blastn程序進行同源性比較，采用MEGA3.1軟件，用Neighbor-Joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株的培養(yǎng)特征和生理生化特征根據(jù)放線菌分類和鑒定手冊進行。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)唯一與海洋鏈霉菌S187有99%同源性的鏈霉菌為5^e;tow^cesc/m"gw/ze"w's(DSM41843)，而S.Awgw/^ra/s分離自韓國鹽湖，除了16SrDNA序列外，無其他相關(guān)的研究報道。形態(tài)比較結(jié)合生理生化試驗表明，S187與S^zw"gvv/^"^有很大區(qū)別，推測海洋鏈霉菌S187是51c/zw"gw/zera^的海洋變種。第四步聚酮合酶I(PKSI)基因的擴增。利用兼并引物5'-CCSCAGSAGCGCSTSCTSCTSGA-3'/5'-GTSCCSGTSCCGTGSGCCTCSA-3'對聚酮合酶基因進行擴增，成功得到陽性片段，進行轉(zhuǎn)化實驗并測序，將序列提交到GenBank得到序列號EU057563。二、海洋鏈霉菌S187采用瓊脂塊法抗菌實驗第一步放線菌和供試菌株的培養(yǎng)將海洋鏈霉菌S187在Bennett培養(yǎng)基中28。C下培養(yǎng)一周，可見菌體生成白色孢子。取含有孢子和基底菌絲的瓊脂塊在TSB培養(yǎng)基中進行液體培養(yǎng)，供試敏感細菌用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，白色假絲酵母為麥芽汁培養(yǎng)基，霉菌采用察氏培養(yǎng)基，細菌于37t:培養(yǎng)24小時，真菌于32"下培養(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。第二步將供試敏感菌株接種到各自相應的培養(yǎng)基中，方法為將固體培養(yǎng)基加熱溶化，冷卻至6CTC左右時加入100微升的相應的供試菌株，混勻，冷卻至培養(yǎng)基凝固。第三步用lml槍頭取下圓柱形已培養(yǎng)好的放線菌，倒置于己凝固的培養(yǎng)基中。細菌于37匸培養(yǎng)24小時，真菌于32。C下培養(yǎng)48小時。觀察抑菌圈的大小。下表列出了海洋鏈霉菌S187采用瓊脂塊法初篩的抑菌圈直徑(毫米)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、海洋鏈霉菌S187采用發(fā)酵液法抗菌實驗第一步放線菌和供試菌株的培養(yǎng)將海洋鏈霉菌S187在TSB液體培養(yǎng)基中28'C下培養(yǎng)一周，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分。將供試敏感菌株液體培養(yǎng)，細菌用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，白色假絲酵母為麥芽汁培養(yǎng)基，霉菌采用察氏培養(yǎng)基，細菌于37"C培養(yǎng)24小時，真菌于32'C下培養(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。第二步將供試菌株接種到各自相應的培養(yǎng)基中，方法為將固體培養(yǎng)基加熱溶化，冷卻至6(TC左右時加入100微升的相應的供試菌株，混勻，冷卻至培養(yǎng)基凝固。第三步用lml槍頭在己凝固的培養(yǎng)基打圓柱形孔，收集放線菌發(fā)酵液，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液300微升加入圓柱形孔中。細菌于37。C培養(yǎng)24小時，真菌于32'C下培養(yǎng)48小時。觀察抑菌圈的大小。發(fā)酵液抗菌實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>四、海洋鏈霉菌S187的聚酮合成酶序列及分析從S187中成功擴增出I型聚酮合酶基因PKS187，通過blastP進行序列分析發(fā)現(xiàn)，PKS187與很多鏈霉菌來源的重要抗生素的PKS基因片段具有較高的同源性，這些抗生素包括各種抗真菌、抗細菌藥物，抗結(jié)核藥物，以及抗腫瘤藥物。與其同源性最高的是最新發(fā)現(xiàn)的合成具有神經(jīng)再生功能的抗生素meridamycin的聚酮合成酶，進一步證實了其產(chǎn)生新型聚酮類化合物的可能性。這些序列分析的結(jié)果為進一步分析海洋鏈霉菌S187的其它生理活性提供了線索。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)表明，PKS187與EpoDCPce〃w/aw2AAF62883)，AbmECRce/Zw/oswmABK32259)及JerD(戶ce〃w/o犯wABK32290)處于一個分支，而與其它鏈霉菌來源的PKSI片段進化距離較遠，顯示了該序列的新穎性，為進一步研究這段PKSI基因的水平轉(zhuǎn)移奠定了基礎(chǔ)。本研究分離的序列也為以后篩選完整的PKSI基因簇和進一步的組合生物合成奠定基礎(chǔ)。五、海洋鏈霉菌S187和5^e;to附少c^c/zw"gw/^"w^的比較下面分別比較了海洋鏈霉菌S187和5^印tom少cayc/m"gw/zm^在抗菌活性、形態(tài)特性和生理生化特征方面的差別，結(jié)果表明，海洋鏈霉菌S187和S/re/7to/^casc^"gw/ze"^;s存在明顯差別，海洋鏈霉菌S187為一新的鏈霉菌菌株。1、海洋鏈霉菌S187對六種模式菌株都有很好的抗菌活性，而5^ptom;;c^cMmgw/zera!'s對六種模式菌均沒有活性。2、海洋鏈霉菌S187和51c/zw"gw/zm^在Bennett培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征示于下表。根據(jù)形態(tài)觀察，海洋鏈霉菌S187是一株鏈霉菌。在Bennett培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，海洋鏈霉菌S187有黃色的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及白色的孢子，不產(chǎn)色素；而5*.c^"gvv/^"s&有褐色的基內(nèi)菌絲，灰色的氣生菌絲和白色的孢子產(chǎn)，并產(chǎn)生黑色素。在耐鹽性方面，海洋鏈霉菌S187只能在含0%-6%NaCl的Bennett培養(yǎng)基上生長良好，在含9%和12%的Bennett培養(yǎng)基上，海洋鏈霉菌S187的生長受到抑制，而51.c/m"gw/2m^在含0。/。-12。/。NaCl的Bennett的培養(yǎng)基上生長良好。3、下表是海洋鏈霉菌S187和S.c/2w"gw/2e附&的生理生化試驗結(jié)果。所做的四種生理生化實驗中，海洋鏈霉菌S187和S.c/2""gvv/^"s/s有兩點顯著區(qū)別，海洋鏈霉菌S187不能水解淀粉，但是能產(chǎn)生H2S;5*.c/mwgw/^m/s能水解淀粉，但不能產(chǎn)生H2S。在唯一碳源實驗中，海洋鏈霉菌S187比S.c/z"wgw/^m/s能更好的利用葡萄糖，D-甘露糖和鼠李糖，但是不能利用木糖和甘露醇，但是S.dzw"gw/ze似/s能利用實驗中用到的所有唯一碳源生長，能被海洋鏈霉菌S187作為唯一碳源利用最好的是鼠李糖和醋酸鹽，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，果糖，D-甘露糖和棉子糖次之，相反，S.dra"gvv/^"Ws在葡萄糖酸鹽和果糖上生長的最好，在蔗糖，麥芽糖，肌醇，山梨醇，甘露醇，棉子糖和醋酸鹽上生長次之。海洋鏈霉菌S187在28。C時要比在2(TC時生長的更好，而海洋鏈霉菌S187在28。C和2(TC生長都很好，表明海洋鏈霉菌S187對低溫有更好的耐受性，這與其從海泥中分離的環(huán)境是一致的。權(quán)利要求1、一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187；其特征是分離自海泥樣品中，預處理方法為分散與差速離心法(DDC)，分離培養(yǎng)基為寡營養(yǎng)培養(yǎng)基M5，純化培養(yǎng)基為Bennett培養(yǎng)基，海洋鏈霉菌S187有黃色的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及白色的孢子，不產(chǎn)可溶性色素。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187;其特征在于具有廣譜抗菌活性，對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母和黑曲霉都有抗菌活性。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187;其特征在于從其基因組中擴增出I型聚酮合酶(PKSI)基因，并能產(chǎn)生聚酮化合物。全文摘要一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187，其屬于微生物學中放線菌領(lǐng)域。海洋鏈霉菌S187分離自近海水域水下20米處海泥樣品中，瓊脂塊法初篩證明該菌株對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母和黑曲霉都有很強的抗菌活性，發(fā)酵液復篩的結(jié)果證實了良好的拮抗大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌的活性。通過對其16SrDNA的分析表明，唯一與海洋鏈霉菌S187有高達99％的同源性的放線菌為韓國學者分離的鹽湖菌種Streptomyceschungwhensis(DSM41843)，但為第一次從海洋樣品中得到分離。從鏈霉菌S187的基因組中成功擴增出I型聚酮合酶(PKSI)基因，預示其具有產(chǎn)生聚酮化合物的潛在能力。文檔編號A01N63/00GK101302482SQ200710158478公開日2008年11月12日申請日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者矯文策,袁文杰,趙心清申請人:大連理工大學