專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于拮抗rage的方法及組合物的制作方法用于拮抗RAGE的方法及組合物相關(guān)申請(qǐng)交叉參考案本案根據(jù)35U.S.C.gll9(e)的規(guī)定主張2007年3月16日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)案第60/895,303號(hào)及2006年3月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)案第60/784,575號(hào)的優(yōu)先權(quán)，兩案的全文內(nèi)容均以引用方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域：
概括來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于與晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)特異性結(jié)合的抗體及其片段、關(guān)于將所述抗體及其片段投與到人類(lèi)患者及非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中以治療或預(yù)防RAGE相關(guān)疾病及病癥的方法。
背景技術(shù)：
：晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)是免疫球蛋白超家族的多配體細(xì)胞表面成員。RAGE由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單跨膜結(jié)構(gòu)域及胞質(zhì)尾巴組成。所述受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由一種V-型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域繼之以?xún)煞NC-型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。RAGE也以可溶性形式(sRAGE)存在。RAGE在包括肺、心臟、腎、骨骼肌及腦在內(nèi)的多種不同組織中由多種細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)，例如，內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。在諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及糖尿病腎病等慢性炎癥性狀態(tài)下表達(dá)增加。盡管還不清楚其生理功能，但其與炎癥性反應(yīng)有關(guān)并且在包括成肌細(xì)胞分化及神經(jīng)發(fā)育在內(nèi)的多種發(fā)育過(guò)程中起作用。RAGE是罕見(jiàn)的結(jié)合數(shù)種不同種類(lèi)內(nèi)源分子的模式識(shí)別受體，所述內(nèi)源分子導(dǎo)致多種細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞因子分泌、增加的細(xì)胞氧化劑應(yīng)激、神經(jīng)突增生及細(xì)胞遷移。RAGE的配體包括在長(zhǎng)期血糖過(guò)多狀態(tài)下形成的晚期糖化終產(chǎn)物(AGE)。然而，AGE僅為偶然性的病原性配體。除AGE夕卜，RAGE的已知配體包括具有為淀粉樣蛋白沉積及促炎介質(zhì)所特有的(3-折疊原纖維的蛋白質(zhì)，包括S100/鈣粒蛋白(例如，S100A12、S100B、S100A8-A9)、血清淀粉樣蛋白(SAA)(原纖維形式)、卩-淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)(AP)、及高遷移率族染色體蛋白B1(HMGB1，也稱(chēng)為兩性蛋白)。已在兩種鼠科動(dòng)物膿毒癥模型中顯示HMGB-1是后期致命性介體，并且認(rèn)為RAGE與諸如HMGB1等配體間的相互作用在膿毒癥及其它炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。數(shù)種重大人類(lèi)病癥與RAGE配體的增加產(chǎn)生或與RAGE本身的增加產(chǎn)生有關(guān)。這些病癥中許多得不到始終如一的有效治療。這些病癥包括(例如)許多慢性炎癥性疾病，包括風(fēng)濕性及銀屑病關(guān)節(jié)炎及腸病、癌癥、糖尿病及糖尿病腎病、淀粉樣變性、心臟血管疾病及膿毒癥。對(duì)于所述RAGE相關(guān)病癥來(lái)說(shuō)，具有安全且有效的治療將極為有益。膿毒癥是對(duì)感染的全身性炎癥性反應(yīng)(SIRS)，并且在甚至先前正常的患者中仍具有深遠(yuǎn)影響。膿毒癥由存在以下四種臨床體征中的至少兩種來(lái)界定體溫過(guò)低或過(guò)熱、心動(dòng)過(guò)速、呼吸急促、過(guò)速呼吸或白細(xì)胞像異常。伴有一種器官功能障礙/衰竭的膿毒癥定義為嚴(yán)重膿毒癥，并且伴有頑固性低血壓的嚴(yán)重膿毒癥為膿毒性休克。其它類(lèi)型的膿毒癥包括敗血癥及新生兒膿毒癥。在美國(guó)、歐洲及日本每年發(fā)生200多萬(wàn)例膿毒癥，估計(jì)年度費(fèi)用為170億美元且死亡率介于20-50%范圍內(nèi)。與未患膿毒癥的監(jiān)護(hù)病室(ICU)患者相比，膿毒癥幸存患者的ICU停留平均延長(zhǎng)65n/。。盡管最近市場(chǎng)進(jìn)入及醫(yī)院護(hù)理不斷改良，但膿毒癥仍然是重要的未滿(mǎn)足醫(yī)療需要的病癥。膿毒癥患者的治療是時(shí)間及資源密集型治療。新藥齊IK包括引入XIGRIS⑧)對(duì)結(jié)果的效應(yīng)一般。所述綜合征繼續(xù)展示20-50%的死亡率。能夠衰退早期膿毒癥到嚴(yán)重膿毒癥或膿毒性休克進(jìn)展的安全且耐受良好的治療劑可提供膿毒癥治療的突破。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于預(yù)防及治療RAGE相關(guān)疾病及病癥(例如，膿毒癥、糖尿病及糖尿病相關(guān)病變、心臟血管疾病及癌癥)的新穎免疫試劑，具體來(lái)說(shuō)，是與RAGE結(jié)合的治療性抗體試劑。本發(fā)明的代表性抗體包括與RAGE特異性結(jié)合的抗體(即，抗RAGE抗體)，其與XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7、或XT-M4抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE或與結(jié)合XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7、或XT-M4抗體的RAGE的表位結(jié)合。本發(fā)明的其它代表性抗RAGE抗體可包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述抗體的RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明抗RAGE抗體可姐斷RAGE體配偶體的結(jié)合。例如，本發(fā)明抗RAGE抗體可包含(a)XT-H1—VL(SEQIDNO:19)、XT-H2—VL(SEQIDNO:22)、XT-H3—VL(SEQIDNO:25)、XT-H5—VL(SEQIDNO:23)、XT-H7—VL(SEQIDNO:27)、或XT-M4—VL(SEQIDNO:17)的輕鏈可變區(qū)；(b)具有與SEQIDNO:19、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:17的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(c)(a)或(b)中的抗體的RAGE結(jié)合片段。作為另一實(shí)例，本發(fā)明抗RAGE抗體可包含(a)IXT-H1—VH(SEQIDNO:18)、XT-H2VH(SEQIDNO:21)、XT-H3一VH(SEQIDNO:24)、XT-H5—VH(SEQIDNO:20)、XT-H7—VH(SEQIDNO:26)、或XT-M4—VH(SEQIDNO:16)的重鏈可變區(qū)；(b)具有與SEQIDNO:18、SEQIDNO:21、SEQIDNO:24、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、或SEQIDNO:16的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或(c)(a)或(b)中的抗體的RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明進(jìn)一步提供具有任何一個(gè)上述輕鏈可變區(qū)及任何一個(gè)上述重鏈可變區(qū)的抗RAGE抗體。例如，本發(fā)明抗RAGE抗體可為嵌合抗體或其RAGE結(jié)合片段，其具有與XT-M4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:17)至少90%—致的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列、與XT-M4重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:16)至少90%—致的重鏈可變區(qū)氨基酸序列、及源自人類(lèi)恒定區(qū)的恒定區(qū)，例如具有以下的抗體具有XT-M4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:17)的輕鏈可變區(qū)、具有XT-M4重鏈可變區(qū)序列氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重鏈可變區(qū)、人類(lèi)k輕鏈恒定區(qū)及人類(lèi)IgGl重鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的其它代表性抗RAGE抗體包括人類(lèi)化抗體，例如，具有與氨基酸序列XT-H2—hVL一V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—hVL一V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2—hVL—V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2—hVL—V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—hVL—V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—hVL—V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4hVL_V2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL_V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4—hVL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4—hVL_V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4hVL—V2.10(SEQIDNO:45)、XT-M4—WLV2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4—hVL_V2.12(SEQIDNO:47)、XT掘一hVL—V2.13(SEQIDNO:48)、或XT-M4—hVL_V2.14(SEQIDNO:49)至少90%—致的人類(lèi)化輕鏈可變區(qū)的抗體。作為另一實(shí)例，人類(lèi)化抗RAGE抗體可包含與氨基酸序列XT-H2—hVH—V2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2_hVH_V2.7(SEQIDNO:29)、XT陽(yáng)H2一hVH一V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—WH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4一hVH—V1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、或XT-M4_hVH—V2.0(SEQIDNO:38)至少90%一致的人類(lèi)化重鏈可變區(qū)。人類(lèi)化抗體可為半人類(lèi)抗體(即，其中僅輕鏈及重鏈可變區(qū)之一經(jīng)人類(lèi)化)或完全人類(lèi)化抗體(即，其中輕鏈及重鏈可變區(qū)二者均經(jīng)人類(lèi)化)。本文所揭示的其它代表性人類(lèi)化抗RAGE抗體包括人類(lèi)化XT-M4抗體及人類(lèi)化XT-H2抗體。本發(fā)明還進(jìn)一步提供含有如下CDR的抗RAGE抗體，所述CDR具有以下特征中的至少八個(gè)(a)在VHCDRl中的氨基酸序列為Y-X-M(Y32;X33;M34)，其中X優(yōu)選為W或N;(b)在VHCDR2中氨基酸序列為I-N-X二S(151;N52;X53及S54)，其中X為P或N;(c)在VHCDR2中位置58上的氨基酸為蘇氨酸；(d)在VHCDR2中位置60上的氨基酸為酪氨酸；(e)在VHCDR3中位置103上的氨基酸為蘇氨酸；(f)在VHCDR3中存在一或多個(gè)酪氨酸殘基；(g)在VLCDRl中位置24上為帶正電荷的殘基(Arg或Lys);(h)在VLCDRl中位置26上為親水性殘基(Thr或Ser);(i)在VLCDR1中位置25上為小殘基Ser或Ala;(j)在VLCDR1中位置33上為帶負(fù)電荷的殘基(Asp或Glu);(k)在VLCDR1中位置37上為芳香族殘基(Phe或Tyr或Trp);(I)在VLCDR2中位置57上為親水性殘基(Ser或Thr);(m)在VLCDR3的末端為P-X-T序列，其中X可為疏水性殘基Leu或Trp;其中氨基酸位置分別如SEQIDNO:22及SEQIDNO:16中的輕鏈及重鏈氨基酸序列中所示。本發(fā)明也提供編碼任何所揭示抗RAGE抗體或抗體可變區(qū)的經(jīng)分離核酸、及與具有如下核苷酸序列的核酸在嚴(yán)格雜交條件下特異性雜交的經(jīng)分離核酸所述核苷酸序列為編碼任何所揭示抗RAGE抗體或抗體可變區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的經(jīng)分離核酸進(jìn)一步包括(a)編碼狒狒、猴或兔RAGE蛋白的核酸，所述RAGE蛋白具有選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、及SEQIDNO:13組成的群組的氨基酸序列；(b)與(a)的所述互補(bǔ)序列特異性雜交的核酸；及(c)當(dāng)詢(xún)問(wèn)覆蓋度(querycoverage)為100%時(shí)，具有與編碼狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列95%—致的核苷酸序列的核酸，所述編碼狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列選自由SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、及SEQIDNO:12組成的群組。本發(fā)明也包括預(yù)防或治療患有RAGE相關(guān)疾病或病癥的個(gè)體所述疾病或病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的本發(fā)明抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明包括預(yù)防或治療RAGE相關(guān)疾病或病癥的方法，所述RAGE相關(guān)疾病或病癥選自由下列組成的群組膿毒癥、膿毒性休克(包括導(dǎo)致膿毒癥或膿毒性休克的病狀，例如社區(qū)獲得性肺炎)、利斯特菌病、炎癥性疾病、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性急性炎癥性疾病、心臟血管疾病、勃起功能障礙、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病變、及神經(jīng)病變。本發(fā)明所述方法可包含投與組合物，所述組合物包含本發(fā)明抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段與一或多種可用于治療所述待要治療的RAGE相關(guān)疾病或病癥的藥劑。本發(fā)明所述藥劑包括抗生素、消炎劑、抗氧化劑、卩-阻斷劑、抗血小板劑、ACE抑制劑、降脂劑、抗血管生成劑、及化學(xué)治療劑。本發(fā)明提供治療人類(lèi)個(gè)體膿毒癥、膿毒性休克、或利斯特菌病(例如，全身性利斯特菌病)的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的嵌合抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段，所述嵌合抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段包含具有XT-M4輕鏈可變區(qū)氨基酸序歹i」(SEQIDNO:17)的輕鏈可變區(qū)、具有XT-M4重鏈可變區(qū)序列氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重鏈可變區(qū)、人類(lèi)K輕鏈恒定區(qū)、及人類(lèi)IgGl重鏈恒定區(qū)。圖1A-1C顯示小鼠、大鼠、兔(兩種同種型)、狒狒、食蟹猴及人類(lèi)RAGE的比對(duì)氨基酸序列(SEQIDNO:3、14、11、13、7、9、1)。圖2是來(lái)自直接結(jié)合ELISA的數(shù)據(jù)的曲線圖，其展示XT-H2與hRAGE的結(jié)合(EC50值為90pM)及XT-M4與hRAGE-Fc的結(jié)合(EC50值為300pM)。圖3是來(lái)自直接結(jié)合ELISA分析的數(shù)據(jù)的曲線圖，其展示抗體XT-M4及XT-H2與hRAGEV-結(jié)構(gòu)域-Fc的結(jié)合(EC50值為100pM)。圖4是來(lái)自配體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定的數(shù)據(jù)的曲線圖，其顯示XT-H2及XT-M4阻斷HMG1與hRAGE-Fc結(jié)合的能力。圖5是來(lái)自抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定的數(shù)據(jù)的曲線圖，其顯示XT-H2及XT-M4共享類(lèi)似表位并與人類(lèi)RAGE上的重疊位點(diǎn)結(jié)合。圖6顯示鼠科動(dòng)物抗RAGE抗體XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5及XT-H7、及大鼠抗RAGE抗體XT-M4的重鏈可變區(qū)的比對(duì)氨基酸序列(SEQIDNO:18、21、24、20、26、16)。圖7顯示鼠科動(dòng)物抗RAGE抗體XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5及XT-H7、及大鼠抗RAGE抗體XT-M4的輕鏈可變區(qū)的比對(duì)氨基酸序列(SEQIDNO:'19、22、25、23、27、17)。圖8顯示編碼狒狒RAGE的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:6)。圖9顯示編碼食蟹猴RAGE的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:8)。圖10顯示編碼兔RAGE同種型1的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:10)。圖11顯示編碼兔RAGE同種型2的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。圖12A-12E顯示編碼狒狒RAGE的經(jīng)克隆狒狒基因組DNA的核苷酸序列(克隆體18.2)(SEQIDNO:15)。圖13呈現(xiàn)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定所測(cè)定的四個(gè)曲線圖，其顯示嵌合XT-M4抗體及大鼠抗體XT-M4阻斷RAGE配體HMGBl、淀粉樣蛋白卩1-42肽、S100-A及S100-B與hRAGE-Fc結(jié)合的能力。圖14呈現(xiàn)通過(guò)抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定所測(cè)定的曲線圖，其顯示嵌合XT-M4與抗體XT-M4及XT-H2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hRAGE-Fc的能力。圖15繪示食蟹猴、兔及狒狒肺組織的IHC-染色，其顯示XT-M4與這些組織中的內(nèi)源細(xì)胞表面RAGE結(jié)合。對(duì)照樣品是表達(dá)通過(guò)XT-M4接觸的hRAGE的CHO細(xì)胞、不表達(dá)RAGE的NGBCHO細(xì)胞、及表達(dá)通過(guò)對(duì)照IgG抗體接觸的hRAGE的CHO細(xì)胞。圖16顯示大鼠抗體XT-M4與正常人類(lèi)肺及患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的人類(lèi)肺中的RAGE結(jié)合。圖17顯示人類(lèi)化鼠科動(dòng)物XT-H2HV區(qū)域的氨基酸序列。圖18顯示人類(lèi)化鼠科動(dòng)物XT-H2HL區(qū)域的氨基酸序列。圖19顯示人類(lèi)化大鼠XT-M4HV區(qū)域的氨基酸序列。圖20A-20B顯示人類(lèi)化大鼠XT-H2HL區(qū)域的氨基酸序列。圖21繪示用于制造人類(lèi)化輕鏈及重鏈多肽的表達(dá)載體。圖22顯示通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定的人類(lèi)化XT-H2抗體與人類(lèi)RAGE-Fc結(jié)合的ED50值。圖23顯示通過(guò)BIACORETM結(jié)合測(cè)定而測(cè)定的XT-M4及人類(lèi)化抗體XT-M4-V10、XT-M4-V11及XT-M4-V14與hRAGE-SA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(ka及k》及締合和解離常數(shù)(Ka及Kd)。屈24顯示通過(guò)BIACORETM結(jié)合測(cè)定而測(cè)定的XT-M4及人類(lèi)化抗體XT-M4-V10、XT-M4-V11及XT-M4-V14與mRAGE-SA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(ka及k》及締合和解離常數(shù)(Ka及Kd)。圖25顯示鼠科動(dòng)物XT-H2VL-VHScFv構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:51)。圖26顯示鼠科動(dòng)物XT-H2VH-VLScFv構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:52)。圖27顯示大鼠XT-M4VL-VHScFv構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:54)。圖28顯示大鼠XT-M4VH-VLScFv構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:53)。圖29是ELISA數(shù)據(jù)圖，其顯示VL/VH或VH/VL構(gòu)型的XT-H2及XT-M4抗RAGE抗體的ScFv構(gòu)建體與人類(lèi)RAGE-Fc結(jié)合。圖30是ELISA數(shù)據(jù)圖，其顯示以可溶性蛋白在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)的VL/VH或VH/VL構(gòu)型的XT-H2及XT-M4抗RAGE抗體的ScFv構(gòu)建體與人類(lèi)RAGE-Fc及BSA結(jié)合。ActRIIb是作為陰性對(duì)照自相同載體表達(dá)的非結(jié)合蛋白。圖31示意性地展示使用PCR將摻加突變引入到XT-M4的CDR中。圖32顯示XT-M4VL-VHScFv構(gòu)建體的C末端核苷酸序列(SEQIDNO:56)。VH-CDR3加以下劃線。也顯示兩種摻加寡核苷酸(SEQIDNO:57-58)，每一突變位點(diǎn)上具有可識(shí)別用于所述位點(diǎn)突變的摻加比的數(shù)字。也可識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述數(shù)字的摻加比的核苷酸組成。圖33示意性地展示核糖體展示載體pWRIL-3。"T7"表示T7啟動(dòng)子，"RBS"是核糖體結(jié)合位點(diǎn)，"間隔多肽"是將折疊蛋白與核糖體連接的間隔多肽，"Flag-標(biāo)簽"是用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的Flag表位標(biāo)簽。圖34示意性地展示噬菌體展示載體pWRIL-1。圖35示意性地展示使用Fab展示載體pWRIL-6來(lái)組合裝配VL及VH摻加文庫(kù)。圖36是抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA數(shù)據(jù)的曲線圖，其顯示在去除位置52上的糖基化位點(diǎn)的突變后XT-M4抗體對(duì)于hRAGE的親和力增加。圖37是存活率圖，其顯示與野生型對(duì)照動(dòng)物相比純合及雜合RAGE基因剔除小鼠及給與抗RAGE抗體的小鼠在CLP后顯示存活優(yōu)勢(shì)。圖38是顯示CLP后腸道細(xì)菌組織菌落計(jì)數(shù)的圖。圖39是存活率圖，其顯示抗RAGE抗體的兩種不同劑量對(duì)CLP后小鼠存活的效果。圖40是存活率圖，其顯示在CLP后將抗RAGE抗體的單次劑量延遲長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)的效果。'圖41顯示與野生型對(duì)照動(dòng)物相比自受感染純合及雜合RAGE基因剔除小鼠及受感染的給與抗RAGEmAb的小鼠的肝及脾分離的單核細(xì)胞增生性利斯特菌(丄.mo"oc_y的含量。圖42是顯示與野生型對(duì)照動(dòng)物相比受感染純合及雜合RAGE基因剔除小鼠及受感染的給與抗RAGE抗體的小鼠的干擾素Y的血清含量的圖。圖43是存活率圖，其顯示與野生型對(duì)照動(dòng)物相比純合及雜合RAGE基因剔除小鼠在CLP后的存活優(yōu)勢(shì)。圖44是存活率圖，其顯示與野生型對(duì)照動(dòng)物相比給與抗RAGE抗體單次注射的小鼠在CLP后的存活優(yōu)勢(shì)。圖45是存活率圖，其顯示在CLP后將抗RAGE抗體的單次劑量延遲6小時(shí)或12小時(shí)的效果。圖46是顯示與對(duì)照動(dòng)物相比給與抗RAGE抗體的小鼠具有改良的病理學(xué)分?jǐn)?shù)的圖。圖47是存活率圖，其顯示給與抗RAGE抗體與抗生素的小鼠在CLP后的存活率。圖48是存活率圖，其顯示單獨(dú)給與抗生素的小鼠在CLP后的存活率。圖50是顯示受感染純合及雜合RAGE基因剔除小鼠及給與抗RAGE抗體的小鼠的肝及脾中的單核細(xì)胞增生性利斯特菌的圖。圖51是顯示單次靜脈內(nèi)投與到小鼠中后嵌合XT-M4的血清濃度的圖。圖52顯示在CLP模型中嵌合XT-M4抗體具有保護(hù)性。圖53顯示在手術(shù)后長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)嵌合XT-M4抗體在CLP模型中具有保護(hù)性。具體實(shí)施例方式抗RAGE抗體本發(fā)明提供與RAGE(包括本文所述的可溶性RAGE及內(nèi)源分泌型RAGE)特異性結(jié)合的抗體。代表性抗RAGE抗體可包含至少一種SEQIDNO:16-49中所示的抗體可變區(qū)氨基酸序列。本發(fā)明抗RAGE抗體包括與RAGE特異性結(jié)合并具有與SEQIDNO:16-49的任何一種氨基酸序列一致或基本一致的氨基酸序列的抗體?；疽恢碌目筊AGE抗體的氨基酸序列是與SEQIDNO:16-49的任何一種氨基酸序列具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%—致性者。本發(fā)明抗RAGE抗體包括如下抗體與RAGE特異性結(jié)合，且(a)包含選自由SEQIDNO:19,22、25、23、27及17組成的群組的輕鏈可變區(qū)，或(b)包含具有與SEQIDNO:19、22、25、23、27及17的任何一種氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或?yàn)?a)或(b)中的抗體的RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明抗RAGE抗體也包括如下抗體與RAGE特異性結(jié)合，且(a)包含選自由SEQIDNO:18、21、24、20、26及16組成的群組的重鏈可變區(qū)，或(b)包含具有與SEQIDNO:18、21、24、20、26及16的任何一種氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或?yàn)?a)或(b)中的抗體的RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明包括如下抗RAGE抗體與RAGE特異性結(jié)合，且(a)與選自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE;(b)與RAGE的表位結(jié)合，所述RAGE的表位與選自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體結(jié)合；(c)包含選自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);或(d)為(a)、(b)或(c)中的抗體的RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明包括與表達(dá)RAGE的細(xì)胞在活體外及活體內(nèi)特異性結(jié)合的抗RAGE抗體及抗體與人類(lèi)RAGE結(jié)合，其解離常數(shù)(Kd)介于至少約1x10—7M至約1x10—1()M的范圍。也包括與人類(lèi)RAGE的V結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的本發(fā)明抗RAGE抗體及阻斷RAGE與RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)結(jié)合的抗RAGE抗體。本發(fā)明也包括如下抗體與RAGE特異性結(jié)合并且阻斷RAGE與RAGE結(jié)合配偶體(例如配體，例如HMGB1、AGE、A卩、SAA、S100、兩性蛋白、S100P、S100A(包括S100A8及S100A9)、S100A4、CRP、(32-整聯(lián)蛋白、Mac-1及p150，95)結(jié)合，且含有具有以下特征中的四個(gè)或更多個(gè)特征的CDR(位置編號(hào)是關(guān)于圖6及7中所示VH及VL序列的氨基酸位置)1.在VHCDR1中的氨基酸序列為Y-X-M(Y32;X33;M34)，其中X優(yōu)選為W或N;2.在VHCDR2中氨基酸序列為I-N-X-S(151;N52;X53及S54)，其中X為P或N;3.在VHCDR2中位置58上的氨基酸為蘇氨酸；4.在VHCDR2中位置60上的氨基酸為酪氨酸；5.在.VHCDR3中位置103上的氨基酸為蘇氨酸；6.在VHCDR3中存在一或多個(gè)酪氨酸殘基；7.在VLCDR1中位置24上為帶正電荷的殘基(Arg或Lys);8.在VLCDR1中位置26上為親水性殘基(Thr或Ser);9.在VLCDR1中位置25上為小殘基Ser或Ala;10.在VLCDR1中位置33上為帶負(fù)電荷的殘基(Asp或Glu);11.在VLCDR1中位置37上為芳香族殘基(Phe或Tyr或Tip);12.在VLCDR2中位置57上為親水性殘基(Ser或Thr);13.在VLCDR3的末端為P-X-T序列，其中X可為疏水性殘基Leu或Trp。本發(fā)明抗RAGE抗體包括如下抗體與人類(lèi)RAGE的V結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合并且阻斷RAGE與其配體結(jié)合且含有具有13個(gè)特征中的5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)或全部特征的CDR。本發(fā)明抗RAGE抗體包括上文所述抗RAGE抗體或選自由下列組成的群組的RAGE結(jié)合片段嵌合抗體、人類(lèi)化抗體、單鏈抗體、四聚體抗體、四價(jià)抗體、多特異性抗體、結(jié)構(gòu)域特異性抗體、結(jié)構(gòu)域缺失抗體、融合蛋白、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、單結(jié)構(gòu)域抗體、dAb片段及Fc融合蛋白(即，與免疫球蛋白恒定區(qū)融合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。這些抗體可與細(xì)胞毒性劑、放射治療劑或可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)。例如，已經(jīng)制備包含大鼠XT-M4抗體的VH及VL結(jié)構(gòu)域的ScFv抗體(SEQIDNO:63)并且通過(guò)基于細(xì)胞的ELISA分析顯示其對(duì)于狒狒、小鼠、兔及人類(lèi)的RAGE具有親和力，此親和力與嵌合及野生型XT-M4抗體的親和力相當(dāng)。本發(fā)明抗體進(jìn)一步意欲包括對(duì)于一種標(biāo)的多肽具有親和力的復(fù)共軛對(duì)配合物、雙特異性、單鏈及嵌合及人類(lèi)化分子，所述親和力由抗體的至少一個(gè)CDR區(qū)賦予。與RAGE特異性結(jié)合的本發(fā)明抗體也包括可容易地利用已知分子生物學(xué)及克隆技術(shù)制備的本文所述任何一種抗體的變體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)案第2003/0118592號(hào)、第003/0133939號(hào)、第004/0058445號(hào)、第005/0136049號(hào)、第005/0175614號(hào)、第005/0180970號(hào)、第005/0186216號(hào)、第005/0202012號(hào)、第005/0202023號(hào)、第005/0202028號(hào)、第005/0202534號(hào)、及第2005/0238646號(hào)、及其相關(guān)專(zhuān)利家族成員，所有這些專(zhuān)利的全文都以引用方式并入本文中。例如，本發(fā)明的變體抗體也可包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白，其包括與免疫球蛋白鉸鏈或鉸鏈作用區(qū)域多肽融合或否則連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(例如，scFv)，所述免疫球蛋白鉸鏈或鉸鏈作用區(qū)域多肽又與包含一或多個(gè)來(lái)自免疫球蛋白重鏈的天然或經(jīng)設(shè)計(jì)恒定區(qū)的區(qū)域融合或否則連接，所述恒定區(qū)不為CH1，其為(例如)IgG及IgA的CH2及CH3區(qū)域、或IgE的CH3及CH4區(qū)域(對(duì)于更完全闡述參見(jiàn)(例如)萊德貝特(Ledbetter,J.)等人的美國(guó)專(zhuān)利第2005/0136049號(hào)，其以引用方式并入本文中)。結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白可進(jìn)一步包括一個(gè)區(qū)域，所述區(qū)域包括與鉸鏈區(qū)多肽融合或否則連接的天然或經(jīng)設(shè)計(jì)的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)多肽(或CH3，在構(gòu)建體全部或部分源自IgE的情況下)及與CH2恒定區(qū)多肽(或CH3，在構(gòu)建體全部或部分源自IgE的情況下)融合或否則連接的天然或經(jīng)設(shè)計(jì)的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽(或CH4，在構(gòu)建體全部或部分源自IgE的情況下)。一般來(lái)說(shuō)，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白能夠具有至少一種免疫活性，例如，與RAGE特異性結(jié)合、抑制RAGE與RAGE結(jié)合配偶體間的相互作用、誘導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)補(bǔ)體固定等。本發(fā)明抗體也可包含附接到其上且能夠檢測(cè)的標(biāo)記(例如，標(biāo)記可為放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。RAGE多肽本發(fā)明也提供具有SEQIDN0:7、9、11、或13中所示氨基酸序列的狒狒、食蟹猴及兔的經(jīng)分離RAGE蛋白，且進(jìn)一步包括具有與SEQIDNO:7、9、11、或13中所示氨基酸序列基本一致的氨基酸序列的RAGE蛋白，即其氨基酸序列與SEQIDNO:7、9、11、或13的任何一種氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9°/(>一致。本發(fā)明也包括通過(guò)業(yè)內(nèi)已知的任何手段來(lái)制造本發(fā)明抗RAGE抗體及其RAGE結(jié)合片段的方法。本發(fā)明也包括單克隆抗體的經(jīng)純化制備品，所述單克隆抗體與任何SEQIDNO:1、3、7、9、11、或13中所述的RAGE氨基酸序列的一或多個(gè)表位特異性結(jié)合。定義為方便起見(jiàn)，在說(shuō)明書(shū)、實(shí)例及隨附權(quán)利要求書(shū)中所用的某些術(shù)語(yǔ)集中于此。除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常所了解含義相同的含義。本文所用的冠詞"一"("a"及"an，，)是指一個(gè)或一個(gè)以上(即指至少一個(gè))的所述冠詞的文法受詞。舉例來(lái)說(shuō)，"一元件"意指一個(gè)元件或一個(gè)以上的元件。除非上下文另外明確說(shuō)明，否則本文所用的術(shù)語(yǔ)"或"意指術(shù)語(yǔ)"及/或"，且可與"及/或"互換使用。"經(jīng)分離"或"經(jīng)純化"多肽或蛋白質(zhì)(例如，"經(jīng)分離抗體")是純化至超過(guò)其天然存在狀態(tài)的多肽或蛋白質(zhì)。例如，"經(jīng)分離"或"經(jīng)純化"多肽或蛋白質(zhì)(例如，"經(jīng)分離抗體")基本上不含來(lái)自蛋白質(zhì)源自其的細(xì)胞或組織來(lái)源的細(xì)胞材料或其它雜質(zhì)蛋白，或基本上不含化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其它化學(xué)品。非抗體蛋白(本文中也稱(chēng)為"雜質(zhì)蛋白")或化學(xué)前體小于約50%的抗體蛋白制備品視為"基本上不含"。非抗體蛋白或化學(xué)前體占40%、30%、20%、10%且更優(yōu)選5%(以干燥重量計(jì))視為基本上不含。當(dāng)抗體蛋白或其生物活性部分是經(jīng)重組產(chǎn)生時(shí)，其也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制備品體積或質(zhì)量的小于約30%，優(yōu)選小于約20%，更優(yōu)選小于約10%，且最優(yōu)選小于約5%。在本文中以"重組體"提及的蛋白質(zhì)或多肽是通過(guò)重組核酸表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽。在本文中術(shù)語(yǔ)"抗體"可與術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"互換使用，且包括完整抗體、抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab')2片段)及在其恒定區(qū)及/或可變區(qū)中發(fā)生突變的完整抗體及片段(例如，突變以產(chǎn)生嵌合、部分人類(lèi)化、或完全人類(lèi)化抗體，以及產(chǎn)生具有期望特性的抗體，例如，增強(qiáng)的IL13結(jié)合及/或減弱的FcR結(jié)合)。術(shù)語(yǔ)"片段"是指比完整(intact或complete)抗體或抗體鏈包含較少氨基酸殘基的抗體或抗體鏈的一部分(part或portion)。片段可經(jīng)由對(duì)完整(intact或complete)抗體或抗體鏈進(jìn)行化學(xué)或酶處理而獲得。片段也可通過(guò)重組手段獲得。實(shí)例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fd、dAb、及scFv及/或Fv片段。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合片段"是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，其與抗原結(jié)合或與完整抗體(即，與其源自的完整抗體)競(jìng)爭(zhēng)與抗原結(jié)合(即，特異性結(jié)合)。只要抗體或片段與RAGE特異性結(jié)合并且中和或抑制一或多種RAGE相關(guān)活性(例如，抑制RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)與RAGE結(jié)合)，這些抗體或其片段就包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述抗體包括包含通過(guò)二硫鍵相互連接的四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)的分子結(jié)構(gòu)。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為HCVR或VH)及重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為L(zhǎng)CVR或VL)及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域(CL)?？蓪H及VL區(qū)進(jìn)一步細(xì)分成高度可變區(qū)(稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))和較為保守的區(qū)(稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR))，二者間雜排列。各VH及VL由三個(gè)CDR及四個(gè)FR構(gòu)成，其自氨基端至羧基端按如下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語(yǔ)"抗體"意欲涵蓋自任何來(lái)源(例如，人類(lèi)及非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、及嚙齒類(lèi)動(dòng)物、兔類(lèi)動(dòng)物、山羊、牛科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、綿羊等)獲得的任何Ig類(lèi)或任何Ig亞類(lèi)(例如IgG的IgGl、IgG2、IgG3及IgG4亞類(lèi))。本文所用的術(shù)語(yǔ)"Ig類(lèi)"或"免疫球蛋白類(lèi)"是指已在人類(lèi)及高等哺乳動(dòng)物中識(shí)別出的五類(lèi)免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)。術(shù)語(yǔ)"Ig亞類(lèi)"是指已在人類(lèi)及高等哺乳動(dòng)物中識(shí)別出的IgM的兩個(gè)亞類(lèi)(H及L)、IgA的三個(gè)亞類(lèi)(IgAl、IgA2及分泌型IgA)、及IgG的四個(gè)亞類(lèi)(IgGpIgG2、IgG3及IgG》?？贵w可以單體或聚合形式存在；例如，IgM抗體以五聚體形式存在，且IgA抗體以單體、二聚體或多聚體形式存在。術(shù)語(yǔ)"IgG亞類(lèi)"是指分別通過(guò)免疫球蛋白的Y重鏈(Yl-Y4)在人類(lèi)及高等哺乳動(dòng)物中識(shí)別出的IgG類(lèi)免疫球蛋白的四個(gè)亞類(lèi)-IgG,、IgG2、IgG3及IgG4。術(shù)語(yǔ)"單鏈免疫球蛋白"或"單鏈抗體"(在本文中可互換使用)是指具有由重鏈及輕鏈組成的兩條多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，所述鏈(例如)通過(guò)鏈間肽連接體經(jīng)穩(wěn)定化，所述蛋白質(zhì)具有與抗原特異性結(jié)合的能力。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"是指包含(例如)通過(guò)P-折疊片及/或鏈間二硫鍵經(jīng)穩(wěn)定化的肽環(huán)(例如，包含3個(gè)至4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈多肽的球狀區(qū)域。結(jié)構(gòu)域在本文中進(jìn)一步指"恒定"或"可變"結(jié)構(gòu)域，此基于"恒定"結(jié)構(gòu)域情況下各類(lèi)成員結(jié)構(gòu)域內(nèi)的序列變異相對(duì)缺乏或"可變"結(jié)構(gòu)域情況下各類(lèi)成員結(jié)構(gòu)域內(nèi)顯著變異?？贵w或多肽"結(jié)構(gòu)域"通常是指抗體或多肽"區(qū)域"(業(yè)內(nèi)可互換)?？贵w輕鏈的"恒定"結(jié)構(gòu)域是指"輕鏈恒定區(qū)"、"輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域"、"CL"區(qū)域或"CL"結(jié)構(gòu)域(可互換)?？贵w重鏈的"恒定"結(jié)構(gòu)域是指"重鏈恒定區(qū)"、"重鏈恒定結(jié)構(gòu)域"、"CH"區(qū)域或"CH"結(jié)構(gòu)域(可互換)?？贵w輕鏈的"可變"結(jié)構(gòu)域是指"輕鏈可變區(qū)"、"輕鏈可變結(jié)構(gòu)域"、"VL"區(qū)域或"VL"結(jié)構(gòu)域(可互換)?？贵w重鏈的"可變"結(jié)構(gòu)域是指"重鏈恒定區(qū)"、"重鏈恒定結(jié)構(gòu)域"、"VH"區(qū)域或"VH"結(jié)構(gòu)域(可互換)。術(shù)語(yǔ)"區(qū)域"也可指抗體鏈或抗體鏈結(jié)構(gòu)域的一部分(part或portion)(例如，如本文所定義的重鏈或輕鏈的一部分或恒定結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域的一部分)以及所述鏈或結(jié)構(gòu)域的更分散部分。例如，如本文所定義，輕鏈及重鏈或輕鏈及重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括散布于"框架區(qū)"或"FR"中的"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"。術(shù)語(yǔ)"構(gòu)象"是指蛋白質(zhì)或多肽(例如，抗體、抗體鏈、結(jié)構(gòu)域或其區(qū)域)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，短語(yǔ)"輕(或重)鏈構(gòu)象"是指輕(或重)鏈可變區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，且短語(yǔ)"抗體構(gòu)象"或"抗體片段構(gòu)象"是指抗體或其片段的三級(jí)結(jié)構(gòu)?？贵w"特異性結(jié)合"意指抗體對(duì)于特定抗原或表位展示可觀親和力且通常不展示顯著交叉反應(yīng)性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗RAGE抗體"是指與RAGE特異性結(jié)合的抗體。抗體可展示無(wú)交叉反應(yīng)性，例如，不與非RAGE肽或RAGE上的遙遠(yuǎn)表位交叉反應(yīng)。"可觀"結(jié)合包括以至少106、107、108、109M"、或101()M—'的親和力結(jié)合。親和力大于WM"或10SNf1的抗體一般以對(duì)應(yīng)較強(qiáng)的特異性結(jié)合。本文所述親和力值的中間值也意欲包括在本發(fā)明范圍內(nèi)且本發(fā)明抗體以以下范圍的親和力與RAGE結(jié)合，例如，106至10"NT1、或107至101GM-'、或108至101GM"。"不展示顯著交叉反應(yīng)性"的抗體是不與不是其靶標(biāo)的實(shí)體(例如，不同表位或不同分子)可觀結(jié)合的抗體。例如，與RAGE特異性結(jié)合的抗體將與RAGE可觀結(jié)合，但不與非RAGE蛋白或肽顯著反應(yīng)。對(duì)特定表位具有特異性的抗體將(例如)不與相同蛋白質(zhì)或肽上的遙遠(yuǎn)表位顯著交叉反應(yīng)。特異性結(jié)合可按照用于測(cè)定所述結(jié)合的任何業(yè)內(nèi)公認(rèn)手段來(lái)測(cè)定。優(yōu)選地，按照斯卡査德分析(Scatchardanalysis)及/或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定特異性結(jié)合。本文所用的術(shù)語(yǔ)"親和力"是指單一抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原決定簇的結(jié)合強(qiáng)度。親和力取決于抗體結(jié)合位點(diǎn)與抗原決定簇之間的立體化學(xué)吻合緊密性、其間的接觸面積大小、帶電荷基團(tuán)及疏水性基團(tuán)的分布等?？贵w親和力可通過(guò)平衡透析或動(dòng)力學(xué)BIACORETM方法測(cè)量。BIACORETM方法依賴(lài)于表面等離子共振(SPR)現(xiàn)象，其在金屬/液體界面激發(fā)表面等離子波時(shí)發(fā)生。光在不與樣品接觸的表面?zhèn)戎鄙洳⒆云浞瓷?，并且SPR造成特定角度及波長(zhǎng)組合下的反射光強(qiáng)度降低。雙分子結(jié)合事件使表面層的折射率改變，此可以SPR信號(hào)的改變來(lái)檢測(cè)。解離常數(shù)Kd及締合常數(shù)Ka是親和力的數(shù)量測(cè)量。平衡時(shí)，游離抗原(Ag)及游離抗體(Ab)與抗原-抗體復(fù)合物(Ag-Ab)相平衡，且速率常數(shù)(ka及kd)定量各反應(yīng)的速率kakdAb+Ag—Ab-Ag及Ab-Ag—Ab+Ag平衡時(shí)，ka[Ab][Ag〗=kd[Ag-Ab]。解離常數(shù)Kd由Kd=kd/ka=[Ag][Ab]/[Ag-Ab]給出。Kd具有濃度單位，最一般為M、mM、^M、nM、pM等。當(dāng)比較以Kd表示的抗體親和力時(shí)，對(duì)RAGE具有較大親和力者由較低值表示。締合常數(shù)Ka由Ka二ka/kd^[Ag-Ab]/[Ag][Ab]給出。Ka具有濃度倒數(shù)單位，最一般為M—1、mM'1、pM'1、nM—1、pM"等。本文所用的術(shù)語(yǔ)"親合力"是指在可逆復(fù)合物形成后抗原-抗體鍵的強(qiáng)度?？筊AGE抗體可以其與RAGE蛋白結(jié)合的Kd為特征，以"在約(較低Kd值)至約(較高Kd值)范圍內(nèi)的解離常數(shù)(Kd)"結(jié)合。在此上下文中，術(shù)語(yǔ)"約"意指所指出的Kd值±20%;即，約1Kd=0.8-1.2Kd。本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是指源自結(jié)構(gòu)及抗原特異性均一的抗體產(chǎn)生細(xì)胞(例如，B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞)的克隆群體的抗體。術(shù)語(yǔ)"多克隆抗體"是指源自結(jié)構(gòu)及表位特異性不均一但識(shí)別共同抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的不同克隆群體的多種抗體。單克隆抗體及多克隆抗體可在體液內(nèi)以粗制備品形式存在，或可如本文所述經(jīng)純化。術(shù)語(yǔ)抗體"結(jié)合部分"(或"抗體部分")包括一或多個(gè)完整結(jié)構(gòu)域(例如，一對(duì)完整結(jié)構(gòu)域)以及保留與RAGE特異性結(jié)合能力的抗體片段。己顯示，抗體的結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)施。結(jié)合片段可通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)對(duì)完整免疫球蛋白實(shí)施酶或化學(xué)裂解來(lái)產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fd、dAb、Fv、單鏈、單鏈抗體(例如，scFv)及單結(jié)構(gòu)域抗體(姆德曼(Muyldermans)等人，2001，26:230-5)及經(jīng)分離互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。Fab片段是由VL、VH、CL及CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段。F(ab')2片段是包含兩個(gè)在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫橋鍵連接的Fab片段的二價(jià)片段。Fd片段由VH及CH1結(jié)構(gòu)域組成，且Fv片段由抗體單臂的VL及VH結(jié)構(gòu)域組成。dAb片段由VH結(jié)構(gòu)域組成(沃德(Ward)等人，(1989)自然(Nature)341:544-546)。盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(VL及VH)是由單獨(dú)基因編碼，但是可使用重組方法通過(guò)合成連接體將此兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，此合成連接體使其能夠以其中VL及VH區(qū)域配對(duì)形成單價(jià)分子的單一蛋白鏈(稱(chēng)為單鏈Fv(scFv))產(chǎn)生(伯德(Bird)等人，(1988)科學(xué)(Science)242:423-426)。所述單鏈抗體也意欲涵蓋于術(shù)語(yǔ)抗體的"結(jié)合部分"中。也涵蓋單鏈抗體的其它形式(例如雙特異抗體)。雙特異抗體是二價(jià)雙特異性抗體，其中VH及VL結(jié)構(gòu)域在多肽單鏈上表達(dá)，但是所用連接體太短以致不容許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)，從而迫使此等結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，豪里格(Holliger)等人，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-6448)?？贵w或其結(jié)合部分也可為通過(guò)抗體或抗體部分與一或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)締合而形成的較大免疫粘附分子的一部分。所述免疫粘附分子的實(shí)例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區(qū)域來(lái)制造四聚體cFv分子(克普瑞雅納夫(KipriyaiKw,S.M.)等人(1995)人類(lèi)抗體及雜交瘤(HumanAntibodiesandHybridomas)6:93-101)及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽及C-端聚組氨酸標(biāo)簽來(lái)制造二價(jià)及生物素化scFv分子(克普瑞雅納夫等人(1994)分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)31:1047-1058)。諸如Fab及F(ab')2片段等結(jié)合片段可利用習(xí)用技術(shù)自全抗體制備，例如全抗體的分別木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。而且，抗體、抗體部分及免疫粘附分子可利用本文所述且為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得。除"雙特異性"抗體或"雙功能"抗體外，抗體應(yīng)理解為其每一結(jié)合位點(diǎn)均相同者。"雙特異性"抗體或"雙功能"抗體是具有兩個(gè)不同重/輕鏈對(duì)及兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜交抗體。雙特異性抗體也可包括具有間插恒定區(qū)的兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)。雙特異性抗體可通過(guò)多種方法(包括雜交瘤融合或連接Fab'片段)產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如，松思維萊(Songsivilai)等人，免疫學(xué)臨床及實(shí)驗(yàn)(Clin.Exp.Immunol.)79:315-321，1990.;考斯戴尼(Kostelny)等人，1992，免疫學(xué)(J.Immunol.)148，1547-1553。術(shù)語(yǔ)"回復(fù)突變"是指人類(lèi)抗體的一些或全部經(jīng)體突變的氨基酸由來(lái)自同源種系抗體序列的對(duì)應(yīng)種系殘基所代替的過(guò)程。將本發(fā)明人類(lèi)抗體的重鏈及輕鏈序列與VBASE數(shù)據(jù)庫(kù)中的種系序列單獨(dú)比對(duì)以識(shí)別具有最高同源性的序列。通過(guò)使編碼所述不同氨基酸的經(jīng)界定核苷酸位置突變將本發(fā)明人類(lèi)抗體的差異返回到種系序列。應(yīng)研究因此經(jīng)識(shí)別作為回復(fù)突變候選者的每一氨基酸的作用(在抗原結(jié)合中的直接或間接作用)且在突變后發(fā)現(xiàn)影響人類(lèi)抗體任何期望特征的任何氨基酸都不應(yīng)包括在最終人類(lèi)抗體中；作為實(shí)例，通過(guò)選擇性誘變途徑識(shí)別的活性增強(qiáng)氨基酸不經(jīng)歷回復(fù)突變。為使經(jīng)歷回復(fù)突變的氨基酸數(shù)目最小化，發(fā)現(xiàn)與最接近種系序列不同但與第二種系序列中的對(duì)應(yīng)氨基酸相同的那些氨基酸位置可保留，只要在所研究氨基酸的兩側(cè)上所述第二種系序列與本發(fā)明人類(lèi)抗體序列至少10個(gè)、優(yōu)選12個(gè)氨基酸相同及共線性即可?；貜?fù)突變可在抗體優(yōu)化的任何階段發(fā)生；優(yōu)選地，回復(fù)突變?cè)谶x擇性誘變途徑之前或之后不久發(fā)生。更優(yōu)選地，回復(fù)突變?cè)谶x擇性誘變途徑之前不久發(fā)生。完整抗體(也稱(chēng)為免疫球蛋白)一般是由兩條輕(L)鏈(每一約25kDa)及兩條重(H)鏈(每一約50kDa)構(gòu)成的四聚體糖基化蛋白。在抗體中發(fā)現(xiàn)兩種輕鏈類(lèi)型，稱(chēng)為X及k。根據(jù)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分成五個(gè)主要種類(lèi):A、D、E、G及M，且可將這些中的幾種進(jìn)一步分成亞類(lèi)(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2。每一輕鏈由N端可變(V)結(jié)構(gòu)域(VL)及恒定(C)結(jié)構(gòu)域(CL)構(gòu)成。每一重鏈由N端V結(jié)構(gòu)域(VH)、三個(gè)或四個(gè)C結(jié)構(gòu)域(CH)及鉸鏈區(qū)構(gòu)成。與VH最接近的CH結(jié)構(gòu)域稱(chēng)為CH1。VH及VL結(jié)構(gòu)域由四個(gè)相對(duì)保守的稱(chēng)為框架區(qū)的序列區(qū)域組成(FR1、FR2、FR3、及FR4)，其形成三個(gè)超變序列區(qū)域(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的支架。CDR含有造成抗體與抗原特異性相互作用的大多數(shù)殘基。CDR以CDR1、CDR2及CDR3提及。因此，重鏈上的CDR組件稱(chēng)為Hl、H2及H3，而輕鏈上的CDR組件稱(chēng)為L(zhǎng)1、L2及L3。CDR3是抗體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)分子多樣性的最主要來(lái)源。例如，H3可短至兩個(gè)氨基酸殘基或多于26個(gè)氨基酸。不同種類(lèi)免疫球蛋白的亞單元結(jié)構(gòu)及三維構(gòu)型已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知。對(duì)于抗體結(jié)構(gòu)的綜述，參見(jiàn)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(An他odies:ALaboratoryManual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory)編輯，哈婁(Harlow)等人，1988。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員將意識(shí)到每一亞單元結(jié)構(gòu)(例如，CH、VH、CL、VL、CDR、FR結(jié)構(gòu))包含活性片段，例如，與抗原結(jié)合的VH、VL或CDR亞單元部分(即結(jié)合片段)或例如，與(例如)Fc受體及/或補(bǔ)體結(jié)合及/或激活Fc受體及/或補(bǔ)體的CH亞單元部分?？贵w多樣性是通過(guò)使用多種編碼可變區(qū)的種系基因及多種體細(xì)胞事件發(fā)生。體細(xì)胞事件包括將V基因(variablegene)節(jié)段與D基因(diversitygene)及J基因(joininggene)節(jié)段重組以產(chǎn)生完整VH區(qū)域及將V基因及J基因節(jié)段重組以產(chǎn)生完整VL區(qū)域。重組過(guò)程本身是不精確的，導(dǎo)致V(D)J連接處氨基酸丟失或添加。這些多樣性機(jī)制發(fā)生在抗原暴露之前的B-細(xì)胞發(fā)育中。在抗原刺激后，B-細(xì)胞中表達(dá)的抗體基因經(jīng)歷體細(xì)胞突變?；诜N系基因節(jié)段的估計(jì)數(shù)目，這些節(jié)段隨機(jī)重組及隨機(jī)VH-VL配對(duì)可產(chǎn)生至多1.6x107種不同抗體(基礎(chǔ)免疫學(xué)(FundamentalImmunology),第3版(1993)編輯，保羅(Paul)，雷文出版社(RavenPress),紐約，NY)。當(dāng)考慮促成抗體多樣性的其它過(guò)程(例如體細(xì)胞突變)時(shí)，認(rèn)為可產(chǎn)生多達(dá)lxl(^種不同抗體(免疫球蛋白基因(ImmunoglobulinGenes)，第2版(1995)，杰尼奧(Jonio)等人編輯，美國(guó)學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，圣迭戈(SanDiego)，加利福尼亞州)。因?yàn)樵S多過(guò)程涉及產(chǎn)生抗體多樣性，所以具有相同抗原特異性的獨(dú)立衍生單克隆抗體不可能具有相同的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)"二聚多肽"或"二聚結(jié)構(gòu)域"包括與另一多肽形成二聚體(或更高級(jí)復(fù)合物，例如三聚體、四聚體等)的任何多肽。視情況，二聚多肽與其它相同二聚多肽連接，由此形成同型多體。IgGFc元件是易于形成同型多體的二聚結(jié)構(gòu)域的實(shí)例。視情況，二聚多肽與其它不同二聚多肽連接，由此形成異型多體。Jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與Fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域形成二聚體，且因此是易于形成異型多體的二聚結(jié)構(gòu)域的實(shí)例。二聚結(jié)構(gòu)域可形成25種異型及同型多體(二者)。術(shù)語(yǔ)"人類(lèi)抗體"包括具有對(duì)應(yīng)于如卡百特(Kabat)等人所述的人類(lèi)種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)及恒定區(qū)的抗體(參見(jiàn)，卡百特等人，(1991)具有免疫學(xué)興趣的蛋白質(zhì)序歹!j(SequencesofproteinsofImmunologicalInterest),第5版，美國(guó)衛(wèi)生禾口人類(lèi)服務(wù)部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices),國(guó)家衛(wèi)生研究院公開(kāi)案(NIHPublication)第91-3242號(hào))。本發(fā)明人類(lèi)抗體可在(例如)CDR內(nèi)且尤其CDR3內(nèi)包括不是由人類(lèi)種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過(guò)活體外隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變或通過(guò)活體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。突變優(yōu)選地利用本文所述"選擇性誘變途徑"引入。人類(lèi)抗體可至少一個(gè)位置經(jīng)不是由人類(lèi)種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基代替，例如，活性增強(qiáng)氨基酸殘基。人類(lèi)抗體可至多二十個(gè)位置經(jīng)不是人類(lèi)種系免疫球蛋白序列一部分的氨基酸殘基代替。而且，至多十個(gè)、至多五個(gè)、至多三個(gè)或至多兩個(gè)位置經(jīng)代替。這些代替可屬于在下文中詳細(xì)闡述的CDR區(qū)域。然而，本文所用的術(shù)語(yǔ)"人類(lèi)抗體"不欲包括其中源自另一哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠)種系的CDR序列已移植到人類(lèi)框架序列上的抗體。短語(yǔ)"重組人類(lèi)抗體"包括通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人類(lèi)抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(在下文第II部分進(jìn)一步闡述)、自重組組合人類(lèi)抗體文庫(kù)分離的抗體(在下文第m部分進(jìn)一步闡述)、自人類(lèi)免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)分離的抗體(參見(jiàn)，例如，泰勒(Taylor,L.D.)等人(1992)核酸研究(Nud.AcidsRes.)20:6287-6295)或通過(guò)涉及將人類(lèi)免疫球蛋白基因序列拼接到其它DNA序列上的任何其它手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。所述重組人類(lèi)抗體具有源自人類(lèi)種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)及恒定區(qū)(參見(jiàn)，卡百特(Kabat,E.A.)等人(1991)具有免疫學(xué)興趣的蛋白質(zhì)序列(S叫uencesofproteinsofImmunologicalInterest),第5版，美國(guó)衛(wèi)生和人類(lèi)服務(wù)部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices),國(guó)家衛(wèi)生研究院公開(kāi)案(NIHPublication)第91-3242號(hào))。然而，所述重組人類(lèi)抗體可經(jīng)受活體外誘變(或者，當(dāng)使用人類(lèi)Ig序列轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，經(jīng)受活體內(nèi)體細(xì)胞誘變)且因此重組抗體VH及VL區(qū)的氨基酸序列(當(dāng)源自或與人類(lèi)種系VH及VL序列相關(guān)時(shí))是不可天然存在于人類(lèi)活體內(nèi)抗體種系譜中的序列。然而，在某些實(shí)施例中，所述重組抗體可能是選擇性誘變途徑或回復(fù)突變或二者的結(jié)果。"經(jīng)分離抗體"包括基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，與RAGE特異性結(jié)合的經(jīng)分離抗體基本上不含與非hRAGE的RAGE特異性結(jié)合的抗體)。與RAGE特異性結(jié)合的經(jīng)分離抗體可結(jié)合來(lái)自其它物種的RAGE分子。而且，經(jīng)分離抗體可基本上不含其它細(xì)胞材料及/或化學(xué)品。"中和抗體"(或"中和RAGE活性的抗體")包括與hRAGE結(jié)合導(dǎo)致hRAGE生物活性調(diào)節(jié)的抗體。所述hRAGE生物活性的調(diào)節(jié)可通過(guò)測(cè)量一或多種hRAGE生物活性的指示物來(lái)評(píng)價(jià)，例如在人類(lèi)RAGE受體結(jié)合測(cè)定中的受體結(jié)合抑制(參見(jiàn)，例如，實(shí)例6及7)。hRAGE生物活性的這些指示物可通過(guò)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的數(shù)種標(biāo)準(zhǔn)活體外或活體內(nèi)測(cè)定的一或多種來(lái)評(píng)價(jià)(參見(jiàn)，例如，實(shí)例6及7)。"人類(lèi)化"形式的非人類(lèi)(例如，鼠科動(dòng)物)抗體是含有最少量源自非人類(lèi)免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人類(lèi)化抗體是如下的人類(lèi)免疫球蛋白(接受者抗體)來(lái)自接受者超變區(qū)的殘基由來(lái)自非人類(lèi)物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)超變區(qū)(供體抗體)的具有期望特異性、親和力及容量的殘基所代替。在一些情況下，人類(lèi)免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由對(duì)應(yīng)非人類(lèi)殘基所代替。此外，人類(lèi)化抗體可包含未曾在接受者抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。實(shí)施所述修飾可進(jìn)一步改良抗體特性。一般來(lái)說(shuō)，人類(lèi)化抗體可包含基本上所有至少一個(gè)且通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有超變區(qū)對(duì)應(yīng)于非人類(lèi)免疫球蛋的超變區(qū)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人類(lèi)免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人類(lèi)化抗體視情況也包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)(通常為人類(lèi)免疫球蛋白恒定區(qū))的至少一部分。對(duì)于更詳細(xì)闡述，參見(jiàn)瓊斯(Jones)等人，自然(Nature)321:522-525(1986);里耶曼(Riechmann)等人，自然332:323-329(1988);及普銳斯塔(Presta)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點(diǎn)(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。術(shù)語(yǔ)"活性"包括以下活性例如，抗體對(duì)抗原的結(jié)合特異性/親和性(例如，與RAGE結(jié)合的抗hRAGE抗體)、及/或抗體的中和效能(例如，與hRAGE的結(jié)合可抑制RAGE生物活性的抗hRAGE抗體，例如，在人類(lèi)RAGE受體結(jié)合測(cè)定中抑制受體結(jié)合)。"表達(dá)構(gòu)建體"是包括可表達(dá)核酸及足以介導(dǎo)可表達(dá)核酸蛋白質(zhì)或多肽在適宜宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的任何重組核酸。術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"及"嵌合蛋白"可互換且是指具有如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽所述氨基酸序列的一部分對(duì)應(yīng)于來(lái)自?xún)煞N或更多種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。來(lái)自?xún)煞N或更多種蛋白質(zhì)的序列可為蛋白質(zhì)的全部或部分(即，片段)。融合蛋白也可在對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)氨基酸序列的部分之間具有氨基酸連接區(qū)。所述融合蛋白可通過(guò)重組方法制備，其中通過(guò)用核酸酶及連接酶處理將對(duì)應(yīng)核酸連接在一起并納入到表達(dá)載體中。一般來(lái)說(shuō)，融合蛋白的制備已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所了解。術(shù)語(yǔ)"核酸"是指聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)及(合適時(shí))核糖核酸(RNA)。此術(shù)語(yǔ)也應(yīng)理解為包括自核苷酸類(lèi)似物制造的RNA或DNA的等效物、類(lèi)似物、及適用于所述實(shí)施例的單鏈(同義或反義)及雙鏈聚核苷酸。術(shù)語(yǔ)"百分比(％)—致"或"百分比(％)—致性"是指兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的序列一致性。百分比一致性可通過(guò)比較每一序列中的位置來(lái)測(cè)定，所述每一序列可為比較目的而進(jìn)行比對(duì)。一致性百分比表達(dá)式是所比較序列共有位置上相同氨基酸或核酸數(shù)目的函數(shù)?？墒褂枚喾N比對(duì)算法及/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA及BLAST可作為GCG序列分析程序包(威斯康星大學(xué)(UniversityofWisconsin),麥迪遜(Madison)，威斯康星州(Wis.))的一部分獲得，且可以(例如)默認(rèn)設(shè)置使用。ENTREZ是通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation),國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(NationalLibraryofMedicine),國(guó)家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth),貝塞斯達(dá)市(Bethesda)，馬里蘭州(Md)獲得。兩個(gè)序列的一致性百分比可通過(guò)缺口權(quán)重為1的GCG程序來(lái)測(cè)定，例如使每一氨基酸缺口加權(quán)，好像其是兩個(gè)序列之間的單氨基酸或核苷酸錯(cuò)配一樣。其它比對(duì)技術(shù)闡述于酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)，第266巻大分子序列分析的計(jì)算機(jī)方法(ComputerMethodsforMacromolecularSequenceAnalysis)(1996)，杜利特爾(Doolittle)編輯，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)公司，哈考特公司(HarcourtBrace&0).)的分部，圣地亞哥(SanDiego)，加利福尼亞(California)，美國(guó)。優(yōu)選地，使用允許序列中存在缺口的比對(duì)程序來(lái)實(shí)施序列比對(duì)。史密斯-華特曼(Smith-Waterman)算法是允許序列比對(duì)中存在缺口的一種算法類(lèi)型。參見(jiàn)，分子生物學(xué)方法(Meth.Mol.Biols.)70:173-187(1997)。而且，使用尼德曼溫斯(NeedlenanandWunsch)比對(duì)方法的GAPI程序可用以實(shí)施序列比對(duì)。替代研究策略使用在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行的MPSRCH軟件。MPSRCH使用史密斯-華特曼算法在整體平行的計(jì)算機(jī)上評(píng)價(jià)5個(gè)序列。此方法提高了挑選關(guān)系較遠(yuǎn)匹配的能力，且尤其容忍小缺口及核苷酸序列差錯(cuò)?？墒褂镁幋a核酸的氨基酸序列來(lái)搜索蛋白質(zhì)及DNA數(shù)據(jù)庫(kù)二者。在本文中，術(shù)語(yǔ)"多肽"與"蛋白質(zhì)"可互換使用。如所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知，"RAGE"蛋白是"晚期糖化終產(chǎn)物受體"。代表性RAGE蛋白陳述于圖1A-1C中。RAGE蛋白包括可溶性RAGE(sRAGE)及內(nèi)源分泌型RAGE(esRAGE)。內(nèi)源分泌型RAGE是在細(xì)胞外釋放的RAGE拼接變體，其中其能夠結(jié)合AGE配體并中和AGE作用。參見(jiàn)，例如，小山(Koyama)等人，X7T￡，2005;25:2587-2593。已觀察到人類(lèi)血漿esRAGE與代謝綜合征的數(shù)個(gè)組成(BMI、胰島素抗性、BP、高甘油三酯血癥及IGT)逆相關(guān)。血漿esRAGE含量也與患有糖尿病或不患有糖尿病的個(gè)體的頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈粥樣硬化(通過(guò)超聲定量)逆相關(guān)。而且，與年齡匹配的健康對(duì)照相比，在患有經(jīng)血管造影術(shù)證實(shí)的冠狀動(dòng)脈疾病的非糖尿病患者中血漿esRAGE含量顯著較低。"晚期糖化終產(chǎn)物受體配體結(jié)合元件"或"RAGE-LBE"(在本文中也稱(chēng)為"RAGE-Fc"及"RAGE-鏈球菌")包括保留與RAGE配體結(jié)合能力的跨膜RAGE多肽及其片段的任何細(xì)胞外部分。此術(shù)語(yǔ)也涵蓋與RAGE多肽具有至少85%—致性、優(yōu)選至少90%—致性或更優(yōu)選至少95%—致性的多肽，例如，RAGE配體或RAGE-BP將與其結(jié)合的人類(lèi)或鼠科動(dòng)物多肽。"晚期糖化終產(chǎn)物受體結(jié)合配偶體"或"RAGE-BP"包括在生理學(xué)環(huán)境下與RAGE蛋白(受體多肽，例如，RAGE或RAGE-LBE)的細(xì)胞外部分結(jié)合的任何物質(zhì)(例如，多肽、小分子、碳水化合物結(jié)構(gòu)等)。"RAGE相關(guān)病癥(RAGE-relateddisorder或RAGE-associateddisorder)包括其中受侵襲的細(xì)胞或組織展示增加或降低的RAGE或一或多種RAGE配體的表達(dá)及/或活性的任何病癥。RAGE相關(guān)病癥也包括可通過(guò)減弱RAGE功能(包括(例如)投與破壞RAGE:RAGE-BP相互作用的藥劑)治療(即，一或多個(gè)癥狀可消除或改善)的任何病癥。"RAGE的V-結(jié)構(gòu)域"是指如尼普(Neeper)等人，"RAGE的克隆及表達(dá)蛋白質(zhì)晚期糖化終產(chǎn)物的細(xì)胞表面受體(OoningandexpressionofRAGE:acellsurfacereceptorforadvancedglycosylationendproductsofproteins)"，生物化學(xué)(J.Biol.Chem.)267:14998-15004(1992)圖5中所示的免疫球蛋白樣可變結(jié)構(gòu)域，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用方式并入本文中。所述V-結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:l及SEQIDNO:3中所示自位置1至位置120的氨基酸。RAGE的人類(lèi)cDNA具有1406個(gè)堿基對(duì)且編碼404個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。參見(jiàn)尼普(Neeper)等人，1992的圖3。術(shù)語(yǔ)"重組核酸"包括包含至少兩條非天然共存在序列的任何核酸。重組核酸可通過(guò)(例如)利用分子生物學(xué)方法在活體外產(chǎn)生或通過(guò)(例如)在新染色體位置上通過(guò)同源或非同源重組插入核酸在活體內(nèi)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)對(duì)個(gè)體的"治療"是指改良個(gè)體疾病或病癥的至少一種癥狀。治療可為治愈疾病或病狀或使其得以改良。術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸的核酸分子。一種載體類(lèi)型是附加體，g卩，能夠染色體外復(fù)制的核酸。另一種載體類(lèi)型是經(jīng)設(shè)計(jì)與宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)重組的整合載體。載體可自主復(fù)制及整合二者，且載體的特性可隨細(xì)胞環(huán)境而不同(即，載體可在一種宿主細(xì)胞類(lèi)型中自主復(fù)制及在另一種宿主細(xì)胞類(lèi)型中純粹整合)。能夠引導(dǎo)與其可操作連接的可表達(dá)核酸表達(dá)的載體在本文中稱(chēng)為"表達(dá)載體"。"特異性免疫反應(yīng)"是指當(dāng)抗體與特定肽序列相互作用時(shí)化合物[抗體]優(yōu)先與特定肽序列結(jié)合。本文所用的短語(yǔ)"有效量"意指可在動(dòng)物中有效產(chǎn)生一些期望效果的一或多種藥劑、材料或包含一或多種本發(fā)明藥劑的組合物的量。已意識(shí)到，當(dāng)使用藥劑來(lái)達(dá)成治療效果時(shí)，包含"有效量"的實(shí)際劑量將隨多種條件而改變，包括所治療的特定病狀、疾病的嚴(yán)重程度、患者的個(gè)頭及健康狀況、投與途徑等。熟練的醫(yī)務(wù)人員可利用醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員所熟知的方法容易地確定合適劑量。本文所用的短語(yǔ)"醫(yī)藥學(xué)上可接受的"是指如下化合物、材料、組合物、及/或劑型在合理醫(yī)學(xué)診斷范疇內(nèi)、適于與人類(lèi)及動(dòng)物組織接觸使用而無(wú)過(guò)度毒性、刺激性、過(guò)敏反應(yīng)或其它問(wèn)題或并發(fā)癥、與合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)。本文所用的短語(yǔ)"醫(yī)藥上可接受的載劑"意指醫(yī)藥上可接受的材料、組合物或媒劑，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料，其參與自身體的一種器官或一部分向身體的另一種器官或另一部分?jǐn)y帶或轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)的藥劑。每一載體在與調(diào)配物其它成份相容意義上必須為"可接受的"。一些可用作醫(yī)藥上可接受的載劑的材料實(shí)例包括(1)糖類(lèi)，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)淀粉類(lèi)，例如玉米淀粉及馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；(4)粉末狀黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂及栓劑蠟；(9)油類(lèi)，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及豆油；(10)二醇類(lèi)，例如丙二醇；(11)多元醇類(lèi)，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯類(lèi)，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無(wú)熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution);(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；及(21)用于醫(yī)藥調(diào)配物中的其它無(wú)毒性可相容物質(zhì)。單克隆抗體的制備哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠或兔)可用全長(zhǎng)蛋白或其片段或編碼全長(zhǎng)蛋白或其片段的cDNA(肽的免疫原性形式)實(shí)施免疫。賦予蛋白質(zhì)或肽免疫原性的技術(shù)包括所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的與載劑偶聯(lián)或其它技術(shù)。多肽的免疫原性部分可在佐劑存在下投與。免疫過(guò)程可通過(guò)檢測(cè)血漿或血清中的抗體滴度來(lái)監(jiān)測(cè)。可使用免疫原作為抗原的標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)抗體含量。在用標(biāo)的多肽抗原制備品對(duì)動(dòng)物實(shí)施免疫后，可獲得抗血清且(若需要)自血清分離出多克隆抗體。為制造單克隆抗體，可自經(jīng)免疫動(dòng)物收獲產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合程序使其與永生細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞)融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。所述技術(shù)已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知，且包括(例如)雜交瘤技術(shù)(最初由科勒(Kohler)及米爾斯坦(Milstein)，(1975)自然(Nature),256:495-497提出)、人類(lèi)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(科茲巴(Kozbar)等人，(1983)現(xiàn)代免疫學(xué)(ImmunologyToday),4:72)、及產(chǎn)生人類(lèi)單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(科爾(Cole)等人，(1985)單克隆抗體及癌癥治療(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy),阿蘭里斯(AlanR.Liss)公司，第77-96頁(yè))?？蓪?duì)雜交瘤細(xì)胞實(shí)施免疫化學(xué)篩選以產(chǎn)生與RAGE多肽表位特異性反應(yīng)的抗體及自包含所述雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物分離的單克隆抗體。人類(lèi)化嵌合抗體包含來(lái)自至少兩種不同物種的序列。作為一個(gè)實(shí)例，重組克隆技術(shù)可用以包括含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的來(lái)自非人類(lèi)抗體(即，在用抗原免疫的非人類(lèi)物種中制備的抗體)的可變區(qū)及源自人類(lèi)免疫球蛋白的恒定區(qū)。人類(lèi)化抗體是一種嵌合抗體，其中造成抗原結(jié)合的可變區(qū)殘基(即，互補(bǔ)決定區(qū)殘基、縮短互補(bǔ)決定區(qū)殘基、或參與抗原結(jié)合的任何其它殘基)源自非人類(lèi)物種，而剩余可變區(qū)殘基(即，框架區(qū)殘基)及恒定區(qū)源自(至少部分源自)人類(lèi)抗體序列。人類(lèi)化抗體框架區(qū)殘基及恒定區(qū)殘基的亞組可源自非人類(lèi)來(lái)源。人類(lèi)化抗體的可變區(qū)也可闡述為人類(lèi)化可變區(qū)(即，人類(lèi)化輕鏈或重鏈可變區(qū))。用于經(jīng)抗原免疫的非人類(lèi)物種一般為(例如)小鼠、大鼠、兔、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或其它非人類(lèi)哺乳動(dòng)物物種。人類(lèi)化抗體一般比傳統(tǒng)嵌合抗體具有較低免疫原性且在投與到人類(lèi)中后顯示改良的穩(wěn)定性。參見(jiàn)，例如，本科薩(Benincosa)等人，(2000)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)治療G/尸Aa，aco/.五x;.7%e。292:810-6;卡勒松(Kalofonos)等人，(1994)歐洲癌癥(五wrJOmcer)30A:1842-50;蘇布阿曼(Subramanian)等人，(1998)兒科傳染病/一ctJ.)17:110-5?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)是參與抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)殘基。通常使用數(shù)種用于識(shí)別CDR的編號(hào)系統(tǒng)。卡百特(Kabat)定義是基于序列可變性，且邵氏(Chothia)定義是基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的定位。AbM定義是卡百特與邵氏方法的折衷。按照卡百特、邵氏或AbM算法，輕鏈可變區(qū)的CDR是由位置24及34(CDRl-L)、50及56(CDR2-L)、及89及97(CDR3-L)上的殘基約束。按照卡百特定義，重鏈可變區(qū)的CDR是由位置31及35B(CDRl-H)、50及65(CDR2-H)、及95及102(CDR3-H)上的殘基約束(按照卡百特編號(hào))。按照邵氏定義，重鏈可變區(qū)的CDR是由位置26及32(CDR1-H)、52及56(CDR2-H)、及95及102(CDR3-H)上的殘基約束(按照邵氏編號(hào))。按照AbM定義，重鏈可變區(qū)的CDR是由位置26及35B(CDR1-H)、50及58(CDR2-H)、及95及102(CDR3-H)上的殘基約束(按照卡百特編號(hào))。參見(jiàn)，馬丁(Martin)等人，(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86:9268-9272;馬丁等人(1991)酶學(xué)方法203:121-153;派德森(Pedersen)等人(1992)免疫方法(/www"ome/zo&)l:126;及瑞斯(Rees)等人，(1996)斯藤伯格(SternbergM丄E.)(編輯)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(ProteinStructurePrediction),牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress),牛津，第141-172頁(yè)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"CDR"是指由卡百特或邵氏定義的CDR;而且，本發(fā)明的人類(lèi)化抗體可變區(qū)可經(jīng)構(gòu)建以包含一或多個(gè)由卡百特定義的CDR，且也包含一或多個(gè)由邵氏定義的CDR。特異性決定區(qū)(SDR)是CDR內(nèi)與抗原間接相互作用的殘基。SDR與超變殘基對(duì)應(yīng)。參見(jiàn)(帕德蘭(Padlan)等人，(1995)美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)志(尸^SE5/)9:133-139)?？蚣軞埢欠浅儏^(qū)或CDR殘基的那些抗體可變區(qū)殘基。框架殘基可源自天然存在的人類(lèi)抗體，例如與本發(fā)明抗RAGE抗體的框架區(qū)基本上類(lèi)似的人類(lèi)框架。也可使用代表各序列共有序列的人工框架序列。當(dāng)選擇框架區(qū)人類(lèi)化時(shí)，在人類(lèi)中廣泛呈現(xiàn)的序列要優(yōu)于人口較少的序列?？蓪?shí)施人類(lèi)框架受體序列的額外突變以恢復(fù)認(rèn)為與抗原接觸有關(guān)的鼠科動(dòng)物殘基及/或與抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)整合有關(guān)的殘基或改良抗體表達(dá)?？衫秒慕Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來(lái)分析人類(lèi)化可變重及輕區(qū)域序列以識(shí)別并避免通過(guò)人類(lèi)化設(shè)計(jì)引入的翻譯后蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)。人類(lèi)化抗體可使用多種方法中的任何一種來(lái)制備，包括下文所述的覆蓋、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植、縮短CDR移植、特異性決定區(qū)(SDR)移植及弗氏(Frankenstein)組裝。人類(lèi)化抗體也包括在CDR中引入一或多個(gè)改變的超人類(lèi)化抗體。例如，人類(lèi)殘基可取代CDR中的非人類(lèi)殘基。可將這些一般途徑與標(biāo)準(zhǔn)誘變及合成技術(shù)組合以產(chǎn)生具有任何期望序列的抗RAGE抗體。覆蓋是基于通過(guò)用人類(lèi)氨基酸序列重作抗體的溶劑可及外表表面以減少?lài)X類(lèi)動(dòng)物或其它非人類(lèi)抗體中的潛在免疫原性氨基酸序列的觀點(diǎn)。因此，經(jīng)覆蓋的抗體比未經(jīng)修飾的非人類(lèi)抗體似乎更適合于人類(lèi)細(xì)胞。參見(jiàn)，帕德蘭(1991)分子免疫學(xué)(Mo/./mmw"o/.)28:489-98。如下覆蓋非人類(lèi)抗體識(shí)別非人類(lèi)抗體中的暴露外表框架區(qū)殘基(其與人類(lèi)抗體框架區(qū)中相同位置上的那些殘基不同)并用人類(lèi)抗體中占據(jù)這些相同位置的氨基酸代替所識(shí)別的殘基。CDR移植是通過(guò)用供體抗體(例如，非人類(lèi)抗體)的CDR代替受體抗體(例如，人類(lèi)抗體或包含期望框架殘基的其它抗體)的一或多個(gè)CDR來(lái)實(shí)施?？苫诤蜻x受體抗體與供體抗體間框架殘基的類(lèi)似性來(lái)選擇受體抗體。例如，按照弗氏方法，識(shí)別與相關(guān)非人類(lèi)抗體的每一框架區(qū)具有實(shí)質(zhì)序列同源性的人類(lèi)框架區(qū)，并將非人類(lèi)抗體的CDR移植到不同人類(lèi)框架區(qū)的復(fù)合結(jié)構(gòu)上?？捎糜谥苽浔景l(fā)明抗體的有關(guān)方法闡述于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第2003/0040606號(hào)中?？s短CDR的移植是相關(guān)方法?？s短CDR包括特異性決定殘基及相鄰氨基酸，包括輕鏈中位置27d-34、50-55及89-96位置上的氨基酸及重鏈中位置31-35b、50-58及95-101上的氨基酸((卡百特等人(1987)的編號(hào)約定)。參見(jiàn)(帕德蘭(Padlan)等人，(1995)美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)志(尸A5五SJ)9:133-9)。特異性決定殘基(SDR)移植的前提是如下協(xié)定抗體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合特異性及親和性是由每一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)內(nèi)的最高度可變殘基決定?；贑DR內(nèi)每一位置上存在的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)不相似性，可利用抗體-抗原復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)分析與可變氨基酸序列數(shù)據(jù)的分析來(lái)模擬序列可變性。SDR識(shí)別為由接觸殘基組成的最小免疫原性多肽序列。參見(jiàn)帕德蘭(Padlan)等人，(1995)美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)志(FAS^^J)9:133-139)。可對(duì)用于CDR或縮短CDR移植的受體框架實(shí)施進(jìn)一步修飾以引入期望殘基。例如，受體框架可包含人類(lèi)亞群I共有序列的重鏈可變區(qū)，視情況在位置1、28、48、67、69、71及93的一或多個(gè)位置上具有非人類(lèi)供體殘基。作為另一實(shí)例，人類(lèi)受體框架可包含人類(lèi)亞群I共有序列的輕鏈可變區(qū)，視情況在位置2、3、4、37、38、45及60的一或多個(gè)位置上具有非人類(lèi)供體殘基。在移植后，可對(duì)供體及/或受體序列實(shí)施額外改變以?xún)?yōu)化抗體結(jié)合及功能。參見(jiàn)，例如，PCT國(guó)際公開(kāi)案第WO91/09967號(hào)?？捎糜谥苽淙祟?lèi)化抗RAGE抗體的重鏈可變區(qū)的人類(lèi)框架包括以下的框架殘基DP-75、DP54、DP-54FWVH3JH4、DP-54VH33-07、DP-8(VHl-2)、DP陽(yáng)25、Vl-2b及VI-3(VHl-03)、DP-15及Vl-8(VHl-08)、DP-14及V1-18(VH1隱18)、DP-5及V1-24P(VHl-24)、DP-4(VHl-45)、DP-7(VHl-46)、DP-IO、DA-6及YAC-7(豐-69)、DP-88(VHl-e)、DP-3、及DA-8(VHl-f)?？捎糜谥苽淙祟?lèi)化抗RAGE抗體的輕鏈可變區(qū)的人類(lèi)框架包括人類(lèi)種系克隆體DPK24、DPK-12、DPK-9Vkl、DPK-9Jk4、DPK9Vkl02、及種系克隆體亞群VkIII及VKI的框架殘基。DPK24種系的以下突變可增加抗體表達(dá)F10S、T45K、163S、Y67S、F73L、及T77S。本發(fā)明的代表性人類(lèi)化抗RAGE抗體包括具有選自SEQIDNO:16-27的可變區(qū)氨基酸序列的一或多個(gè)CDR的抗體。例如，人類(lèi)化抗RAGE抗體可包含兩個(gè)或更多個(gè)CDR，所述CDR選自SEQIDNO:16、18、21、24、20及26的任一者的重鏈可變區(qū)的CDR或SEQIDNO:17、19、22、25、23及27的任一者的輕鏈可變區(qū)的CDR。人類(lèi)化抗RAGE抗體也可包含如下重鏈及輕鏈，所述重鏈包含具有SEQIDNO:16、18、21、24、20及26的任一者的兩個(gè)或三個(gè)CDR的可變區(qū)，且所述輕鏈包含具有SEQIDNO:17、19、22、25、23及27的任一者的兩個(gè)或三個(gè)CDR的可變區(qū)。本發(fā)明人類(lèi)化抗RAGE抗體可如下構(gòu)建其中第一條鏈的可變區(qū)(即，輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū))經(jīng)人類(lèi)化，且其中第二條鏈的可變區(qū)未經(jīng)人類(lèi)化(即，在非人類(lèi)物種中產(chǎn)生的抗體的可變區(qū))。這些抗體是稱(chēng)為半人類(lèi)化抗體的人類(lèi)化抗體類(lèi)型。嵌合及人類(lèi)化抗RAGE抗體的恒定區(qū)可源自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、及其任何同種型(例如，IgG的IgGl、IgG2、IgG3、或lgG4同種型)中任何一種的恒定區(qū)。己知許多抗體恒定區(qū)的氨基酸序列。人類(lèi)同種型的選擇及同種型中特定氨基酸的修飾可增強(qiáng)或消除宿主防御機(jī)制的活性并改變抗體生物分布。參見(jiàn)(瑞夫(Reff)等人，(2002)癌癥控制(Ca"cwCo"&o/)9:152-66)。對(duì)于克隆編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的序列，可缺失內(nèi)含子序列。嵌合及人類(lèi)化抗RAGE抗體可使用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)構(gòu)建。例如，可變區(qū)可通過(guò)使編碼可變區(qū)的重疊寡核苷酸一起復(fù)性并將其連接到含有人類(lèi)抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中來(lái)制備。參見(jiàn)，例如，哈婁及萊恩(Harlow&Lane)(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約及美國(guó)專(zhuān)利第4,196,265號(hào)；第4,946,778號(hào)；第5,091,513號(hào)；第5,132,405號(hào)；第5,260,203號(hào)；第5,677,427號(hào)；第5,892,019號(hào)；第5，985,279號(hào)；第6,054,561號(hào)?？芍苽浒瑑煞N完整四聚體抗體(包括同二聚體及異二聚體)的四價(jià)抗體(H4L4)，例如，如PCT國(guó)際公開(kāi)案第WO02/096948號(hào)中所述。抗體二聚體也可經(jīng)由在抗體恒定區(qū)中引入促進(jìn)鏈間二硫鍵形成的半胱氨酸殘基通過(guò)使用異雙功能交聯(lián)劑(沃爾夫(Wolff)等人(1993)癌癥研究(Cawcer7仏)53:2560-5)或通過(guò)重組產(chǎn)生以包括雙重恒定區(qū)(史蒂文森(Stevenson)等人，(1989)抗癌藥物設(shè)計(jì)04""c^cwZ)^gDes.)3:219-30)來(lái)制備。本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合片段可通過(guò)(例如)經(jīng)截短抗體序列的表達(dá)或全長(zhǎng)抗體的翻譯后消化來(lái)制備。可容易地制備包括多種改變、取代、插入及缺失的本發(fā)明抗RAGE抗體的變體。例如，可針對(duì)用于抗體表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型中的密碼子使用對(duì)抗體序列進(jìn)行優(yōu)化。為延長(zhǎng)抗體的血清半衰期，可將補(bǔ)救受體結(jié)合表位(若仍不存在)納入到抗體重鏈序列中。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,739,277號(hào)?？稍鰪?qiáng)抗體穩(wěn)定性的其它修飾包括用脯氨酸代替殘基241上的絲氨酸對(duì)IgG4進(jìn)行修飾。參見(jiàn)安高(Angal)等人，(1993)分子免疫學(xué)30:105-108。其它有用改變包括優(yōu)化抗體與藥物的偶聯(lián)效率所需要的取代。例如，可對(duì)抗體羧基端進(jìn)行修飾以包括用于藥物附著的氨基酸，例如可添加一或多個(gè)半胱氨酸殘基?？蓪?duì)恒定區(qū)進(jìn)行修飾以引入用于結(jié)合碳水化合物或其它部分的位點(diǎn)。其它抗體變體包括達(dá)成改良功能特性的糖基化同種型。例如，F(xiàn)c糖基化修飾可達(dá)成改變的效應(yīng)子功能，例如，增加與Fcy受體結(jié)合及改良ADCC及/或可降低Clq結(jié)合及CDC(例如，F(xiàn)c寡糖自復(fù)雜形式改變成高甘露糖或雜交類(lèi)型可降低Clq結(jié)合及CDC(參見(jiàn)，例如，堪達(dá)(Kanda)等人，糖生物學(xué)(Glycobiology)，2007:17:104-118))。修飾可通過(guò)對(duì)細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施生物工程來(lái)進(jìn)行；其也可通過(guò)在經(jīng)基因工程構(gòu)建的有機(jī)體中實(shí)施蛋白質(zhì)或天然產(chǎn)物糖基化路徑來(lái)進(jìn)行。也可通過(guò)利用糖結(jié)合酶(糖基轉(zhuǎn)移酶)可容忍大量不同底物的慷慨來(lái)改變糖基化。最后，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可通過(guò)多種化學(xué)途徑使蛋白質(zhì)及天然產(chǎn)物糖基化用小分子、酶、蛋白質(zhì)連接、代謝生物工程或全合成。N-聚糖加工的適宜小分子抑制劑實(shí)例包括澳粟精胺(CS)、幾夫堿(Kifonensine)(KF)、脫氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojirimycin)(DMJ)、苦馬豆素(Sw)、莫能星(Monensin)(Mn)。本發(fā)明抗RAGE抗體的變體可利用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)(包括定點(diǎn)誘變或重組克隆)來(lái)制造。抗RAGE抗體的多樣化譜可經(jīng)由基因排列及基因轉(zhuǎn)變方法在轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物中制備(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第2003/0017534號(hào))，隨后利用功能測(cè)定對(duì)其相關(guān)活性予以測(cè)試。在本發(fā)明特定實(shí)施例中，可如下獲得變體利用用于CDR突變的親和力成熟方案(楊(Yang)等人(1995)分子生物學(xué)254:392-403)、鏈改組(馬克(Marks)等人(1992)生物技術(shù)(所otec/mo/ogyfTV19)10:779-783)、使用大腸桿菌增變菌株(洛(Low)等人(1996)分子生物學(xué)260:359-368)、DNA改組(帕藤(Patten)等人(1997)現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)(Ci^r.Qp/".歷ofec/mo/.)8:724-733)、噬菌體展示(湯普森(Thompson)等人(1996)分子生物學(xué)256:77-88)、及有性PCR(科瑞邁瑞(Crameri)等人(1998)自然391:288-291)。對(duì)于免疫療法應(yīng)用，相關(guān)功能測(cè)定包括本文下文中所述的與人類(lèi)RAGE抗原特異性結(jié)合、抗體內(nèi)化、及當(dāng)投與到具有腫瘤的動(dòng)物中時(shí)靶向腫瘤位點(diǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步提供表達(dá)本發(fā)明抗RAGE抗體的細(xì)胞及細(xì)胞系。代表性宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物及人類(lèi)細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、CV-1細(xì)胞及COS細(xì)胞。在將異源構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中后產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的方法已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知。代表性非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括昆蟲(chóng)細(xì)胞(波特(Potter)等人(1993)免疫學(xué)國(guó)際評(píng)論(/W.iev./畫(huà)畫(huà)/.)10(2隱3):103-112)。也可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(侯德濱(Houdebine)(2002)現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)，13(6):625-629)及轉(zhuǎn)基因植物((Schillberg)等人(2003)細(xì)胞分子生命科學(xué)(Ce//Mo/.h/e60(3):433陽(yáng)45)中制造抗體。如上文所論述，已通過(guò)(例如)缺失、添加或取代抗體的其它部分(例如，恒定區(qū))'修飾的單克隆、嵌合及人類(lèi)化抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，可如下對(duì)抗體進(jìn)行修飾(i)通過(guò)缺失恒定區(qū)；(ii)通過(guò)用另一恒定區(qū)(例如，意欲延長(zhǎng)抗體半衰期、增加抗體的穩(wěn)定性或親和力的恒定區(qū)、或來(lái)自另外物種或抗體種類(lèi)的恒定區(qū))代替所述恒定區(qū)；或(iii)通過(guò)修飾恒定區(qū)中的一或多個(gè)氨基酸以改變(例如)糖基化位點(diǎn)數(shù)目、效應(yīng)子細(xì)胞功能、Fc受體(FcR)結(jié)合、補(bǔ)體固定(這些只是其中的一部分)。用于改變抗體恒定區(qū)的方法已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知。具有經(jīng)改變功能的抗體(例如對(duì)于效應(yīng)子配體(例如細(xì)胞上的FcR或補(bǔ)體的Cl組件)親和力改變)可通過(guò)用不同殘基代替抗體恒定部分中的至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)制造(參見(jiàn)，例如，歐洲專(zhuān)利第388,151Al號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,624,821號(hào)及美國(guó)專(zhuān)利第5,648,260號(hào)，所有這些專(zhuān)利的內(nèi)容都以引用方式并入本文中)?？梢蕴峒跋嗨祁?lèi)型的改變，如果將其應(yīng)用到鼠科動(dòng)物或其它物種免疫球蛋白會(huì)降低或消除這些功能。例如，可通過(guò)以下來(lái)改變抗體(例如，IgG，例如人類(lèi)IgG)Fc區(qū)域?qū)τ贔cR(例如，F(xiàn)cYRl)或Clq結(jié)合的親和力用在其側(cè)鏈上具有合適官能度的殘基代替特定殘基、或引入帶電荷的官能團(tuán)(例如谷氨酸鹽或天冬氨酸)、或也許芳香族非極性殘基(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,624,821號(hào))?？墒箍贵w或其結(jié)合片段與細(xì)胞毒素、治療劑或放射性金屬離子偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，偶聯(lián)的蛋白質(zhì)是抗體或其片段。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何藥劑。非限制性實(shí)例包括卡奇霉素(calicheamidn)、紫杉醇(taxol)、細(xì)胞松弛素B(cytochalasinB)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊武(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春親萬(wàn)堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、二,5基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽酉昆(mitoxantrone)、光輝霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycinD)、1-去氫睪留酮(l-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)、及類(lèi)似物、或其同系物。治療劑包括(但不限于)抗代謝物質(zhì)(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6誦thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、及5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine))、烷基化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、cyclothosphamide、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲霉素(streptozotocin)、絲裂霉素C(mitomycinC)、及順二氯二胺鉬(cis-dichlorodiamineplatinum(II))(DDP)、順鉬)、蒽環(huán)抗生素(例如，柔紅霉素及多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)、博來(lái)霉素(bleomycin)、光輝霉素、及氨茴霉素(anthmmycin))、及抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿及長(zhǎng)春堿)。將所述部分偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上的技術(shù)已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知?；蛘?，現(xiàn)在能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)免疫后能夠在不存在內(nèi)源免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生整組人類(lèi)抗體。例如，已闡述嵌合及種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JM)基因的純合缺失會(huì)導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源抗體產(chǎn)生。將人類(lèi)種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)入這些種系突變小鼠中可在受到抗原攻擊后引起人類(lèi)抗體的產(chǎn)生。參見(jiàn)(例如)耶科波維斯(Jakobovits)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊卯:2551(1993);耶科波維斯等人，自然362:255-258(1993);布如格曼(Bruggermann)等人，免疫學(xué)年刊(YearinImmunol.)7:33(1983);及杜科薩(Duchosal)等人，自然355:258(1992)。人類(lèi)抗體也可源自噬菌體展示文庫(kù)(胡根布(Hoogenboom)等人，分子生物學(xué)227:381(1991);馬克等人，分子生物學(xué)222:581-597(1991);沃恩(Vaughan)等人，自然生物技術(shù)(NatureBiotech)14:309(1996))。在某些實(shí)施例中，可將本發(fā)明抗體與作為組合療法一部分的其它藥劑組合投與。例如，在炎癥性病狀情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種可用于治療炎癥性疾病或病狀的其它藥劑組合投與。在心臟血管疾病病狀(且尤其那些起于認(rèn)為具有實(shí)質(zhì)炎癥性組份的粥樣硬化蝕斑者)情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種可用于治療心臟血管疾病的其它藥劑組合投與。在癌癥情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種抗血管生成因子、化學(xué)治療劑組合投與或標(biāo)的抗體作為放射療法的佐劑。進(jìn)一步預(yù)見(jiàn)，可與許多不同癌癥治療劑組合的標(biāo)的抗體的投與將作為癌癥治療方案的一部分。在IBD情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種消炎劑一起投與，且另外可與改良的食養(yǎng)組合。抑制RAGE-LBE與RAGE-BP間相互作用的方法本發(fā)明包括抑制RAGE與RAGE-BP間的相互作用或調(diào)節(jié)RAGE活性的方法。優(yōu)選地，所述方法可用于治療RAGE相關(guān)病癥。所述方法可包含投與本文所揭示的在RAGE下培育的抗體。所述方法包含投與與RAGE蛋白的一或多個(gè)表位特異性結(jié)合的抗體，所述RAGE蛋白具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、或SEQIDNO:13中所述的氨基酸序列。在再一實(shí)施例中，所述方法包含投與可抑制RAGE與一或多種RAGE-BP結(jié)合的化合物。識(shí)別所述化合物的實(shí)例性方法在下文中予以論述。在某些實(shí)施例中，所述相互作用是在活體外經(jīng)抑制，例如在包含經(jīng)純化蛋白質(zhì)、細(xì)胞、生物樣品、組織、人工組織等的反應(yīng)混合物中。在某些實(shí)施例中，所述相互作用是在活體內(nèi)經(jīng)抑制，例如，通過(guò)投與與RAGE結(jié)合的抗體或其RAGE結(jié)合片段。所述抗體或其片段與RAGE結(jié)合并抑制RAGE-BP的結(jié)合。本發(fā)明包括通過(guò)抑制RAGE與RAGE-BP間的相互作用或調(diào)節(jié)RAGE活性來(lái)預(yù)防或治療RAGE相關(guān)病癥的方法。所述方法包括以可有效抑制相互作用的量在足以預(yù)防或治療所述病癥的時(shí)間段內(nèi)投與對(duì)抗RAGE的抗體。核酸核酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其呈單鏈、雙鏈或三股螺旋形式的聚合物。除非明確限制，否則核酸可含有與參考天然核酸具有類(lèi)似特性的天然核苷酸的已知類(lèi)似物。核酸包括基因、cDNA、mRNA及cRNA。核酸可合成，或可源自任何生物來(lái)源(包括任何有機(jī)體)。本發(fā)明的代表性核酸包含編碼SEQIDNO:6、8、10、12中任一者所示RAGE的核苷酸序列(對(duì)應(yīng)于所揭示的編碼狒狒、食蟹猴及兔RAGE的cDNA)或編碼SEQIDNO:15中所示RAGE的核苷酸序歹iK對(duì)應(yīng)于編碼狒狒RAGE的基因組DNA序列)。本發(fā)明核酸也包含編碼SEQIDNO:16-49中所示任一抗體可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明核酸也可包含與SEQIDNO:6、8、10、12及15中任一者基本上一致的核苷酸序列，包括與SEQIDNO:6、8、10、12及15中任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%—致的核苷酸序列。本發(fā)明核酸也可包含編碼RAGE蛋白的核苷酸序列，所述RAGE蛋白具有與SEQIDNO:7、9、11及13中所示的任一氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列，所述核苷酸序列包括與SEQIDNO:7、9、11及13中任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%—致的核苷酸序列。本發(fā)明核酸也可包含編碼抗RAGE抗體可變區(qū)的核苷酸序列，所述抗RAGE抗體可變區(qū)具有與SEQIDNO:16-49中所示的任一氨基酸序列基本上一致的氨基酸序歹U，所述核苷酸序列包括編碼與SEQIDNO:16-49中任一者至少85。/。、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%—致的氨基酸序列的核苷酸序列。如本文下文中闡述利用序列比較算法使用編碼全長(zhǎng)可變區(qū)的SEQIDNO:16-49中的任一序列(編碼具有SEQIDNO:16-49中所示任一序列的全長(zhǎng)可變區(qū)的核苷酸序列)作為詢(xún)問(wèn)序列或通過(guò)目測(cè)來(lái)比較序列的最大對(duì)應(yīng)性?；旧弦恢碌男蛄锌蔀槎嘈螒B(tài)序列，B卩，群體中的替代序列或等位基因。等位基因差異可小至一個(gè)堿基對(duì)?；旧弦恢碌男蛄幸部砂T變序列，包括包含沉默突變的序列。突變可包含改變一或多個(gè)殘基、缺失一或多個(gè)殘基或插入一或多個(gè)額外殘基?；旧弦恢碌暮怂嵋沧R(shí)別為與SEQIDNO:6、8、10、12、或15中任一者的全長(zhǎng)或編碼SEQIDNO:7、9、11及13中所示RAGE氨基酸序列或編碼SEQIDNO:16-49中所示抗體可變區(qū)氨基酸序列的任一核苷酸序列的全長(zhǎng)在嚴(yán)格條件下特異性雜交或基本上雜交的核酸。在核酸雜交的上下文中，所比較的兩個(gè)核酸序列可稱(chēng)為探針及靶。探針是參考核酸分子，且靶是測(cè)試核酸分子，通常見(jiàn)于核酸分子的不均一群體中。耙序列與測(cè)試序列同義。對(duì)于雜交研究，有用探針與本發(fā)明核酸分子的至少約14個(gè)至40個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)或相仿。優(yōu)選地，探針包含SEQIDNO:6、8、10、12、或15中任一者、或編碼SEQIDNO:7、9、11及13中所示RAGE氨基酸序列、或編碼SEQIDNO:16-49中所示抗體可變區(qū)氨基酸序列的任一核苷酸序列的14個(gè)至20個(gè)核苷酸、或(若期望)甚至更長(zhǎng)，例如30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、或500個(gè)核苷酸或至多全長(zhǎng)。所述片段可容易地通過(guò)(例如)片段的化學(xué)合成、通過(guò)使用核酸擴(kuò)增技術(shù)或通過(guò)將所選序列引入到用于重組產(chǎn)生的重組載體中來(lái)制備。特異性雜交是指在嚴(yán)格條件下分子僅與特定核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈或雜交，當(dāng)所述序列存在于復(fù)雜核酸混合物(例如，全細(xì)胞DNA或RNA)中時(shí)。特異性雜交可視雜交條件的嚴(yán)格性而容納探針與靶序列間的錯(cuò)配。在諸如南方及北方墨點(diǎn)分析等核酸雜交實(shí)驗(yàn)上下文中的嚴(yán)格雜交條件及嚴(yán)格雜交洗滌條件是序列及環(huán)境二者依賴(lài)性的。較長(zhǎng)的序列將在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可見(jiàn)于提森(Tijssen)(1993)生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-與核酸探針雜交(L^mMyTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes),第I部分第2章，愛(ài)思唯爾(Elsevier)，紐約。通常，所選高度嚴(yán)格雜交及洗滌條件為在已確定的離子強(qiáng)度和pH下比特定序列的熱熔點(diǎn)(TJ低約5°C。一般來(lái)說(shuō)，在嚴(yán)格條件下探針將與其靶子序列特異性雜交，而不與其它序列雜交。Tm是在其下50%的耙序列與完美匹配的探針雜交的溫度(在已確定的離子強(qiáng)度和pH下)。對(duì)于特定探針，所選非常嚴(yán)格的條件是等于Tm。具有多于約100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的南方或北方墨點(diǎn)分析的嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是在50%甲酰胺與1mg肝素中于42。C下雜交過(guò)夜。高度嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是在0.1XSSC中于65°C下15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是在0.2XSSC緩沖液中于65'C下15分鐘。參見(jiàn)薩姆布魯克(Sambrook)等人編輯，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning:ALaboratoryManual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約對(duì)于SSC緩沖液的闡述。通常，高度嚴(yán)格洗滌之前為低度嚴(yán)格洗漆以清除背景探針信號(hào)。對(duì)于多于約100個(gè)核苷酸的雙鏈體來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是在IXSSC中于45'C下15分鐘。對(duì)于多于約100個(gè)核苷酸的雙鏈體來(lái)說(shuō)，低度嚴(yán)格洗漆的實(shí)例是在4X至6XSSC中于40'C下15分鐘。對(duì)于較短探針(例如，約10個(gè)至50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格條件一般涉及在pH7.0-8.3下小于約lMNa+離子的鹽濃度、一般約0.01至lMNa+離子濃度(或其它鹽)且溫度一般為至少約3(TC。嚴(yán)格條件也可經(jīng)添加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑達(dá)成。通常來(lái)說(shuō)，在特定雜交分析中信噪比為對(duì)于無(wú)關(guān)探針?biāo)^察者2-倍(或更高)表示檢測(cè)到特異性雜交。以下是可用于識(shí)別與本發(fā)明參考核苷酸序列基本上一致的核苷酸序列的雜交及洗滌條件的實(shí)例探針核苷酸序列優(yōu)選與靶核苷酸序列在7M十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中于5CTC下雜交，然后在2XSSC、0.1%SDS中于5(TC下洗滌；更優(yōu)選地，探針與靶序列在7。/。十二垸基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA中于50。C下雜交，然后在1XSSC、0.1Q/。SDS中于50。C下雜交；更優(yōu)選地，探針與靶序列在7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中于5(TC下雜交，然后在0.5XSSC、0.1。/。SDS中于5(TC下洗滌；更優(yōu)選地，探針與耙序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中于50。C下雜交，然后在0.1XSSC、0.1%SDS中于5(TC下洗滌；更優(yōu)選地，探針與靶序列在7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA中于50。C下雜交，然后在O.IXSSC、0.1%SDS中于65"下洗滌。兩個(gè)核酸序列基本上一致的進(jìn)一步指示是由核酸編碼的蛋白質(zhì)基本上一致、共享總體三維結(jié)構(gòu)、或?yàn)樯锕δ艿刃?。這些術(shù)語(yǔ)在本文下文中進(jìn)一步予以定義。如果對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)基本上一致，則在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸分子仍基本上一致。此可在(例如)兩個(gè)核苷酸序列包含基因代碼允許的保守取代變體時(shí)發(fā)生。保守取代變體是具有簡(jiǎn)并密碼子取代的核酸序列，其中一或多個(gè)所選(或全部)密碼子的第三位置經(jīng)混合堿基及/或脫氧肌苷殘基取代。參見(jiàn)巴特茲(Batzer)等人(1991)核酸研究(M/c/e/cA油L)19:5081;大塚(Ohtsuka)等人(1985)生物化學(xué)C/扁.C/2，.)260:2605-2608;及羅斯里尼(Rossolini)等人(1994)分子細(xì)胞探針(Mo/.Ce〃尸ra6e力8:91-98。本發(fā)明核酸也包含與SEQIDNO:6、8、10、12、或15中任一者互補(bǔ)的核酸、或編碼SEQIDNO:7、9、11及13中所示RAGE氨基酸序列或編碼SEQIDNO:16-49中所示抗體可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列及其互補(bǔ)序列?；パa(bǔ)序列是包含能夠在堿基對(duì)間形成氫鍵后彼此配對(duì)的反向平行核苷酸序列的兩個(gè)核苷酸序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)序列意指基本上互補(bǔ)的核苷酸序列(此可通過(guò)下文所述的相同核苷酸比較方法評(píng)價(jià))或定義為能夠在本文所述那些相對(duì)嚴(yán)格條件下與所研究核酸節(jié)段雜交?；パa(bǔ)核酸節(jié)段的特定實(shí)例是反義寡核苷酸。子序列是包含較長(zhǎng)核酸序列的一部分的核酸序列。實(shí)例性子序列是本文上文所述的探針或引物。本文所用的術(shù)語(yǔ)引物是指包含所選核酸分子的約8個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、優(yōu)選10-20個(gè)核苷酸、且更優(yōu)選20-30個(gè)核苷酸的連續(xù)序列。本發(fā)明引物涵蓋具有足夠長(zhǎng)度及合適序列以在本發(fā)明核酸分子上開(kāi)始聚合的寡核苷酸。伸長(zhǎng)序列包含納入到核酸中的額外核苷酸(或其它類(lèi)似分子)。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可在核酸分子的3'端添加序列。另外，可使核苷酸序列與其它DNA序列組合，例如啟動(dòng)子、啟動(dòng)子區(qū)域、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)含子序列、額外限制性酶位點(diǎn)、多個(gè)克隆位點(diǎn)、及其它編碼節(jié)段。因此，本發(fā)明也提供包含所揭示核酸的載體，包括用于重組表達(dá)的載體，其中使本發(fā)明核酸與功能啟動(dòng)子可操作連接。當(dāng)與核酸可操作連接時(shí)，啟動(dòng)子與核酸在功能上組合，由此啟動(dòng)子區(qū)域控制并調(diào)控核酸轉(zhuǎn)錄。載體是指能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸，例如質(zhì)粒、粘粒、及病毒載體。本發(fā)明核酸可克隆、合成、改變、誘變或其組合?？捎糜诜蛛x核酸的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA及分子克隆技術(shù)已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知。定點(diǎn)誘變以產(chǎn)生堿基對(duì)改變、缺失或小插入也已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知。參見(jiàn)，例如，薩姆布魯克等人(編輯)(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；斯哈維(Silhavy)等人(1984)基因融合實(shí)驗(yàn)(Experimentsw池s)。冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；格洛夫及黑穆斯(Glover&Hames)(1995)DNA克隆實(shí)用方法(DNACloning:APracticalApproach),第2版，牛津大學(xué)出版社IRL出版社，牛津/紐約；奧蘇貝爾(Ausubel)(編輯)(1995)分子生物學(xué)簡(jiǎn)略方案(ShortProtocolsinMolecularBiology),第3版，威立(Wiley)，紐約。治療方法本發(fā)明是關(guān)于且包括治療RAGE相關(guān)病癥(RAGE-related或RAGE-associated)的方法。RAGE相關(guān)病癥的特征通常在于包括其中受侵襲細(xì)胞展示RAGE或一或多種RAGE配體的提高表達(dá)的任何病癥。RAGE相關(guān)病癥也可稱(chēng)為可通過(guò)降低RAGE功能來(lái)治療(即，可消除或改善一或多個(gè)癥狀)的任何病癥。例如，可通過(guò)投與破壞RAGE與RAGE-BP間相互作用的藥劑(例如RAGE抗體)來(lái)降低RAGE功能。RAGE的增加表達(dá)與數(shù)種病理學(xué)狀態(tài)有關(guān)，例如糖尿病性血管病變、腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、及包括血管壁免疫/炎癥性反應(yīng)及膿毒癥在內(nèi)的其它病癥。RAGE配體在受許多炎癥性病癥侵襲的組織中產(chǎn)生，所述炎癥性病癥包括關(guān)節(jié)炎(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。在糖尿病性組織中，RAGE產(chǎn)生認(rèn)為是由晚期糖化終產(chǎn)物的過(guò)度產(chǎn)生造成。此導(dǎo)致氧化性應(yīng)激及導(dǎo)致糖尿病患者血管疾病的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。本發(fā)明包括治療個(gè)體炎癥及特征在于炎癥性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)活化的疾病或病狀的方法，其包含投與有效量的抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段及/或包含抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段的組合物(例如，醫(yī)藥組合物)。例如，已顯示S100/鈣粒蛋白包含密切相關(guān)的特征在于由結(jié)合肽連接的兩個(gè)EF-手區(qū)域的鈣結(jié)合多肽家族(例如，參見(jiàn)斯卡菲爾(Schafer)等人，1996，生物化學(xué)科學(xué)走向(TIBS)，21:134-140;齊默(Zimmer)等人，1995，腦研究公報(bào)(BrainRes.Bull.)，37:417-429;哈穆斯(Rammes)等人，1997，生物化學(xué)，272:9496-9502;魯格瑞(Lugering)等人，1995，歐洲臨床研究(Eur.J.Clin.Invest.),25:659-664)。盡管其缺少信號(hào)肽，但早已習(xí)知S100/l丐粒蛋白可進(jìn)到細(xì)胞外隙中，尤其慢性免疫/炎癥性反應(yīng)位點(diǎn)，如在囊性纖維化及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中。RAGE是S100/鈣粒蛋白家族中許多成員的受體，其介導(dǎo)所述S100/鈣粒蛋白家族成員對(duì)諸如淋巴細(xì)胞及單核吞噬細(xì)胞等細(xì)胞的促炎性效果。而且，對(duì)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)、IL-10裸小鼠結(jié)腸炎、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎、及實(shí)驗(yàn)型自身免疫性腦炎模型的研究表明RAGE-配體相互作用(推測(cè)與S-100/鈣粒蛋白)在炎癥性級(jí)聯(lián)中具有最接近作用。適于本文所述治療方法的炎癥性病狀可為其中炎癥性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)經(jīng)活化者。炎癥性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)可造成全身性反應(yīng)，與膿毒性休克所發(fā)生的一樣。本發(fā)明抗RAGE抗體及其RAGE結(jié)合片段可用于治療膿毒癥、膿毒性休克及全身性利斯特菌病。膿毒癥是對(duì)感染的全身性炎癥性反應(yīng)，且會(huì)伴隨器官功能障礙、灌注不足或低血壓。在膿毒性休克(嚴(yán)重形式的膿毒癥)中，盡管流體復(fù)蘇充足，但仍引起低血壓。利斯特菌病是由進(jìn)食經(jīng)細(xì)菌單核細(xì)胞增生性利斯特菌(Listeriamonocytogenes)污染的食物而造成的嚴(yán)重感染。已顯示RAGE介導(dǎo)膿毒性休克的致死效應(yīng)(里來(lái)塞克(Liliensek)等人，2004，113:11641-50)。膿毒癥的生理學(xué)極為復(fù)雜，表現(xiàn)為全身性炎癥及器官功能障礙，包括體溫、心臟血管參數(shù)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常；肝酶提高及大腦功能改變。膿毒癥是對(duì)夸大及失調(diào)的感染或刺激的反應(yīng)。膿毒癥的鼠科動(dòng)物CLP模型導(dǎo)致多種微生物感染，伴有腹部膿腫及菌血癥，并重新產(chǎn)生人類(lèi)疾病中所觀察到的血液動(dòng)力學(xué)及代謝階段。用本文所述膿毒癥的鼠科動(dòng)物CLP模型獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RAGE在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用。數(shù)據(jù)也展示在手術(shù)時(shí)以及在手術(shù)后至多36小時(shí)時(shí)投與與RAGE特異性結(jié)合的抗RAGE抗體可對(duì)小鼠提供顯著治療性保護(hù)，此通過(guò)提高的存活率及提高的病理學(xué)分?jǐn)?shù)證實(shí)?？捎糜谥委熌摱景Y、利斯特菌病、及其它RAGE相關(guān)疾病的抗體可為與RAGE的V結(jié)構(gòu)域結(jié)合并防止RAGE配體或結(jié)合配偶體與RAGE蛋白結(jié)合的抗體。本發(fā)明抗體及方法治療或預(yù)防的炎癥性病狀可由局限炎癥性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)介導(dǎo)，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎?？墒褂帽景l(fā)明抗RAGE抗體及其RAGE結(jié)合片段及/或組合物有效治療的炎癥性病狀的非限制性實(shí)例包括(例如)與胃腸道及有關(guān)組織相關(guān)的疾病(例如腸梗阻、闌尾炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、潰瘍性、假膜性、急性及缺血性結(jié)腸炎、憩室炎、會(huì)厭炎、失弛緩癥、膽管炎、膽囊炎、腹部疾病、肝炎、克隆氏病、腸炎、及惠普爾氏病(Whipple'sdisease));全身性或局部性炎癥性疾病及病狀(例如哮喘、過(guò)敏癥、過(guò)敏性休克、免疫復(fù)合物疾病、器官缺血、再灌注損傷、器官壞死、花粉癥、膿毒癥、敗血癥、內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)、體溫過(guò)高、嗜酸細(xì)胞性肉芽腫、肉芽腫病、及肉樣瘤病)；與泌尿生殖系統(tǒng)及有關(guān)組織相關(guān)的疾病(例如膿毒性流產(chǎn)、附睪炎、陰道炎、前列腺炎、及尿道炎)；與呼吸系統(tǒng)及有關(guān)組織相關(guān)的疾病(例如支氣管炎、肺氣腫、鼻炎、囊性纖維化、肺炎、成人呼吸性窘迫綜合征、硅酸鹽沉著病、肺泡炎、細(xì)支氣管炎、咽炎、胸膜炎、及鼻竇炎)；由各種病毒(例如流感病毒、呼吸道合胞病毒、HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及皰疹病毒)、細(xì)菌(例如彌散性菌血癥、登革熱(Denguefever))、真菌(例如念珠菌病)及原生動(dòng)物及多細(xì)胞寄生蟲(chóng)(例如瘧疾、絲蟲(chóng)病、阿米巴病(amebiasis)及包蟲(chóng)囊腫)感染引起的疾??；皮膚的皮膚病學(xué)疾病及病狀(例如燒傷、皮炎、皮肌炎、曬傷、蕁麻疹疣、及風(fēng)疹塊)；與心臟血管系統(tǒng)及有關(guān)組織相關(guān)的疾病(例如狹窄、再狹窄、血管炎、脈管炎、心內(nèi)膜炎、動(dòng)脈炎、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓性靜脈炎、心包炎、充血性心力衰竭、心肌炎、心肌缺血、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)?、及風(fēng)濕熱)；與中樞或周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)及有關(guān)組織相關(guān)的疾病(例如腦膜炎、腦炎、多發(fā)性硬化、腦梗死、腦栓塞、格-巴二氏綜合征(Guillame-Barresyndrome)、神經(jīng)炎、神經(jīng)痛、脊髓損傷、麻痹、及葡萄膜炎)；骨、關(guān)節(jié)、肌肉及結(jié)締組織疾病(例如各種關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病(Paget'sdisease)、痛風(fēng)、牙周病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、及滑膜炎)；其它自身免疫性及炎癥性病癥(例如重癥肌無(wú)力、甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture'ssyndrome)、貝赫切特綜合征(Behcets'ssyndrome)、同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、強(qiáng)直性脊柱炎、貝格爾氏病(Berger'sdisease)、及萊特爾綜合征(Retier'ssyndrome));以及各種癌癥、腫瘤及增殖性病癥(例如霍奇金病(Hodgkinsdisease));及任何情形下對(duì)任何原發(fā)性疾病的炎癥性或免疫宿主反應(yīng)。本發(fā)明抗RAGE抗體及其RAGE結(jié)合片段可用于治療癌癥。腫瘤細(xì)胞顯示RAGE配體的增加表達(dá)，所述RAGE配體尤其為已顯示與RAGE相互作用的兩性蛋白，其為高遷移率族I非組蛋白染色體DNA結(jié)合蛋白(蘿芙拉(Rauvala)等人，生物化學(xué)，262:16625-16635(1987);帕克嫩(Parkikinen)等人，生物化學(xué)，268:19726-19738(1993))。兩性蛋白促進(jìn)神經(jīng)突增生，以及用作纖維蛋白溶解系統(tǒng)中蛋白酶復(fù)合物裝配的表面(也稱(chēng)為有助于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性)，此表明癌癥也是RAGE相關(guān)病癥。慢性炎癥的氧化效應(yīng)及其它方面也對(duì)某些腫瘤的生成具有促進(jìn)效果。另外，例如，已在原發(fā)性腫瘤模型(C6膠質(zhì)瘤)、路易士(Lewis)肺轉(zhuǎn)移模型(田口(Taguchi)等人，2000，自然405:354-360)、及表達(dá)v-Ha-ras轉(zhuǎn)基因的小鼠自發(fā)產(chǎn)生乳頭狀瘤(萊德(Leder)等人，1990，國(guó)家科學(xué)院院刊，87:9178-9182)中觀察到阻斷RAGE的局部腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。本發(fā)明抗體或其結(jié)合片段可用于治療或預(yù)防糖尿病、糖尿病并發(fā)癥及與糖尿病相關(guān)的病理學(xué)病狀。已顯示，最終導(dǎo)致形成晚期糖化終產(chǎn)物(AGE)的大分子的非酶糖基化在炎癥位點(diǎn)、在腎衰竭中、在高血糖癥及與全身性或局部性氧化劑應(yīng)激相關(guān)的其它病狀存在下增強(qiáng)(戴爾(Dyer)等人，臨床研究(J.Clin.Invest.),91:2463-2469(1993);瑞迪(Reddy)等人，生物化學(xué)(Biochem.)，34:10872-10878(1995);戴爾等人，生物化學(xué)，266:11654-11660(1991);德根哈特(Degenhardt)等人，細(xì)胞和分子生物學(xué)(CellMol.Biol.)，44:1139-1145(1998))。AGE在脈管系統(tǒng)中的堆積可聚集發(fā)生，如在由可見(jiàn)于患有與透析相關(guān)淀粉樣變性的患者中的AGE-(32-微球蛋白構(gòu)成的關(guān)節(jié)淀粉樣蛋白(宮田(Miyata)等人，臨床研究，92:1243-1252(1993);宮田等人，臨床研究，98:1088-1094(1996))，或(通常來(lái)說(shuō))如患有糖尿病患者的脈管系統(tǒng)及組織所例示(施密特(Schmidt)等人，自然醫(yī)學(xué)(NatureMed.)，1:1002-1004(1995))。AGE在糖尿病患者中的時(shí)間進(jìn)行性堆積表明內(nèi)源清除機(jī)制在.AGE沉積位點(diǎn)處不能有效起作用。所述堆積的AGE能夠通過(guò)數(shù)種機(jī)制改變細(xì)胞特性。盡管RAGE在正常組織及脈管系統(tǒng)中以低水平表達(dá)，但己顯示在其中受體配體堆積的環(huán)境中RAGE上調(diào)(李(Li)等人，生物化學(xué)，272:16498-16506(1997);李等人，生物化學(xué)，273:30870-30878(1998);田中(Tanaka)等人，生物化學(xué)，275:25781-25790(2000))。RAGE表達(dá)在糖尿病性脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)單核吞噬細(xì)胞中增加。而且，細(xì)胞培養(yǎng)研究已展示AGE-RAGE相互作用造成在血管內(nèi)平衡中極為重要的細(xì)胞特性變化。抗RAGE抗體或其結(jié)合片段也可用于治療勃起功能障礙。RAGE活化經(jīng)由NADH氧化酶樣酶產(chǎn)生氧化劑，由此抑制一氧化氮循環(huán)，一氧化氮是導(dǎo)致陰莖勃起的海綿體平滑肌松弛的主要刺激物。通過(guò)抑制RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑活化，可減少氧化劑產(chǎn)生。本發(fā)明抗體或其結(jié)合片段可用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。已顯示，缺血性心臟病在糖尿病患者中發(fā)病率尤其高(羅伯遜(Robertson)等人，實(shí)驗(yàn)室研究(LabInvest),18:538-551(1968);卡奈爾(Kannel)等人，美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)會(huì)刊(J.Am.Med.Assoc.),241:2035-2038(1979);卡奈爾等人，糖尿病護(hù)理(Diab.Care)，2:120-126(1979))。另外，研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化在糖尿病患者中比在不患有糖尿病的患者中更加速且更為廣泛(參見(jiàn)，例如沃勒(Waller)等人，美國(guó)醫(yī)學(xué)(Am.JMed.)，69:498-506(1980);科瑞奧(Crall)等人，美國(guó)醫(yī)學(xué)，64:221-230(1978);海貝(Hamby)等人，胸科(Chest.)2:251-257(1976);及普瑞拉(Pyorala)等人，糖尿病代謝評(píng)論(Diab.Metab.Rev.)，3:463-524(1987))。盡管在糖尿病環(huán)境中加速動(dòng)脈粥樣硬化的原因有很多，但已顯示AGE降低可減少蝕斑形成。因此，可用本發(fā)明組合物治療或預(yù)防的RAGE相關(guān)病癥的列示包括急性炎癥性疾病(例如膿毒癥)、休克(例如，膿毒性休克、出血性休克)、慢性炎癥性疾病(例如風(fēng)濕性及銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、過(guò)敏性腸病、多發(fā)性硬化、銀屑病、狼瘡、全身性狼瘡腎炎、及炎癥性狼瘡腎炎、及其它自身免疫性疾病)、心臟血管疾病(例如，動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、脆性蝕斑病癥、絞痛癥及再狹窄)、糖尿病(且尤其糖尿病患者的心臟血管疾病)、糖尿病并發(fā)癥、勃起功能障礙、癌癥(例如，肺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、前列腺癌、人類(lèi)胰腺癌、腎細(xì)胞癌黑素瘤)、脈管炎及其它脈管炎綜合征(例如壞死性血管炎病)、腎病、視網(wǎng)膜病變、及神經(jīng)病變。本發(fā)明提供抗RAGE抗體及RAGE結(jié)合片段的活體內(nèi)投與。標(biāo)的抗體可以醫(yī)藥組合物形式投與，并且也可與一或多種額外藥劑一起投與。標(biāo)的抗體的投與可為治療特定病狀的治療方案的一部分?？赏ㄟ^(guò)投與單獨(dú)抗體或通過(guò)投與標(biāo)的抗體與其它藥劑的組合予以治療的病狀包括RAGE相關(guān)病癥。舉例來(lái)說(shuō)，RAGE相關(guān)病癥包括'(但不限于)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、動(dòng)脈粥樣硬化、脈管炎及其它脈管炎綜合征(例如壞死性血管炎病)、阿茲海默氏癥(Alzheimer'sdisease)、癌癥、糖尿病并發(fā)癥(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變)、自身免疫性疾病(例如銀屑病及狼瘡)。RAGE相關(guān)病癥進(jìn)一步包括急性炎癥性疾病(例如，膿毒癥)、慢性炎癥性疾病、及經(jīng)炎癥惡化的其它病狀(即，其癥狀可通過(guò)減輕炎癥而改善)?；诳贵w組合物的投與方法可為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的大量方法中的任一種方法。這些方法包括局部性或全身性投與且進(jìn)一步包括真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、及鼻內(nèi)途徑投與，包括使用噴霧器及吸入劑。另外，可能期望通過(guò)任何適宜途徑(包括心室內(nèi)及鞘內(nèi)注射)將本發(fā)明醫(yī)藥組合物引入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。心室內(nèi)注射可借助(例如)附接到儲(chǔ)集器(例如奧馬耶儲(chǔ)集器(Ommayareservoir))上的心室內(nèi)導(dǎo)管。引入方法也可通過(guò)可再裝載或生物可降解的裝置(例如，儲(chǔ)槽)來(lái)實(shí)施。而且，預(yù)期投與也可通過(guò)涂覆裝置、植入物、支撐架或假肢發(fā)生。，例如，受諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)病狀嚴(yán)重?fù)p傷的軟骨可整體或部分地由各種假肢代替。存在多種適宜可移植材料，包括那些基于以下者膠原-糖胺聚糖模板(斯通(Stone)等人(1990)臨床骨科及相關(guān)研究(Clin.Orthop.Relat.Res.)252:129)、經(jīng)分離軟骨細(xì)胞(格蘭德(Grande)等人(1989)骨科研究(JOrthopRes)7:208;及塔利戈瓦(Taligawa)等人(1987)骨與礦物質(zhì)研究(BoneMiner)2:449)、及附接到天然或合成聚合物上的軟骨細(xì)胞(瓦莉塔尼(Walitani)等人(1989)骨及關(guān)節(jié)外科(JBoneJtSurg)71B:74;瓦肯提(Vacanti)等人(1991)塑料及修補(bǔ)外科學(xué)(PlastReconstrSurg)88:753;馮'施羅德(vonSchroeder)等人(1991)生物醫(yī)學(xué)材料研究(JBiomedMaterRes)25:329;福瑞德(Freed)等人(1993)生物醫(yī)學(xué)材料研究27:11;及瓦肯提等人，美國(guó)專(zhuān)利第5,041,138號(hào))。例如，軟骨細(xì)胞可在生物可降解、生物相容性高度多孔支架上的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，所述支架自諸如聚乙醇酸、聚乳酸、瓊脂糖凝膠等聚合物或隨時(shí)間隨聚合物骨架水解成無(wú)害單體而降解的其它聚合物形成。基質(zhì)經(jīng)設(shè)計(jì)應(yīng)允許充足的營(yíng)養(yǎng)物及氣體交換到細(xì)胞直至發(fā)生移植物植入。可在活體外培養(yǎng)細(xì)胞，直至待要植入的細(xì)胞生長(zhǎng)到充足細(xì)胞體積及密度。所述基質(zhì)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其可基于各自情況經(jīng)澆注或塑造成期望形狀，因此最終產(chǎn)品精密地類(lèi)似(例如)患者自己的耳朵或鼻子，或可使用允許在植入時(shí)進(jìn)行處理(如在關(guān)節(jié)處)的撓性基質(zhì)。這些及其它植入物及假肢可用標(biāo)的抗體或其結(jié)合片段進(jìn)行處理并用以投與標(biāo)的抗體或其結(jié)合片段。例如，可將包括抗體或結(jié)合片段的組合物施加到或涂覆于植入物或假肢上。這樣，所述抗體或其片段可直接投與到特定受侵襲組織(例如，受損傷的關(guān)節(jié))上。標(biāo)的抗體可作為組合療法的一部分與其它藥劑一起投與。組合療法是指兩種或更多種不同治療化合物的任何組合投與形式，由此當(dāng)先前投與的治療化合物在體內(nèi)仍有效時(shí)投與第二種化合物(例如，所述兩種化合物在患者中同時(shí)有效，此包括所述兩種化合物的協(xié)同效應(yīng))。例如，不同治療化合物可以相同調(diào)配物或以單獨(dú)調(diào)配物相伴或依序投與。因此，接受所述治療的個(gè)體可具有不同治療化合物的組合(聯(lián)合)效應(yīng)。例如，在炎癥性病狀情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種可用于治療炎癥性疾病或病狀的其它藥劑組合投與?？捎糜谥委熝装Y性疾病或病狀的藥劑包括(但不限于)消炎劑或消炎藥。消炎藥包括(例如)糖皮質(zhì)激素，例如可的松(cortisone)、氫化可的松(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、氟可特龍(fluorcortolone)、曲安西龍(triamcinolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼立定(prednylidene)、巾白拉米松(paramethasone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、氟潑尼定(fluprednylidene)、脫氧米塞松(desoxymethasone)、膚輕松(fluocinolone)、氟米松(flumethasone)、二氟可龍(diflucortolone)、氯可托龍(clocortolone)、氯倍他索(clobetasol)及氟考丁酯(fluocortinbutylester);免疫抑制劑，例如抗TNF劑(例如，依那西普(etanercept)、英夫利昔單抗(infliximab))及IL-l抑制劑；青霉胺(penicillamine);非類(lèi)固醇類(lèi)消炎藥物(NSAID)，其包括消炎、止痛、及退熱藥物，例如水楊酸、塞來(lái)考昔(celecoxib)、氟苯水楊酸及來(lái)自經(jīng)取代苯乙酸鹽或2-苯基丙酸鹽者，例如阿氯芬酸(alclofenac)、異丁芬酸(ibutenac)、布洛芬(ibuprofen)、科林耐酸(clindanac)、苯克洛酸(fenclorac)、酮洛芬(ketoprofen)、非諾洛芬(fen叩rofen)、吲哚洛芬(indoprofen)、芬氯酸(fenclofenac)、雙氯芬酸(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、哌洛芬(piprofen)、萘普生(naproxen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、卡洛芬(carprofen)及環(huán)洛芬(cicloprofen);昔康(oxican)衍生物，例如吡羅昔康(piroxican);鄰氨基苯甲酸衍生物，例如甲芬那酸(mefenamicacid)、氟芬那酸(flufenamicacid)、氟芬那酸(tolfenamicacid)及甲氯芬那酸(meclofenamicacid)、經(jīng)苯胺基取代的煙酸衍生物，例如滅酸酯類(lèi)尼氟滅酸(niflumicacid)、氯尼辛(clonixin)及氟尼辛(flunixin);雜芳基乙酸，其中雜芳基為2-吲哚-3-基或吡咯-2基，例如吲哚美辛(indomethacin)、奧沙美辛(oxametacin)、B引四唑(intrazole)、阿西美辛(acemetacin)、桂美辛(cinmetacin)、佐美酸(zomepirac)、托美丁(tolmetin)、克哌洛酸(colpirac)及噻洛芬酸(tiaprofenicacid);舒林酸(sulindac)類(lèi)型的idenylaceticacid;具有止痛活性的雜芳基氧基乙酸，例如芐達(dá)酸(bendazac);保泰松(phenylbutazone);依托度酸(etodolac);萘丁美酮(nabumetone);及緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(DMARD)，例如甲氨蝶呤、氯金化鈉、羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、環(huán)孢素(ciclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、及來(lái)氟米特(leflunomide)。可用于治療炎癥性疾病或病狀的其它治療劑包括抗氧化劑。抗氧化劑可為天然或合成抗氧化劑?？寡趸瘎┦?例如)超氧化物歧化酶(SOD)、21-氨基甾類(lèi)/氨基色滿(mǎn)、維生素C或E等。許多其它抗氧化劑已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知?？膳c許多不同消炎劑組合的標(biāo)的抗體可用作炎癥性病狀治療方案的一部分。例如，可將標(biāo)的抗體與一或多種NSAID、DMARD或免疫抑制劑組合投與。在所述應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施例中，可將標(biāo)的抗體或其片段與甲氨蝶呤組合投與。在另一實(shí)施例中，可將標(biāo)的抗體與TNF-ct抑制劑組合投與。在心臟血管疾病病狀且尤其那些起于粥樣硬化蝕斑(認(rèn)為其具有實(shí)質(zhì)炎癥性組份)的病狀的情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種可用于治療心臟血管疾病的其它藥劑組合投與?？捎糜谥委熜呐K血管疾病的藥劑包括(但不限于)(3-阻斷劑，例如卡維地洛(carvedilol)、美托洛爾(metoprolol)、布新洛爾(bucindolol)、比索洛爾(bis叩rolol)、阿替洛爾(atenolol)、普萘洛爾(propranolol)、納多洛爾(nadolol),噻嗎洛爾(timolol)、吲哚洛爾(pindolol)、及拉貝洛爾(labetalol);抗血小板劑，例如阿司匹林(aspirin)及噻氯匹定(ticlopidine);血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，例如卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴(lài)諾普利(lisin叩ril)、貝那普利(benazepril)、福辛普禾lj(fosin叩ril)、喹那普禾U(quinapril)、雷米普利(ramipril)、螺普利(spirapril)、及莫昔普利(moexipril);及降脂劑，例如美伐他汀(mevastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、及羅舒伐他汀(rosuvastatin)。在癌癥情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種抗血管生成因子、化學(xué)治療劑組合投與，或標(biāo)的抗體作為放射療法的佐劑。進(jìn)一步預(yù)見(jiàn)，可與許多不同癌癥治療劑組合的標(biāo)的抗體的投與將作為癌癥治療方案的一部分?？蓪⒖贵w或其結(jié)合片段與細(xì)胞毒素或放射療法連接或結(jié)合以殺死表達(dá)RAGE的癌細(xì)胞?？蓪⑺隹贵w或其片段投與給患者，由此所述抗體將與表達(dá)RAGE的癌細(xì)胞結(jié)合。在IBD情況下，可將標(biāo)的抗體與一或多種消炎劑一起投與，且另外可與改良的食養(yǎng)組合。對(duì)于治療膿毒癥及膿毒癥相關(guān)病癥或病狀(例如膿毒性休克)以及對(duì)于治療全身性利斯特菌病，可將本發(fā)明抗RAGE抗體與治療膿毒癥及膿毒癥相關(guān)病癥或病狀或治療全身性利斯特菌病的其它藥劑及治療方法組合投與。例如，膿毒癥或利斯特菌病可通過(guò)投與標(biāo)的抗體與為患者特定癥狀及狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理的抗生素及/或其它醫(yī)藥組合物來(lái)治療。一方面，本發(fā)明也提供抑制個(gè)體中AGE與RAGE相互作用的方法，其包含向所述患者投與治療有效量的通過(guò)本發(fā)明方法識(shí)別的化合物。治療有效量是能夠防止個(gè)體中AGE/RAGE相互作用的量。因此，此量將隨所治療的個(gè)體而變化?；衔锏耐杜c可為每小時(shí)一次、每天一次、每周一次、每月一次、每年一次或單次事件。例如，化合物的有效量可包含約1pg/kg體重至約100mg/kg體重。在一個(gè)實(shí)施例中，化合物的有效量包含約1叱/kg體重至約50mg/kg體重。在又一實(shí)施例中，化合物的有效量包含約10pg/kg體重至約10mg/kg體重。實(shí)際有效量將使用業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)劑量/反應(yīng)分析來(lái)確定(約翰遜(Johnson)等人，糖尿病，42:1179，(1993))。因此，如所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知，有效量將隨化合物的生物利用性、生物活性及生物可降解性而定。例如，將本發(fā)明抗RAGE抗體及組合物以足以抑制促炎性細(xì)胞因子自細(xì)胞釋放及/或治療炎癥性病狀的量投與給需要其的患者。本發(fā)明包括將促炎性細(xì)胞因子釋放抑制至少10%、20%、25%、50%、75%、80%、90%、或95%，如使用本文所述或所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的其它方法所評(píng)價(jià)。在實(shí)施例中，個(gè)體是動(dòng)物。在實(shí)施例中，個(gè)體是人類(lèi)。在實(shí)施例中，個(gè)體患有AGE相關(guān)疾病，例如糖尿病、淀粉樣變性、腎衰竭、衰老或炎癥。在另一實(shí)施例中，個(gè)體包含患有阿茲海默氏癥的個(gè)體。在替代實(shí)施例中，個(gè)體包含患有癌癥的個(gè)體。在再一實(shí)施例中，個(gè)體包含患有全身性紅斑狼瘡或炎癥性狼瘡腎炎的個(gè)體?？蓪?biāo)的抗體或其結(jié)合片段以約1pg/kg體重至約100mg/kg體重的劑量投與。在一個(gè)實(shí)施例中，化合物的有效量包含約1ng/kg體重至約50mg/kg體重。治療的持續(xù)時(shí)間頻率將尤其隨特定疾病狀態(tài)以及患者狀態(tài)而定。生物標(biāo)記可對(duì)測(cè)量膿毒癥疾病活動(dòng)的生物標(biāo)記(例如CRP、IL-6、原降鈣素、原腎上腺髓素、及聚沉參數(shù)(D-二聚體、PAI-1水平、蛋白質(zhì)-C、纖維蛋白原))予以監(jiān)測(cè)以定性個(gè)體的疾病狀態(tài)及用本發(fā)明抗RAGE抗體治療的潛在及實(shí)際反應(yīng)。另外，在血衆(zhòng)中可發(fā)現(xiàn)呈自細(xì)胞膜分泌形式或裂解形式的可溶性RAGE(sRAGE)。已研發(fā)出用于測(cè)量sRAGE血漿含量的測(cè)定法且也可用于定性個(gè)體。由于本發(fā)明抗體與sRAGE結(jié)合，因此若存在的sRAGE濃度接近抗體濃度，則患者血漿中存在的sRAGE可能影響用本發(fā)明抗體治療的藥效學(xué)。藥物篩選分析在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于識(shí)別抑制RAGE-BP(例如，HMGB1、AGE、A|3、SAA、S100、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及p150，95)與受體多肽(例如，如上文所述的RAGE或RAGE-LBE)結(jié)合的測(cè)試抗體的測(cè)定法。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定法檢測(cè)調(diào)節(jié)RAGE受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的測(cè)試抗體，所述RAGE受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性是由選自由下列組成的群組的RAGE-BP誘導(dǎo)HMGB1、AGE、A卩、SAA、S100、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及pl50,95。所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性包括(但不限于)與其它細(xì)胞組份結(jié)合、活化酶(例如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK))、活化NF-KB轉(zhuǎn)錄活性及諸如此類(lèi)。上述RAGE結(jié)合蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑有關(guān)，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑與包括癌細(xì)胞生長(zhǎng)在內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖有關(guān)。例如，S100P是鈣結(jié)合蛋白S100家族(大于20個(gè)成員)的成員且是首先自胎盤(pán)分離出的95氨基酸蛋白質(zhì)。所有胰腺腫瘤中大于90%的胰腺腫瘤表達(dá)并分泌S100P且表達(dá)隨胰腺癌進(jìn)展而增加。S100P也在肺、乳房、前列腺及結(jié)腸癌中表達(dá)，在結(jié)腸細(xì)胞系中的表達(dá)與對(duì)化學(xué)療法的抗性相關(guān)，且在肺癌中，S100P的高表達(dá)預(yù)示預(yù)后較差。S100P的基因轉(zhuǎn)移或細(xì)胞外添加增加腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)性、侵入及活體外細(xì)胞存活及活體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，而使S100P表達(dá)沉默可達(dá)成增殖及轉(zhuǎn)移降低。S100P的唯一已知受體是RAGE，其表達(dá)與胃癌及膠質(zhì)瘤的侵入及轉(zhuǎn)移相關(guān)。RAGE抑制劑取消了S100P-RAGE相互作用對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖及存活的影響且源自?xún)尚缘鞍椎囊种菩缘鞍踪|(zhì)起S100P-RAGE相互作用拮抗劑的作用。抗RAGE抗體及顯性陰性RAGE的表達(dá)抑制了S100P的效應(yīng)。多種分析形式將有能力勝任，且根據(jù)本揭示內(nèi)容，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員將仍然理解那些未經(jīng)本文清楚闡述者。接近所述蛋白質(zhì)復(fù)合物形成、酶活性條件的分析形式可以許多不同形式產(chǎn)生，且包括基于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(例如，經(jīng)純化蛋白質(zhì)或細(xì)胞裂解物)的分析以及使用完整細(xì)胞的基于細(xì)胞的分析。簡(jiǎn)單結(jié)合測(cè)定可用于檢測(cè)抑制RAGEBP(例如，HMGB1、AGE、Ap、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及p150,95)與受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)間相互作用的化合物。擬測(cè)試的化合物可由(例如)細(xì)菌、酵母或其它有機(jī)體(例如，天然產(chǎn)物)產(chǎn)生、化學(xué)產(chǎn)生(例如，小分子，包括模擬肽)、或重組產(chǎn)生。在許多實(shí)施例中，將細(xì)胞與候選化合物培育后進(jìn)行處理并測(cè)定由RAGEBP(例如，HMGB1、AGE、A卩、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、(32-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及pl50，95)誘導(dǎo)的RAGE受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。在某些實(shí)施例中，所述活性的生物測(cè)定可包括NF-KB活性測(cè)定(例如，NF-KB熒光素酶或GFP報(bào)告基因測(cè)定)。實(shí)例性NF-KB熒光素酶或GFP報(bào)告基因測(cè)定可如修納(Shona)等人(2002)歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)快報(bào)(FEBSLett.)515:119-126中所述實(shí)施。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將表達(dá)RAGE受體或其變體的細(xì)胞用NF-KB-熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染。隨后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選化合物一起培育。隨后，在經(jīng)化合物處理或未經(jīng)化合物處理的細(xì)胞中測(cè)量經(jīng)NF-KB-刺激的熒光素酶活性?；蛘?，可將細(xì)胞用NF-KB-GFP報(bào)告基因(Stratagene)轉(zhuǎn)染。隨后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選化合物一起培育。隨后，通過(guò)用熒光/可見(jiàn)光顯微鏡裝備測(cè)量GFP表達(dá)或通過(guò)FACS分析來(lái)監(jiān)測(cè)經(jīng)NF-KB-刺激的基因活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)及一或多種RAGE-BP(例如，HMGB1、AGE、Ap、SAA、S100、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、(32-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及p150,95)的重構(gòu)蛋白質(zhì)制備品。本發(fā)明測(cè)定法包括標(biāo)記的活體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定法、蛋白質(zhì)結(jié)合免疫測(cè)定法及諸如此類(lèi)。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)也可用以測(cè)定可用于模擬分子間相互作用的三維晶體結(jié)構(gòu)。經(jīng)純化的抗體也可用以測(cè)定可用于模擬分子間相互作用的三維晶體結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明測(cè)定法的某些實(shí)施例中，RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、A(3、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、P2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及pl50,95)或受體多肽(例如，RAGE)對(duì)于所選細(xì)胞可為內(nèi)源性的以支持所述測(cè)定法?；蛘撸琑AGE-BP多肽或受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)可源自外源來(lái)源。例如，可通過(guò)重組技術(shù)(例如通過(guò)使用表達(dá)載體)以及通過(guò)微注射多肽本身或編碼多肽的mRNA將多肽引入到細(xì)胞中。在所述測(cè)定法的又一實(shí)施例中，RAGE-BP與受體多肽的復(fù)合物可利用支持標(biāo)的測(cè)定法的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在全細(xì)胞中產(chǎn)生。例如，如下文所述，復(fù)合物可在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(包括哺乳動(dòng)物及酵母細(xì)胞)中建立。在完整細(xì)胞中產(chǎn)生標(biāo)的測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)包括能夠檢測(cè)在與化合物治療應(yīng)用環(huán)境更緊密類(lèi)似的環(huán)境中起作用的化合物。而且，所述測(cè)定法的某些活體內(nèi)實(shí)施例(例如下文所給出的實(shí)例)適于候選化合物的高通量分析。在本發(fā)明測(cè)定法的某些活體外實(shí)施例中，重構(gòu)復(fù)合物包含至少經(jīng)半純化蛋白質(zhì)的重構(gòu)混合物。所謂經(jīng)半純化意指在重構(gòu)混合物中所用的蛋白質(zhì)先前已與其它細(xì)胞蛋白質(zhì)分離。例如，與細(xì)胞裂解物相比，復(fù)合物形成中涉及的蛋白質(zhì)在混合物中以相對(duì)于混合物中所有其它蛋白質(zhì)至少50%的純度存在，在一個(gè)實(shí)施例中以90-95%的純度存在，且在又一實(shí)施例中以95-99%的純度存在。在標(biāo)的方法的某些實(shí)施例中，所述重構(gòu)蛋白質(zhì)混合物是通過(guò)將經(jīng)高度純化的蛋白質(zhì)混合由此重構(gòu)混合物基本上沒(méi)有可能干擾或否則改變測(cè)量復(fù)合物裝配及/或分解能力的其它蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì))而獲得。在某些實(shí)施例中，在候選化合物存在及不存在下的測(cè)定可在適于含有反應(yīng)物的任何容器中實(shí)施。實(shí)例包括微量滴定板、試管及微量離心管。在某些實(shí)施例中，可實(shí)施藥物篩選分析，所述藥物篩選分析基于測(cè)試抗體干擾RAGE-BP(例如，HMGB1、AGE、A(3、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、及(32-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及pl50,95)與受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)復(fù)合物裝配、穩(wěn)定性或功能的能力檢測(cè)測(cè)試抗體。在實(shí)例性結(jié)合測(cè)定中，使所關(guān)注化合物與包含RAGE-LBE多肽及諸如HMGB1、AGE、A卩、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及pl50，95等RAGE-BP的混合物接觸。復(fù)合物的檢測(cè)及量化提供測(cè)定化合物抑制復(fù)合物兩種組份間相互作用的功效的手段。化合物功效可通過(guò)自使用各種濃度測(cè)試抗體所獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線來(lái)評(píng)價(jià)。而且，也可實(shí)施對(duì)照測(cè)定以提供比較基線。在對(duì)照測(cè)定中，在不存在測(cè)試抗體下對(duì)形成的復(fù)合物進(jìn)行定量。在某些實(shí)施例中，復(fù)合物中兩種多肽(例如，RAGE-BP及受體多肽)間的締合可通過(guò)多種技術(shù)來(lái)檢測(cè)，其中許多實(shí)際上已在上文中予以闡述。例如，對(duì)復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)可使用(例如)以可檢測(cè)方式標(biāo)記(例如，經(jīng)放射標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記)的蛋白質(zhì)通過(guò)免疫測(cè)定、通過(guò)雙雜交測(cè)定或通過(guò)色譜檢測(cè)來(lái)定量。也可使用表面等離子共振系統(tǒng)(例如那些可從巴考國(guó)際AB(BiacoreInternationalAB)(烏普薩拉(Uppsala)，瑞典)購(gòu)得者)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。在某些實(shí)施例中，可將包含RAGEBP及受體多肽的復(fù)合物中的一種多肽固定以助于復(fù)合物與另一多肽的未復(fù)合形式分離以及允許測(cè)定自動(dòng)化。在例示性實(shí)施例中，提供添加允許抗體與不溶性基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的抗體。例如，可將抗體吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠粒(西格瑪化學(xué)(SigmaChemical),圣路易斯(St.Louis)，密蘇里州(MO))或源自谷胱甘肽微量滴定板上或直接或間接附接到磁性珠粒上，隨后將所述磁性珠粒與潛在相互作用蛋白質(zhì)(例如，經(jīng)"S-標(biāo)記的S100多肽或經(jīng)其它標(biāo)記的RAGE-BP)組合，并在有益于復(fù)合物形成的條件下對(duì)測(cè)試抗體進(jìn)行培育。培育后，洗滌珠粒以去除任何未結(jié)合的相互作用抗體，并直接測(cè)定結(jié)合基質(zhì)珠粒的放射標(biāo)記(例如，珠粒置于閃爍體中)或在復(fù)合物解離后于上清液中測(cè)定(例如當(dāng)使用微量滴定板時(shí))?；蛘撸谙磧粑唇Y(jié)合抗體后，可將復(fù)合物自基質(zhì)解離，通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離，并使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)自凝膠定量在結(jié)合基質(zhì)部份中發(fā)現(xiàn)的相互作用多肽的含量。在另一實(shí)施例中，可使用雙雜交測(cè)定(也稱(chēng)為相互作用捕獲測(cè)定)來(lái)檢測(cè)RAGE-LBE與RAGE-BP復(fù)合物中兩種多肽的相互作用(也參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利第5,283,317號(hào)；澤爾沃斯(Zervos)等人(1993)細(xì)胞72:223-232;馬都拉(Madura)等人(1993)生物化學(xué)268:12046-12054;巴特爾(Bartel)等人(1993)生物技術(shù)(Biotechniques)14:920-924;及巖淵(Iwabuchi)等人(1993)癌基因(Oncogene)8:1693-1696)，并隨后檢測(cè)抑制RAGE-LBE與RAGE-BP多肽間結(jié)合的測(cè)試抗體。此測(cè)定包括提供宿主細(xì)胞，例如，酵母細(xì)胞(優(yōu)選)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞類(lèi)型。宿主細(xì)胞含有報(bào)告基因，所述報(bào)告基因具有誘餌蛋白中所用轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)，因此當(dāng)報(bào)告基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄激活時(shí)所述報(bào)告基因表達(dá)可檢測(cè)基因產(chǎn)物。提供能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)并編碼"誘餌"多肽的第一嵌合基因。也提供能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)并編碼"魚(yú)"多肽的第二嵌合基因。在一個(gè)實(shí)施例中，將第一及第二嵌合基因二者均以質(zhì)粒形式引入到宿主細(xì)胞中。然而，優(yōu)選地，第一嵌合基因存在于宿主細(xì)胞的染色體中且將第二嵌合基因作為質(zhì)粒的一部分引入到宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供雙雜交測(cè)定，其識(shí)別抑制RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、A卩、SAA、S100、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及p150,95)與受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)結(jié)合的測(cè)試抗體。為闡釋?zhuān)瑢荏w多肽的"誘餌"多肽及包含RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、Ap、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及p150,95)的"魚(yú)"多肽引入到宿主細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，誘餌包含人類(lèi)或鼠科動(dòng)物RAGE的V-結(jié)構(gòu)域或與人類(lèi)或鼠科動(dòng)物RAGE的V-結(jié)構(gòu)域具有80-99%—致性的仍可結(jié)合RAGE-BP的序列。使細(xì)胞經(jīng)受如下條件在所述條件下誘餌及魚(yú)多肽以足以激活報(bào)告基因的量表達(dá)。兩種融合多肽的相互作用導(dǎo)致由報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)。因此，在存在測(cè)試抗體下或不存在測(cè)試抗體下兩種多肽間相互作用的水平可通過(guò)檢測(cè)每一情況下報(bào)告基因的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)。可按照本發(fā)明方法使用各種報(bào)告基因構(gòu)建體且包括(例如)產(chǎn)生選自由下列組成群組的可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告基因酶信號(hào)、熒光信號(hào)、磷光信號(hào)及藥物抗性。在測(cè)試化合物及天然提取物庫(kù)的許多藥物篩選程序中，我們期望高通量分析以使給定時(shí)間段內(nèi)所考察化合物的數(shù)量最大化。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中實(shí)施的本發(fā)明測(cè)定(例如可用經(jīng)純化或半純化蛋白質(zhì)或用裂解物實(shí)施)通常優(yōu)選為"主要"篩選，因?yàn)槠淇蓪?shí)施以允許快速實(shí)施及相對(duì)容易地檢測(cè)測(cè)試抗體介導(dǎo)的分子靶的改變。而且，測(cè)試抗體的細(xì)胞毒性及/或生物利用性效應(yīng)在活體外系統(tǒng)中通?？梢院雎?，而測(cè)定主要集中在藥物對(duì)分子靶的影響上，因?yàn)榉肿影信c其它蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力變化或酶特性的改變可能較為明顯。在某些實(shí)施例中，RAGE-BP與受體復(fù)合物的形成可通過(guò)免疫沉淀及分析共免疫沉淀蛋白質(zhì)或親和力純化及分析共純化蛋白質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)。也可使用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的測(cè)定法來(lái)測(cè)定所述復(fù)合物形成。使具有適當(dāng)發(fā)射及激發(fā)光譜的熒光分子彼此緊密接近可展示FRET。選擇的熒光分子應(yīng)使一個(gè)分子(供體分子)的發(fā)射光譜與另一個(gè)分子(受體分子)的激發(fā)光譜重疊。供體分子在供體激發(fā)光譜內(nèi)由合適強(qiáng)度的光激發(fā)。隨后供體以熒光形式發(fā)射所吸收的能量。其產(chǎn)生的熒光能量由受體分子壓制。FRET可表現(xiàn)為來(lái)自供體的熒光信號(hào)強(qiáng)度降低、其激發(fā)態(tài)壽命縮短、及/或熒光在受體較長(zhǎng)特征波長(zhǎng)(較低能量)處再發(fā)射。當(dāng)以物理方式分離出熒光蛋白時(shí)，F(xiàn)RET效應(yīng)降低或消除(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,981,200號(hào))。發(fā)生FRET也造成供體熒光部分的熒光壽命縮短。熒光壽命的此改變可使用稱(chēng)為熒光壽命成像技術(shù)(FLIM)的技術(shù)來(lái)測(cè)量(外威爾(Verveer)等人(2000)科學(xué)(Science)290:1567-1570;斯怪爾(Squire)等人(1999)顯微鏡學(xué)(J.Microsc.)193:36;外威爾等人(2000)生物物理(Bi叩hys.J.)78:2127)。已研發(fā)出用于分析FLIM數(shù)據(jù)的整體分析技術(shù)。這些算法利用如下協(xié)定供體熒光部分僅以有限數(shù)量的狀態(tài)存在，每一狀態(tài)具有不同的熒光壽命。每一狀態(tài)的定量圖可基于逐像素產(chǎn)生。為實(shí)施基于FRET的分析，將RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、A(3、SAA、SIOO、兩性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整聯(lián)蛋白、Mac-l、及pl50，95)及受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)均經(jīng)熒光標(biāo)記。適宜熒光標(biāo)記己為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知。下文中提供實(shí)例，但所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員也可得到且可使用未具體論述的適宜熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記可通過(guò)將多肽表達(dá)為帶有熒光蛋白的多肽來(lái)達(dá)成，例如自海蜇、珊瑚蟲(chóng)及其它腔腸動(dòng)物分離的熒光蛋白。實(shí)例性熒光蛋白包括多管水母(Aequoriavictoria)綠色熒光蛋白(GFP)的許多變體。變體可更為明亮、更為暗淡或具有不同的激發(fā)及/或發(fā)射光譜。某些變體可經(jīng)改變以不再呈現(xiàn)綠色，且可呈現(xiàn)藍(lán)色、青色、黃色或紅色(分別稱(chēng)為BFP、CFP、YFP、及REP)?？赏ㄟ^(guò)多種共價(jià)及非共價(jià)鍵將熒光蛋白穩(wěn)定附接到多肽上，包括(例如)肽鍵(例如，表達(dá)為融合蛋白)、化學(xué)交聯(lián)及生物素-抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)。對(duì)于熒光蛋白實(shí)例，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,625,048號(hào)、第5,777,079號(hào)、第6,066,476號(hào)及第6，124，128號(hào)；普瑞舍(Prasher)等人(1992)基因(Gene)，111:229-233;瑞恩(Reign)等人(1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，91:12501-04;沃德等人(1982)光化學(xué)及光生物學(xué)(Photochem.Photobiol.)，35:803-808;萊文(Levine)等人(1982)比較生物化學(xué)與生理學(xué)(Comp.Biochem.Physiol.)，72B:77-g5;特斯科(Tersikh)等人(2000)科學(xué)290:1585-88?？稍诨诩?xì)胞的測(cè)定及無(wú)細(xì)胞測(cè)定中使用基于FRET的測(cè)定?；贔RET的測(cè)定適于包括熒光激活細(xì)胞分選及微量滴定分析的熒光掃描在內(nèi)的高通量篩選方法。通常來(lái)說(shuō)，在篩選測(cè)定是結(jié)合測(cè)定(無(wú)論蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合、化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合等)的情況下，可將一或多種分子偶聯(lián)或連接到標(biāo)記上，其中標(biāo)記可直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)。各種標(biāo)記包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光物、酶、特異性結(jié)合分子、粒子(例如磁性粒子)及諸如此類(lèi)。特異性結(jié)合分子包括諸如生物素與抗生蛋白鏈菌素、地高辛(digoxin)及抗地高辛藥(antidigoxin)等對(duì)。對(duì)于特異性結(jié)合成員，互補(bǔ)成員通常按照已知程序用提供檢測(cè)的分子標(biāo)記。多種其它試劑可包括于篩選測(cè)定中。這些包括用于促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合優(yōu)化及/或降低非特異性或所爭(zhēng)論相互作用的諸如鹽、中性蛋白(例如，白蛋白)、去污劑等試劑?？墒褂媚軌蛱岣邷y(cè)定效率的諸如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物化合物等試劑。按可提供需要結(jié)合的順序添加組份混合物。培育是在任何適宜溫度(一般介于4'C與4(TC之間)下實(shí)施。所選培育時(shí)間段應(yīng)有利于使活性最佳，但也可經(jīng)優(yōu)化以有助于快速高通量篩選。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供不依賴(lài)于復(fù)合物的測(cè)定法。所述測(cè)定法包含識(shí)別為RAGE-BP與受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)結(jié)合候選抑制劑的測(cè)試抗體。在實(shí)例性實(shí)施例中，可使用受體RAGE-LBE多肽來(lái)識(shí)別與受體多肽結(jié)合的化合物。在例示性實(shí)施例中，可提供添加允許蛋白質(zhì)與不溶性基質(zhì)結(jié)合的額外結(jié)構(gòu)域的RAGE-LBE。例如，可將與GST蛋白融合的RAGE-LBE吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠粒(西格瑪化學(xué)，圣路易斯(St.Louis)，密蘇里州(MO))或谷胱甘肽衍生微量滴定板上，隨后將其與潛在標(biāo)記的結(jié)合化合物組合并在有益于結(jié)合的條件下進(jìn)行培育。培育后，洗滌珠粒以去除任何未結(jié)合的化合物，并直接測(cè)定結(jié)合基質(zhì)珠粒的標(biāo)記或在結(jié)合化合物解離后于上清液中測(cè)定。在某些實(shí)施例中，標(biāo)記可直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)。各種標(biāo)記包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光物、酶、特異性結(jié)合分子、粒子(例如磁性粒子)及諸如此類(lèi)。特異性結(jié)合分子包括諸如生物素與抗生蛋白鏈菌素、地高辛及抗地高辛藥等對(duì)。對(duì)于特異性結(jié)合成員，互補(bǔ)成員通常按照已知程序用提供檢測(cè)的分子標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，所述方法包含在活體外形成混合物。在某些實(shí)施例中，所述方法包含通過(guò)在活體內(nèi)形成混合物的基于細(xì)胞的測(cè)定。在某些實(shí)施例中，所述方法包含使表達(dá)受體多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)或其變體的細(xì)胞與測(cè)試抗體接觸。在某些實(shí)施例中，測(cè)定是基于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(例如，經(jīng)純化蛋白質(zhì)或細(xì)胞裂解物)的測(cè)定，以及使用完整細(xì)胞的基于細(xì)胞的測(cè)定。簡(jiǎn)單結(jié)合測(cè)定可用于檢測(cè)與受體多肽相互作用的化合物。擬測(cè)試的化合物可由(例如)細(xì)菌、酵母或其它有機(jī)體(例如，天然產(chǎn)物)產(chǎn)生、化學(xué)產(chǎn)生(例如，小分子，包括模擬肽)、或重組產(chǎn)生。視情況，自這些測(cè)定法識(shí)別的測(cè)試抗體可用于治療RAGE相關(guān)病癥。醫(yī)藥制備品本發(fā)明標(biāo)的蛋白質(zhì)或核酸最優(yōu)選以合適組合物形式投與。作為合適組合物，可提及通常用于全身或局部投與藥物的所有組合物。醫(yī)藥上可接受的載劑應(yīng)基本上惰性，以不與活性組份作用。適宜惰性載劑包括水、乙醇、聚乙二醇、礦物油或石油凝膠、丙二醇、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、注射用抑菌水(BWFI)、注射用無(wú)菌水(SWFI)及諸如此類(lèi)。所述醫(yī)藥制備品(包括標(biāo)的抗體或編碼標(biāo)的抗體的核酸)可經(jīng)調(diào)配以任何方便方式投與用于人類(lèi)或獸醫(yī)醫(yī)學(xué)。因此，本發(fā)明另一方面提供包含有效量抗體的醫(yī)藥上可接受的組合物，所述抗體與一或多種醫(yī)藥上可接受的載劑(添加劑)及/或稀釋劑一起調(diào)配。如下文詳述，可為投與將本發(fā)明醫(yī)藥組合物特別調(diào)配成固體或液體形式，包括那些適于下列投與方式者(1)經(jīng)口投與，例如，施用于舌的獸用頓服藥(水性或非水性溶液或懸浮液)、片劑、大藥丸、粉劑、顆粒劑、糊劑；(2)非經(jīng)腸投與，例如，以(例如)無(wú)菌溶液或懸浮液形式經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射投與；(3)局部施用，例如，以乳霜、軟膏或噴霧劑形式施用于皮膚；或(4)經(jīng)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)投與，例如，以陰道栓劑、乳霜或泡沫劑形式投與。然而，在某些實(shí)施例中，可將標(biāo)的藥劑簡(jiǎn)單溶解或懸浮于無(wú)菌水中。在某些實(shí)施例中，醫(yī)藥制備品無(wú)熱原，即，不提高患者體溫。非經(jīng)腸投與(尤其皮下及靜脈內(nèi)注射)是投與的優(yōu)選途徑。在某些實(shí)施例中，一或多種藥劑可含有堿性官能團(tuán)(例如氨基或烷基氨基)，且因此能夠與醫(yī)藥上可接受的酸形成醫(yī)藥上可接受的鹽。在此方面中，術(shù)語(yǔ)"醫(yī)藥上可接受的鹽"是指本發(fā)明化合物的相對(duì)無(wú)毒的無(wú)機(jī)及有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可在本發(fā)明化合物最后分離及純化期間原位制備，或通過(guò)使呈游離堿形式的本發(fā)明經(jīng)純化化合物與適宜有機(jī)或無(wú)機(jī)酸單獨(dú)反應(yīng)并分離由此形成的鹽來(lái)制備。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽及月桂基磺酸鹽類(lèi)及諸如此類(lèi)。(參見(jiàn)(例如)伯格(Berge傳人，(1977)"醫(yī)藥鹽(PharmaceuticalSalts)",藥物科學(xué)(J66:1-19)。藥劑的醫(yī)藥上可接受的鹽包括來(lái)自(例如)無(wú)毒有機(jī)或無(wú)機(jī)酸的化合物的常規(guī)無(wú)毒鹽或季銨鹽。例如，所述常規(guī)無(wú)毒鹽包括那些衍生自無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸及諸如此類(lèi))者及自有機(jī)酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲垸磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸及諸如此類(lèi))制備的鹽。在其它情況下，所述一或多種藥劑可含有一或多種酸性官能團(tuán)且因此能夠與醫(yī)藥上可接受的堿形成醫(yī)藥上可接受的鹽。這些鹽同樣可在化合物最終分離及純化期間原位制備，或通過(guò)使呈游離酸形式的經(jīng)純化化合物與適宜堿(例如醫(yī)藥上可接受的金屬陽(yáng)離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、與氨、或與醫(yī)藥上可接受的有機(jī)伯胺、仲胺或叔胺單獨(dú)反應(yīng)來(lái)制備。代表性堿金屬或堿土金屬鹽包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂及鋁鹽及諸如此類(lèi)?？捎糜谛纬蓧A加成鹽的代表性有機(jī)胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪及諸如此類(lèi)。(參見(jiàn)，例如，伯格等人，見(jiàn)上文)潤(rùn)濕劑、乳化劑及潤(rùn)滑劑(例如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂)以及著色劑、脫模劑、包覆劑、甜味劑、矯味劑及加香劑、防腐劑及抗氧化劑也可存在于所述組合物中。醫(yī)藥上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類(lèi)；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酯、丁羥基苯甲醚(BHA)、丁羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、a-生育酚及諸如此類(lèi)；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類(lèi)。本發(fā)明調(diào)配物包括那些適于經(jīng)口、經(jīng)鼻、局部(包括含服及經(jīng)舌下)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道及/或非經(jīng)腸投與者。調(diào)配物可方便地以單位劑型存在且可通過(guò)所屬制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的任何方法制備。可與載劑材料組合以產(chǎn)生單獨(dú)劑型的活性成份的量將隨所治療的宿主、特定投與方式而變化?？膳c載劑材料組合以產(chǎn)生單獨(dú)劑型的活性成份的量通常應(yīng)為能產(chǎn)生治療效果的化合物的量。通常來(lái)說(shuō)，除100%外，此活性成份的量將介于約1%至約99%之間，優(yōu)選自約5%至約70%，最優(yōu)選自約10%至約30%。制備這些調(diào)配物或組合物的方法包括使藥劑與載劑及(視情況)一或多種助劑成份混合的步驟。一般來(lái)說(shuō)，所述調(diào)配物通過(guò)以下來(lái)制備使本發(fā)明藥劑與液體載劑或微細(xì)分散固體載劑或二者均勻且充分地混合，且隨后(若必要)使產(chǎn)物成形。適于經(jīng)口投與的本發(fā)明調(diào)配物可呈下列形式膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、菱形片劑(使用矯味基質(zhì)，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠)、粉劑、顆粒劑；或作為存于水性或非水性液體中的溶液或懸浮液；或作為水包油型或油包水型液體乳液；或作為酏劑或糖漿；或作為軟片劑(使用惰性基質(zhì)，例如明膠及甘油、或蔗糖及阿拉伯膠)及/或作為漱口劑及諸如此類(lèi)，每一都含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物作為活性成份。本發(fā)明化合物也可以大丸劑、沖服劑或糊劑投與。在用于經(jīng)口投與的本發(fā)明固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣藥丸、粉劑、顆粒劑及諸如此類(lèi))中，可將活性成份與一或多種醫(yī)藥上可接受的載劑(例如檸檬酸鈉或磷酸二轉(zhuǎn))及/或任一以下成份混合(1)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或硅酸；(2)結(jié)合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽及碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，例如石蠟；(6)吸收加速劑，例如季銨化合物；(7)潤(rùn)濕劑，例如鯨蠟醇及單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，例如高嶺土及膨潤(rùn)土；(9)潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；及(IO)著色劑。在膠囊、片劑及丸劑情況下，所述醫(yī)藥組合物也可包含緩沖劑。在使用諸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇及諸如此類(lèi)等賦形劑的軟質(zhì)及硬質(zhì)填充明膠膠囊中，也可使用類(lèi)似類(lèi)型的固體組合物作為填充劑?？赏ㄟ^(guò)壓制或模制來(lái)制備片劑，其視情況含有一或多種助劑成份?？墒褂媒Y(jié)合劑(例如，明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如，羥乙酸淀粉鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑來(lái)制備壓縮片劑?？赏ㄟ^(guò)在適宜機(jī)器中模制經(jīng)惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的混合物來(lái)制備模制片劑。本發(fā)明醫(yī)藥組合物的片劑及其它固體劑型(例如糖衣藥丸、膠囊、丸劑及顆粒劑)可視情況經(jīng)刻痕或使用諸如腸溶包膜及其它醫(yī)藥調(diào)配技術(shù)中熟知的包膜等包膜及外殼來(lái)制備。也可使用(例如)提供期望釋放性質(zhì)的不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體及/或微球體對(duì)其進(jìn)行調(diào)配以便在其中提供活性成份的緩慢或控制釋放。這些固體劑型可經(jīng)由(例如)通過(guò)細(xì)菌截留過(guò)濾器過(guò)濾或經(jīng)由納入滅菌劑來(lái)滅菌，所述滅菌劑呈可在使用前即刻溶于無(wú)菌水或一些其它無(wú)菌可注射介質(zhì)中的無(wú)菌固體組合物形式。這些組合物也可視情況含有遮光劑且可為視情況以延遲方式僅(或優(yōu)選)在胃腸道的某一部分釋放活性成份的組合物。可使用的包埋組合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟。若合適，所述活性成份也可呈含有一或多種上述賦形劑的微膠囊形式。用于本發(fā)明化合物經(jīng)口投與的液體劑型包括醫(yī)藥上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成份外，所述液體劑型可含有業(yè)內(nèi)常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑及乳化劑，例如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(具體而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇及山梨醇酐脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，經(jīng)口調(diào)配物也可包括諸如潤(rùn)濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、加香劑及防腐劑等佐劑。除活性化合物以外，懸浮液也可含有懸浮劑，例如經(jīng)乙氧基化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤(rùn)土、瓊脂及黃蓍膠及其混合物。用于直腸或陰道投與的本發(fā)明醫(yī)藥組合物的調(diào)配物可以栓劑形式存在，其可通過(guò)使一或多種本發(fā)明化合物與一或多種適宜非刺激性賦形劑或載劑混合來(lái)制備，所述適宜非刺激性賦形劑或載劑包含(例如)可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，且其在室溫下是固體但在體溫下是液體，且因此將在直腸或陰道腔內(nèi)融化并釋放藥劑。適于陰道投與的本發(fā)明調(diào)配物也包括含有業(yè)內(nèi)習(xí)知適宜載劑的陰道栓劑、陰道塞、乳霜、凝膠、糊劑、泡沫劑或噴霧劑調(diào)配物。用于本發(fā)明化合物局部或經(jīng)皮投與的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳霜、洗液、凝膠、溶液、貼劑及吸入劑?？稍跓o(wú)菌條件下將活性化合物與醫(yī)藥上可接受的載劑及與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。除本發(fā)明活性化合物之外，所述軟膏、糊劑、乳霜及凝膠可含有賦形劑，例如動(dòng)物及植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧、膨潤(rùn)土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或其混合物。除本發(fā)明化合物之外，粉劑及噴霧劑可含有賦形劑，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣及聚酰胺粉末或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可另外含有習(xí)用推進(jìn)劑，例如氯氟烴類(lèi)及揮發(fā)性未經(jīng)取代的烴類(lèi)(例如丁烷及丙垸)。經(jīng)皮貼劑具有額外優(yōu)點(diǎn)，即提供本發(fā)明化合物到身體的控制遞送。所述劑型可通過(guò)將藥劑溶解或分散于適宜介質(zhì)中來(lái)制備。也可以使用吸收促進(jìn)劑來(lái)增加穿過(guò)皮膚的藥劑流量。所述流量的速率可通過(guò)提供速率控制膜或?qū)⒒衔锓稚⒂诰酆衔锘|(zhì)或凝膠中加以控制。眼用調(diào)配物、眼用軟膏、粉劑、溶液及諸如此類(lèi)也涵蓋于本發(fā)明范圍內(nèi)。適于非經(jīng)腸投與的本發(fā)明醫(yī)藥組合物包含一或多種本發(fā)明化合物與一或多種醫(yī)藥上可接受的無(wú)菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液、或無(wú)菌粉劑，所述無(wú)菌粉劑可在使用前即刻重構(gòu)成無(wú)菌可注射溶液或分散液，所述醫(yī)藥組合物可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、可使調(diào)配物與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)或懸浮劑或增稠劑?？捎糜诒景l(fā)明醫(yī)藥組合物的適宜水性及非水性載劑的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類(lèi))及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。適當(dāng)流動(dòng)性可通過(guò)(例如)使用包膜材料(例如卵磷脂)、通過(guò)維持所需粒徑(在分散液情況下)及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。.這些組合物也可含有佐劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑及分散劑。微生物作用的預(yù)防可通過(guò)引入各種抗細(xì)菌及抗真菌劑來(lái)確保，例如，對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸及諸如此類(lèi)。所述組合物中也可能需要包括等滲劑，例如糖類(lèi)、氯化鈉及諸如此類(lèi)。另外，通過(guò)納入延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)可達(dá)成可注射醫(yī)藥形式的長(zhǎng)效吸收。在一些情況下，為延長(zhǎng)藥劑功效，需要減緩來(lái)自皮下或肌內(nèi)注射的藥劑的吸收。此可通過(guò)使用具有較差水溶性的結(jié)晶或無(wú)定形物質(zhì)的液態(tài)懸浮液來(lái)達(dá)成。因而，藥劑吸收速率需視其溶解速率而定，而溶解速率又需視晶體大小及結(jié)晶形式而定?；蛘?，非經(jīng)腸投與藥劑的延遲吸收可通過(guò)將所述藥劑溶解或懸浮于油性媒劑中來(lái)實(shí)現(xiàn)。注射用儲(chǔ)積形式是通過(guò)在生物可降解聚合物(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成標(biāo)的化合物的微膠囊基質(zhì)而制備。視藥劑與聚合物的比例及所用特定聚合物的性質(zhì)來(lái)控制藥劑釋放速率。其它生物可降解聚合物的實(shí)例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。儲(chǔ)積注射用調(diào)配物也可通過(guò)將藥劑俘獲入與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中來(lái)制備。當(dāng)本發(fā)明化合物是作為藥物投與到人類(lèi)及動(dòng)物中時(shí)，其可以原狀或作為含有(例如)0.1-99.5%(更優(yōu)選0.5-90%)活性成份與醫(yī)藥上可接受的載劑的醫(yī)藥組合物給與。除上述組合物外，還可使用含有合適量治療劑的覆蓋物，例如，石膏、繃帶、包扎用品、紗布?jí)|及諸如此類(lèi)。如上文詳述，治療性組合物可在支撐架、裝置、假肢及植入物上投與或遞送。用于分析的組織樣品一般為來(lái)自患者的血液、血漿、血清、粘液樣流體或腦脊髓液。對(duì)樣品的(例如)RAGE肽抗體的含量或分布予以分析，例如，人類(lèi)化抗體的含量或分布。檢測(cè)對(duì)RAGE具有特異性的抗體的ELISA方法闡述于實(shí)例中。被動(dòng)免疫后的抗體分布一般在指數(shù)式衰減后立即顯示抗體峰濃度。在不進(jìn)一步投與劑量的情況下，視所投與抗體的半衰期而定，衰減在數(shù)天到數(shù)月內(nèi)接近治療前水平。在一些方法中，患者中的RAGE抗體基線測(cè)量是在投與前實(shí)施，第二次測(cè)量是在其后不久實(shí)施以測(cè)定峰抗體含量，且一或多次進(jìn)一步測(cè)量是以一定間隔實(shí)施以監(jiān)測(cè)抗體含量的衰減。當(dāng)抗體含量降低到基線值或峰值的預(yù)定百分比(例如，50%、25%或10%)減基線值時(shí)，實(shí)施進(jìn)一步抗體劑量投與。在一些方法中，將峰值或或隨后測(cè)量含量減去背景后與先前測(cè)定的參考含量進(jìn)行比較以制定其它患者的有益預(yù)防性或治療性治療方案。如果所測(cè)量的抗體含量顯著低于參考含量(例如，低于平均值減去受益于治療的患者群體中的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參考值偏差)，則表明應(yīng)投與額外劑量的抗體。實(shí)例現(xiàn)已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行概括闡述，通過(guò)參考以下實(shí)例將更容易地理解本發(fā)明，所涵蓋的實(shí)例僅用于闡釋本發(fā)明某些方面及實(shí)施例，且并不意欲限制本發(fā)明。實(shí)例lRAGE構(gòu)建體的制備鼠科動(dòng)物RAGE(mRAGE，Genbank登記號(hào)NP—031451;SEQIDNO:3)及人類(lèi)RAGE(hRAGE，Genbank登記號(hào)NP—00127.1;SEQIDNO:1)的氨基酸序列顯示于圖1A-1C中。將編碼mRAGE的全長(zhǎng)cDNA(登記號(hào)NM—007425.1;SEQIDNO:4)及編碼hRAGE的全長(zhǎng)cDNA(登記號(hào)NM—001136;SEQIDNO:2)插入到Adori1-2表達(dá)載體中，所述Adoril-2表達(dá)載體包含推動(dòng)cDNA序列表達(dá)的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，并含有用于產(chǎn)生病毒的腺病毒元件。通過(guò)將人類(lèi)RAGE的氨基酸1-344追加到人類(lèi)IgG的Fc結(jié)構(gòu)域而形成的人類(lèi)RAGE-Fc融合蛋白是通過(guò)在培養(yǎng)細(xì)胞中使用Adori表達(dá)載體表達(dá)編碼所述融合蛋白的DNA構(gòu)建體來(lái)制備。通過(guò)將人類(lèi)RAGE的氨基酸1-118追加到人類(lèi)IgG的Fc結(jié)構(gòu)域而形成的人類(lèi)RAGEV-區(qū)-Fc融合蛋白以類(lèi)似方式制備。通過(guò)將抗生蛋白鏈菌素(鏈球菌)標(biāo)簽序歹U(WSHPQFEK)(SEQIDNO:5)分別追加到人類(lèi)或鼠科動(dòng)物RAGE的氨基酸1-344而形成的人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE-鏈球菌標(biāo)簽融合蛋白是通過(guò)表達(dá)編碼所述RAGE-鏈球菌標(biāo)簽融合蛋白的DNA構(gòu)建體來(lái)制備(也使用Adori表達(dá)載體)。所有構(gòu)建體都通過(guò)廣泛限制酶切消化分析及通過(guò)質(zhì)粒內(nèi)cDNA插入片段的序列分析來(lái)證實(shí)。表達(dá)全長(zhǎng)RAGE、hRAGE-Fc及hRAGEV-結(jié)構(gòu)域-Fc的重組腺病毒(Ad5Ela/E3缺失)是通過(guò)在人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞系293(HEK293)(ATCC，羅克蘭(Rockland)，馬里蘭州)中同源重組產(chǎn)生。將重組腺病毒分離并隨后在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)三個(gè)周期的凍融將病毒自受感染的HEK293細(xì)胞中釋放出來(lái)。將病毒通過(guò)兩個(gè)氯化銫離心梯度進(jìn)一步純化并對(duì)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.2在4'C下透析。透析后，添加甘油以使?jié)舛葹?0M并將病毒儲(chǔ)存在-8(TC下直至使用。對(duì)病毒構(gòu)建體的感染性(在293細(xì)胞上的蝕斑形成單位)、病毒的PCR分析、編碼區(qū)域的序列分析、轉(zhuǎn)基因的表達(dá)及內(nèi)毒素測(cè)量進(jìn)行定性。使用脂轉(zhuǎn)染試齊!j(lipofectin)(英杰生命技術(shù)有限公司(Invi加gen))將含有編碼人類(lèi)RAGE-Fc、人類(lèi)RAGE-V區(qū)域-Fc及人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE-鏈球菌標(biāo)簽融合蛋白的DNA的Adori表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。在20nM及50nM甲氨蝶呤中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。自各克隆體收獲條件化培養(yǎng)基并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及西方墨點(diǎn)法予以分析以證實(shí)RAGE表達(dá)。(考夫曼(Kaufman，R丄)，1990，酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)，185:537-66;考夫曼，腦，酶學(xué)方法，185:487-511;皮特曼(Pittman，D.D.)等人，1993，酶學(xué)方法，222:236-237)。對(duì)CHO或經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293細(xì)胞(表達(dá)可溶性RAGE融合蛋白)進(jìn)行培育以收獲用于蛋白質(zhì)純化的條件化培養(yǎng)基。利用所指示的親和力-標(biāo)簽方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。使經(jīng)純化蛋白質(zhì)經(jīng)歷還原及非還原SDS-PAGE，通過(guò)考馬斯藍(lán)染色(現(xiàn)代蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)方案(CurrentProtocolsinProteinSciences),威立公司(WileyInterscience))觀察，并顯示具有預(yù)期分子量。實(shí)例2鼠科動(dòng)物抗RAGE單克隆抗體的產(chǎn)生使用基因槍裝置(伯樂(lè)(BioRad)，赫拉克勒市(Hercules)，加利福尼亞州(CA))經(jīng)皮下使6-8周齡雌性BALB/c小鼠(査理士河(CharlesRiver)，安杜佛市(Andover)，馬薩諸塞州(MA))免疫。在皮下投與之前將含有編碼全長(zhǎng)人類(lèi)RAGE的cDNA的pAdori表達(dá)載體預(yù)吸附到膠體金顆粒(伯樂(lè)，赫拉克勒市，加利福尼亞州)上。用3嗎載體對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，每周兩次，持續(xù)兩周。在最后免疫后一周對(duì)小鼠進(jìn)行抽血并評(píng)價(jià)抗體滴度。在細(xì)胞融合之前三天使具有最高RAGE-抗體滴度的小鼠接受一次額外注射，為lO嗎重組人類(lèi)RAGE-鏈球菌蛋白。使用50。/。聚乙二醇(MW1500)(羅氏診斷公司(RocheDiagnosticsCorp)，曼海姆，德國(guó))使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8.653(ATCC，羅克維爾(Rockville)，馬里蘭州(MD))以4:1比例融合。融合后，在96-孔板中以1x105個(gè)細(xì)胞/孔在含有20%FBS、5。/o三甲氧唑辛(Origen)(IGEN國(guó)際公司(IGENInternationalInc.)，蓋瑟斯堡(Ga他ersburg)，馬里蘭州(MD))、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素、lOmM羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及l(fā)x次黃嘌呤-氨基蝶吟-胸苷(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)的RPMI1640選擇培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種及培育。實(shí)例3大鼠抗RAGE單克隆抗體的產(chǎn)生使用基因槍(伯樂(lè)，赫拉克勒市，加利福尼亞州)經(jīng)皮下使LOU大鼠(哈蘭(Harlan)，哈蘭(Harlan)，馬薩諸塞州(MA))免疫。在皮下投與之前將含有編碼全長(zhǎng)鼠科動(dòng)物RAGE的cDNA的pAdori表達(dá)載體預(yù)吸附到膠體金顆粒(伯樂(lè)，赫拉克勒市，加利福尼亞州)上。用3嗎載體對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，每?jī)芍芤淮危庖咚拇?。在最后免疫后一周?duì)大鼠進(jìn)行抽血并評(píng)價(jià)抗體滴度。在細(xì)胞融合之前三天使具有最高RAGE-抗體滴度的大鼠接受一次額外注射，為10嗎重組鼠科動(dòng)物RAGE-鏈球菌蛋白。使用50。/o聚乙二醇(MW1500)(羅氏診斷公司，曼海姆，德國(guó))使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8.653(ATCC，羅克維爾，馬里蘭州)以4:1比例融合。融合后，在96-孔板中以1x1()S個(gè)細(xì)胞/L在含有20。/()FBS、5%三甲氧唑辛(IGEN國(guó)際公司，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100pg/ml鏈霉素、lOmM羥乙基哌嗪乙磺酸及l(fā)x次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)的RPMI1640選擇培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種及培育。實(shí)例4雜交瘤篩選通過(guò)使用基因槍及表達(dá)鼠科動(dòng)物或人類(lèi)RAGE全長(zhǎng)編碼區(qū)域的Adori表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行cDNA免疫產(chǎn)生大鼠抗鼠科動(dòng)物RAGE及鼠科動(dòng)物抗人類(lèi)RAGEmAb組。在瞬時(shí)表達(dá)RAGE的人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞(HEK-293)上通過(guò)ELISA及FACS分析針對(duì)與重組人類(lèi)或鼠科動(dòng)物RAGE-Fc的結(jié)合對(duì)雜交瘤上清液進(jìn)行篩選。針對(duì)中和RAGE與配體HMGB1結(jié)合的能力對(duì)陽(yáng)性上清液進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。識(shí)別出七種大鼠單克隆抗體(XT-M系列)及七種小鼠單克隆抗體(XT-H系列)。通過(guò)連續(xù)稀釋將所選雜交瘤亞克隆四次及通過(guò)FACS分選亞克隆一次。自穩(wěn)定雜交瘤培養(yǎng)物收獲條件化培養(yǎng)基并使用蛋白質(zhì)A抗體純化管住(密理博(MilliporeBillerica)，馬薩諸塞州)純化免疫球蛋白。如上所示用小鼠mAb同種型試劑盒或大鼠mAb同種型試劑盒(IsoStrip;勃林格曼海姆公司(BoehringerMannheimCorp.))測(cè)定每一mAb的Ig類(lèi)別。所選大鼠及小鼠單克隆抗體的同種型陳述于表1(下文)中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)例5FACS分析用人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE腺病毒感染人類(lèi)293細(xì)胞。將受感染細(xì)胞以4x104個(gè)細(xì)胞/ml的密度懸浮于含有1%BSA的PBS中。將細(xì)胞與100|il樣品(經(jīng)稀釋免疫血清、雜交瘤上清液或經(jīng)純化抗體)在4"C下培育30min。洗滌后，將細(xì)胞與經(jīng)PE標(biāo)記的山羊、抗小鼠、IgG、F(ab')2(DAKO公司，葛洛斯綽普(Glostrup)，丹麥)在4"C下于黑暗中培育30min。與細(xì)胞有關(guān)的熒光信號(hào)是通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)(FACScan)流式細(xì)胞熒光測(cè)量?jī)x(flowcytofluorometer)(百科頓迪克森(BectonDickinson))使用5000個(gè)細(xì)胞/處理來(lái)測(cè)量。使用碘化丙啶來(lái)識(shí)別死細(xì)胞，將其自分析中除去。FACS分析顯示，七種鼠科動(dòng)物單克隆抗體XT-H1到XT-H7及七種大鼠單克隆抗體XT-MI到XT-M7與細(xì)胞表面hRAGE結(jié)合(表2)。實(shí)例6ELISA結(jié)合測(cè)定使用標(biāo)準(zhǔn)程序自雜交瘤上清液中提純抗體。利用ELISA針對(duì)與RAGE可溶性形式的結(jié)合對(duì)經(jīng)純化抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)。將九十六孔板(康寧(Corning)，康寧，紐約)涂覆100nl重組人類(lèi)RAGE-Fc或重組人類(lèi)RAGEV-區(qū)-Fc(l嗎/ml)并在4"C下培育過(guò)夜。在用含有1%BSA及0.05。/o吐溫(Tween)-20的PBS洗滌并阻斷后，添加100pl樣品(樣品呈數(shù)種形式經(jīng)稀釋免疫血清、雜交瘤上清液或經(jīng)純化抗體，如上文所述)并在室溫下培育1小時(shí)。將板用PBS(pH7.2)洗滌并使用偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)(IgG)(皮爾斯(Pierce)，洛克福特(Rockford)，伊利諾斯州(IL))檢測(cè)結(jié)合的抗RAGE抗體，隨后與底物TMB(BioFX實(shí)驗(yàn)室，歐文斯米爾市(OwingsMills)，馬里蘭州實(shí)驗(yàn)室)一起培育。在分光光度計(jì)中于450nm處測(cè)定吸光度值。單克隆抗體的濃度是使用經(jīng)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(FcY)(皮爾斯，洛克福特，伊利諾斯州)來(lái)測(cè)定并由純化的同種型匹配小鼠IgG產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。七種鼠科動(dòng)物抗體XT-H1到XT-H7及七種大鼠抗體XT-M1到XT-M7與hRAGE-Fc、hRAGEV-區(qū)-Fc、mRAGE-Fc、及mRAGE-鏈球菌結(jié)合的能力的ELISA結(jié)果概述于表2中。如圖2及3所示，大鼠抗體XT-M4及鼠科動(dòng)物抗體XT-H2二者均與人類(lèi)RAGE-Fc及hRAGE的V-結(jié)構(gòu)域結(jié)合。XT-M4與人類(lèi)RAGE及與人類(lèi)RAGEV-結(jié)構(gòu)域結(jié)合的EC50值分別為300pM及100pM。XT-H2與人類(lèi)RAGE及人類(lèi)RAGEV-結(jié)構(gòu)域結(jié)合的EC50_值分別為90pM及100pM。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>實(shí)例7RAGE配體與抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定為測(cè)定RAGE單克隆抗體是否影響RAGE配體(HMGB1;西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)與RAGE的結(jié)合，實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定。在4'C下將九十六孔板涂覆1ng/mlHMGB1過(guò)夜。如上所述對(duì)孔進(jìn)行洗滌及阻斷并在室溫下于100pl預(yù)培育混合物中暴露l小時(shí)，所述預(yù)培育混合物是O.l(ig/mlRAGE-Fc或TrkB-Fc(非特異性Fc對(duì)照)加上各種形式的上述抗體制備品(免疫血清稀釋物、雜交瘤上清液或經(jīng)純化抗體)的混合物。將板用PBS(pH7.2)洗滌并使用偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的山羊抗人類(lèi)IgG(Fc力(皮爾斯，洛克福特，伊利諾斯州)檢測(cè)結(jié)合配體的重組人類(lèi)RAGE-Fc，隨后與底物TMB(歐文斯米爾市BioFX實(shí)驗(yàn)室，歐文斯米爾市馬里蘭州實(shí)驗(yàn)室，馬里蘭州)一起培育。無(wú)任何抗體或具有經(jīng)稀釋免疫前血清下重組人類(lèi)RAGE-Fc與配體的結(jié)合作為對(duì)照并定義為100y。結(jié)合。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定而測(cè)定的七種鼠科動(dòng)物抗體XT-H1至ijXT-H7及七種大鼠抗體XT-M1至ljXT-M7阻斷HMGB1與hRAGE-Fc結(jié)合的能力顯示于表3中。表3也概述通過(guò)類(lèi)似競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定而測(cè)定的鼠科動(dòng)物抗體XT-H1、XT-H2及XT-H5阻斷不同hRAGE配體、淀粉樣蛋白卩1-42肽與RAGE結(jié)合的能力及大鼠抗體XT-M1到XT-M7阻斷HMGB1與鼠科動(dòng)物RAGE-Fc結(jié)合的能力。如圖4中所示，大鼠抗體XT-M4及鼠科動(dòng)物抗體XT-H2二者均阻斷HMGB1與人類(lèi)RAGE的結(jié)合。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>使用類(lèi)似競(jìng)爭(zhēng)方法測(cè)定抗體對(duì)間的相對(duì)結(jié)合表位。首先，在4"C下將lpg/ml重組人類(lèi)RAGE-Fc涂覆在九十六孔板上過(guò)夜。洗滌并阻斷(參見(jiàn)上文)后，將孔在室溫下于100pl預(yù)培育混合物中暴露1小時(shí)，所述混合物是生物素化靶抗體與競(jìng)爭(zhēng)抗體稀釋物的混合物。使用偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的抗生蛋白鏈菌素(皮爾斯)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的生物素化抗體。使用類(lèi)似競(jìng)爭(zhēng)方法測(cè)定抗體對(duì)間的相對(duì)結(jié)合表位。首先，在4"C下將l昭/ml重組人類(lèi)RAGE-Fc涂覆在九十六孔板上過(guò)夜。洗滌并阻斷(參見(jiàn)上文)后，將孔在室溫下于100pl預(yù)培育混合物中暴露1小時(shí)，所述混合物是生物素化靶抗體與競(jìng)爭(zhēng)抗體稀釋物的混合物。使用偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的抗生蛋白鏈菌素(皮爾斯，洛克福特，伊利諾斯州)檢測(cè)結(jié)合的生物素化抗體，隨后與底物TMB(BioFX實(shí)驗(yàn)室，歐文斯米爾市，馬里蘭州實(shí)驗(yàn)室)一起培育。無(wú)任何競(jìng)爭(zhēng)抗體下生物素化抗體與重組人類(lèi)RAGE-Fc的結(jié)合作為對(duì)照并定義為100%。分析大鼠與鼠科動(dòng)物抗體競(jìng)爭(zhēng)與hRAGE結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定的結(jié)果顯示于表3中。圖5呈現(xiàn)來(lái)自競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定的數(shù)據(jù)圖，所述競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定對(duì)大鼠XT-M4與抗體XT-H1、XT-H2、XT-H5、XT-M2、XT-M4、XT-M6、及XT-M7競(jìng)爭(zhēng)與hRAGE結(jié)合予以分析。圖5中所示的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合數(shù)據(jù)顯示XT-M4及XT-H2與人類(lèi)RAGE上的重疊位點(diǎn)結(jié)合。實(shí)例8鼠科動(dòng)物及大鼠抗RAGE抗體與人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE-Fc結(jié)合的BIACORETM結(jié)合測(cè)定A.與人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE結(jié)合通過(guò)BIACORE⑧直接結(jié)合測(cè)定來(lái)分析所選鼠科動(dòng)物及大鼠抗RAGE抗體與人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE及與人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE的V結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。使用以高密度(2000RU)利用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)涂覆在CM5芯片上的人類(lèi)或鼠科動(dòng)物RAGE-Fc來(lái)實(shí)施測(cè)定。使兩種濃度(50nm及100nm)的抗RAGE抗體溶液一式兩份流過(guò)經(jīng)固定的RAGE-Fc蛋白。BIACORETM技術(shù)利用抗RAGE抗體與經(jīng)固定RAGE抗原結(jié)合時(shí)表面層上的折射率改變。通過(guò)自表面折射的激光的表面等離子共振(SPR)來(lái)檢測(cè)結(jié)合。BIACORE直接結(jié)合測(cè)定的結(jié)果概述于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>通過(guò)BIACORETM直接結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定鼠科動(dòng)物及大鼠抗RAGE抗體與人類(lèi)及鼠科動(dòng)物RAGE結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(ka及kd)及締合及解離常數(shù)(Ka及Kd)。信號(hào)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析締合速率及解離速率使得能夠區(qū)別非特異性及特異性相互作用。通過(guò)BIACORETM直接結(jié)合測(cè)定測(cè)定的鼠科動(dòng)物XT-H2抗體及大鼠XT-M4抗體與hRAGE-Fc結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)及平衡常數(shù)顯示于表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>B.與人類(lèi)RAGEV-結(jié)構(gòu)域結(jié)合鼠科動(dòng)物及大鼠抗RAGE抗體與人類(lèi)RAGEV-結(jié)構(gòu)域結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)及締合及解離常數(shù)也通過(guò)BIACORETM直接結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定。由涂覆在CM5芯片上的抗人類(lèi)Fc抗體俘獲人類(lèi)RAGEV-結(jié)構(gòu)域-Fc，且如上所述實(shí)施鼠科動(dòng)物及大鼠抗RAGE抗體與經(jīng)固定hRAGEV結(jié)構(gòu)域-Fc結(jié)合的BIACORETM直接結(jié)合測(cè)定以測(cè)定其與全長(zhǎng)RAGE-Fc的結(jié)合。實(shí)例9抗RAGE抗體可變區(qū)的氨基酸序列對(duì)編碼鼠科動(dòng)物抗RAGE抗體XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5及XT-H7及大鼠抗RAGE抗體XT-M4的輕鏈及重鏈可變區(qū)的DNA序列進(jìn)行克隆并測(cè)序，并測(cè)定所述可變區(qū)的氨基酸序列。這六種抗體的重鏈可變區(qū)的比對(duì)氨基酸序列顯示于圖6中，且輕鏈可變區(qū)的比對(duì)氨基酸序列顯示于圖7中。實(shí)例io編碼RAGE的兔、狒狒及食蟹猴cDNA序列的分離分離編碼RAGE的cDNA序列并利用標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法迸行克隆。使用Trizol(英杰公司Gibco(GibcoInvitrogen)，卡爾斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亞州)經(jīng)由制造商方案提取RNA并去除肺組織。使用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑(羅氏應(yīng)用科學(xué)(RocheAppliedScience),印第安納波利斯(Indianapolis)，印第安納州(IN))及制造商方案對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。使用英杰公司TaqDNA聚合酶(英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)及方案及添加印eI及五coiF限制位點(diǎn)的寡核苷酸(5'-GACCCTGGAAGGAAGCAGGATG(SEQIDNO:59)及5'-GGATCTGTCTGTGGGCCCCTCAAGGCC)(SEQIDNO:60)自cDNA擴(kuò)增食蟹猴(成束猴師cacafascicularis))及狒狒(草原狒狒(Papiocva露ephalus))RAGE序列。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用5^I/五coRV消化并克隆到質(zhì)粒pAdoril-3中的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)中。利用如上所述RT-PCR使用添加^el及A^I位點(diǎn)的寡核苷酸5'-ACTAGACTAGTCGGACCATGGCAGCAGGGGCAGCGGCCGGA(SEQIDNO:61)及5'-NO:62)克隆兔RAGE，并克隆到pAdoril-3中的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)中。測(cè)定所得質(zhì)粒中編碼狒狒RAGE、猴RAGE及兔兩種RAGE同種型的經(jīng)克隆cDNA序列的核苷酸序列。編碼狒狒RAGE的核苷酸序列顯示于圖8(SEQIDNO:6)中，且編碼食蟹猴RAGE的核苷酸序列顯示于圖9(SEQIDNO:8)中。編碼兔兩種RAGE同種型的核苷酸序列顯示于圖10(SEQIDNO:10)及圖11(SEQIDNO:12)中。實(shí)例ll編碼狒狒RAGE的基因組DNA序列的分離使用標(biāo)準(zhǔn)基因組克隆技術(shù)(例如，參見(jiàn)薩姆布魯克等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手遜，第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)分離編碼RAGE的狒狒基因組DNA序列。使用32P隨機(jī)引物人類(lèi)RAGEcDNA對(duì)XDASHII載體中的狒狒(草原狒狒)X基因組文庫(kù)(Stratagene,拉霍亞，加利福尼亞州)進(jìn)行篩選。分離陽(yáng)性噬菌體蝕斑并使其經(jīng)歷兩輪額外篩選以獲得單一分離物。制備XDNA，用NotI消化，并使用常用程序進(jìn)行尺寸分級(jí)分離以自X基因組臂中分離出插入片段DNA。將Notl片段連接到經(jīng)Notl消化的pBluescriptSK+中，并使用RAGE特異性引物對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。所獲得的克隆體稱(chēng)為克隆體18.2。編碼狒狒RAGE的經(jīng)克隆狒狒基因組DNA的核苷酸序列顯示于圖12A-12-E(SEQIDNO:15)中。實(shí)例12嵌合XT-M4抗體通過(guò)使大鼠抗鼠科動(dòng)物RAGE抗體XT-M4的輕鏈及重鏈可變區(qū)分別與人類(lèi)k輕鏈及IgGl重鏈恒定區(qū)融合產(chǎn)生嵌合XT-M4。為降低抗體的潛在Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子活性，將嵌合突變L234A及G237A引入到XT-M4中(人類(lèi)IgGlFc區(qū)域中)。將所述嵌合抗體分子編號(hào)為XT-M4-A-1。嵌合XT-M4抗體含有93.83%的人類(lèi)氨基酸序列及6.18%的大鼠氨基酸序列。實(shí)例13評(píng)價(jià)嵌合XT-M4與RAGE的結(jié)合通過(guò)ELISA及BIACORETM結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)量嵌合抗體XT-M4及所選大鼠及鼠科動(dòng)物抗RAGE抗體與人類(lèi)RAGE及其它物種的RAGE結(jié)合及阻斷RAGE配體的結(jié)合的能力。A.通過(guò)BIACORETM結(jié)合測(cè)定測(cè)量與可溶性人類(lèi)RAGE的結(jié)合通過(guò)BIACORETM俘獲結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)量嵌合抗體XT-M4、親本大鼠抗體XT-M4及鼠科動(dòng)物抗體XT-H2及XT-H5與可溶性人類(lèi)RAGE(hRAGE-SA)的結(jié)合。所述測(cè)定是通過(guò)將抗體以5000-7000RU涂覆到CM5BIA芯片上來(lái)實(shí)施。使100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM及0nM濃度的標(biāo)記有抗生蛋白鏈菌素的經(jīng)純化可溶性人類(lèi)RAGE(hRAGE-SA)溶液一式三份流過(guò)經(jīng)固定的抗體，并測(cè)定與hRAGE-SA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(ka及kd)及締合及解離常數(shù)(Ka及Kd)。結(jié)果顯示于表6中表6與hRAGE-SA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)及平衡常數(shù)ka(l/Ms)kd(1/s)Ka(l/M)K"M)R~MaxX2XT-M43.78X1061.86X10-22.03X1084.92X10-961.50.563嵌合抗體XT-M44.39X1062.48XI(T21.77X1085.66X10-933.10.436XT-H21.10X1061.16X1CT39.48X1081.06X10—948.12.7XT-H51.66X1064.51XI(T33.69X1082.71X10-924.50.996XT-M4抗體及嵌合抗體XT-M4以類(lèi)似動(dòng)力學(xué)與單體可溶性人類(lèi)RAGE結(jié)合。嵌合XT-M4對(duì)人類(lèi)可溶性單體RAGE的親和力約為5.5nM。B.RAGE配體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定如實(shí)例7中所述，通過(guò)配體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定嵌合抗體XT-M4抗體及大鼠抗體XT-M4阻斷RAGE配體HMGB1、淀粉樣蛋白(31-42肽、S100-A及S100-B與hRAGE-Fc結(jié)合的能力。如圖13中所示，嵌合抗體XT-M4及XT-M4阻斷HMGB1、淀粉樣蛋白|31-42肽、S100-A及S100-B與人類(lèi)RAGE結(jié)合的能力幾乎相同。C.抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定以實(shí)例7中所述方式，通過(guò)抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定嵌合抗體XT-M4抗體與大鼠抗體XT-M4及鼠科動(dòng)物抗體XT-H2競(jìng)爭(zhēng)與hRAGE-Fc結(jié)合的能力。如圖14中所示，嵌合抗體XT-M4與大鼠抗體XT-M4及鼠科動(dòng)物抗體XT-H2競(jìng)爭(zhēng)與hRAGE-Fc結(jié)合。實(shí)例14通過(guò)基于細(xì)胞的ELISA測(cè)量抗體與不同物種RAGE的結(jié)合。細(xì)胞轉(zhuǎn)染將人類(lèi)胚胎腎293細(xì)胞(美國(guó)組織典型培養(yǎng)物(AmericanTissueTypeCulture),馬納薩斯(Manassas)，弗吉尼亞州(VA))以5x106個(gè)細(xì)胞/10cr^鋪板于組織培養(yǎng)物板上并在37匸下培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，利用制造商方案使用LF2000試劑(英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)用RAGE表達(dá)質(zhì)粒(編碼小鼠、人類(lèi)、狒狒、食蟹猴或兔RAGE的pAdoril-3載體)以試劑:質(zhì)粒DNA為4:1的比例將細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)使用胰蛋白酶收獲細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，隨后以2xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中?；诩?xì)胞的ELISA將1昭/ml—級(jí)抗體以1:2或1:3連續(xù)稀釋于96-孔板中含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中。將以2x106個(gè)細(xì)胞/1111存于無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的經(jīng)RAGE轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞或?qū)φ沼H本293細(xì)胞(50pl)添加到U-形底％孔板中，最后濃度為1x105個(gè)細(xì)胞/孔。將細(xì)胞在1600rpm下離心分離2分鐘。經(jīng)一次旋轉(zhuǎn)用手輕輕棄除上清液并輕拍所述板使細(xì)胞團(tuán)粒松散。向細(xì)胞中添加存于含有10。/。胎牛血清(FCS怖冷PBS中的經(jīng)稀釋一級(jí)抗RAGE抗體或同種型匹配對(duì)照抗體(IOOW)并在冰上培育1小時(shí)。.將細(xì)胞用100經(jīng)稀釋二級(jí)抗IgG抗體HRP偶聯(lián)物(皮爾斯生物技術(shù)公司，洛克福特，伊利諾斯州)在冰上染色1小時(shí)。一級(jí)抗體及二級(jí)抗體培育的每一步驟后都用冰冷PBS將細(xì)胞洗滌3次。向板中添加100pl底物TMB1組份(BIOFX，TMBW-0100-01)并在室溫下培育5-30分鐘。通過(guò)添加100^10.18MH2S04終止顯色。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心分離并將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮板上并在450nm處讀數(shù)(軟件MAXpro4.0，分子裝置公司(MolecularDevicesCorporation),桑尼維爾(Sunnyvale)，加利福尼亞州)。通過(guò)基于細(xì)胞的ELISA測(cè)定的抗體嵌合XT-M4及XT-M4與人類(lèi)及狒狒RAGE結(jié)合的能力顯示于圖14中。通過(guò)基于細(xì)胞的ELISA測(cè)定的嵌合抗體XT-M4及XT-M4與由293細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面人類(lèi)、狒狒、猴、小鼠及兔RAGE結(jié)合的EC50值顯示于表7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>實(shí)例15通過(guò)免疫組織化學(xué)染色測(cè)定與不同物種RAGE的結(jié)合通過(guò)肺組織切片的免疫組織化學(xué)(IHC)染色來(lái)測(cè)定嵌合抗體XT-M4、大鼠XT-M4抗體及鼠科動(dòng)物抗體XT-H1、XT-H2、及XT-H5與人類(lèi)、食蟹猴、狒狒、及兔肺組織中內(nèi)源細(xì)胞表面RAGE的結(jié)合能力。經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞經(jīng)設(shè)計(jì)以表達(dá)鼠科動(dòng)物及人類(lèi)RAGE全長(zhǎng)蛋白。將鼠科動(dòng)物及人類(lèi)RAGEcDNA克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，線性化并使用脂轉(zhuǎn)染試劑方法轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中(考夫曼，1990，酶學(xué)方法，185:537-66;考夫曼，1990，酶學(xué)方法，185:487-511;皮特曼等人，1993，酶學(xué)方法，222:236)。在20nM甲氨蝶呤中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步選擇并自各克隆體中收獲細(xì)胞提取物并通過(guò)SDS十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及西方墨點(diǎn)法予以分析以證實(shí)表達(dá)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施自過(guò)表達(dá)人類(lèi)RAGE的狒狒、食蟹猴、兔或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或?qū)φ誄HO細(xì)胞分離的RAGE肺組織的免疫組織化學(xué)。使用1-15mgRAGE抗體及大鼠IgG2b同種型對(duì)照或小鼠同種型對(duì)照。使嵌合XT-M4、XT陽(yáng)M4-hVH-V2.0陽(yáng)2m/hVL-V2.10、XT-M4-hVH-V2.0陽(yáng)2m/hVL-V2.11、XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.14生物素化并使用0.2、1、5及10pg/ml的西格瑪(sigma)IgGl生物素化對(duì)照抗體。在用HRP及AlexaFluor594、AlexaFluor488或偶聯(lián)FITC的抗生物素檢測(cè)后，也用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)將切片染色。圖15顯示嵌合抗體XT-M4與食蟹猴、兔及狒狒肺組織中的RAGE結(jié)合。在其中產(chǎn)生RAGE的細(xì)胞與嵌合XT-M4接觸的樣品中可以看到陽(yáng)性IHC-染色形式，但在不存在RAGE或RAGE結(jié)合抗體的樣品中則不能。圖16顯示大鼠抗體XT-M4與正常人類(lèi)肺及患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的人類(lèi)肺中的RAGE結(jié)合。通過(guò)肺組織切片的IHC染色測(cè)定的大鼠XT-M4抗體及鼠科動(dòng)物抗體XT-H1、XT-H2及XT-H5與膿毒性狒狒肺及正常食蟹猴肺中內(nèi)源細(xì)胞表面RAGE的結(jié)合概述于表8中。使用經(jīng)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，所述表達(dá)載體表達(dá)編碼hRAGE的DNA。表8通過(guò)IHC測(cè)定的與非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肺中RAGE的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>實(shí)例16人類(lèi)化鼠科動(dòng)物抗人類(lèi)RAGE抗體XT-H2的分子模型鼠科動(dòng)物抗人類(lèi)RAGE抗體XT-H2HV結(jié)構(gòu)域的分子模型基于對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP搜索選擇用于模擬鼠科動(dòng)物XT-H2重鏈的抗體結(jié)構(gòu)模板。鼠科動(dòng)物XT-H2的分子模型是使用InsightII同源模組(艾克樂(lè)瑞斯(Accelrys)，圣地亞哥(SanDiego))基于6個(gè)模板結(jié)構(gòu)構(gòu)建，1SY6(抗CD3抗體)、1MRF(抗RNA抗體)、及1RIH(抗腫瘤抗體)?；诿恳环肿拥腃a距離矩陣測(cè)定模板的結(jié)構(gòu)保守區(qū)域(SCR)并基于SCR中對(duì)應(yīng)原子的最小RMS偏離使模板結(jié)構(gòu)迭加。將靶蛋白大鼠XT-H2VH的序列與所迭加模板蛋白的序列進(jìn)行比對(duì)并將SCR的原子坐標(biāo)指定為耙蛋白的對(duì)應(yīng)殘基?；诿恳籗CR中靶與模板間序列的相似程度，不同SCR使用來(lái)自不同模板的坐標(biāo)。未包括在SCR內(nèi)的環(huán)及可變區(qū)的坐標(biāo)通過(guò)同源模組中所實(shí)施的搜索環(huán)(SearchLoop)或產(chǎn)生環(huán)(GenerateLoop)方法產(chǎn)生。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，搜索環(huán)方法通過(guò)將側(cè)接SCR殘基的Ca距離矩陣與源自具有相同數(shù)目側(cè)接殘基及給定長(zhǎng)度間插肽節(jié)段的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)計(jì)算矩陣進(jìn)行比較對(duì)酷似2個(gè)SCR間區(qū)域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描。對(duì)搜索環(huán)方法的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)以首先找出側(cè)接SCR殘基中具有最小RMS偏離及最大序列一致性的匹配。隨后著手評(píng)價(jià)潛在匹配與耙環(huán)序列間的序列相似性。在搜索環(huán)方法未發(fā)現(xiàn)最佳匹配的那些情況下重新使用產(chǎn)生環(huán)方法來(lái)產(chǎn)生原子坐標(biāo)。若模板與靶中的氨基酸殘基相同，則使氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象與模板中的構(gòu)象保持相同。然而，實(shí)施旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的構(gòu)象搜索并將在能量方面最有利的構(gòu)象保留給那些在模板及靶中不相同的殘基。為優(yōu)化兩個(gè)相鄰SCR(其坐標(biāo)根據(jù)不同模板確定)間及SCR與環(huán)間的剪接點(diǎn)，使用同源模組的剪接修復(fù)功能。剪接修復(fù)實(shí)施分子力學(xué)模擬以在2個(gè)SCR間或SCR與可變區(qū)間的剪接點(diǎn)上獲得最佳鍵長(zhǎng)及鍵角。最后，對(duì)模型實(shí)施能量最小化，直至使用最陡下降算法時(shí)最大導(dǎo)數(shù)為5kcal/(mo1A)或500個(gè)循環(huán)及使用共軛梯度算法時(shí)最大導(dǎo)數(shù)為5kcal/(mo1A)或2000個(gè)循環(huán)。使用同源模組的ProStat/S加ct—檢查(ProStat/Struct—Check)功用對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。人類(lèi)化抗RAGEXT-H2HV結(jié)構(gòu)域的分子模型人類(lèi)化(CDR移植)抗RAGE抗體XT-H2重鏈的分子模型是用InsightII按照與對(duì)于小鼠XTH2抗體重鏈所述相同的程序構(gòu)建，只是使用不同的模板。在此情況下使用的結(jié)構(gòu)模板是1L7I(抗ErbB2抗體)、1FGV(抗CD18抗體)、UPS(抗組織因子抗體)及1N8Z(抗Her2抗體)。框架回復(fù)突變的模型分析及預(yù)測(cè)-人類(lèi)化比較親本小鼠抗體模型與CDR移植人類(lèi)化形式模型在一或多個(gè)以下特征方面的相似性及差異CDR-框架接觸、影響CDR構(gòu)象的潛在氫鍵、及各區(qū)域(例如框架l、框架2、框架3、框架4及3個(gè)CDR)的RMS偏離。經(jīng)預(yù)測(cè)，以下回復(fù)突變(單獨(dú)或組合)對(duì)于通過(guò)CDR移植進(jìn)行的成功人類(lèi)化甚為重要E46Y、R72A、N77S、N74K、R67K、K76S、A23K、F68A、R38K、A概。實(shí)例17人類(lèi)化大鼠抗RAGE抗體XT-M4的分子模型大鼠抗鼠科動(dòng)物RAGE抗體XT-M4HV結(jié)構(gòu)域的分子模型基于對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP搜索選擇用于模擬大鼠XT-M4重鏈的抗體結(jié)構(gòu)模板。大鼠XT-M4的分子模型是使用InsightII同源模組(艾克樂(lè)瑞斯，圣地亞哥)基于6個(gè)模板結(jié)構(gòu)構(gòu)建1QKZ(抗肽抗體)、1IGT(抗犬科動(dòng)物淋巴瘤單克隆抗體)、8FAB(抗對(duì)-偶氮苯基胂酸鹽抗體)、1MQK(抗細(xì)胞色素C氧化酶抗體)、1H0D(抗血管生成素抗體)、及1MHP(抗alpi抗體)?；诿恳环肿拥腃a距離矩陣測(cè)定模板的結(jié)構(gòu)保守區(qū)域(SCR)并基于SCR中對(duì)應(yīng)原子的最小RMS偏離使模板結(jié)構(gòu)迭加。將靶蛋白大鼠XT-M4VH的序列與所迭加模板蛋白的序列進(jìn)行比對(duì)并將SCR的原子坐標(biāo)指定為靶蛋白的對(duì)應(yīng)殘基?；诿恳籗CR中靶與模板間序列的相似程度，不同SCR使用來(lái)自不同模板的坐標(biāo)。未包括在SCR內(nèi)的環(huán)及可變區(qū)的坐標(biāo)通過(guò)同源模組中所實(shí)施的搜索環(huán)或產(chǎn)生環(huán)方法產(chǎn)生。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，搜索環(huán)方法通過(guò)將側(cè)接SCR殘基的Ca距離矩陣與源自具有相同數(shù)目側(cè)接殘基及給定長(zhǎng)度間插肽節(jié)段的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)計(jì)算矩陣進(jìn)行比較對(duì)酷似2個(gè)SCR間區(qū)域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描。對(duì)搜索環(huán)方法的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)以首先找出在側(cè)接SCR殘基中具有最小RMS偏離及最大序列一致性的匹配。隨后著手評(píng)價(jià)潛在匹配與靶環(huán)序列間的序列相似性。在搜索環(huán)方法未發(fā)現(xiàn)最佳匹配的那些情況下重新使用產(chǎn)生環(huán)方法來(lái)產(chǎn)生原子坐標(biāo)。若模板與靶中的氨基酸殘基相同，則使氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象與模板中的構(gòu)象保持相同。然而，實(shí)施旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的構(gòu)象搜索并將在能量方面最有利的構(gòu)象保留給那些在模板及靶中不相同的殘基。為優(yōu)化兩個(gè)相鄰SCR(其坐標(biāo)根據(jù)不同模板確定)間及SCR與環(huán)間的剪接點(diǎn)，使用同源模組的剪接修復(fù)功能。剪接修復(fù)實(shí)施分子力學(xué)模擬以在2個(gè)SCR間或SCR與可變區(qū)間的剪接點(diǎn)上獲得最佳鍵長(zhǎng)及鍵角。最后，使模型能量最小化，直至使用最陡下降算法時(shí)最大導(dǎo)數(shù)為5kcal/(mo1A)或500個(gè)循環(huán)及使用共軛梯度算法時(shí)最大導(dǎo)數(shù)為5kcal/(mo1A)或2000個(gè)循環(huán)。使用同源模組的ProStat/Struct—檢査功用對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。XT-M4輕鏈可變結(jié)構(gòu)域XTM4輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型是用Modeler8v2使用1K6Q(抗組織因子抗體)、1WTL、1D5B(抗體AZ-28)及1B0G(抗p24抗體)作為模板產(chǎn)生。對(duì)于每一個(gè)靶，在100個(gè)初始模型中，選擇經(jīng)分子概率密度函數(shù)定義對(duì)限制具有最低違背的一個(gè)模型來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化。對(duì)于模型優(yōu)化，使用Charmm27力場(chǎng)(艾克樂(lè)瑞斯軟件公司)及構(gòu)建于DiscoveryStudio1.6(艾克樂(lè)瑞斯軟件公司)中的廣義波恩虛擬溶劑模型(GeneralizedBornimplicitsolvation)實(shí)施由最陡下降、共軛梯度及所采納基礎(chǔ)牛頓拉富生方法(AdoptedBasisNewtonRaphsonmethod)組成的能量最小化級(jí)聯(lián)，直至滿(mǎn)足RMS梯度為0.01。在能量最小化期間，使用IO質(zhì)量力的諧波約束限制骨架原子的運(yùn)動(dòng)。人類(lèi)化抗RAGEXT-M4VH結(jié)構(gòu)域的分子模型人類(lèi)化(CDR移植)抗RAGE抗體XT-M4抗體重鏈的分子模型是用InsightII按照與對(duì)于大鼠XTM4抗體重鏈所述相同的程序構(gòu)建，只是使用不同的模板。在此情況下使用的結(jié)構(gòu)模板是1MHP(抗alpl抗體)、1IGT(抗犬科動(dòng)物淋巴瘤單克隆抗體)、8FAB(抗對(duì)-偶氮苯基胂酸鹽抗體)、1MQK(抗細(xì)胞色素C氧化酶抗體)及1H0D(抗血管生成素抗體)。人類(lèi)化XT-M4輕鏈可變結(jié)構(gòu)域人類(lèi)化(CDR移植)抗RAGE抗體XTM4抗體輕鏈的分子模型是使用Modeler8v2按照與對(duì)于大鼠XTM4抗體輕鏈所述相同的程序構(gòu)建，只是使用不同的模板。在此情況下使用的結(jié)構(gòu)模板是1B6D、1FGV(抗CD18抗體)、1UJ3(抗組織因子抗體)及1WTL作為模板。框架回復(fù)突變的模型分析及預(yù)測(cè)-人類(lèi)化比較親本大鼠抗體模型與CDR移植人類(lèi)化形式模型在一或多個(gè)以下特征方面的相似性及差異CDR-框架接觸、影響CDR構(gòu)象的潛在氫鍵、各區(qū)域(例如框架1、框架2、框架3、框架4及3個(gè)CDR)的RMS偏差、及所計(jì)算的殘基-殘基相互作用能量。將所識(shí)別的潛在回復(fù)突變(單獨(dú)或組合)納入使用InsightII或Modeler8v2構(gòu)建的另一組模型中并將突變體的模型與親本大鼠抗體模型進(jìn)行比較以在電腦上評(píng)價(jià)突變體的適宜性。經(jīng)預(yù)測(cè)，以下回復(fù)突變(單獨(dú)或組合)對(duì)于通過(guò)CDR移植進(jìn)行的成功人類(lèi)化甚為重要重鏈L114M、T113V及A88S;輕鏈K45R、L46R、L47M、D70I、G66R、T85D、Y87H、T69S、Y36F、F71Y。實(shí)例18具有鼠科動(dòng)物XT-H2及大鼠XT-M4抗體的CDR的人類(lèi)化可變區(qū)人類(lèi)化重鏈可變區(qū)是通過(guò)將鼠科動(dòng)物XT-H2及大鼠XT-M4抗體的CDR移植到表9中所示的人類(lèi)種系框架序列上并引入所選回復(fù)突變制備。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>人類(lèi)化鼠科動(dòng)物XT-H2重鏈及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別顯示于圖17(SEQIDNO:28-3l)及圖18(SEQIDNO:32-35)中。人類(lèi)化大鼠XT-M4重鏈及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別顯示于圖19(SEQIDNO:36-38)及圖20A-20B(SEQIDNO:39-49)中。框架序列衍生自其的種系序列及人類(lèi)化可變區(qū)中的特定回復(fù)突變?cè)诒?0中給出。將編碼人類(lèi)化可變區(qū)的DNA序列亞克隆到含有編碼人類(lèi)免疫球蛋白恒定區(qū)的序列的表達(dá)載體中，并使用標(biāo)準(zhǔn)程序在COS細(xì)胞中表達(dá)編碼全長(zhǎng)輕鏈及重鏈的DNA序歹i」。將編碼重鏈可變區(qū)的DNA亞克隆到pSMED2hlgGlm—(L234,L237)cDNA載體中，產(chǎn)生人類(lèi)化IgGl抗體重鏈。將編碼輕鏈可變區(qū)的DNA亞克隆到pSMEN2hK載體中，產(chǎn)生人類(lèi)化k抗體輕鏈。參見(jiàn)圖21。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)方案人類(lèi)化XT-H2及XT-M4抗體及嵌合XT-M4與人類(lèi)RAGE-Fc的結(jié)合是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)定性。為產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)者，將親本大鼠XT-M4抗體生物素化。將ELISA板涂覆1嗎/ml人類(lèi)RAGE-Fc過(guò)夜。將不同濃度的生物素化XT-M4一式兩份添加到孔中(0.11-250ng/ml)，培育，洗滌并用抗生蛋白鏈菌素-HRP檢測(cè)。所計(jì)算的經(jīng)生物素化親本大鼠XT-M4的ED50值為5ng/ml。當(dāng)與12.5ng/ml生物素化親本XT-M4抗體競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，計(jì)算嵌合及每一人類(lèi)化XT-M4抗體的IC50值。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將板涂覆l嗎/ml人類(lèi)RAGE-Fc過(guò)夜。將不同濃度的與12.5ng/ml生物素化親本大鼠XT-M4混合的嵌合或人類(lèi)化抗體一式兩份添加到孔中(介于9ng/ml到20嗎/ml范圍內(nèi))。用抗生蛋白鏈菌素-HRP檢測(cè)生物素化親本大鼠XT-M4抗體并計(jì)算IC50值。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析測(cè)定的人類(lèi)化抗體的IC50值顯示于表11中。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>人類(lèi)化XT-H2抗體與人類(lèi)RAGE-Fc結(jié)合的ED50值通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA以類(lèi)似方式測(cè)定且顯示于圖22中。實(shí)例20嵌合及人類(lèi)化XT-M4抗體與其它細(xì)胞表面受體的交叉反應(yīng)性測(cè)試人類(lèi)化XT-M4抗體XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10及XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.U連同嵌合XT-M4與其它RAGE樣受體的交叉反應(yīng)性。選擇這些受體是因?yàn)槠渑cRAGE—樣為細(xì)胞表面表達(dá)，且其與配體的相互作用類(lèi)似地依賴(lài)于電荷。所測(cè)試的受體是rhVCAM-l、rhlCAM-l-Fc、rhTLR4(C-端His標(biāo)簽)、rhNCAM-l、rhB7-Hl-Fcml—oxl-Fc、hi—oxl-Fc及hRAGE-Fc(作為陽(yáng)性對(duì)照)。將ELISA板用1pg/ml所列示的受體蛋白涂覆過(guò)夜。將各種濃度的上文列示人類(lèi)化及嵌合XT-M4抗體一式兩份添加到孔中(0.03至20pg/ml)，培育，洗滌并用抗人類(lèi)IgGHRP檢測(cè)。表12顯示嵌合及人類(lèi)化XT-M4抗體與人類(lèi)及小鼠細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的直接結(jié)合ELISA分析的結(jié)果。所顯示數(shù)據(jù)是所檢測(cè)的受體與20^g/ml(所測(cè)試的最高濃度)抗體結(jié)合的OD450值。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>'實(shí)例21與可溶性人類(lèi)RAGE結(jié)合的BIACORETM結(jié)合測(cè)定通過(guò)BIACORETM俘獲結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)量嵌合抗體XT-M4及人類(lèi)化XT-M4抗體與可溶性人類(lèi)RAGE(hRAGE-SA)及可溶性鼠科動(dòng)物RAGE(mRAGE-SA)的結(jié)合。通過(guò)將抗人類(lèi)Fc抗體以5000RU(pH5.0，7min,)涂覆到流動(dòng)池1-4中的CM5BIA芯片上實(shí)施測(cè)定。通過(guò)以2.0嗎/ml流過(guò)流動(dòng)池2-4中的抗Fc抗體俘獲每一抗體(流動(dòng)池1用作參考)。使100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.25nM及0nM濃度的標(biāo)記有抗生蛋白鏈菌素的經(jīng)純化可溶性人類(lèi)RAGE(hRAGE-SA)溶液一式兩份流過(guò)經(jīng)固定的抗體，解離5分鐘，并測(cè)定與hRAGE-SA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(ka及kd)及締合及解離常數(shù)(Ka及Kd)。嵌合XT-M4及人類(lèi)化抗體XT-M4-V10、XT-M4-V11、及XT-M4-V14與hRAGE-SA及mRAGE-SA結(jié)合的結(jié)果分別顯示于圖23及24中。實(shí)例22前導(dǎo)抗體XT-H2的物種交叉反應(yīng)性的優(yōu)化物種交叉反應(yīng)性通過(guò)以下過(guò)程設(shè)計(jì)使XT-H2抗體隨機(jī)突變，產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體文庫(kù)并選擇性地富集那些具有導(dǎo)致小鼠-人類(lèi)RAGE交叉反應(yīng)性的獲得性突變的分子。利用核糖體展示(黑尼斯(Hanes)等人，2000，酶學(xué)方法，328:404-30)及噬菌體展示(McAfferty等人，1989，自然，348:552-4)技術(shù)。基于抗體XT-H2及HT-M4制備ScFv抗體。A.基于XT-H2的ScFv抗體合成包含XT-H2的V區(qū)域的兩種ScFv構(gòu)建體，所述兩種構(gòu)建體是借助DGGGSGGGGSGGGGSS(SEQIDNO:50)撓性連接體連接的VH/VL形式或VL/VH形式。構(gòu)型為VL-VH及VH-VL的ScFv構(gòu)建體的序列分別顯示于圖25(SEQIDNO:51)及圖26(SEQIDNO:52)中。B.基于XT-M4的ScFv抗體合成包含XT-M4的V區(qū)域的兩種ScFv構(gòu)建體，所述兩種構(gòu)建體是借助DGGGSGGGGSGGGGSS(SEQIDNO:50)撓性連接體連接的VH/VL形式或VL/VH形式。構(gòu)型為VL-VH及VH-VL的ScFv構(gòu)建體的序列分別顯示于圖27(SEQIDNO:54)及圖28(SEQIDNO:53)中。圖29顯示活體外轉(zhuǎn)錄及翻譯的M4及H2構(gòu)建體的ELISA數(shù)據(jù)。將ELISA板用存于碳酸氫鹽緩沖液中的人類(lèi)RAGE-Fc(5pg/ml)或BSA(200pg/ml)在4'C下涂覆過(guò)夜，用PBS+吐溫0.05%洗滌并在室溫下用2%奶粉PBS阻斷1小時(shí)。在室溫下將板與活體外翻譯的ScFv培育2小時(shí)。將板阻斷并用抗Flag抗體(1/1000稀釋)隨后兔抗小鼠HRP(1/1000稀釋)檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示，VL/VH或VH/VL構(gòu)型的XT-H2及XT-M4抗RAGE抗體的可變區(qū)的ScFv構(gòu)建體可產(chǎn)生與人類(lèi)RAGE特異性結(jié)合的功能折疊蛋白。使用通過(guò)BIACORETM測(cè)定的兩種形式ScFv的Kd值來(lái)確定用于選擇實(shí)驗(yàn)的最佳抗原濃度。C.回收具有改良的小鼠/人類(lèi)RAGE交叉反應(yīng)性的變體的選擇及篩選策略通過(guò)錯(cuò)配PCR創(chuàng)建變體文庫(kù)(革蘭(Gram)等人，1992，PNA89:3576-80)。此誘變策略在ScFv基因的整個(gè)長(zhǎng)度上引入隨機(jī)突變。隨后使用已確定程序(例如，黑尼斯等人，2000，酶學(xué)方法，328:404-30)在活體外轉(zhuǎn)錄及翻譯所述文庫(kù)。使此文庫(kù)在人類(lèi)-RAGE-Fc上經(jīng)歷第l輪選擇，洗掉未結(jié)合的核糖體復(fù)合物，并對(duì)結(jié)合抗原的核糖體復(fù)合物進(jìn)行溶析?；厥誖NA，通過(guò)RT-PCR轉(zhuǎn)化成cDNA并在小鼠RAGE-Fc上經(jīng)歷第2輪選擇。此交互選擇策略?xún)?yōu)先富集與人類(lèi)及小鼠RAGE-Fc二者均結(jié)合的克隆體。隨后使來(lái)自此選擇的產(chǎn)物經(jīng)歷第2次錯(cuò)配PCR。隨后使所產(chǎn)生的文庫(kù)經(jīng)歷第3輪選擇且所述選擇輪分別在人類(lèi)-RAGE-Fc及小鼠RAGE-Fc上進(jìn)行。視需要重復(fù)此過(guò)程。將來(lái)自每一選擇步驟的RNA產(chǎn)物集合轉(zhuǎn)化成cDNA并克隆到蛋白質(zhì)表達(dá)載體pWRIL-l中以評(píng)價(jià)變體ScFv的物種交叉反應(yīng)性。也對(duì)多樣性集合進(jìn)行測(cè)序以評(píng)價(jià)多樣性來(lái)確定選擇是否朝向具有物種交叉反應(yīng)性的顯性克隆體。實(shí)例23前導(dǎo)抗體XT-M4的親和力成熟提高的親和力轉(zhuǎn)化成劑量降低或劑量頻率減小及/或功效提高的潛在益處。hRAGE的親和力通過(guò)親和力成熟利用VH-CDR3靶向誘變與隨機(jī)錯(cuò)配PCR誘變的組合過(guò)程(革蘭等人，1992，PNA89:3576-80)來(lái)提高。此產(chǎn)生抗體變體文庫(kù)，自此文庫(kù)回收對(duì)于人類(lèi)-RAGE具有提高的親和力同時(shí)保持對(duì)于小鼠-RAGE-Fc的物種交叉反應(yīng)性的分子。利用核糖體展示技術(shù)(黑尼斯等人，1997，見(jiàn)上文)及噬菌體展示技術(shù)(McAfferty等人，1989，見(jiàn)上文)。圖30顯示pWRIL-l中呈VL-VH形式的XT-M4及XT-H2ScFv構(gòu)建體的ELISA結(jié)合數(shù)據(jù)，所述構(gòu)建體在大腸桿菌中以可溶性蛋白形式表達(dá)并在人類(lèi)RAGE-Fc及BSA上測(cè)試結(jié)合。ActRIIb代表自作為陰性對(duì)照的相同載體表達(dá)的非結(jié)合蛋白。將ELISA板用存于碳酸氫鹽緩沖液中的人類(lèi)RAGE-Fc(5嗎/ml)或BSA(200嗎/ml)在4r下涂覆過(guò)夜，用PBS+吐溫0.05%洗漆并在室溫下用2%奶粉PBS阻斷1小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)嵤?0ml大腸桿菌培養(yǎng)物的周質(zhì)制備。未經(jīng)純化ScFv抗體的周質(zhì)制備品的最終體積為1ml，用2M奶粉PBS將其中50|11與以1/1000稀釋的抗His抗體(總體積為100pl)在室溫下預(yù)培育1小時(shí)。將交聯(lián)周質(zhì)制備品添加到ELISA板中并在室溫下再培育2小時(shí)。將所述板用PBS+0.05n/o吐溫洗滌兩次并用PBS洗滌兩次并與以1/1000稀釋的兔抗小鼠HRP—起在2%奶粉PBS中預(yù)培育。如先前所述洗滌所述板并使用標(biāo)準(zhǔn)TMB試劑檢測(cè)結(jié)合。數(shù)據(jù)顯示，VL/VH構(gòu)型的XT-M4及XT-H2抗體的ScFv構(gòu)建體可在大腸桿菌中產(chǎn)生與人類(lèi)RAGE特異性結(jié)合的功能折疊可溶性蛋白。使用通過(guò)BIACORETM測(cè)定的兩種形式ScFv的起始Kd值來(lái)確定用于親和力選擇的最佳抗原濃度。實(shí)例24回收對(duì)于hRAGE-Fc具有提髙的親和力同時(shí)保持物種交叉反應(yīng)性的變體的選擇及篩選策略通過(guò)XT-M4VH-CDR3的摻加誘變利用PCR創(chuàng)建變體文庫(kù)。圖31示意性地展示如何使用PCR將摻加突變引入到XT-M4的CDR中。(1)摻加寡核苷酸被設(shè)計(jì)為在CDR環(huán)長(zhǎng)度上攜帶多樣性區(qū)(regionofdiversity)并且兩側(cè)為與FR3及FR4中的靶V基因同源的區(qū)域。(2)在與特異性引物的PCR反應(yīng)中使用寡核苷酸，所述特異性引物退火到靶V基因的5'末端并與FR1區(qū)域同源。圖32顯示XT-M4VL-VHScFv構(gòu)建體的C末端的核苷酸序列(SEQIDNO:56)。VH-CDR3加以下劃線。也顯示兩種摻加寡核苷酸(SEQIDNO:57-58)，在每一突變位點(diǎn)上具有顯示用于所述位點(diǎn)突變的摻加比的數(shù)字。也顯示與所述數(shù)字對(duì)應(yīng)的摻加比的核苷酸組成。將XT-M4-VHCDR3摻加PCR產(chǎn)物以Sj7/片段克隆到核糖體展示載體pWRIL-3中以產(chǎn)生文庫(kù)。利用核糖體展示(黑尼斯及普拉克頓(Pluckthun)，2000)在人類(lèi)生物素化RAGE上對(duì)此文庫(kù)進(jìn)行選擇。使用經(jīng)生物素標(biāo)記的抗原是因?yàn)榇嗽试S基于溶液的選擇，所述基于溶液的選擇允許對(duì)過(guò)程予以更動(dòng)力學(xué)控制并增加優(yōu)先富集較高親和力克隆體的可能性?？稍谄胶夥绞较乱韵鄬?duì)于起始親和力漸減的抗原濃度實(shí)施選擇或在動(dòng)力學(xué)方式下實(shí)施選擇，其中特別選擇高解離速率以在根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的時(shí)間范圍內(nèi)利用與未經(jīng)標(biāo)記抗原的競(jìng)爭(zhēng)。洗掉未結(jié)合的核糖體復(fù)合物，對(duì)結(jié)合抗原的核糖體復(fù)合物進(jìn)行溶析，回收RNA,通過(guò)RT-PCR轉(zhuǎn)化成cDNA并在生物素化小鼠-RAGE-Fc上實(shí)施第二輪選擇以保持物種交叉反應(yīng)性。隨后使來(lái)自此選擇步驟的含有在VH-CDR3中具有突變的ScFv變體的產(chǎn)物經(jīng)歷第2周期誘變步驟。此誘變步驟涉及使用錯(cuò)配PCR產(chǎn)生隨機(jī)突變。隨后使所產(chǎn)生的文庫(kù)在生物素化人類(lèi)-RAGE-Fc上以十分之一的抗原濃度經(jīng)歷第3輪選擇。視需要重復(fù)此過(guò)程。將來(lái)自每一選擇步驟的RNA產(chǎn)物集合轉(zhuǎn)化成cDNA并克隆到蛋白質(zhì)表達(dá)載體pWRIL-l中以將變體ScFv的親和力和物種交叉反應(yīng)性分級(jí)。也對(duì)多樣性集合進(jìn)行測(cè)序以評(píng)價(jià)多樣性來(lái)確定選擇是否朝向顯性克隆體。實(shí)例25利用噬菌體展示使XT-M4親和力成熟將VH-CDR3摻加文庫(kù)克隆到圖34中所示的噬菌體展示載體pWRIL-l中以在生物素化hRAGE上進(jìn)行選擇。使用經(jīng)生物素標(biāo)記的抗原是因?yàn)榇诵问礁m合溶液中的親和力驅(qū)動(dòng)選擇?？稍谄胶夥绞较乱韵鄬?duì)于起始親和力漸減的抗原濃度實(shí)施選擇或在動(dòng)力學(xué)方式下實(shí)施選擇，其中特別選擇高解離速率以在根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的時(shí)間范圍內(nèi)利用與未經(jīng)標(biāo)記抗原的競(jìng)爭(zhēng)。利用噬菌體展示的標(biāo)準(zhǔn)程序。ScFv可二聚，此使得選擇及篩選程序變得復(fù)雜。二聚體ScFv潛在顯示基于親合力的結(jié)合并且此增加的結(jié)合活性可支配選擇。ScFv二聚能力的所述改進(jìn)而非親和力的任何內(nèi)在改進(jìn)與最終治療性抗體(其通常為IgG)具有較少相關(guān)性。為避免由二聚能力改變產(chǎn)生的制造物，使用Fab抗體形式，因?yàn)槠渫ǔ２粫?huì)二聚。將XT-M4重新格式化為Fab抗體并克隆到新的噬菌體展示載體pWRIL-6中。此載體具有橫跨VH及VL兩個(gè)區(qū)域且在人類(lèi)種系V基因中不會(huì)頻繁相交的限制位點(diǎn)。這些限制位點(diǎn)可用于VL及VH譜的改組及組合裝配。在一種策略中，將VH-CDR3及VL-CDR3摻加文庫(kù)二者均組合裝配于圖34中所示的Fab展示載體中，并針對(duì)提高的親和力進(jìn)行選擇。實(shí)例26嵌合抗體XT-M4的物理定性通過(guò)高效液相色譜(HPLC)/質(zhì)譜(MS)肽譜及網(wǎng)上MS檢測(cè)的亞單位分析的初步定性已證實(shí)氨基酸序列與來(lái)自嵌合XT-M4DNA序列的預(yù)測(cè)相同。這些MS數(shù)據(jù)也表明，在ASn299SerThr處的預(yù)期W-連接寡糖序列共有序列位點(diǎn)已被占據(jù)且兩種主要物質(zhì)是分別含有零個(gè)或一個(gè)末端半乳糖殘基的復(fù)合物N-連接二天線核心巖藻糖化聚糖。除位于分子Fc區(qū)域中的預(yù)期N-連接寡糖外，也在嵌合XT-M4重鏈的CDR2區(qū)域中的序列共有序列位點(diǎn)(Asn"AsnSer)上觀察到N-連接寡糖。此額外N-連接寡糖主要僅見(jiàn)于一條重鏈上且通過(guò)CEX-HPLC分析測(cè)定其占分子的約38%(可能存在不能由一級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)分的其它酸性物質(zhì)，其可構(gòu)成酸性物質(zhì)總百分比)。主要物質(zhì)是具有兩個(gè)唾液酸的核心巖藻糖化二天線結(jié)構(gòu)。使用吸光度通過(guò)測(cè)量A28Q值來(lái)計(jì)算濃度。經(jīng)計(jì)算，嵌合XT-M4的理論吸光度為1.35mLmg"cm"。通過(guò)非還原SDS-PAGE測(cè)定的嵌合XT-M4的表觀分子量約為200kDa?？贵w遷移比自其序列預(yù)期的較為緩慢。對(duì)于迄今分析的所有重組抗體都觀察到此現(xiàn)象。在還原條件下，嵌合XT-M4具有在約50kDa處遷移的單重鏈帶及在約25kDa處遷移的單輕鏈帶。也存在正好在重鏈帶上方遷移的額外帶。此帶的特征在于自動(dòng)埃德曼降解(Edmandegradation)且經(jīng)測(cè)定具有與嵌合XT-M4的重鏈對(duì)應(yīng)的順2-端。這些結(jié)果連同通過(guò)SDS-PAGE所觀察到的分子量增加表明，所述額外帶與在CDR2區(qū)域中具有額外N-連接寡糖的重鏈一致?；诎被嵝蛄蓄A(yù)測(cè)的嵌合XT-M4的等電點(diǎn)(pl)為7.2(在重鏈中沒(méi)有COOH-端Lys)。等電聚焦(正F)使嵌合XT-M4解析成在約7.4-8.3的pl范圍內(nèi)遷移的十條帶，其中一條顯著的帶在pl約7.8處遷移。通過(guò)毛細(xì)管電泳等電聚焦測(cè)定的pl約為7.7。通過(guò)陽(yáng)離子交換高效液相色譜(CEX-HPLC)對(duì)顯色材料進(jìn)行分析可提供對(duì)分子電荷不同的嵌合XT-M4物質(zhì)的進(jìn)一步解析。所觀察到的多半電荷異質(zhì)性最可能歸于在位于重鏈CDR2區(qū)域中的額外N-連接寡糖上發(fā)現(xiàn)的唾液酸的貢獻(xiàn)。小部分電荷異質(zhì)性可能歸因于COOH-端賴(lài)氨酸的異質(zhì)性。實(shí)例27去除糖基化位點(diǎn)如圖36中所示，通過(guò)與hRAGE-Fc的直接結(jié)合ELISA分析測(cè)定，使抗體XT-M4重鏈可變區(qū)中位置52(根據(jù)卡百特編號(hào))上的天冬酰胺(N)轉(zhuǎn)化成天冬氨酸(D)的突變可使XT-M4抗體與人類(lèi)RAGE的結(jié)合得以改良。N52D突變是在抗體XT-M4重鏈可變區(qū)的CDR2中。實(shí)例28膿毒癥及利斯特菌病的治療已顯示，抗RAGE抗體在多種微生物、腹內(nèi)膿毒癥的標(biāo)準(zhǔn)鼠科動(dòng)物模型中提供顯著治療益處。所述結(jié)果也顯示，RAGE表達(dá)對(duì)經(jīng)單核細(xì)胞增生性利斯特菌全身攻擊的動(dòng)物非常有害，此可由與野生型動(dòng)物相比純合RAGE基因剔除小鼠及雜合體中觀察到的顯著存活益處予以證實(shí)。A.材料及方法除非另外說(shuō)明，否則所有試劑及化學(xué)品都購(gòu)自西格瑪(圣路易斯，密蘇里州)。在上文中已闡述大鼠單克隆抗體XT-M4IgG對(duì)鼠科動(dòng)物二聚體RAGE的親和力常數(shù)為0.3nM?？鼓[瘤壞死因子a(TNF)單克隆抗體TN3.1912是源自倉(cāng)鼠的中和IgG抗體，其與鼠科動(dòng)物TNF結(jié)合的親和力較高。單核細(xì)胞增生性利斯特菌的攻擊菌株購(gòu)自美國(guó)典型細(xì)胞培養(yǎng)物(AmericanTypeCellCultures)(ATCC#19115，馬納薩斯，弗吉尼亞州)。這些實(shí)驗(yàn)中使用的所有小鼠品系都是2-6月齡且為維持在生物安全水平2條件下的無(wú)特殊病原體動(dòng)物。BALB/c(査理士河實(shí)驗(yàn)室公司，威爾明頓，馬薩諸塞州)野生型雄性小鼠、純合RAGE—A129SvEvBrd雄性小鼠、雜合RAGE+/'129SvEvBrd雄性小鼠、及野生型129SvEvBrd雄性小鼠(在韋思(Wyeth)的住宅中飼養(yǎng))。在韋思研究中將RAGE基因剔除小鼠設(shè)計(jì)成基因靶向條件化基因剔除129SvEv-Brd小鼠，其中Cre重組酶切除外顯子2、3及4(LexiconGenetics公司，伍德蘭(TheWoodlands),TX)。所得缺失導(dǎo)致RAGE蛋白移碼截短且并不產(chǎn)生蛋白質(zhì)。RAGE對(duì)于小鼠的生存能力并不是必需的。RAGE裸小鼠不具有明顯表型且正常飼養(yǎng)。在CLP或單核細(xì)胞增生性利斯特菌攻擊后長(zhǎng)達(dá)七天對(duì)小鼠存活進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)CLP及利斯特菌病兩種實(shí)驗(yàn)后尸檢時(shí)自小鼠獲得的器官樣品實(shí)施定量微生物學(xué)。血液樣品是在犧牲時(shí)自存活動(dòng)物獲得，并采集血清并立即置于冰上以用于細(xì)胞因子測(cè)定。血清細(xì)胞因子是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定多重測(cè)定使用MesoScaleDelivery(蓋瑟斯堡，馬里蘭州)提供的定制板及方案來(lái)測(cè)量。所測(cè)定的細(xì)胞因子是MCP-l、IL-ip、TNFa、干擾素Y及IL-6。自肺、肝及脾中采集組織樣品。腹膜液是通過(guò)用5ml無(wú)菌鹽水灌洗腹膜腔并抽出流體獲得。將器官組織稱(chēng)重并隨后粉碎以產(chǎn)生存于TSB中的組織懸浮液。將樣本連續(xù)稀釋并在37t:下在TSB(對(duì)于革蘭陰性及革蘭陽(yáng)性細(xì)菌)及麥?zhǔn)檄傊?MacConkeyagar)(對(duì)于革蘭陰性細(xì)菌)上進(jìn)行好氧培養(yǎng)以獲得標(biāo)準(zhǔn)化的定量細(xì)菌計(jì)數(shù)/克器官重量或CFU/ml腹膜灌洗液。也由不知情每一動(dòng)物治療分配的病理學(xué)家對(duì)動(dòng)物組織(肺、回腸遠(yuǎn)端)進(jìn)行組織學(xué)分析并在自0(正常)到4(擴(kuò)散及大范圍組織壞死)分級(jí)的界定病理學(xué)分?jǐn)?shù)上進(jìn)行評(píng)分。自肺組織的濕干比計(jì)算作為肺水腫液測(cè)量的肺總水量。-統(tǒng)^學(xué)沒(méi)#-及^^分析。每一實(shí)驗(yàn)中的主要終點(diǎn)是存活率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是使用使研究者不知情動(dòng)物基因型或抗體治療(相對(duì)于血清對(duì)照)的數(shù)字代碼系統(tǒng)實(shí)施，直至完成研究。數(shù)字代碼以平均值(+ASEM)呈現(xiàn)。通過(guò)卡-梅氏(Kaplan-Meier)存活率圖及對(duì)數(shù)秩統(tǒng)計(jì)學(xué)(log-rankstatistic)來(lái)分析存活差異。使用非參數(shù)單程變異數(shù)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)科-瓦氏(non-parametriconewayANOVAstatisticKruskal-Wallis)(對(duì)于多個(gè)群組)或曼-惠特尼U檢驗(yàn)(Mann-WhitneyUtest)(對(duì)于兩個(gè)群組)來(lái)分析群組間的差異。使用測(cè)試后迪恩多項(xiàng)比較(Du皿'smultiplecomparisonspost-test)來(lái)證實(shí)當(dāng)分析比較涉及多個(gè)群組時(shí)的差異。雙尾P值小于0.05視為顯著。B.盲腸結(jié)扎及穿孔模型先前己詳細(xì)闡述CLP程序[伊藤?gòu)?Echtenacher)等人，1990，免疫學(xué)，145:3762-6]。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，經(jīng)腹膜內(nèi)注射200微升氯胺酮(貝德福德(Bedford)公司，貝德福德市(Bedford),俄亥俄州(OH))(9mg/ml)與賽拉嗪(xylazine)(菲尼克斯(Phoenix)，圣路易斯市，密蘇里州)(1mg/ml)組合使動(dòng)物麻醉。通過(guò)中線剖腹術(shù)由腹中取出約1cm長(zhǎng)度的盲腸。隨后將盲腸在回盲部遠(yuǎn)端處用5.0單絲結(jié)扎(大于90%的盲腸經(jīng)結(jié)扎)。用23號(hào)針頭將盲腸的腸系膜對(duì)側(cè)反復(fù)穿孔。隨后使少量腔內(nèi)容物通過(guò)兩個(gè)穿孔位點(diǎn)以確保開(kāi)放性。將盲腸返回到腹腔中，并分別用6.0單絲及外科縫合線縫合筋膜及皮膚切口。在手術(shù)后將P/。利多卡因(lidocaine)及桿菌肽(bacitracin)局部應(yīng)用到手術(shù)位點(diǎn)上。所有動(dòng)物都在手術(shù)后立即接受20mg/kg劑量的曲伐沙星(輝瑞(Pfizer)，紐約)(單次肌內(nèi)注射)，并經(jīng)皮下注射l.Oml生理鹽水實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)流體復(fù)蘇。隨后使測(cè)試動(dòng)物返回到其各自籠中并使用熱燈恢復(fù)體溫，直至其恢復(fù)正常姿勢(shì)及運(yùn)動(dòng)性。在CLP之前30-60分鐘或在CLP后以如下時(shí)間間隔6、12、24、或36小時(shí)將7.5mg/kg或15mg/kg劑量(或血清對(duì)照)的抗RAGEmAbXT-M4—次靜脈內(nèi)給與野生型小鼠。作為額外對(duì)照，使五只動(dòng)物經(jīng)歷假手術(shù)(經(jīng)盲腸活動(dòng)化及外置術(shù)實(shí)施剖腹手術(shù)，但并不結(jié)扎或穿孔)。結(jié)果A.CLP后純合RAGE基因剔除小鼠、RAGE雜合體及野生型動(dòng)物的存活。圖37顯示與野生型對(duì)照動(dòng)物(11=15)相比純合RAGE基因剔除小鼠(n-15)及RAGE雜合體(n-23)二者均具有顯著存活優(yōu)勢(shì)(P小于0.001)。RAGE雜合體以及純合RAGE基因剔除小鼠經(jīng)保護(hù)幾乎免于致命性多種微生物膿毒癥(RAGE一對(duì)RAGE+A，P=ns)。與預(yù)期一樣，所有假手術(shù)動(dòng)物(n-5)都存活。在CLP之前30分鐘給與另外15只野生型129SvEvBrd動(dòng)物群組抗RAGEmAb且與野生型、血清治療、對(duì)照動(dòng)物相比其具有與RAGE基因剔除小鼠類(lèi)似的存活優(yōu)勢(shì)。圖38顯示CLP后好氧革蘭陽(yáng)性及革蘭陰性腸道細(xì)菌有機(jī)體的組織菌落計(jì)數(shù)。所有三個(gè)群組的肝及脾組織及腹膜液的組織濃度類(lèi)似(P=ns)，但所有都顯著高于假手術(shù)動(dòng)物(P小于0.05)。與其它群組相比，純合RAGE基因剔除小鼠具有最少量肺水，盡管此沒(méi)有達(dá)到顯著性(濕干比:4.8士0.2-RAGE;對(duì)5.0±0.4-RAGE仏對(duì)5.3士0.3陽(yáng)wt;P=ns)。圖39顯示在CLP之前30-60分鐘給與對(duì)照血清的BALB/c動(dòng)物(r^l5)及給與抗RAGE抗體的動(dòng)物(7.5mg/kg群組[n45]或15mg/kg群組[n45])的存活率具有顯著差異。在15mg/kg抗RAGEmAb時(shí)達(dá)成最佳保護(hù)效果(相對(duì)7.5mg/kg群組P小于0.05;相對(duì)血清對(duì)照P小于0.001)且因此可在隨后CLP后延遲mAb治療的實(shí)驗(yàn)中使用此劑量。與對(duì)照動(dòng)物相比，給與抗RAGE抗體的動(dòng)物沒(méi)有顯著增加的器官細(xì)菌接種量，但兩個(gè)群組均具有比假治療對(duì)照動(dòng)物(11=5)顯著較多的菌落形成單位(CFU)/gm脾及肝組織。參見(jiàn)表1。在血清對(duì)照組中尸檢時(shí)肺組織及小腸粘膜的組織病理學(xué)顯著異常，而在抗RAGEmAb群組及假手術(shù)群組中病理學(xué)所見(jiàn)顯著減少(表13)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>圖40顯示在CLP后延長(zhǎng)到至多36小時(shí)以時(shí)間間隔延遲投與單次劑量15mg/kg抗RAGE抗體的效果。在CLP后長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的延遲單克隆抗體治療提供顯著的對(duì)抗致命性的保護(hù)(P小于O.Ol)。在CLP后長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)延遲投與mAb顯示有利存活趨勢(shì)，但與血清治療對(duì)照組相比差異不再顯著(P=0.12)。好氧腸道革蘭陰性及革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的組織濃度在治療群組間無(wú)差異(P=ns)。延遲投與抗RAGE抗體后發(fā)現(xiàn)存活益處具有重要的臨床應(yīng)用，因?yàn)樵谀摱拘曰颊叽碳な录笠话悴荒芰⒓唇o與諸如抗RAGE抗體治療等干預(yù)。這些數(shù)據(jù)支持使用抗RAGEmAb作為患有已確定嚴(yán)重膿毒癥的患者的補(bǔ)救療法。C.鼠科動(dòng)物利斯特菌病攻擊模型在這些實(shí)驗(yàn)中使用BALB/c野生型雄性小鼠、野生型雄性小鼠、雜合RAGE+A-129SvEvBrd雄性小鼠及純合RAGE;-129SvEvBrd雄性小鼠。單核細(xì)胞增生性利斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)接種物是自于37。C下在胰蛋白酶解酪蛋白大豆培養(yǎng)液(TSB)(BBL，Cockseyville，馬里蘭州)中生長(zhǎng)18小時(shí)的培養(yǎng)物制備。將細(xì)菌在10,000g下于4°C下離心分離15min并再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。通過(guò)分光光度測(cè)定調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度并通過(guò)在胰蛋白酶解酪蛋白大豆瓊脂板上用5。/。綿羊RBC(BBL，Cockseyville,馬里蘭州)實(shí)施定量稀釋板計(jì)數(shù)來(lái)檢査。經(jīng)靜脈內(nèi)投與介于103-106個(gè)菌落形成單位(CFU)單核細(xì)胞增生性利斯特菌范圍內(nèi)的連續(xù)稀釋物以測(cè)定野生型小鼠、純合RAGE—:基因剔除小鼠、RAGE+/—雜合體及在細(xì)菌攻擊前1小時(shí)靜脈內(nèi)給與15mg/kg抗RAGEmAb的野生型小鼠的1^5()值。在實(shí)施單核細(xì)胞增生性利斯特菌靜脈內(nèi)攻擊后7天內(nèi)跟蹤動(dòng)物并對(duì)存活者實(shí)施無(wú)痛致死術(shù)以用于組織分析及微生物學(xué)研究。對(duì)于詳細(xì)差別定量微生物學(xué)及細(xì)胞因子測(cè)定，在靜脈內(nèi)輸注抗RAGEmAb(15mg/kg)、抗TNFmAb(20mg/kg)或等體積1%自體鼠科動(dòng)物血清(作為對(duì)照)后1小時(shí)經(jīng)腹膜內(nèi)給與104個(gè)CFU的標(biāo)準(zhǔn)接種物。在此標(biāo)準(zhǔn)接種后48小時(shí)也對(duì)野生型、RAGE+z'及RAGE一(r^5/群組)進(jìn)行研究。在單核細(xì)胞增生性利斯特菌攻擊后48小時(shí)對(duì)動(dòng)物實(shí)施無(wú)痛致死術(shù)并通過(guò)切碎組織樣品并在血液瓊脂板上連續(xù)稀釋實(shí)施肝及脾組織的定量微生物學(xué)。結(jié)果野生型小鼠的1^>5()值為(10§|())3.31±0.2CFU，而雜合RAGE基因剔除小鼠的LDso值為5.98±0.39，且純合RAGE基因剔除小鼠的1^5()值為5.10±0.47。與野生型小鼠相比，對(duì)于RAGE雜合體及純合體，全身性利斯特菌病LDM)值的此多于兩個(gè)數(shù)量級(jí)的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P小于0.01)。單次劑量的XY-M4抗RAGE抗體也給野生型小鼠提供顯著對(duì)抗全身性利斯特菌病的保護(hù)，LDso值為4.69士0.55(相對(duì)野生型對(duì)照P小于0.05)?？筊AGEmAb提供的對(duì)抗利斯特菌病的保護(hù)程度與RAGE;動(dòng)物中觀察到的類(lèi)似，但不及RAGE+^動(dòng)物獲得的高(P小于0.05)。在野生型對(duì)照動(dòng)物、給與抗RAGE抗體的動(dòng)物、純合RAGE基因剔除動(dòng)物或RAGE雜合體的各群組(1!=10/群組)中實(shí)施1(^個(gè)CFU的標(biāo)準(zhǔn)全身性攻擊后肝及脾組織中分離的單核細(xì)胞增生性利斯特菌的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。參見(jiàn)圖41。然而，在投與抗TNF抗體后在給與相同單核細(xì)胞增生性利斯特菌接種物的動(dòng)物中器官細(xì)菌濃度具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著提高(P小于0.001)。圖42顯示治療后干擾素Y的血清含量。利斯特菌攻擊后的細(xì)胞因子測(cè)定顯示與對(duì)照BALB/c動(dòng)物相比純合RAGE基因剔除動(dòng)物中干擾素y的含量顯著較低。與BALB/c對(duì)照相比，給與抗TNFmAb的BALB/c動(dòng)物具有顯著較高的干擾素y含量，而給與抗RAGEmAb的動(dòng)物的干擾素Y含量與對(duì)照動(dòng)物的干擾素y含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-6觀察到類(lèi)似結(jié)果(抗TNFmAb群組-459±121pg/ml，相對(duì)對(duì)照組-38±14pg/ml;P小于0.01)及MCP-1(抗TNFmAb-1363±480pg/ml，相對(duì)對(duì)照組566±70pg/ml;P小于0.05)。與對(duì)照組相比，在RAGE缺失動(dòng)物中或在抗RAGE抗體治療群組中未發(fā)現(xiàn)IL-6或MCP-1含量的顯著差異。其它細(xì)胞因子測(cè)定顯示無(wú)顯著差異。全身性單核細(xì)胞增生性利斯特菌攻擊是用于小鼠先天性及獲得性免疫應(yīng)答研究的經(jīng)典模型。利斯特菌攻擊實(shí)驗(yàn)顯示，純合RAGE基因剔除動(dòng)物及雜合體比野生型動(dòng)物對(duì)此感染的容忍性顯著較好，此表明在非伴隨多種微生物膿毒癥的炎癥性狀態(tài)下可以見(jiàn)到RAGE的有害效應(yīng)。給與抗RAGEmAb的野生型動(dòng)物及RAGE基因剔除動(dòng)物以及野生型動(dòng)物似乎清除單核細(xì)胞增生性利斯特菌。此與給與抗TNF抗體的動(dòng)物相反，在給與抗TNF抗體的動(dòng)物中組織樣品中的單核細(xì)胞增生性利斯特菌菌落計(jì)數(shù)顯著增加。類(lèi)似地，在給與抗TNFmAb的動(dòng)物中利斯特菌攻擊后細(xì)胞因子含量增加，但所述含量與給與抗RAGEmAb的動(dòng)物中的對(duì)照含量類(lèi)似。這些發(fā)現(xiàn)表明RAGE在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在兩項(xiàng)單獨(dú)CLP研究中，與注射1.0%自體小鼠血清的小鼠(20%存活率)相比，單次劑量XT-M4(7.5mg/kg，在CLP后1-6小時(shí))在第7天時(shí)顯示顯著保護(hù)(65%存活率)。與接受經(jīng)稀釋BALB/c血清的小鼠約25%存活率相比，兩次劑量XT-M4(7mg/kg，在CLP后6及12小時(shí))在第7天時(shí)保護(hù)約85%的小鼠。與對(duì)照動(dòng)物相比，在CLP后24小時(shí)投與單次劑量抗RAGEXT-M4也具有保護(hù)性。上述實(shí)驗(yàn)表明，RAGE在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用且表明抗RAGE抗體可能為治療膿毒癥的有用治療劑。實(shí)例29在鼠科動(dòng)物CLP模型中進(jìn)一步評(píng)價(jià)抗RAGE抗體膿毒癥的鼠科動(dòng)物CLP模型導(dǎo)致多種微生物感染，伴有腹部膿腫及菌血癥，且重新產(chǎn)生在人類(lèi)疾病中觀察到的血液動(dòng)力學(xué)及代謝階段。在此模型中，通過(guò)中線剖腹術(shù)由腹中取出約l厘米長(zhǎng)度的盲腸，隨后結(jié)扎，并用23號(hào)針頭將盲腸的腸系膜對(duì)側(cè)穿孔。將盲腸返回到腹腔中，并縫合筋膜及皮膚切口。動(dòng)物接受一次曲伐沙星(20mg/kg)肌內(nèi)注射，并用1.0ml生理鹽水經(jīng)皮下實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)流體復(fù)蘇。在CLP后7天內(nèi)觀察動(dòng)物，在全天間隔檢査注意到死亡時(shí)作記錄。作為額外對(duì)照，使動(dòng)物經(jīng)歷由盲腸活動(dòng)化及外置術(shù)的剖腹手術(shù)組成的假手術(shù)，但并不結(jié)扎或穿孔。通過(guò)卡-梅氏存活率圖比較存活結(jié)果并用非參數(shù)變異數(shù)分析測(cè)試予以分析。在鼠科動(dòng)物CLP模型中評(píng)價(jià)RAGE抗體的預(yù)防性及治療性投藥功效及RAGE基因修飾小鼠。如圖43中所示，與親本野生型小鼠相比，純合RAGE裸小鼠(RAGE,顯示對(duì)抗盲腸結(jié)扎及穿孔致死效應(yīng)的顯著保護(hù)程度。到CLP后第8天為止，與野生型小鼠存活35%相比，80%的RAGE;小鼠在CLP后存活下來(lái)。RAGE^動(dòng)物與RAGE;動(dòng)物的表現(xiàn)類(lèi)似。自存活時(shí)間分析可以看出，RAGE—z—?jiǎng)游锉纫吧蛣?dòng)物在CLP后具有顯著存活優(yōu)勢(shì)。這些發(fā)現(xiàn)表明RAGE在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用。RAGE對(duì)于小鼠的生存能力并不是必需的。純合RAGE缺失小鼠無(wú)明顯表型。RAGE一、RAGE仏及RAGE+"位于129SvEvBrd背景菌株上。腹膜內(nèi)(IP)投與、放射標(biāo)記、XT-M4(4mg/kg)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析顯示T1/2為73h且Tm^為6h。XT-M4也在數(shù)種小鼠品系中展示有利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。經(jīng)靜脈內(nèi)投與5mg/kgXT-M4到雄性BALB/c小鼠中展示非常低的血清清除率且Tl/2為4~5天。經(jīng)腹膜內(nèi)投與5mg/kgXT-M到雄性db/db小鼠中也顯示類(lèi)似藥物代謝動(dòng)力學(xué)。在兩項(xiàng)單獨(dú)CLP研究中，與注射1.0%自體小鼠血清的小鼠(15%-20%存活率)相比，單次劑量XT-M4(7.5mg/kg，在CLP后0-6小時(shí))在第7天時(shí)顯示對(duì)抗CLP影響的顯著保護(hù)(大于50%存活率)。參見(jiàn)圖44及45。與對(duì)照組的15%存活率相比，兩次劑量XT-M4(7mg/kg，在CLP后6及12小時(shí)，最終劑量為15mg/kg)在第7天時(shí)保護(hù)約90%的小鼠(圖45)。在15mg/kgXT-M4情況下觀察到最佳保護(hù)。經(jīng)CLP小鼠的病理學(xué)分?jǐn)?shù)在抗RAGE抗體治療動(dòng)物中降低將到第8天為止存活的所有動(dòng)物殺死并經(jīng)歷尸檢以實(shí)施器官損傷的組織學(xué)證實(shí)及肺及小腸的病理學(xué)評(píng)分。應(yīng)用自0(正常)到4(擴(kuò)散及大范圍組織壞死)分級(jí)的界定病理學(xué)分?jǐn)?shù)。在血清對(duì)照組中尸檢時(shí)肺組織及小腸粘膜的組織病理學(xué)顯著異常，而在抗RAGEXT-M4(15mg/kg)治療群組及假手術(shù)群組中病理學(xué)所見(jiàn)顯著減少。參見(jiàn)圖46。組織病變減少與提高的存活率符合。好氧腸道革蘭陰性及革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的組織濃度在治療群組間無(wú)差異。對(duì)自CLP后存活的小鼠尸檢時(shí)獲得的器官樣品實(shí)施定量微生物學(xué)。組織樣品是自肺、肝及脾采集。腹膜液是通過(guò)灌洗腹膜腔獲得。定量細(xì)菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為每克器官重量或菌落形成單位(CFU)/ml腹膜灌洗液。與對(duì)照動(dòng)物相比，給與XT-M4抗體或RAGE—z—的動(dòng)物無(wú)顯著增加的器官細(xì)菌接種量(p:ns)，但兩個(gè)群組均具有比假治療對(duì)照動(dòng)物(11=5)顯著較多的菌落形成單位(CFU)/gm脾及肝組織(p小于0.05)?？筊AGE抗體在具有抗生素的鼠科動(dòng)物CLP模型中具有保護(hù)性在存在或不存在抗生素下靜脈內(nèi)投與30mg/kgXT-M4可保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗CLP的致死效應(yīng)。參見(jiàn)圖47。使小鼠在第Oh經(jīng)歷CLP。小鼠接受30mg/kgXT-M4或等體積1%自體小鼠血清(靜脈內(nèi)注射)。所有群組在0時(shí)間接受曲伐沙星劑量(20mg/kg肌內(nèi)注射(IM))。另外，在CLP后O、12、24、36及24h時(shí)投與曲伐沙星(20mg/kg肌內(nèi))(在24及48h時(shí)給與)或萬(wàn)古霉素(20mg/kglP)。單獨(dú)注射萬(wàn)古霉素導(dǎo)致存活率降低。參見(jiàn)圖48。投與萬(wàn)古霉素或曲伐沙星時(shí)未觀察到額外效應(yīng)?？筊AGE抗體在鼠科動(dòng)物CLP模型(具有延遲投與)中具有保護(hù)性在CLP后以各種時(shí)間間隔給予抗RAGEmAb延遲治療的動(dòng)物相對(duì)血清對(duì)照治療動(dòng)物盲腸結(jié)扎及穿孔后的卡-梅氏存活率分析(圖49)。在CLP后6、12或24小時(shí)以15mg/kg劑量經(jīng)靜脈內(nèi)延遲投與XT-M4到雄性BALB/c小鼠中也達(dá)成動(dòng)物的顯著存活(N=15，對(duì)照；n=14)。在CLP后長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的延遲單克隆抗體治療提供顯著對(duì)抗致死性的保護(hù)(p小于O.Ol)。在CLP后長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)的延遲投與顯示有利的存活趨勢(shì)(9/15動(dòng)物存活)，但與血清治療對(duì)照組相比差異不再顯著&=0.12)。好氧腸道革蘭陰性及革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的組織濃度在治療群組間無(wú)差異(P=ns)。實(shí)例30RAGE調(diào)節(jié)不會(huì)惡化全身性單核細(xì)胞增生性利斯特菌感染RAGE的抑制或缺失不會(huì)破壞微生物病原體的宿主機(jī)制或清除。單核細(xì)胞增生性利斯特菌攻擊是用于小鼠先天性及獲得性免疫應(yīng)答研究的熟知模型。野生型小鼠的LDso值為(log10)3.31±0.2CFU，而雜合RAGE+A的LDsJ直為5.98±0.39，且純合RAGE-A的LDM)值為5.10±0.47。與野生型小鼠相比，對(duì)于RAGE雜合體及純合體二者，全身性利斯特菌病LD5o值的此多于兩個(gè)數(shù)量級(jí)的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P小于O.Ol)。在投與抗體或?qū)φ昭搴?小時(shí)經(jīng)全身性投與單核細(xì)胞增生性利斯特菌U(^個(gè)菌落形成單位(CFU))對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊。給與抗RAGEXT-M4的野生型動(dòng)物及RAGEV-動(dòng)物以及野生型動(dòng)物似乎清除單核細(xì)胞增生性利斯特菌。與對(duì)照組相比，投與XT-M4抗體(15mg/kg)未改變肝臟及脾組織中或無(wú)RAGE動(dòng)物及RAGE雜合動(dòng)物中的單核細(xì)胞增生性利斯特菌含量(CFU/gm)。相反，投與抗TNF-a抗體(單克隆抗體TN3.1912，20mg/kg)使含量增加。見(jiàn)圖IOB。與預(yù)期一樣，抗TNF單克隆抗體顯著提高小鼠對(duì)利斯特菌病的感染性。在此模型中RAGE缺失或抑制不會(huì)惡化感染。實(shí)例31嵌合抗RAGE抗體功效的活體內(nèi)臨床前測(cè)定A.藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)對(duì)于嵌合XT-M4，評(píng)價(jià)經(jīng)靜脈內(nèi)投與單次劑量5mg/kg到雄性BALB/c小鼠(11=3)中后嵌合抗體嵌合XT-M4的血清濃度。用IgGELISA測(cè)量抗體隨時(shí)間的血清濃度。嵌合XT-M4的平均血清暴露量是(23，235ghr/mL)且半衰期約為1周(152小時(shí))。參見(jiàn)圖51。B.CLP后不同劑量嵌合XT-M4的保護(hù)效果評(píng)價(jià)嵌合抗體XT-M4及親本大鼠XT-M4抗體延長(zhǎng)CLP后雄性BALB/c小鼠存活的能力是在手術(shù)時(shí)靜脈內(nèi)投用3.5mg/kg、7.5mg/kg及30mg/kg后測(cè)量，并與血清對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行比較。存活率圖顯示于圖52中。與注射1.0%自體小鼠血清的小鼠(20%存活率)相比，嵌合XT-M4的單次靜脈內(nèi)劑量(7.5mg/kg，在CLP后0小時(shí))在CLP后第七天保護(hù)約90%的小鼠(p小于0.05)。投用3.5mg/kg及30mg/kg嵌合XT-M4在CLP后第七天也提供對(duì)小鼠的顯著保護(hù)(與對(duì)照相比約70。/。，p小于0.05)。C.在CLP后24小時(shí)給與嵌合XT-M4所提供保護(hù)的評(píng)價(jià)在具有延遲治療的動(dòng)物中在盲腸結(jié)扎及穿孔后通過(guò)卡-梅氏存活率圖來(lái)分析存活率差異(p小于O.Ol，兩個(gè)抗體治療群組與血清對(duì)照組相比)。當(dāng)在CLP后24小時(shí)以15mg/kg劑量靜脈內(nèi)投與時(shí)嵌合與大鼠抗RAGEXT-M4的可比性繪示于圖53中。當(dāng)在CLP后24小時(shí)以治療方式投與時(shí)，CLP模型中嵌合XT-M4所提供的保護(hù)程度與親本大鼠XT-M4抗體所提供的保護(hù)程度類(lèi)似。結(jié)果總結(jié)使RAGE不存在可保護(hù)小鼠對(duì)抗CLP誘導(dǎo)的膿毒癥的致死效應(yīng)。單次劑量XT-M4可保護(hù)小鼠對(duì)抗CLP的致死效應(yīng)。全身性利斯特菌攻擊后48小時(shí)在RAGE-/-或抗體治療小鼠中單核細(xì)胞增生性利斯特菌的組織濃度無(wú)顯著差異，此表明無(wú)總體免疫抑制。數(shù)據(jù)顯示，用人類(lèi)恒定區(qū)代替大鼠抗體XT-M4的恒定區(qū)不會(huì)影響抗體的結(jié)合活性。另外，以預(yù)防方式投用嵌合XT-M4在CLP模型中的功效顯示以7.5mg/kg劑量可保護(hù)90%的動(dòng)物。當(dāng)在CLP后24小時(shí)以治療方式投與時(shí)，嵌合XT-M4及親本XT-M4抗體在CLP模型中提供類(lèi)似保護(hù)程度。本文所提及的所有出版物及專(zhuān)利的全文都以引用方式并入本文中，如同將每一個(gè)別出版物或?qū)＠囟ǖ丶皞€(gè)別地指示以引用方式并入本文中一般。在矛盾情況下，則以本申請(qǐng)案(包括本文中的任何定義)為準(zhǔn)。盡管己論述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但上文說(shuō)明書(shū)是闡釋性而非限制性的。閱讀此說(shuō)明書(shū)后，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可明了本發(fā)明的許多變更。應(yīng)參照權(quán)利要求書(shū)以及其等效內(nèi)容的完整范圍及說(shuō)明書(shū)以及所述變更來(lái)確定本發(fā)明的完整范圍。權(quán)利要求1、一種抗體，其與RAGE特異性結(jié)合且(a)與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE；(b)與RAGE的表位結(jié)合，所述RAGE的表位與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體結(jié)合；(c)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；或(d)為如(a)、(b)或(c)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。2、如權(quán)利要求1所述的抗體，其所包含的輕鏈可變區(qū)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈可變區(qū)的至少兩個(gè)CDR。3、如權(quán)利要求2所述的抗體，其所包含的輕鏈可變區(qū)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR。4、如權(quán)利要求1所述的抗體，其所包含的重鏈可變區(qū)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的重鏈可變區(qū)的至少兩個(gè)CDR。5、如權(quán)利要求4所述的抗體，其所包含的重鏈可變區(qū)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR。6、如權(quán)利要求1所述的抗體，其包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR;及重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的重鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR。7、如權(quán)利要求1所述的抗體，其所包含的輕鏈及重鏈可變區(qū)分別包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR及重鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR。8、如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體與人類(lèi)RAGE結(jié)合，其解離常數(shù)(Kd)介于至少約1x10'7M至約1x10—1QM的范圍。9、如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體與人類(lèi)RAGE的V結(jié)構(gòu)域結(jié)合。10、如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述抗體與表達(dá)RAGE的細(xì)胞在活體外特異性結(jié)合。11、如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述抗體與表達(dá)RAGE的細(xì)胞在活體內(nèi)特異性結(jié)合。12、如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述抗體與RAGE結(jié)合并抑制RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)與所述RAGE的結(jié)合。13、一種抗體，其與RAGE特異性結(jié)合，且(a)包含選自由下列組成的群組的輕鏈可變區(qū)XT-H1—VL(SEQIDNO:19)、XT-H2一VL(SEQIDNO:22)、XT-H3一VL(SEQIDNO:25)、XT-H5一VL(SEQIDNO:23)、XT陽(yáng)H7—VL(SEQIDNO:27)、及XT-M4—VL(SEQIDNO:17)，或(b)包含具有與選自以下的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:19、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、及SEQIDNO:17;或(c)為如(a)或(b)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。14、一種抗體，其與RAGE特異性結(jié)合且(a)包含選自由下列組成的群組的重鏈可變區(qū)IXT-H1_VH(SEQIDN0:18)、XT-H2—VH(SEQIDNO:21)、XT-H3VH(SEQIDNO:24)、XT-H5—VH(SEQIDNO:20)、XT-H7—VH(SEQIDNO:26)、及XT-M4—VH(SEQIDNO:16)，或(b)包含具有與選自以下的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)SEQIDNO:18、SEQIDNO:21、SEQIDNO:24、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、及SEQIDNO:16;或(c)為如(a)或(b)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。15、如權(quán)利要求13所述的抗體，其(a)進(jìn)一步包含選自由下列組成的群組的重鏈可變區(qū)XT-HI—VH(SEQIDNO:18)、XT-H2—VH(SEQIDNO:21)、XT-H3—VH(SEQIDNO:24)、XT-H5—VH(SEQIDNO:20)、XT-H7—VH(SEQIDNO:26)、及XT-M4—VH(SEQIDNO:16)，或(b)進(jìn)一步包含具有與選自以下的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)SEQIDNO:18、SEQIDNO:21、SEQIDNO:24、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、及SEQIDNO:16;或(c)為如(a)或(b)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。16、如權(quán)利要求l所述的抗體，其所包含的輕鏈及重鏈可變區(qū)分別具有選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈及重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。17、如權(quán)利要求1所述的抗體，其選自由下列組成的群組嵌合抗體、人類(lèi)化抗體、人類(lèi)抗體、單鏈抗體、四聚體抗體、四價(jià)抗體、多特異性抗體、結(jié)構(gòu)域特異性抗體、結(jié)構(gòu)域缺失抗體、融合蛋白、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、單結(jié)構(gòu)域抗體、及dAb片段。18、如權(quán)利要求1所述的抗體，其在輕鏈或重鏈可變區(qū)中包含至少一個(gè)去除糖基化位點(diǎn)的氨基酸突變。19、一種嵌合抗體或其RAGE結(jié)合片段，其包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及重鏈可變區(qū)氨基酸序列，且進(jìn)一步包含源自人類(lèi)恒定區(qū)的恒定區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與所述XT-M4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:17)至少90%—致，所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列與所述XT-M4重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:16)至少90%一致。20、一種嵌合抗體或其RAGE結(jié)合片段，其包含具有XT-M4輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的輕鏈可變區(qū)，具有XT-M4重鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重鏈可變區(qū)，人類(lèi)k輕鏈恒定區(qū)及人類(lèi)IgGl重鏈恒定區(qū)。21、一種人類(lèi)化抗體或其RAGE結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)人類(lèi)化輕鏈可變區(qū)，所述人類(lèi)化輕鏈可變區(qū)與選自由下列組成的群組的人類(lèi)化輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列至少90%—致XT-H2—hVL—V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—hVL—V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2_hVL_V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2—hVL—V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—hVL一V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—hVL_V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4—hVL一V2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL_V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4—WL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4_hVL—V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4—hVL一V2.10(SEQIDNO:45)、XT匿M4一hVL—V2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4hVL_V2.12(SEQIDNO:47)、XT-M4—hVL—V2.13(SEQIDNO:48)、及XT-M4—hVL—V2.14(SEQIDNO:49)。22、一種人類(lèi)化抗體或其RAGE結(jié)合片段，其所包含的人類(lèi)化重鏈可變區(qū)與選自由下列組成的群組的人類(lèi)化重鏈可變區(qū)的氨基酸序列至少90%—致XT-H2—WH—V2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2—hVH—V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2—hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—hVH_V4.1(SEQIDNO:31)、XT德—hVH一Vl.O(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4hVH—V2.0(SEQIDNO:38)。23、如權(quán)利要求21所述的人類(lèi)化抗體或其片段，其進(jìn)一步包含人類(lèi)化重鏈可變區(qū)，所述人類(lèi)化重鏈可變區(qū)與選自由下列組成的群組的人類(lèi)化重鏈可變區(qū)的氨基酸序列至少90%—致XT-H2—hVHV2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2—hVH_V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2—hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—WH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4—hVHV1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4—hVH一V2.0(SEQIDNO:38)。24、一種與RAGE特異性結(jié)合的人類(lèi)化抗體或其RAGE結(jié)合片段，所述抗體是人類(lèi)化XT-M4抗體。25、一種與RAGE特異性結(jié)合的人類(lèi)化抗體或其RAGE結(jié)合片段，所述抗體是人類(lèi)化XT．H2抗體。26、一種抗體，其與RAGE特異性結(jié)合并阻斷RAGE體配偶體的結(jié)合，所述抗體所具有的CDR具有以下特征中的至少8個(gè)a．在ⅦCDRl中的氨基酸序列為Y．x．M(Y32；X33；M34)，其中x優(yōu)選為W或N；b．在VHCDR2中氨基酸序列為I．N—x．S(151；N52；X53及$54)，其中x為P或N；C．在ⅧCDR2中位置58上的氨基酸為蘇氨酸；d．在ⅦCDR2中位置60上的氨基酸為酪氨酸；e．在VHCDR3中位置103上的氨基酸為蘇氨酸；f在VHCDR3中存在一或多個(gè)酪氨酸殘基；g．在VLCDRl中位置24上為帶正電荷的殘基(Arg或Lys)；h．在VLCDRl中位置26上為親水性殘基(Thr或Ser)；i．在VLCDRl中位置25上為小殘基Ser或Ala；．i．在VLCDRl中位置33上為帶負(fù)電荷的殘基(Asp或Glu)；k．在VLCDRl中位置37上為芳香族殘基(Phe或Tyr或Trp)；I．在VLCDR2中位置57上為親水性殘基(Ser或Thr)；m．在VLCDR3的末端為P—X．T序列，其中X可為疏水性殘基Leu或Trp；其中氨基酸位置分別如SEQIDNO22及SEQIDNO16中的所述輕鏈及重鏈氨基酸序列中所示。27、一種經(jīng)分離核酸，其所包含的核苷酸序列編碼選自由下列組成的群組的抗RAGE抗體可變區(qū)XT-H1一呢fSEQIDNO19)、XT-H2一汜(SEQIDNO22)、XT—H3一汜(SEQIDNO25)，XT—H5一∥zfSEQIDNO23)、XT—H7一"L(SEQIDNO27)、XT—M4一∥z(SEQIDNO17)、XT-H1一VH(SEQIDNO18)、XT—H2一VH(SEQIDNO21)、XT—H3一VH(SEQIDNO24)、XT—H5一VH(SEQIDNO20)、XT—H7一VH(SEQIDNO26)、及XT-M4一VH(SEQIDNO16)。28、一種經(jīng)分離核酸，其在嚴(yán)格雜交條件下與一核酸特異性雜交，該核酸具有的核苷酸序列是編碼選自由下列組成的群組的抗RAGE抗體可變區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列XT-H1_、幾(SEQIDNO19)、XT—H2j，L(SEQIDNO22)、XT—H3一VL(SEQIDNO25)、XT-H5一汜fSEQIDNO23)1XT—H7一呢(SEQIDNO27)、XT—M4一汜(SEQIDNO17)、XT-H1一VH(SEQIDNO18)、XT—H2一VH(SEQIDNO21)、XT-H3二VH(SEQIDNO24)、XT-H5_VH(SEQIDNO20)、XT—H7一VH(SEQIDNO26)、及XT—M4一VH(SEQIDNO16)。29、一種經(jīng)分離核酸，其所包含的核苷酸序列編碼選自由下列組成的群組的抗RAGE抗體可變區(qū)XT-H2—hVL—V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—WL—V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2—hVL—V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2一hVL一V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—WL—V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—hVL—V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4—hVL—V2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL—V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4hVL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4—hVL一V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4—hVL—V2.10(SEQIDNO:45)、XT-M4—hVL_V2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4—hVL_V2.12(SEQIDNO:47)、XT-M4—WLV2.13(SEQIDNO:48)、及XT-M4—hVL—V2.14(SEQIDNO:49)、XT-H2—hVH—V2.0(SEQIDNO:28)、XT陽(yáng)H2一hVH—V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2_hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—hVH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4—hVH—V1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4—hVH一V2.0(SEQIDNO:38)。30、一種經(jīng)分離核酸，其在嚴(yán)格雜交條件下與一核酸特異性雜交，該核酸具有的核苷酸序列是編碼選自由下列組成的群組的抗RAGE抗體可變區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列XT-H2_hVL_V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—hVL_V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2hVL—V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2—hVL—V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—hVL—V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—WL—V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4hVLV2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL—V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4—hVL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4一hVL一V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4—hVL_V2.10(SEQIDNO:45)、XT-M4—hVL_V2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4—hVL—V2.12(SEQIDNO:47)、XT-M4—hVL—V2.13(SEQIDNO:48)、及XT-M4—hVL—V2.14(SEQIDNO:49)、XT-H2—WHV2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2—hVH—V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2—hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—hVH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4—hVH—V1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4一hVH一V2.0(SEQIDNO:38)。31、一種經(jīng)分離核酸，其包含(a)編碼狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列，所述RAGE具有選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、及SEQIDNO:13組成的群組的氨基酸序列；(b)與(a)的互補(bǔ)序列特異性雜交的核酸；或(c)當(dāng)詢(xún)問(wèn)覆蓋度(querycoverage)為100%時(shí)與編碼狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列95%—致的核苷酸序列，所述編碼狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列選自由SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、及SEQIDNO:12組成的群組。32、一種治療患有RAGE相關(guān)疾病或病癥的個(gè)體的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的抗體，所述抗體(a)與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE;(b)與RAGE的表位結(jié)合，所述RAGE的表位與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體結(jié)合；(c)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);或(d)為如(a)、(b)或(c)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。33、如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述RAGE相關(guān)疾病或病癥選自由下列組成的群組膿毒癥、膿毒性休克、利斯特菌病、炎癥性疾病、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病(Crohn'sdisease)、慢性急性炎癥性疾病、心臟血管疾病、勃起功能障礙、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病變、及神經(jīng)病變。34、如權(quán)利要求32所述的方法，其包含投與所述抗體或其RAGE結(jié)合片段與一或多種可用于治療所述待要治療的RAGE相關(guān)疾病或病癥的藥劑。35、如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述藥劑選自由下列組成的群組消炎劑、抗氧化劑、(3-阻斷劑、抗血小板劑、ACE抑制劑、降脂劑、抗血管生成劑、及化學(xué)治療劑。36、一種治療人類(lèi)個(gè)體膿毒癥或膿毒性休克的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的嵌合或人類(lèi)化抗RAGE抗體，所述嵌合或人類(lèi)化抗RAGE抗體包含源自人類(lèi)恒定區(qū)的恒定區(qū)，且(a)與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE;(b)與RAGE的表位結(jié)合，所述RAGE的表位與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體結(jié)合；(c)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);或(d)為如(a)、(b)或(c)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。37、一種治療人類(lèi)個(gè)體膿毒癥或膿毒性休克的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的嵌合抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段，所述嵌合抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段包含具有XT-M4輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的輕鏈可變區(qū)，具有XT-M4重鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重鏈可變區(qū)，人類(lèi)k輕鏈恒定區(qū)及人類(lèi)IgGl重鏈恒定區(qū)。38、一種治療人類(lèi)個(gè)體全身性利斯特菌病的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的嵌合或人類(lèi)化抗RAGE抗體，所述嵌合或人類(lèi)化抗RAGE抗體包含源自人類(lèi)恒定區(qū)的恒定區(qū)，且(a)與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE;(b)與RAGE的表位結(jié)合，所述RAGE的表位與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體結(jié)合；(c)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);或(d)為如(a)、(b)或(c)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。39、一種治療人類(lèi)個(gè)體利斯特菌病的方法，其包含向所述個(gè)體投與治療有效量的嵌合抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段，所述嵌合抗RAGE抗體或其RAGE結(jié)合片段包含具有XT-M4輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的輕鏈可變區(qū)，具有XT-M4重鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重鏈可變區(qū)，人類(lèi)k輕鏈恒定區(qū)及人類(lèi)IgGl重鏈恒定區(qū)。40、一種抑制哺乳動(dòng)物個(gè)體中RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)與RAGE結(jié)合的方法，其向所述個(gè)體投與抑制量的嵌合或人類(lèi)化抗RAGE抗體，所述嵌合或人類(lèi)化抗RAGE抗體包含源自人類(lèi)恒定區(qū)的恒定區(qū)，且(a)與選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAGE;(b)與RAGE的表位結(jié)合，所述RAGE的表位與選自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體結(jié)合；(c)包含選自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4組成的群組的抗體的輕鏈或重鏈的一或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);或(d)為如(a)、(b)或(c)所述的抗體的RAGE結(jié)合片段。41、如權(quán)利要求l所述的抗體，所述抗體與可溶性RAGE(sRAGE)特異性結(jié)合。42、如權(quán)利要求41所述的抗體，所述抗體與選自由鼠科動(dòng)物sRAGE及人類(lèi)sRAGE組成的群組的sRAGE特異性結(jié)合。43、如權(quán)利要求42所述的抗體，所述抗體與sRAGE特異性結(jié)合，其解離常數(shù)(Kd)介于約1x10'9M至約5x10—9M的范圍。全文摘要本發(fā)明揭示與晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)特異性結(jié)合的抗體及其RAGE結(jié)合片段。本發(fā)明也揭示包含所述抗RAGE抗體及其RAGE結(jié)合抗體片段的醫(yī)藥組合物及其用于治療RAGE相關(guān)疾病的用途。文檔編號(hào)A61P31/00GK101405300SQ200780009746公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2007年3月21日優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日發(fā)明者利烏米拉·奇斯蒂亞科夫,妮科爾·皮什-尼古拉斯,穎孫,安杰拉·維多姆,布賴(lài)恩·克蘭西,戴比·皮特曼,珍妮特·保爾森,科丹加蒂·斯里庫(kù)爾瑪,譚向陽(yáng)申請(qǐng)人:惠氏公司