專利名稱：：Reg1抗凝系統(tǒng)的給藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：提供一種給藥適體和解毒劑系統(tǒng)來控制宿主中的血凝固的改進(jìn)方法，其基于該系統(tǒng)組分的體重調(diào)節(jié)或體重指數(shù)調(diào)節(jié)的劑量給藥。
背景技術(shù)：
：緊急醫(yī)護(hù)抗凝作用鑒于可注射的抗凝血?jiǎng)┰诩毙匀毖孕呐K病病理學(xué)中對(duì)血栓癥的中心作用，可注射抗凝血?jiǎng)┮呀?jīng)成為具有急性冠脈綜合癥例如不穩(wěn)定的心絞痛和心力幾纟更死的病人以及進(jìn)4亍冠狀血管再生術(shù)的那些病人的藥物治療的基礎(chǔ)(Harrington等人，2004;Popma等人，2004)。當(dāng)前可采用的抗凝血?jiǎng)┌ㄆ胀ǜ嗡?UFH)、低分子量肝素(LMWH)、以及直接的凝血酶抑制劑(DTI)例如重組的水蛭素、比伐蘆定和阿加曲班。用于抗;疑血?jiǎng)┯猛竞瓦B續(xù)的抗血栓形成藥物開發(fā)這兩者的本范例是要在意味著降低局部缺血事件風(fēng)險(xiǎn)的功效和意味著將出血風(fēng)險(xiǎn)減至最小的安全性之間建立一種平衡(Hamngton等人，2004)。每種可利用的藥劑都帶有相對(duì)于安慰劑相比出血風(fēng)險(xiǎn)增加。與抗凝血?jiǎng)┖涂寡ㄐ纬伤幬锵嚓P(guān)的主要不利事件是出血，其可引起終生殘疾和死亡(Ebbesen等人2001;Levme等人，2004)。通常，當(dāng)藥物可降低急性冠脈綜合癥或冠狀血管再生術(shù)的局部出血并發(fā)癥時(shí)，心血管臨床醫(yī)生一直愿意去賣掉出血的風(fēng)險(xiǎn)。但是，新近的數(shù)據(jù)提示出血事件，特別是需要輸血的那些出血事件對(duì)ACS病人治療的結(jié)果和花費(fèi)有重要影響。進(jìn)行擇期冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)手術(shù)的患者輸血率為30-60%,并且在這些患者中輸血與短期、中期、長期死亡率增加相關(guān)聯(lián)(Bracey等人，1999;Engoren等人，2002;Hebert等人，1999)。出血也是與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)相關(guān)的最頻繁發(fā)生和費(fèi)用大的并發(fā)癥，5-10%的患者進(jìn)行輸血，費(fèi)用增加SS0004U,000(Moscucci，2002)。另外，進(jìn)行ACS治療的患者大出血的頻率也是高的，范圍從5%至10%(不包括進(jìn)行CABG的患者)，出血和輸血獨(dú)立地與短期死亡率的顯著增加相關(guān)聯(lián)(Moscucci等人，2003;Rao等人，2004)。因此，盡管有新抗血栓藥被持續(xù)地開發(fā)出來，但對(duì)于更安全的抗凝血?jiǎng)┤源嬖诰薮蟮呐R床需要。達(dá)到藥物活性的迅速逆轉(zhuǎn)可被動(dòng)地通過將藥物配制成半衰期短的可灌注的藥劑，采用灌注終止作為逆轉(zhuǎn)方式來達(dá)到；或主動(dòng)地通過給藥中和該藥物的活性的第二種藥劑_解毒劑來達(dá)到。對(duì)于患有急性缺血性心臟病的住院治療的患者，理想的抗凝血?jiǎng)┦峭ㄟ^靜脈或皮下注射可輸送的、立即生效的、易于給藥，以致不需要頻繁地監(jiān)測并且是立即和可預(yù)測地逆轉(zhuǎn)。解決該問題的現(xiàn)有方法UFH是當(dāng)前被認(rèn)可使用的唯一解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)?。但是UFH具有重要的局限性。首先，肝素具有復(fù)雜的藥物動(dòng)力學(xué)使其用途的可預(yù)測性受到挑戰(zhàn)(Granger等人，1996)。其次，其解毒劑魚精蛋白的劑量可預(yù)測性正在受到挑戰(zhàn)，并且其使用伴有嚴(yán)重的副作用(CarrandSilverman,1999;Welsby等人，2005)。最后，肝素可引起血小板減少癥(HIT)和伴有血栓形成的血小板減少癥(HITT)(Warkentin,2005;WarkentinandGreinacher,2004》盡管有這些限制，肝素仍然是最通常用于住院就醫(yī)病人的抗凝血?jiǎng)?，主要因?yàn)樗?可逆的"。更新一代的抗湊是血?jiǎng)?，例如LMWHs對(duì)UFH給藥劑量的可預(yù)測性已經(jīng)有改進(jìn)，并且不需要基于實(shí)^^室的監(jiān)測作為其日常使用的一部分。相對(duì)于UFH而言，采用LMWHs不太頻繁地觀察到HIT和HITT，^f旦是^也們并沒有消除這種風(fēng)險(xiǎn)。市售的DTIs、來匹盧定和阿加曲班這三種中的兩種浮皮特別批準(zhǔn)用于已經(jīng)出現(xiàn)或具有HIT病史的患者。比伐蘆定被批準(zhǔn)在PCI期間用作抗凝血?jiǎng)?，并因此為HIT患者提供了對(duì)于UFH的有吸引力的可替代選擇。然而，沒有直接和清晰的解毒劑來逆轉(zhuǎn)LMWHs和DTIs的抗凝血?jiǎng)┳饔?，DTIs在進(jìn)行外科手術(shù)或經(jīng)皮冠狀血管再生術(shù)的病人中使用呈現(xiàn)出特別的風(fēng)險(xiǎn)(Jones等人，2002)。在用LMWH's或DTI's治療的病人中出血是通過給藥包括凝固因子在內(nèi)的血制品來控制的。血凝固和FIX迄今為止，血凝固的細(xì)胞模型(圖1)為生理學(xué)血凝固如何在體內(nèi)發(fā)生提供了最清晰的解釋(Hoffman等人，1995;Kjalke等人，1998;，Monroe等人，1996)。根據(jù)這種模型，促凝血反應(yīng)在引發(fā)、擴(kuò)增和繁殖三個(gè)不同階段中發(fā)生。血凝固的引發(fā)發(fā)生在帶有組織因子的細(xì)胞例如活性單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之上。與組織因子形成復(fù)合物的凝血因子VIIa催化凝血因子IX(FIX)和X(FX)的活化，F(xiàn)IX和FX又依次由凝血酶原產(chǎn)生了少量凝血酶。在擴(kuò)增期(也稱為引導(dǎo)期)中，在引發(fā)階段中產(chǎn)生的少量凝血酶使凝血因子V、VIII和XI活化并且也使血小板活化，血小板提供了于其上發(fā)生進(jìn)一步的促凝血反應(yīng)的表面。在體內(nèi)，在擴(kuò)增期期間產(chǎn)生的少量凝血酶不足以使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成血纖蛋白，這是由于存在被稱為絲氨酸蛋白酶抑制劑的內(nèi)源性凝血酶抑制劑，例如抗凝血酶III、a-2-巨球蛋白和肝素輔因子II。促凝血反應(yīng)的最后階段繁殖僅發(fā)生在活化的血小板表面上。在繁殖期間，由于FIXa催化的對(duì)FIX的活化作用產(chǎn)生了大量的FIXa,FXIa與其所需的輔因子FVIIIa形成復(fù)合物，后者使FX活化。隨后，F(xiàn)Xa與其所需的輔因子形成復(fù)合物。FXa-FVa復(fù)合物使凝血酶原活化，這導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生的"爆發(fā)"以及血纖維蛋白沉積，最終結(jié)果是形成了穩(wěn)定的血凝塊。根據(jù)這種模型，F(xiàn)IXa在血凝固中起兩種作用。在引發(fā)階段，F(xiàn)IXa在通過使FX活化成Fxa而產(chǎn)生少量凝血酶以及后來的凝血酶原活化中起重要作用。然而，就FX被組織因子FVIIa催化轉(zhuǎn)化成FXa而言，F(xiàn)IXa的這種作用至少是部分多佘的。在繁殖階段，F(xiàn)IXa的作用更關(guān)鍵，其中FVIIIa/FIXa酶復(fù)合物用作在活化血小板表面上產(chǎn)生Fxa的唯一催化劑。因此可預(yù)期或者是由于FIX遺傳缺陷(即血友病B)，或者是由于FIX/IXa的藥理學(xué)抑制而致的FIXa活性降低對(duì)于血凝固具有幾種作用第一，F(xiàn)IXa活性的抑制或損失將部分地抑制血凝固的引發(fā)。第二，F(xiàn)IXa活性的抑制或損失將對(duì)血凝固的繁殖階段產(chǎn)生極深的影響，導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)量顯著降低或消除。最后，通過減小血小板和上游凝血因子例如因子V、7VIII和XI活化作用，在繁殖階段期間限制凝血酶產(chǎn)生將至少部分:^也減弱血凝固的反饋放大。先前對(duì)FIXa抑制劑的動(dòng)物和人的評(píng)估FIX活性的抑制劑，例如活性部位滅活的因子Ixa(FIXai)或抗FIX的單克隆抗體(例如抗體BC2)在多個(gè)動(dòng)物模型包括動(dòng)脈血栓形成和中風(fēng)的各種動(dòng)物模型中已經(jīng)表現(xiàn)出有效的抗凝血和抗血栓形成活性(Benedict等人，1991;Choudhri等人，1999;Feuerstem等人，1999;Spanier等人，1998a;Spanier等人，1997;Spanier等人，1998b;Toomey等人，2000)。通常，這些研究已經(jīng)表明在動(dòng)物中FIXa抑制劑的抗血栓形成活性與出血風(fēng)險(xiǎn)的比率比普通肝素高。然而，在這些研究中，在稍高于有效劑量的劑量下，用這些藥劑治療的動(dòng)物所顯示的出血曲線與肝素沒有差別。這種控制良好的動(dòng)物研究方面的經(jīng)驗(yàn)暗示在臨床應(yīng)用中，控制FIXa抑制劑活性的能力將增強(qiáng)其安全性并促進(jìn)其醫(yī)療用途。另外已經(jīng)表明，在需要抗凝血?jiǎng)┲委煹脑S多動(dòng)物外科模型(包括合成的貼的血管修補(bǔ)的兔模型以及帶有心肺旁路CABG的犬和非人靈長類動(dòng)物模型)中作為肝素替代物，F(xiàn)IXa是安全和有效的(Spamer等人，1998a;Spamer等人,1997;Spanier等人，1998b)。根據(jù)陪護(hù)，F(xiàn)IXai也已經(jīng)由哥倫比亞內(nèi)外科醫(yī)師學(xué)院的內(nèi)科醫(yī)生成功地用于需要心肺轉(zhuǎn)流并且其它體外回路硬化如體外膜氧化(Spamer等人，1998a)的幾種病危患者。因此，F(xiàn)IXa是用于冠狀血管再生術(shù)(CABG和PCI兩者)中抗凝血?jiǎng)┲委熞约凹毙怨诿}綜合癥患者的血栓癥的治療和預(yù)防的有效標(biāo)靶。適體藥物開發(fā)，藥物-解毒劑對(duì)及REGl一種提供可控的抗凝作用的方法是利用在相對(duì)較低劑量下可達(dá)到臨床適當(dāng)活性的、具有12小時(shí)及更長的中長期作用延續(xù)時(shí)間的抗凝血?jiǎng)┡c能夠特異性地結(jié)合到該第一抗凝血?jiǎng)┎⒅泻驮摰谝豢鼓獎(jiǎng)┑牡诙巹┑慕M合。這種"藥物-解毒劑"組合能夠確保該藥物抗凝活性的可預(yù)測的和安全的中和和逆轉(zhuǎn)(Ruscom等人，2004,NatBiotechnol.22(ll):1423-8;Rusconi等人，2002,Nature419(6902):90-4)。申請(qǐng)人已經(jīng)將該藥物-解毒劑技術(shù)應(yīng)用到REG1、基于適體的抗凝系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)中(見圖2)。適體是以高親和力和特異性結(jié)合到標(biāo)靶蛋白質(zhì)的單鏈核酸(Nimjee等人，2005),4艮像單克隆抗體。然而，為了使適體結(jié)合到標(biāo)輩巴蛋白質(zhì)上并抑制其，該適體必須采取特異的球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)。8形成這種球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)需要適體采取適當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)(即正確的石咸基配對(duì)和非堿基配對(duì)區(qū))。如圖2中的卡通形式所示，將與部分適體互補(bǔ)的寡核苷酸引入可改變適體的結(jié)構(gòu)以使其能不再結(jié)合到其標(biāo)輩巴蛋白質(zhì)，并因此有效地逆轉(zhuǎn)或中和該適體藥物的藥理學(xué)活性(Rusconi等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8;Rusconi等人，2002,Nature419(6902):90陽4)。RB006(P-L隱guggaCUaUaCCgCgUaaUgCuGcCUccacT,其中P=mPEG2-NHS酉旨MW40kDa;L=C6NH2接頭；G=2-OHG;g=2'-0陽MeG;C=2-FC;c=2'-0-MeC;U=2-FU;u=2,-O-MeU;a=2-O-MeA;以及T=轉(zhuǎn)化的2'-HT(SEQIDNOl);見圖2)，REGl的藥物成分是以高親和力和特異性與凝血因子IXa結(jié)合的直接FIXa抑制劑(Ruscom等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8;Rusconi等人，2002,Nature419(6卯2):90-4;也可參見杜克大學(xué)的WO05/106042)。RB006引出了通過阻斷FVIIIa/FIXa催化的FX向FXa的轉(zhuǎn)化而致的抗凝血步支果。RB006是修飾的RNA適體，31個(gè)核苷酸長，由于存在含2'-氟基和2'-0-甲基糖殘基，它是中度穩(wěn)定化的抗內(nèi)切核酸酶降解的，并且通過3'反向脫氧胸苷帽，它是穩(wěn)定化的抗外切核酸酶降解的。該適體的核酸部分被軛合到40千道爾頓的聚乙二醇(PEG)載體上以增強(qiáng)其血液半衰期。在靜脈內(nèi)團(tuán)注之后，在小鼠中RB006的半衰期約為8小時(shí)，而在猴子中約為12小時(shí)。這樣，可以以團(tuán)注，而不是以靜脈灌注的形式來給予RB006,以在幾個(gè)小時(shí)里保持抗凝血狀態(tài)。如圖2中所示，RB007(cgcgguauaguccac,其中g(shù)=2'-0-MeG;c=2'-0-MeC;u=2'-0-MeU;以及a=2'-0-MeA(SEQIDNO2);見圖2)，REG1的解毒劑成分是與RB006的部分互補(bǔ)的寡核苷酸，其可有效地結(jié)合到RB006并由此中和其抗FIXa活性。RB007是2'-0-甲基RNA寡核苷酸，15個(gè)核苷酸長，其與REG1的藥物成分部分互補(bǔ)。2'-0-甲基々務(wù)飾賦予所述的解毒劑以適度的抗核酸酶性，這提供了充分的體內(nèi)穩(wěn)定性以使其能夠?qū)で蟛⒔Y(jié)合RB006,但不支持延長的體內(nèi)持續(xù)性。REG1的非臨床研發(fā)申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)展了藥理學(xué)數(shù)據(jù)，證明RB006適體對(duì)FIXa的特異性以及抗體RB007對(duì)適體的親和力。非臨床藥理學(xué)研究的結(jié)果可以被總結(jié)如下REG1的藥物成分(RB006和/或相關(guān)的前體化合物)可(l)在體外有效地抑制凝血因子X的活化；(2)延長人或其它動(dòng)物物種中的體外血漿的血漿凝固時(shí)間；(3)在靜脈內(nèi)團(tuán)注給藥之后，全身性地抗動(dòng)物凝血；(4)在動(dòng)物動(dòng)脈損傷血栓形成;^莫型中防止血栓形成；(5)在動(dòng)物心肺分流術(shù)才莫型中取代肝素；以及(6)^皮REG1解毒劑成分中和之后在30分鐘內(nèi)有效地在動(dòng)物中再給藥。迄今為止的非臨床藥理學(xué)研究已經(jīng)顯示REG1的抗體成分(RB007和/或REG1藥物成分前體的特異性抗體)能夠(l)在體外迅速持久地中和人或其它動(dòng)物種類的血漿中REG1藥物成分(RB006)的抗凝血活性；(2)在靜脈內(nèi)團(tuán)注給藥之后，在采用該藥劑進(jìn)行全身性抗凝血處理的動(dòng)物中，在體內(nèi)迅速而持久地中和體內(nèi)REG1藥物成分的抗凝血活性；(3)防止由超治療劑量的REG1藥物成分與手術(shù)創(chuàng)傷的結(jié)合引起的出血；以及(4)在心肺分流術(shù)之后在動(dòng)物中中和REG1藥物成分的抗凝血活性。此外，在靜脈內(nèi)團(tuán)注給藥之后，在體外在人血漿中或在動(dòng)物中該抗體沒有表現(xiàn)出任何抗凝血或其它藥理學(xué)活性。仍然需要提供一種允許可預(yù)測的并且可重復(fù)的適體-解毒劑系統(tǒng)效果的可靠的給藥方法。發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在適體，特別是適體抗凝血?jiǎng)┑捏w重調(diào)節(jié)的劑量以及更重要地，體重指數(shù)調(diào)節(jié)的劑量及其藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)兩者之間有清晰的關(guān)系。此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)適體的解毒劑的劑量僅僅需要根據(jù)提供給宿主的適體數(shù)量而不用根據(jù)任何其它標(biāo)準(zhǔn)而被調(diào)節(jié)以抑制適體的活性達(dá)到所需的水平。這種新認(rèn)識(shí)為特定的給藥方式提供了支持，該特定的給藥方式允許針對(duì)臨床用途使用可預(yù)測并且可重復(fù)的給藥方案。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的適體抗凝血系統(tǒng)的給藥方法，包括l)測量宿主的體重指數(shù)(BMI);2)表征所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)；以及3)根據(jù)每個(gè)BMI的劑量與藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的比較，將一定劑量的適體抗凝血?jiǎng)┙o藥到宿主以達(dá)到所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，隨后將該適體的解毒劑給藥到宿主，其中對(duì)于所需的適體活性減小量，根據(jù)一種比率和先前給予的調(diào)節(jié)的適體劑量來提供解毒劑劑量。在某些情形中，根據(jù)給藥適體后的時(shí)間來調(diào)節(jié)解毒劑劑量。在某些情形中，如果已經(jīng)在多于24小時(shí)之前給藥適體，則將解毒劑與適體的比例減半。在某些實(shí)施方式中，需要最大水平的抗凝血效果。在這些情形中，可以以4mg/BMI或更大的水平提供適體。在其它情形中，需要約75%的最大凝血水平。在那些情形中，供給宿主的劑量約為0.75.0-1.5mg/BMI。在其它情形中，需要約50%的最大凝血水平，在這些情形中，供給的劑量約為0.25-0.5mg/BMI。在某些一般性的實(shí)施方式中，采用的抗凝血?jiǎng)┑膭┝繛?.1-10mg/BMI。在另一實(shí)施方式中，所述劑量為0.2-8mg/BMI,或0.2-6mg/BMI,0.2-5mg/BMI，0.2-4mg/BMI，0.2-3mg/BMI,0.2-2mg/BMI或0.2-1mg/BMI。在某些實(shí)施方式中，抗凝血?jiǎng)┑膭┝繛榧slmg/BMI,或約2mg/BMI,或約5mg/BMI，或約.75mg/BMI,或約1mg/BMI,或約2mg/BMI,或約3mg/BMI,或約4mg/BMI，或約5mg/BMI,或約6mg/BMI,或約7mg/BMI,或約8mg/BMI,或約9mg/BMI，或約10mg/BMI。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的適體抗凝血系統(tǒng)的給藥方法，該方法包括l)測量宿主的體重；2)表征所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)；以及3)根據(jù)每千克宿主體重的劑量與藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的比較，將一定劑量的適體抗凝血?jiǎng)┙o藥到宿主以達(dá)到所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，隨后將該適體的解毒劑給藥到宿主，其中對(duì)于所需的適體活性減小量，根據(jù)一種比率和先前給予調(diào)節(jié)的適體劑量來提供解毒劑劑量。在某些情形中，根據(jù)給藥適體后的時(shí)間來調(diào)節(jié)該解毒劑劑量。在某些情形中，如果已經(jīng)在多于24小時(shí)之前給藥適體，則將解毒劑與適體的比例力口一4咅。在某些實(shí)施方式中，需要最高水平的抗凝血效果。在這些情形中，可提供1.4mg/kg或更大的適體量。在其它情形中，需要約75%的最大凝血水平。在那些情形中，供給宿主的劑量約為0.5-0.75mg/kg。在其它情形中，需要約50%的最大凝血水平，在這些情形中，提供給約為0.2-.0.4mg/kg的劑量。在某些一般性的實(shí)施方式中，采用的劑量為0.1-2mg/kg,0.1-1.8mg/kg,0.1-1,6mg/kg,0.1-1.5mg/kg,0.1-1.4mg/kg,0.1-1.3mg/kg,0.1-1.2mg/kg，0.1-1.1mg/kg，0.1-1.0mg/kg,0.1-0.9mg/kg,0.1-0.8mg/kg,0.1-0.7mg/kg,0.1-0.6mg/kg,0.1-0.5mg/kg,0.1-0.4mg/kg,0.1—0.3mg/kg,或者O.l-0.2mg/kg.。在其它實(shí)施方式中，劑量為1-20mg/kg,1-18mg/kg,1-15mg/kg,2-15mg/kg,3-15mg/kg,4—15mg/kg,5-20mg/kg,5—15mg/kg,或者1-10mg/kg，或者5-10mg/kg，或?yàn)榧slmg/kg,約2mg/kg,約3mg/kg,約4mg/kg,約5mg/kg，約6mg/kg,約7mg/kg,約8mg/kg,約9mg/kg,或約為10mg/kg.。在原則性的實(shí)施方式中，適體抗凝血系統(tǒng)是REG1系統(tǒng)，其包括適體抗凝血?jiǎng)┖凸押塑账峤舛緞?。在某些非限制性?shí)施方式中，適體是RB006(SEQIDNOl)并且解毒劑是RB007(SEQIDNO2)。在一種實(shí)施方式中，測量藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，例如aPTT(血漿或全血)或活化的凝固時(shí)間(ACT),并且可記錄為絕對(duì)值、效果百分比、變化百分比、時(shí)間加權(quán)的平均值或在定義的時(shí)間l殳上的曲線下的面積。對(duì)于特定的應(yīng)用，藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)水平可以處于任何所需的水平。例如，在某些情況下，當(dāng)患者處于低的發(fā)生血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)中時(shí)，可能需要低水平的反應(yīng)。在特定的情形中，可能不需要采用飽和量的抗凝血?jiǎng)?，特別是FIXa的適體如RB006來使凝血因子抑制以及特別是FIX或FIXa抑制最大化。在其它情形中，當(dāng)患者處于高的發(fā)生血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)中或血栓形成正在發(fā)生時(shí)，可能需要高水平的反應(yīng)。在這種情形中，采用飽和量的抗凝血?jiǎng)?，特別是FIXa的適體如RB006來使凝血因子抑制以及特別是FIX或FIXa抑制最大化可能是理想的。在一種實(shí)施方式中，以靜脈內(nèi)團(tuán)輸來提供抗凝血?jiǎng)┻m體如RB006。在另一實(shí)施方式中，通過皮下注射來提供抗凝血?jiǎng)┻m體。在另一實(shí)施方式中，在靜脈內(nèi)或皮下團(tuán)輸適體之后，注射解毒劑。在此所述的程序允許分步遞送抗凝血?jiǎng)┖徒舛緞﹥烧咭栽蔵午將兩種化合物中任一種或兩者的滴度達(dá)到所需的目標(biāo)抑制和逆轉(zhuǎn)的水平。根據(jù)所需的該適體抑制水平來調(diào)節(jié)解毒劑與適體的比率。發(fā)現(xiàn)解毒劑劑量僅需要與適體的劑量相關(guān)，并且不必根據(jù)與宿主相關(guān)的因素另外調(diào)節(jié)。在一種實(shí)施方式中，適體與解毒劑的比率是l丄在其它實(shí)施方式中，適體與解毒劑的比率大于1:1，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或更大。也可根據(jù)解毒劑與適體的比率來計(jì)算這些比率，例如其可小于約1:1如0.9:1或約0.9:1、0.8:1或約0.8:1、0.7:1或約0.7:1、0.6:1或約0.6:1、0.5:1或約0.5:1、0.45:1或約0.45:1、0.4:1或12約0.4:1、0.35:1或約0.35:1、0.3:1或約0.3:1、0.25:1或約0.25:1、0.2:1或約0.2:1、0.15:1或約0.15:1、0.1:1或約0.1:1或小于0.1:1例如約為0.005:1或更小。在某些實(shí)施方式中，該比率為0.5:1至0.1:1,或0.5:1-0.2:1，或0.5:1-0.3:1。在其它實(shí)施方式中，該比率為1:1-5:1或1:1-10:1或1:1-20:1。在某些實(shí)施方式中，僅發(fā)生適體活性的部分逆轉(zhuǎn)。例如，在一些實(shí)施方式中，適體活性逆轉(zhuǎn)90%或小于90%,例如約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%或更少。可通過將重量與重量比較或以摩爾為基準(zhǔn)來計(jì)算解毒劑與適體的比率在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，劑量給藥系統(tǒng)被應(yīng)用的宿主或主體是人。在具體的實(shí)施方式中，宿主是需要抗凝血治療的人。在某些實(shí)施方式中，宿主是進(jìn)4亍血管手術(shù)例如CABG手術(shù)的病人。附圖的簡要說明圖1描述了基于細(xì)胞的血凝固模型。TF-組織因子；vWF-血管性血友病因子；II-凝血酶原；Ha-凝血酶；凝血因子V、VII、VIII、IX、X和XI的Va、VIIa、VIIIa、IXa、Xa、XIa活4t形式。圖2描述了REG1抗凝血系統(tǒng)。該系統(tǒng)由FXIa抑制劑RB006及其配對(duì)的解毒劑RB007構(gòu)成。解毒劑對(duì)藥物的識(shí)別是通過如所示的沃森-克里克堿基配對(duì)來進(jìn)行的。RB006是修飾的RNA適體，其由2'-氟殘基(大寫體)2'-0-曱基殘基(小寫體)以及單個(gè)的2'-羥基殘基(下劃線)構(gòu)成。RB006經(jīng)由6-碳氨基接頭(L)與40-Kda聚乙二醇載體(P)軛合，并且被3'端上的反向脫氧胸普(idT)保護(hù)以防被核酸外切酶降解。RB007(解毒劑)是2'-0-甲基修飾的RNA寡核苷酸。圖3是體外的RB006APTT劑量反應(yīng)曲線圖，其表明RB006引起了正常匯合的人血漿的APTT的濃度依賴性的增加。"平均秒，，是平均APTT。將數(shù)據(jù)擬合到四參數(shù)邏輯方程，允許確定該曲線的IC50。圖4是在來自個(gè)體的血漿中RB006抗凝血效果的圖。在4個(gè)人(兩個(gè)女人，兩個(gè)男人)中測量了RB006的抗凝血活性。血漿樣品是從GeorgeKingBiomedical(OverlandPark,KS)得到的。個(gè)體被甄別過并被證實(shí)就凝血因子水平而言是正常的。M/55意味著供血者是男人，年齡55歲；F/49意味著供血者是女人，年齡49歲。所采用的APTT試劑是MDA13PlatelinL(Biomeriux),與圖3中所示該研究中所采用的APTT試劑相比，它對(duì)FIX水平相^j"更壽丈感。圖5是顯示解毒劑RB007的藥物中和活性的圖。解毒劑RB007對(duì)適體RB006的低摩爾過量在10分鐘內(nèi)完全中和了RB006的抗凝血活性。所示數(shù)據(jù)是來自三個(gè)獨(dú)立測量值的平均值土SEM。摩爾比基于適體和解毒劑(AD)的寡核苷酸的摩爾數(shù)。圖6是在解毒劑中和先前的藥物劑量之后再劑量給藥適體RB006的圖。將2.5mg/kg適體RB006給藥到豬，15分鐘后用3mg/kgRB007解毒劑(11=2)處理以中和該初始劑量，然后在給藥解毒劑RB007之后30分鐘(初始適體劑量給藥后45分鐘)，將2.5mg/kg適體RB006再給藥到豬。在全血中在(A)ACT(O)測定中；或B)在血漿中測定APTT(O)凝固來測量血凝固時(shí)間的變化。所示數(shù)據(jù)是來自每個(gè)動(dòng)物的雙份測量值的平均值±范圍。在(A和B)中粗線是通過數(shù)據(jù)點(diǎn)的一條點(diǎn)到點(diǎn)的線。圖7是在來自獼猴和人的血漿中RB006的體外APTT劑量反應(yīng)曲線圖。RB006引起來自猴的血漿中的APTT的劑量依賴性延長，其非常類似于在人血漿中所觀察到的情況。采用與在猴子中進(jìn)行的在非臨床毒性研究中用來分析血漿藥品所采用的相同商標(biāo)的APTT試劑、APTT-LS(REG1-TOX001和REG1-TOX003)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因此，這些數(shù)據(jù)用作解釋在8.4部分中所示的來自REG1-TOX001和REG1-TOX003的APTT結(jié)果的基礎(chǔ)。根據(jù)制造商(PacificHemostasis,Middletown,VA),該試劑在FIX含量〈1%的人血漿樣品中產(chǎn)生~87.3秒的APTT;在含~20%正常FIX活性的樣品中為36.1秒；以及在含100%正常FIX活性的樣品中為27.5秒。枸櫞酸鈉獼猴血漿是由CharlesRiverLaboratories,SierraDivision.才是供6勺。圖8是經(jīng)給藥RB006后猴子的全身抗凝血作用圖。利用APTT來監(jiān)測猴子的抗凝血水平。對(duì)于采用15mg/kg處理的動(dòng)物，將RB006數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM。對(duì)于5和30-mg/kg劑量水平的動(dòng)物，將數(shù)據(jù)顯示為平均值±范圍，因?yàn)樵诿總€(gè)這些劑量水平下僅有兩個(gè)動(dòng)物。圖9是采用RB006對(duì)猴子進(jìn)行全身抗凝血作用和用RB007進(jìn)行逆轉(zhuǎn)的圖。利用APTT來監(jiān)測猴子中的抗凝血水平。在給藥RB006后的t=3小時(shí)時(shí)給藥RB007。顯示的數(shù)據(jù)為平均值士SEM。圖IO是在人中RB006的藥物動(dòng)力學(xué)活性的圖。圖11是利用RB007中和人中的RB006藥理活性的圖。圖11是比較有和沒有給藥RB007時(shí)的RB006藥物動(dòng)力學(xué)活性的圖。圖12是比較在用RB007處理后在3小時(shí)時(shí)用60mgRB006處理與用安慰劑處理的受試者中藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的圖。圖13顯示對(duì)于接受了RB006的所有受試者，對(duì)從0至3小時(shí)在基線上的APTT的相對(duì)增長的更詳細(xì)分析。圖14是通過RB006劑量水平(15、30、60或卯mg)組織的各受試者的AUC0-3圖。因?yàn)樵?小時(shí)內(nèi)測量了相對(duì)效果，值"3"表示對(duì)RB006沒有反應(yīng)；值6表示在基線上平均增加2倍，等。圖15是體重調(diào)節(jié)的RB006劑量作為RB006劑量水平的函數(shù)的圖。圖16是與RB006"體重調(diào)節(jié)"劑量比較的UC0-3的圖。圖17是用RB006處理的受試者的BMI調(diào)節(jié)劑量作為RB006劑量水平的函數(shù)的圖。圖18是RB006的UC0-3與BMI調(diào)節(jié)的劑量的關(guān)系圖。圖19是相對(duì)于。/。FIX活性的與基線相比的APTT圖，其顯示在不同的RB006劑量(15、30、60和卯mg)下的APTT。圖20是在患有冠狀動(dòng)脈病的患者中使用4劑靜脈內(nèi)給藥的RB006適體和RB007解毒劑比較的APTT反應(yīng)圖。圖21是顯示在全部治療組中在第1、3和5天給藥RB006(0.75mg/kg)后的時(shí)間加權(quán)的APTT的圖。第1組受試者在第1、3和5天接受單次劑量適體(0.75mg/kgRB006),接著在一'J、時(shí)后接受固定劑量的解毒劑(1.5mg/kgRB007);第2和3組受試者在第1、3和5天接受單次劑量適體(0.75mg/kgRB006),接著在一'J、時(shí)后給藥不同的RB007單次劑量。圖23是給藥RB006(0.75mg/kg)和與RB006比率不同的RB007的組中的平均APTT對(duì)時(shí)間的圖。圖24是顯示與RB006相比時(shí)以所列比率在給藥RB007后一'h時(shí)給藥RB006而得的時(shí)間加^又的APTT恢復(fù)百分比。^洋細(xì)i兌明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在適體、特別是適體抗凝血?jiǎng)┑捏w重調(diào)節(jié)的劑量以及更為重要地，體重指數(shù)調(diào)節(jié)的劑量及其藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)兩者之間有清晰的關(guān)系。此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)適體的解毒劑的劑量僅需要根據(jù)供給宿主的水平。這種新認(rèn)識(shí)為特定的給藥方式提供了支持，該特定的給藥方式允許針對(duì)臨床用途的可預(yù)測的并且可重復(fù)的給藥方案。適體改進(jìn)利用被稱為SELEX的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化方法來分離核酸適體。該方法允許在體外發(fā)展高度特異性地結(jié)合到耙分子的核酸分子。例如在美國專利號(hào)7,087,735、美國專利號(hào)5,475,096和美國專利號(hào)5,270,163(還參見WO91/19813)中描述了SELEX方法。SELEX方法涉及從候選寡核苷酸混合物中選擇和采用相同的常規(guī)選擇方案分步反復(fù)結(jié)合、分開和擴(kuò)增，以實(shí)際上達(dá)到親和力和選擇性的任何所需標(biāo)準(zhǔn)。從核酸的混合物(例如包括隨機(jī)序列的片段的混合物)開始，SELEX方法包括以下步驟在有利于結(jié)合的條件下使該混合物與靶接觸，將未結(jié)合的核酸與已經(jīng)特異性地結(jié)合到耙分子的那些分開，使核酸_靶復(fù)合物解離，將從核酸-靶復(fù)合物中分離出來的核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生富含配體的核酸的混合物，然后重復(fù)以下步驟結(jié)合、分開、解離和擴(kuò)增，通過與所需循環(huán)一樣多的循環(huán)來產(chǎn)生革巴分子的高特異性、高親和力適體。已經(jīng)改進(jìn)了基本的SELEX方法來達(dá)到許多具體目的。例如美國專利號(hào)5,707,796描述了采用SELEX與凝膠電泳結(jié)合來選擇具有特定結(jié)構(gòu)特征的核酸分子，例如彎曲的DNA。美國專利號(hào)5,763,177描述了一種基于SELEX的方法，該方法用于選擇含有光反應(yīng)性基團(tuán)的適體，該光反應(yīng)性基團(tuán)能夠結(jié)合到和/或光致交聯(lián)到和/或光滅活靶分子。美國專利號(hào)5,580,737描述了一種用于確定高特異性適體的方法，該高特異性適體能夠在密切相關(guān)的分子之間進(jìn)行區(qū)分，被稱為反向SELEX。美國專利號(hào)5,567,588和5,861,254描述了基于SELEX的方法，其可在對(duì)靶分子具有高和低的親和力的寡核苷酸之間完成高效率的分開。美國專利號(hào)5,496,938,描述了在已經(jīng)實(shí)施SELEX方法之后得到改進(jìn)適體的方法，美國專利5,705,337描述了使配基共價(jià)鍵合到其粑的方法。美國專利號(hào)5,648,214證明了識(shí)別適體與溶液中的小肽的可行性。在美國專利號(hào)5,780,228中舉例說明采用配基使用親和洗脫來產(chǎn)生耙向靶分子上的特定位置的適體的能力，該專利涉及與某些外源凝集素結(jié)合的高親和力適體的生產(chǎn)。在美國專利號(hào)6,127,119中描述了制備某些組16織的適體的方法，這些組織包括細(xì)胞類型組。在美國專利號(hào)6，673,553中描述了牛小腸磷酸酶的某些高親和力改進(jìn)配基的制備。美國專利號(hào)6,716,580描述了表征適體的自動(dòng)化方法，其包括采用機(jī)械手操作員。在SELEX方法的最基本方式中，SELEX方法可以;故以下的系列步驟定義1)制備不同序列的核酸的候選混合物。該候選混合物通常包括固定序列區(qū)(即候選混合物各成分在相同位置包含相同的序列)和隨機(jī)序列區(qū)。選擇固定的序列區(qū)(a)有助于下述的擴(kuò)增步驟，(b)模擬已知序列以結(jié)合到靶，或者(c)提高候選混合物中給定的核酸結(jié)構(gòu)排列的濃度。隨機(jī)序列可以是完全隨機(jī)化的(即在任意位置發(fā)現(xiàn)堿基的概率為四分之一)或者僅部分隨機(jī)化(例如在任意位置發(fā)現(xiàn)堿基的概率可選擇為0-100%之間的任意水平)。2)使候選混合物與所選耙在有利于耙與候選混合物成分之間結(jié)合的條件下進(jìn)行接觸。在這些情況下，靶與候選混合物的核酸之間的相互作用可被認(rèn)為是在耙和對(duì)該粑具有最強(qiáng)親和力的那些核酸之間形成了核酸-革巴對(duì)。3)將對(duì)該靶具有最高親和力的核酸與對(duì)該靶具有較小親和力的那些核酸分開。因?yàn)閮H極其小數(shù)量的對(duì)應(yīng)于最高親和力的核酸的序列(并且可能僅一個(gè)核酸分子)存在于候選混合物中，所以通常理想的是設(shè)定分開標(biāo)準(zhǔn)，使得候選混合物中顯著量的核酸(約為5-50%)在分開期間被保留。4)然后，將在分開期間作為對(duì)乾具有比較高親和力的被選擇的那些核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生新的候選混合物，其富含對(duì)耙具有比較高親和力的核酸。5)通過重復(fù)以上分開和擴(kuò)增步驟，新形成的候選混合物含有少而又少的弱結(jié)合序列，并且核酸對(duì)粑的平均親和度將普遍增加。取其極端，SELEX方法將產(chǎn)生含有一種或少量的獨(dú)特核酸的候選混合物，該獨(dú)特核酸代表了來自對(duì)靶分子具有最高親和力的初始候選混合物的那些核酸?；瘜W(xué)修飾在核酸的治療性使用中遇到的一個(gè)問題是在所需效果顯示之前，以其磷酸二酯形式存在的寡核普酸可能在體液中被細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的酶例如核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶迅速地降解?？梢詫?duì)適體進(jìn)4亍某些化學(xué)修飾來增大該適體的體內(nèi)穩(wěn)定性或增強(qiáng)或介導(dǎo)適體的遞送。適體的修飾包括(但不限于)提供其它化學(xué)基團(tuán)的那些修飾，該化學(xué)基團(tuán)將附加電荷、極化性、疏水性、氫鍵、靜電相互作用和立體易變性引入適體堿基或作為一個(gè)整體的適體。這種修飾包括(但不限于)2'-位糖修飾、5-位嘧咬修飾、8-位噪呤修飾、環(huán)外胺修飾、4-硫尿核苦取代、5-溴或5-殃尿嘧啶取代；主鏈修飾、疏代磚酸酯或烷基磷酸酯修飾、曱基化、不尋常的堿基配對(duì)組合，例如異堿、異胞苷和異胍等。修飾也可包括3'和5'修飾，例如加帽。SELEX方法包括筌定含有修飾核普酸的高親和力適體，該修飾的核苷酸賦予配基以改進(jìn)的特性，例如改進(jìn)的體內(nèi)穩(wěn)定性或改進(jìn)的遞送特性。這類修飾的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或堿位置處的化學(xué)取代。SELEX鑒定的含有^f'f飾的核苷酸的適體^皮描述在美國專利號(hào)5,660,985中，該專利描述了含有在嘧啶的5-和2'-位化學(xué)修飾了的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利號(hào)5,580,737描述了含有一種或多種核苷酸的特異性適體，該核苷酸被2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-0-曱基(2'-OMe)修飾。美國專利號(hào)5,756,703描述了含有各種2'-修飾的嘧啶的寡核苷酸。SELEX方法包括將所選^^的寡核苷酸與美國專利號(hào)5,637,459和5,683,867中所述的其它所選擇的寡核苷酸和非寡核苷酸功能單元相組合。美國專利號(hào)5,637,459描述了含有一種或多種核苷酸的高特異性適體，該核苷酸被2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-0-曱基(2'-OMe)修飾。SELEX方法進(jìn)一步包括將所選適體與親脂性或非免疫原性高分子量化合物在診斷或治療復(fù)合物中相組合，如美國專利號(hào)6,011,020中所述。當(dāng)通過SELEX方法衍生適體時(shí)，修飾可以是SELEX前或后的修飾。體。對(duì)2'-OH適體進(jìn)行的SELEX后的修飾可導(dǎo)致體內(nèi)穩(wěn)定性改進(jìn)而對(duì)適體的結(jié)合能力沒有不利影響。在一種實(shí)施方式中，適體修飾包括在該分子3'端的3'-3'反向磷酸二酯鍵以及一些或全部核苷酸的2'-氟(2'-F)和/或2'-氨基(2'-NH2)和/或2'-0-甲基(2'-OMe)修飾。在一種實(shí)施方式中，適體或其調(diào)節(jié)劑可以被共價(jià)連接到親脂性化合物例如膽固醇、二烷基甘油、二?；视突蚍敲庖咴缘母叻肿恿炕衔锘蚓酆衔锢缇垡叶?PEG)。在這些例子中，能夠提高適體或調(diào)節(jié)劑的藥物動(dòng)力學(xué)性能。在還有的其它實(shí)施方式中，適體或調(diào)節(jié)劑可以被包在質(zhì)脂體內(nèi)。親脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物可以與適體或調(diào)節(jié)劑共價(jià)鍵合或通過非共價(jià)相互作用締合。在采用共價(jià)連接的實(shí)施方式中，親脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物可以被共價(jià)連接到適體或調(diào)節(jié)劑的各種位置，例如堿基上的環(huán)外氨基、嘧啶核苷酸的5-位、噤呤核苷酸的8-位、磷酸酯的羥基或5'或3'終端羥基或其它基團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，共價(jià)連接是連接到5'或3'羥基。寡核苷酸調(diào)節(jié)劑與例如，可在堿基部分、糖部分或磷酸酯主鏈上對(duì)本發(fā)明寡核苷酸進(jìn)行修飾，以改進(jìn)分子穩(wěn)定性、雜化等。寡核苷酸可包括其它附加基團(tuán)。為此目的，可將寡核苷酸軛合到另一分子，例如肽、雜交引發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)移劑、雜交引發(fā)的裂解劑等等。寡核苷酸可以包括選自下組的至少一種修飾的堿基部分，該組包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧吱、次黃。票呤、黃。票呤、4-乙酰月包嘧啶、5-(羧基羥曱基)尿嘧啶、5-羧曱基氨甲基硫尿苷、5-羧曱基氨曱基尿嘧啶、二氬尿嘧啶、(3-D-半乳糖Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯腺噤呤、1-曱基鳥嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-曱基腺嘌呤、2-曱基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-曱基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-曱基鳥嘌呤、5-曱基氨基甲基尿嘧啶、5-曱氧基氨基甲基-2a-硫尿嘧啶、(3-D-甘露糖Q核苷(queosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-曱硫基-6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧咬羥乙酸、wybutoxosme、假尿嘧啶、Q核苷(queosme)、2—硫胞嘧啶、5-曱基石危尿嘧啶、2-石克尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-曱基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-羥乙酸曱基酯、尿嘧啶羥乙酸(v)、5-曱基石克尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧丙基)和2,6-二氨基嘌呤。本發(fā)明的適體和調(diào)節(jié)劑也可包括選自下組的至少一種修飾的糖部分，該組包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖。適體和調(diào)節(jié)劑可包括選自下組的至少一種修飾的磷酸酯主鏈，該組包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、曱基膦酸酯、烷基磷酸三酯和曱縮醛(formacetal)或其類似物。可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成任何本發(fā)明的寡核苷酸，例如通過采用DNA自動(dòng)合成儀(例如市售的如Biosearch,AppliedBiosystems)。調(diào)節(jié)劑本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可以是寡核苷酸、小分子、肽、寡糖，例如氨基苷這些中任何一種的嵌合體或融合或連接產(chǎn)物。在一種實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑是與適體的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。在另一實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑可以是靶向適體的核酶或DNA酶。在此外的實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑可以是肽核酸(PNA)、嗎啉基核酸(MNA)、鎖閉的核酸(LNA)或假環(huán)狀寡核堿基(PCO),其包括與適體的至少一部分互補(bǔ)或雜交的序列。適體具有活性的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其取決于適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。因此，雖然在本發(fā)明的互補(bǔ)寡核苷酸調(diào)節(jié)劑和適體之間的雙螺旋形成機(jī)理與兩個(gè)短的線性寡核糖核苷酸之間的相同，但是設(shè)計(jì)這種相互作用的規(guī)則和這種產(chǎn)物的形成動(dòng)力學(xué)兩方面都是受分子內(nèi)適體結(jié)構(gòu)影響的。成核速率對(duì)于最終形成穩(wěn)定的雙螺旋是重要的，并且通過使寡核苷酸調(diào)節(jié)極大:提高。為了發(fā)生分子間雙;:旋的形成,形成:子間雙:、旋的自由能必須有利于已有分子內(nèi)雙螺旋在靶向的適體內(nèi)形成。調(diào)節(jié)劑可被設(shè)計(jì)成使其以高度特異'性和所需水平的親和力結(jié)合特定的適體。調(diào)節(jié)劑也可被設(shè)計(jì)成這樣，在結(jié)合后，適體結(jié)構(gòu)被修飾為活性更大或更小的形式。例如，調(diào)節(jié)劑可被設(shè)計(jì)成這樣，在結(jié)合到靶向的適體之后，該適體的三維結(jié)構(gòu)改變以致該適體不再能夠結(jié)合到其靶分子或以較小親和力結(jié)合到其耙分子?？商娲兀{(diào)節(jié)劑可被設(shè)計(jì)成這樣，使得在結(jié)合后，適體的三維結(jié)構(gòu)被改變以致該適體對(duì)于其靶分子的親和力增強(qiáng)。即調(diào)節(jié)劑可一皮設(shè)計(jì)成這樣，在結(jié)合后，在適體中產(chǎn)生了一種結(jié)構(gòu)基序以使該適體可結(jié)合到其靶分子。在本發(fā)明的一種備選的實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑其自身是一種適體。在該實(shí)施方式中，首先產(chǎn)生適體，該適體結(jié)合到所需的治療靶，第二步，利用在此所述的SELEX方法或其它方法產(chǎn)生結(jié)合到第一適體的第二適體，并且調(diào)節(jié)治療適體和耙之間的相互作用。在一種實(shí)施方式中，第二適體使第一適體的作用鈍化。在其它可供選擇的實(shí)施方式中，結(jié)合到靶的適體可以是PNA、MNA、LNA或PCO，而調(diào)節(jié)劑是一種適體。備選地，結(jié)合到輩巴的適體是PNA、20MNA、LNA或PCO，而調(diào)節(jié)劑是PNA。備選地，結(jié)合到耙的適體是PNA、MNA、LNA或PCO,而調(diào)節(jié)劑是MNA。備選地，結(jié)合到靶的適體是PNA、MNA、LNA或PCO,而調(diào)節(jié)劑是LNA。備選地，結(jié)合到耙的適體是PNA、MNA、LNA或PCO,而調(diào)節(jié)劑是PCO。在天然存在的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)或非天然存在的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)或其混合物中，可隨意采用這些之中的任一種。例如，在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，適體呈D構(gòu)型，而在另一實(shí)施方式中，適體呈L構(gòu)型。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明調(diào)節(jié)劑是一種寡核苷酸，其包括與靶向的適體序列的至少一部分互補(bǔ)的序列。例如，調(diào)節(jié)劑寡核苷酸可包括與單巴向適體的6-25個(gè)核苦酸，典型為8-20個(gè)核苷酸，更典型為10-15個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列。有利地，調(diào)節(jié)劑寡核苷酸與適體的6-25個(gè)、或8-20個(gè)、或10-15個(gè)連續(xù)的核普酸互補(bǔ)。考慮到耙向適體及尋求的效果，可以將調(diào)節(jié)劑寡核普酸的長度優(yōu)化。典型地，調(diào)節(jié)劑寡核苷酸是5-80個(gè)核苷酸長，更典型為10-30個(gè)核苷酸，最典型為15-20個(gè)核苷酸(例如15-17個(gè))。寡核苷酸可被制備成具有帶有D或L立體化學(xué)構(gòu)型或其混合物的核苷酸。天然存在的核苷酸呈D構(gòu)型。可采用各種策略來確定寡核苷酸結(jié)合到耙向適體的最佳位點(diǎn)。可采用經(jīng)驗(yàn)性策略，其中互補(bǔ)寡核苷酸是"步行"在適體周圍。步行實(shí)驗(yàn)可涉及順序進(jìn)行的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?？芍频靡环N新候選混合物，其中該候選混合物的每種成分具有對(duì)應(yīng)于有關(guān)寡核苷酸調(diào)節(jié)劑的固定核酸區(qū)。該候選混合物的每種成分還包括隨機(jī)序列區(qū)。根據(jù)這種方法，有可能鑒定何謂"延長的"適體，其包含可結(jié)合到多于一個(gè)適體結(jié)合區(qū)的區(qū)域。根據(jù)該方法，可采用約為15個(gè)核苷酸長的2'-0-甲基寡核苷酸(例如2'-0-甲基寡核苷酸)，它在適體上(例如與適體的核苷酸1-15、6-20、11-25,等互補(bǔ)的寡核苷酸適體)交錯(cuò)約5個(gè)核苦酸。經(jīng)驗(yàn)性策略可以是特別有效的，因?yàn)殡y于預(yù)知適體的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于雜交效力的影響。后續(xù)的實(shí)施例中所述分析可用于估定不同寡核苷酸與特定適體雜交的能力，特別強(qiáng)調(diào)在達(dá)到適體完全結(jié)合必需的寡核苷酸過量摩爾數(shù)。通過進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)研究，利用例如BIACORE分析，也可測定不同寡核苷酸調(diào)節(jié)劑提高適體與其乾分子分離速率或適體與其乾分子締合速率的能力?？蓪?duì)寡核苷酸調(diào)節(jié)劑進(jìn)行選擇，以使按照所需方式改進(jìn)適體及其靶分子之間相互作用需要5-50倍摩爾過量或更少的寡核苷酸。備選地，為了促進(jìn)與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑的締合，可改進(jìn)靶向適體以使其包括單鏈尾部(3'或5')。合適的尾部可包括1-20個(gè)核苷酸，優(yōu)選l-10個(gè)核苷酸、更優(yōu)選1-5個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選3-5個(gè)核苷酸(例如修飾核苷酸如2'-0-甲基序列)。可在結(jié)合和生物測定中測試有尾的適體(例如隨后實(shí)施例中所述)以證實(shí)加入單鏈尾部沒有石皮壞適體的活性結(jié)構(gòu)。可以設(shè)計(jì)出能夠形成例如，具有尾部序列的1、3或5堿基對(duì)的一系列寡核普酸(例如2'-0-甲基寡核苷酸)并測試其與尾部適體單獨(dú)締合的能力以及提高適體與其靶分子解離速率或適體與其靶分子締合速率的能力?？墒褂秒s亂的序列對(duì)照以證實(shí)效果是由于雙螺旋形成而不是非特異性效果所致。本發(fā)明的寡核苷酸調(diào)節(jié)劑包括與適體的至少一部分互補(bǔ)的序列。然而，完全互補(bǔ)不是必需的。在此提及的"與適體的至少一部分互補(bǔ)的，，序列是指一種具有充分的互補(bǔ)性而能夠與適體雜交的序列。雜交能力可以取決于互補(bǔ)程度和反義核酸的長度兩者。通常，雜交的寡核苷酸越大，其可含有的與靶適體配錯(cuò)的堿基就越多，并且還形成穩(wěn)定的雙螺旋(根據(jù)具體情況或?yàn)槿菪?。通過使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序來測定雜交復(fù)合物的熔點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定可容許的配錯(cuò)程度。在具體的方面，寡核苷酸可以是至少5個(gè)或至少10個(gè)核苷酸，至少15個(gè)或至少17個(gè)核苷酸，至少25個(gè)核苷酸或至少50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合體混合物或其衍生物或其變型，是單鏈的。在一種實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑是核酶或DNA酶。至少有5種核酶，其中各自顯示出不同類型的特異性。例如，第I組內(nèi)含子的大小為約300-〉1000核苷酸并且需要U直接在靶序列中5'分裂位點(diǎn)并且在分裂位點(diǎn)的5'-側(cè)結(jié)合4-6個(gè)核苷酸。另一種類是RNA酶PRNA(M1RNA),其大小約為290-400個(gè)核普酸。第三個(gè)實(shí)例是錘頭核酶，其大小約為30-40個(gè)核苷酸。它們需要靶序列UH直接在5'分裂位置并且在分裂位置兩側(cè)上結(jié)合可變數(shù)目的核苷酸。第四種類是發(fā)夾核酶，其大小約為50個(gè)核苷酸。它們需要靶序列GUC直接在3'分裂位置并且在分裂位置5'-側(cè)上結(jié)合4個(gè)目核苦酸以及可變數(shù)目結(jié)合到分裂位置3'-側(cè)。第五種類是丁型肝炎病毒(HDV)核酶，其大小約為60個(gè)核苷酸。另一類催化分子被稱為"DNA酶"。DNA酶是單鏈的，并且切割RNA和DNA兩者。已經(jīng)提出了DNA酶的一種一般模型，并且該模型22被稱為"10-23"型，符合"10-23"才莫型的DNA酶具有15個(gè)脫氧核糖核苷酸的催化結(jié)構(gòu)域，其兩側(cè)面是兩個(gè)各自具有7-9個(gè)脫氧核糖核苷酸的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的寡核苷酸調(diào)節(jié)劑的核堿基可通過核堿基之間的鍵例如肽基鍵(如肽核酸(PNAs)的情形，Nielsen等人(1991)Science254,1497和U.S.Pat.No.5,539,082)和嗎啉4建(Qin等人，AntisenseNucleicAcidDrugDev.10,11(2000》Summerton,AntisenseNucleicAcidDrugDev.7,187(1997》Summerton等人，AntisenseNucleicAcidDrugDev.7,63(1997);Taylor等人，JBiolChem.271,17445(1996);Partridge等人，AntisenseNucleicAcidDrugDev.6,169(1996))或通過任何其它天然或修飾鍵來連接。低聚核堿基也可以是鎖閉的核酸(LNAs)。Nielsen等人,JBiomolStructDyn17,175(1999);Petersen等人，JMolRecognit13,44(2000);Nielsen等人，BioconjugChem11,228(2000)。PNAs是類似于寡核苷酸的化合物，但組成不同。在PNAs中，寡核苷酸的脫氧核糖主鏈被肽主鏈取代。肽主鏈的每個(gè)亞基連接到天然存在或非天然存在的核堿基上。PNA通常具有由N-(2-氨乙基)氨基乙酸單元組成的非手性聚酰胺主鏈。噤呤或嘧啶堿基經(jīng)由亞曱基羰基接頭(l-3)連接到各單元以輩巴向互補(bǔ)核酸。遵循沃森-克里克堿基配對(duì)規(guī)則，PNA以平行或反平行取向結(jié)合到互補(bǔ)RNA或DNA。與天然同質(zhì)雙鏈相比，PNA低聚物的不帶電性質(zhì)提高了雜交PNA/DNA雙螺旋的穩(wěn)定性。嗎啉核酸如此命名是因?yàn)樗鼈冇蓡徇鴣喕b配而成，其各自包括連接到六元嗎啉環(huán)的四個(gè)遺傳堿基(腺噪呤、胞嘧啶、鳥噪呤和胸腺嘧啶)之一。18-25個(gè)這四種亞基類型的亞基通過非離子性的二氨基磷酸酯亞基之間的鍵以特定順序結(jié)合來提供嗎啉低聚物。這些嗎啉低聚物，其六元嗎啉主鏈部分通過非離子鍵連接，與通過非離子鍵連接的具有五元核糖或脫氧核糖主鏈部分的RNA、DNA及其類似物相比，提供了實(shí)質(zhì)上更好的反義'I"生能(參見wwwgene-tools.com/Morphol-inos/bodymorpholinos.HTML).。LNA是具有某些特征使其成為用于本發(fā)明調(diào)節(jié)劑的主要候選者的一類DNA類似物。LNA單體是在結(jié)構(gòu)上類似于RNA單體的雙環(huán)化合物。LNA共享DNA和RNA的大部分化學(xué)性能，它是水溶性的，能夠通過凝膠電泳、乙醇沉淀等來分離(Tetrahedron,54,3607-3630(1998))。然而，將LNA單體引入DNA或RNA低聚物中導(dǎo)致具有互補(bǔ)DNA或RNA的雙螺旋熱穩(wěn)定性高，而同時(shí)遵從沃森-克里克堿基配對(duì)MJ'J。與LNA低聚物一起形成的雙螺旋的這種高熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)含有3'位LNA的引物是用于酶擴(kuò)展(例如聚合酶鏈反應(yīng))的底物，被用于本發(fā)明以顯著地增加本申請(qǐng)所述體外分析中的不同核酸檢測的特異性。單個(gè)的等位基因的擴(kuò)增方法存在極大差別(不可見交聯(lián)反應(yīng))并且在同一容器中可發(fā)生幾個(gè)反應(yīng)。例如參見美國專利號(hào)6,316,198。假環(huán)狀低聚核堿基(PCOs)也可用作本發(fā)明中的調(diào)節(jié)劑(參見美國專利號(hào)6,383,752)。PCOs含有兩種寡核苷酸片段，它們通過其3'-3'或5'-5'端連接。PCO的片段之一("功能性片段")具有一些官能度(例如與靶mRNA互補(bǔ)的反義寡核苦酸)。另一片段("保護(hù)性片段")與功能性片段的3'-或5'-末端互補(bǔ)(取決于端部，通過該端部連附到功能性片段)。由于功能性片段和保護(hù)性片段之間的互補(bǔ)性，PCOs在沒有靶核酸的條件下形成分子內(nèi)假環(huán)狀結(jié)構(gòu)(例如RNA)。PCOs比常規(guī)的反義寡核苷酸更穩(wěn)定，因?yàn)榇嬖?'-3'或5'-5'鍵并且形成了分子內(nèi)假環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)、組織分布和穩(wěn)定性研究提示通常PCOs的體內(nèi)穩(wěn)定性高于PS-寡核苷酸并且藥物動(dòng)力學(xué)和組織分布輪廓與其相類似，但是從所選組織中迅速除去。當(dāng)熒光團(tuán)和猝滅分子適當(dāng)?shù)剡B接到本發(fā)明PCOs時(shí)，該分子處于線性構(gòu)型時(shí)將發(fā)熒光，但是該熒光在處于環(huán)狀構(gòu)型時(shí)猝滅。適體的基于肽的調(diào)節(jié)劑代表了寡核普酸或其類似物的另一可供選擇的調(diào)節(jié)劑的分子類型。當(dāng)靼適體的充分活性的寡核苷酸調(diào)節(jié)劑由于缺乏足夠的單鏈區(qū)來促進(jìn)該耙和寡核苷酸調(diào)節(jié)劑之間的成核作用而不能被分離時(shí)，這類調(diào)節(jié)劑被證實(shí)是特別有效的。另外，與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑相比，肽調(diào)節(jié)劑提供了不同的生物利用度和藥物動(dòng)力學(xué)。寡糖，象氨基糖苷類，可結(jié)合到核酸并且可用于調(diào)節(jié)適體的活性。插入適體和耙之間或者以別的方式石皮壞或改變適體和革巴之間結(jié)合的小分子也可用作治療調(diào)節(jié)劑。筌別這種類小分子可通過在一種測量在有和沒有小分子時(shí)適體和粑之間的結(jié)合變化的分析中篩選，或通過采用測量鑒別。一旦確定小分子表現(xiàn)出所需效果，可采用例如組合方法的技術(shù)來優(yōu)化化學(xué)結(jié)構(gòu)以達(dá)到所需的調(diào)節(jié)效果?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測定來鑒別和選擇本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑。非限制性例子是凝膠位移檢測和BIACORE檢測。即測試調(diào)節(jié)劑可與待乾向的適體在測試條件或典型生理學(xué)條件下接觸，并且對(duì)測試調(diào)節(jié)劑事實(shí)上是否與該適體結(jié)合進(jìn)行測定。然后在適當(dāng)?shù)纳镨b定(其將隨著適體及其靶分子的變化而變化，例如凝固實(shí)驗(yàn))中可對(duì)被發(fā)現(xiàn)與適體結(jié)合的測試調(diào)節(jié)劑進(jìn)行分析來確定測試調(diào)節(jié)劑是否能夠影響由適體引起的對(duì)其靶分子的生物學(xué)效果。凝膠位移檢測是一種用于評(píng)估結(jié)合能力的技術(shù)。例如，首先將含有測試序列的DNA片段與測試蛋白質(zhì)或含假定結(jié)合蛋白質(zhì)的混合物一起培養(yǎng)，然后通過電泳在凝膠上分離。如果DNA片段與蛋白質(zhì)結(jié)合，則一種電泳凝膠遷移率位移實(shí)驗(yàn)方法可以是(a)在穩(wěn)定的條件下使結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸與含有分子探針的非放射性或放射性標(biāo)記核酸分子在混合物中接觸，來促進(jìn)蛋白質(zhì)和探針在形成復(fù)合物時(shí)它們之間的特異性的結(jié)合相互作用，其中所述探針選自dsDNA、ssDNA和RNA;(b)使該混合物電泳；(c)利用正壓印跡轉(zhuǎn)移或毛細(xì)管轉(zhuǎn)移使該復(fù)合物轉(zhuǎn)移到膜，其中該膜是帶正電荷的尼龍，以及(d)通過檢測該復(fù)合物中的非放射性或放射性標(biāo)記來檢測結(jié)合到該膜的復(fù)合物。Biacore技術(shù)可測量傳感器芯片表面上的結(jié)合情況，使得與該表面附連的相互作用物測定了該檢測的特異性。測試相互作用的特異性包括簡單地分析不同分子是否能夠結(jié)合到固定的反應(yīng)物。結(jié)合立即使表面等離子共振(SPR)信號(hào)發(fā)生變化，所以是否發(fā)生相互作用是立即顯而易見的?；赟PR的生物傳感器，通過測量靠近表面的生物分子質(zhì)量濃度來監(jiān)測相互作用。通過附連配偶體之一而使該表面成為特異性的。當(dāng)來自樣品的分子與附連到該表面的反應(yīng)物結(jié)合時(shí)，含有其它配偶體的樣品在該表面上流動(dòng)，測得了局部濃度變化和SPR響應(yīng)。該反應(yīng)與結(jié)合到該表面上的分子質(zhì)量成正比。當(dāng)光在一定條件下從導(dǎo)電膜反射時(shí)產(chǎn)生SPR,該導(dǎo)電膜在兩種折射率不同的介質(zhì)之間的界面上。在Bmcore技術(shù)中，該介質(zhì)是樣品和傳感器芯片的玻璃，而導(dǎo)電膜是芯片表面上的薄金層。SPR引起特定反射角度的反射光強(qiáng)度減小。該角度隨靠近反射光對(duì)面上的表面的折射率而變化。當(dāng)樣品中的分子結(jié)合到傳感器表面時(shí)，該表面上的濃度變化并因此25折射率變化，從而檢測到了SPR響應(yīng)。繪制相互作用期間反應(yīng)對(duì)時(shí)間的圖提供了相互作用進(jìn)度的定量測量。Biacore技術(shù)可測量反射光強(qiáng)度最小時(shí)的角度。該樣品沒有吸收該光，而是光能量通過金膜中的SPR消散。SPR響應(yīng)值用共振單位(RU)表示。一個(gè)RU代表最小強(qiáng)度的角度變化0.0001°。對(duì)于大部分蛋白質(zhì)，這約略相當(dāng)于傳感器表面上濃度變化約為1pg/mm2。RU和表面濃度之間的精確換算因子取決于該傳感器表面的性能和引起濃度變化的分子性質(zhì)。還有許多其它檢測方法可測定寡核苷酸或其類似物、肽、多肽、寡糖或小分子是否能夠以改進(jìn)了與靶的相互作用的方式結(jié)合到適體。例如，電泳遷移率變化4企測(EMSAs)、滴定量熱法、閃爍親近測定法、采用分析超速離心的沉降平衡分析法(參見例如www.cores.utah.edu/interaction)、焚光偏振分析、焚光各向異性分析、萸光強(qiáng)度分析、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析、硝化纖維過濾器結(jié)合分析、ELISAs、ELONAs(參見例如美國專利號(hào)5,789,163)、RIAs或平衡滲析分析可用于評(píng)估試劑結(jié)合到適體的能力?？蛇M(jìn)行直接測定(其中直接測定試劑與適體之間的相互作用)，或者可進(jìn)行竟?fàn)帨y定或其中試劑能夠?qū)⑦m體從其耙中置換出的置換分析(例如參見Green,BellandJanjic，Biotechmques30(5),2001,p1094和美國專利號(hào)6,306,598)。一旦確定了候選調(diào)節(jié)劑，就可在生物測定中證實(shí)其調(diào)節(jié)適體對(duì)于其耙的活性的能力。備選地，如果一種試劑被確定可調(diào)節(jié)一種適體與其耙的相互作用，就可采用這種結(jié)合分析來證實(shí)該試劑與該適體是直接相互作用的，并且可測量所述相互作用的親和力。在另一實(shí)施方式中，可采用質(zhì)譜法來鑒定結(jié)合到一種適體的調(diào)節(jié)劑、該調(diào)節(jié)劑和該適體之間相互作用的位置、以及試劑對(duì)于該適體的相對(duì)結(jié)合親和力(例如參見Crook等人的美國專利號(hào)6,329,146)。這種質(zhì)譜法也可用于檢測化學(xué)混合物或庫、特別是組合庫中是否有結(jié)合到所選靶適體的個(gè)別化合物，其可用作該適體的調(diào)節(jié)劑。此外，質(zhì)語技術(shù)可用于篩選多靶適體，其同時(shí)對(duì)著例如化合物組合庫。而且，質(zhì)譜技術(shù)可用于鑒別多種分子種類之間的相互作用，特別是輩巴適體上的"小，，分子和分子相互作用位置。評(píng)估調(diào)節(jié)劑在改進(jìn)適體和靶之間相互作用方面的效力的體內(nèi)或體外分析對(duì)于待治療的病癥是特異性的。大量生物性質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測定是眾所周知并且是可采用的。本申請(qǐng)引用的專利中提供了生物學(xué)測定例子，其描述了用于特定應(yīng)用的某些適體。本發(fā)明還提供了用來表征適體的調(diào)節(jié)劑的方法。通過結(jié)合分析、制作分子模型或測量生物學(xué)功能改進(jìn)的體內(nèi)或體外分析通?？杀碚髡{(diào)節(jié)劑。在一種實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑與核酸的結(jié)合是通過凝膠移動(dòng)檢測來測定的。在另一實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑與適體的結(jié)合是通過Biacore檢測來測定的。在一種實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)劑能夠?qū)嵸|(zhì)上結(jié)合溶液中的適體的調(diào)節(jié)劑的濃度小于l(l.O)微摩爾(uM)、優(yōu)選小于0.1uM、更優(yōu)選小于0.01uM.。"實(shí)質(zhì)上"是指通過在具有靶的條件下的調(diào)節(jié)所觀察到的靶生物活性降低至少50%,并且50%降低在此被稱為IC50值。藥用組合物本發(fā)明的適體或調(diào)節(jié)劑可被配制成藥用組合物，其可包括可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。該組合物的精確性質(zhì)將至少部分地取決于該適體和/或調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)，包括任何穩(wěn)定化改進(jìn)以及給藥途徑。通常，該適體或調(diào)節(jié)劑-波酌情以IV、IM、IP、SC、口月l或局部給藥?？筛鶕?jù)已知方法配制包括本發(fā)明適體或調(diào)節(jié)劑的可藥用組合物，例如通過可藥用載體的混合。在Remington'sPharmaceuticalSciences中可找到這種載體的例子及其配制方法。為了形成適用于有效給藥的可藥用組合物，這種組合物將含有有效量的適體或調(diào)節(jié)劑。這種組合物可含有多于一種化合物的混合物。在本發(fā)明的方法中，該化合物可形成活性成分，并且通常以與適當(dāng)?shù)乃幱孟♂寗?、賦形劑或載體的混合物形式(在此共同稱為"載體，，材料)一起給藥，針對(duì)計(jì)劃給藥方式，即口服片劑、膠嚢、酏劑、糖漿、栓劑、凝膠等適當(dāng)選擇稀釋劑、賦形劑或載體，并且與傳統(tǒng)的制藥實(shí)踐一致。對(duì)于口服給藥片劑或膠嚢形式，可將活性藥物成分與口服無毒的可藥用惰性載體例如乙醇、甘油、水等混合。此外，當(dāng)想要或必需時(shí)，適當(dāng)?shù)恼澈蟿櫥瑒?、崩解劑和著色劑也可被混入該混合物中。適當(dāng)?shù)恼澈蟿┌?沒有限制)淀粉、凝膠、天然糖例如葡萄糖或(3-乳糖、玉米甜味劑、天然或合成樹膠如阿拉伯樹膠、黃芘膠或藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。用于這些劑型的潤滑劑包括(沒有限制)油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯曱酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括(沒有限制)淀粉、曱基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等等。對(duì)于液體形式，活性藥物成分可與適當(dāng)調(diào)味的懸浮劑或分散劑例如合成或天然樹膠，如黃芘膠、阿拉伯樹膠、曱基纖維素等混合?？刹捎玫钠渌稚┌ǜ视偷取?duì)于腸胃外給藥，無菌懸浮液和溶液是理想的。當(dāng)想要靜脈內(nèi)給藥時(shí)，采用通常含有適當(dāng)防腐劑的等滲制劑。含有活性藥物成分的局部制劑可與本領(lǐng)域眾所周知的各種載體材料例如醇、庫拉索,薈膠、尿嚢素、甘油、維生素A和E油、礦物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等混合以形成例如醇溶液、局部清潔劑、清潔膏、皮膚凝月交、皮膚洗劑以及膏或凝月交配方的洗發(fā)劑。也可將本發(fā)明的化合物以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，例如以單層小質(zhì)脂體、單層大質(zhì)脂體和多層質(zhì)脂體形式給藥?？捎筛鞣N磷脂例如膽固醇、硬脂酰胺或卵磷脂來形成脂質(zhì)體。本發(fā)明化合物也可與作為可標(biāo)靶藥物載體的可溶性聚合物結(jié)合。該聚合物可包括聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基丙基曱基丙烯?；?對(duì)氨基苯酚、聚羥基-乙基天冬酰胺苯酚或被棕櫚酰殘基取代的聚氧化乙烯聚賴氨酸。此外，本發(fā)明化合物可以被偶聯(lián)到(優(yōu)選通過共價(jià)鍵)可用于達(dá)到藥物控制釋放的一類可生物降解的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚5-己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氬吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及水凝膠的交聯(lián)或兩性嵌段共聚物。膽固醇及類似的分子可被連接到適體以增大和延長生物利用度?？芍苯咏o藥該化合物(例如單獨(dú)或以脂質(zhì)體制劑或與載體復(fù)合(例如PEG))(參見例如美國專利號(hào)6,147,204、美國專利號(hào)6,011,020)。在一種實(shí)施方式中，可以使多個(gè)調(diào)節(jié)劑與單個(gè)PEG分子締合，該調(diào)節(jié)劑可用于相同或不同的適體。在其中對(duì)同一個(gè)適體有多種調(diào)節(jié)劑的實(shí)施方式中，由于與該適體的多重結(jié)合相互作用而增大了親和力。在又一實(shí)施方式中，多個(gè)PEG分子可以被彼此連接。在這種實(shí)施方式中，用于相同適體或不同適體的一種或多種調(diào)節(jié)劑可與各個(gè)PEG分子締合。這也導(dǎo)致了各調(diào)節(jié)劑對(duì)其乾的親和力增大。親脂性化合物和非免疫原性高分子量化合物，利用它可配制成本發(fā)明調(diào)節(jié)劑來用于本發(fā)明，可以通過本領(lǐng)域目前已知或后來發(fā)展的任何各種方法來制備。典型地，它們是由磷脂例如二硬脂?；字Ｄ憠A來制備，并且可包括其它材料例如中性脂質(zhì)如膽固醇、以及還有表面修飾劑如帶正電荷(例如甾基胺或氨基甘露糖或膽固醇的氨基甘露糖醇衍生物)或帶負(fù)電荷(例如二乙?；姿狨ァ⒘字；视?的化合物。可通過傳統(tǒng)方法形成多層脂質(zhì)體，即通過將所選擇的脂質(zhì)溶解于適當(dāng)溶劑中，然后蒸發(fā)該溶劑在容器里面留下薄膜，或者通過噴霧干燥來在適當(dāng)容器或管內(nèi)壁上沉積該脂質(zhì)。然后在漩渦或渦流運(yùn)動(dòng)下將一種水相加入容器中，其導(dǎo)致MLVs的形成。然后可通過MLVs的均化、超聲波降解或擠出(通過過濾器)形成UVs。在某些本發(fā)明的實(shí)施方式中，復(fù)合物包括含有靶與脂質(zhì)體表面締合的適體的脂質(zhì)體和膠嚢包著的治療或診斷劑?？筛倪M(jìn)預(yù)形成的脂質(zhì)體以與適體相締合。例如陽離子脂質(zhì)體通過靜電相互作用與核酸相締合。備選地，附連到親脂性化合物上的核酸例如膽固醇可被加入預(yù)形成的脂質(zhì)體中，由此膽固醇變得與脂質(zhì)體膜締合。備選地，在配制脂質(zhì)體期間可以使核酸與脂質(zhì)體締合。給藥方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明材料給藥到哺乳動(dòng)物宿主的優(yōu)選方式是腸胃外、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、動(dòng)務(wù);K內(nèi)、心臟內(nèi)、月幾內(nèi)、皮下、眶內(nèi)、嚢內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、局部、透皮貼劑、經(jīng)直腸、陰道或尿道栓劑、腹膜、經(jīng)皮、鼻噴霧、外科植入、內(nèi)部外科涂劑、輸液泵或經(jīng)導(dǎo)管的方式。在一種實(shí)施方式中，以緩釋制劑給藥試劑和載體例如灌輸、大丸劑、微粒、微球體、納米顆粒、或毫微球。關(guān)于治療劑型的標(biāo)準(zhǔn)信息，參見Ansel,等人，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,SixthEdition,Williams&Wilkins(1995)?？赏ㄟ^注射或隨時(shí)間逐步輸入來以非腸道方式給藥本發(fā)明的適體或調(diào)節(jié)劑。雖然通過體內(nèi)全身給藥通?？蛇M(jìn)入待治療的組織，并因此最經(jīng)常是通過靜脈內(nèi)給藥治療組合物來治療，但是仍然提供了其它組織和輸送技術(shù)，其中有可能所述的耙向組織含有耙分子。因此，本發(fā)明的適體和調(diào)節(jié)劑通常被口服、局部給藥到血管組織、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)眼，并且能夠通過蠕動(dòng)技術(shù)輸送。如上所述，將藥用組合物供給個(gè)體可通過各種途徑如口服、局部給藥到血管組織、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)眼，并且能夠通過蠕動(dòng)方法輸送。局部給藥到血管組織的非限制性的典型方法包括(1)用含有核酸配基的凝膠涂4隻或浸漬血管組織以在體內(nèi)輸送，例如通過植入涂^隻或浸漬過的血管29代替被除去或旁通的損傷或有病的血管組織段；(2)經(jīng)導(dǎo)管輸送到其中需要輸送的血管；(3)將核酸配基組合物泵送到待植入病人的血管中。備選地，通過顯微注射或脂質(zhì)體封裝可將核酸配基引入細(xì)胞。有利地，本發(fā)明的核酸配基可以是每日一次劑量給藥，或每日全部劑量分幾劑給藥。其后，以任何適當(dāng)方式提供調(diào)節(jié)劑來通過給藥該調(diào)節(jié)劑而改變核酸配基的作用。例如通過注射單位劑量，可按常規(guī)靜脈內(nèi)給藥含有本發(fā)明的多肽調(diào)節(jié)劑的治療組合物。當(dāng)關(guān)于本發(fā)明治療組合物使用術(shù)語"單位劑量"時(shí)，是指適合作為單劑量用于受治療者的完全離散單位，每個(gè)單位含有計(jì)算出的預(yù)定量活性材料，以與所需稀釋劑即載體或賦形劑聯(lián)合產(chǎn)生所需治療效果。以與給藥藥劑相容的方式給藥組合物，并且以在此所述的治療有效量給藥。合適的給藥方式是可變的，但是典型地是在初始給藥后接著以一小時(shí)或更多小時(shí)的時(shí)間間隔繼續(xù)注射或以其它方式重復(fù)劑量給藥。備選地，預(yù)期的連續(xù)靜脈內(nèi)注入足以將在血液中的濃度保持在體內(nèi)治療的指定范圍內(nèi)。在此使用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"、"生理學(xué)上容許的，，及其文法變化，當(dāng)它們是指組合物、載體、稀釋劑和試劑時(shí)，可互換使用，并且表示該材料能夠在沒有相當(dāng)大毒副作用或使毒副作用衰弱下給藥?？伤幱媒M合物包括根據(jù)已知方法例如通過可藥用載體的混合能夠配制的本發(fā)明調(diào)節(jié)劑。在Remington'sPharmaceuticalSciences中可找到這類載體和配制方法的例子。為了形成適用于有效給藥的可藥用組合物，該組合物將含有有效量的適體。該組合物可含有多于一種調(diào)節(jié)劑的混合物。實(shí)施例測試血凝固的措施血凝固的標(biāo)準(zhǔn)測量包括基于血漿的凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)測定，兩者都是在血漿和全血中，以及基于全血的活化凝固時(shí)間(ACT)進(jìn)行測定。雖然在這些測定的各個(gè)中用于引發(fā)血凝固的活化劑不同，但它們共有的特征是凝塊形成作為測定終點(diǎn)。重要的是，在這些體外測定中，低水平的凝血酶-10-30nM就足以產(chǎn)生足夠的纖維蛋白來達(dá)到終點(diǎn)。該凝血酶水平代表僅3-5%的從凝血酶原到凝血酶的轉(zhuǎn)化率，并且與凝固反應(yīng)的開始階段期間產(chǎn)生的凝血酶量一致(Butenas等人，2003;Mann等人，2003)。因此，這些測定大體上報(bào)告了凝固反應(yīng)的初始階段，而沒有充分反映在凝固的增長階段主要涉及的凝血因子的缺乏或受到的抑制的影響。舉例說明了其中標(biāo)準(zhǔn)凝固測定反映FlX/IXa活性的方式，這些測定能夠在具有嚴(yán)重血友病A(FVin缺乏)或B(FIX缺乏)的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)或未發(fā)現(xiàn)異常凝固測量值。血友病的特點(diǎn)是APTT的分離延長，因?yàn)榛佳巡〉膫€(gè)體具有異常APTTs,而不是正常PTs(Bolton-MaggsandPasi,2003)。血凝固細(xì)胞才莫型說明了關(guān)于為什么缺乏FVIII或FIX的個(gè)體記錄了正常的PTs的奇異現(xiàn)象。PT測定以超生理水平的組織因子開始，足以在11-15秒產(chǎn)生凝塊。因此，甚至在沒有FVin或FIX的條件下，用于迅速？I發(fā)反應(yīng)的高水平組織因子FVila復(fù)合物產(chǎn)生的Fxa量足以產(chǎn)生足夠的凝血酶以達(dá)到凝結(jié)終點(diǎn)。因此，甚至不期望深度抑制FIX/FIXa活性來影響PT測定，因?yàn)樵谠摐y定中，在血凝固開始時(shí)FIX的作用被掩蓋了或被忽視了。因此，不期望FIXa的藥理學(xué)抑制劑例如抗FIXa適體FIXa延長PT值。血漿或全血APTT測定兩者都是以帶電的顆粒例如硅藻土或高嶺土、磷脂表面和足量的釣開始，以在28-35秒產(chǎn)生凝塊。雖然患血友病B(和A)的個(gè)體記錄了異常的APTT值，但是在這些個(gè)體中APTT的延長的幅度是有限的(即產(chǎn)生有限值)，因?yàn)樵摐y定大體上報(bào)告了血凝固的開始階段。個(gè)體的血友病B嚴(yán)重性及其APTT值之間不是緊密相關(guān)的，因?yàn)锳PTT取決于除FIX之外的其它凝血因子。因此，用于解釋FIXa的藥理學(xué)抑制如何:故期望在APTT測定中記錄的更好框架是血漿FIX分析。血漿FIX分析是標(biāo)準(zhǔn)APTT方法的一種變化，其中在進(jìn)行APTT之前，將測試血漿在緩沖劑中稀釋并且與缺少FIX的血漿一起混合，使得在測試血漿中FIX水平是凝固時(shí)間的主要決定因素。該分析通常用于確定血友病B的嚴(yán)重性(即測定FIX水平)或用來i貪斷獲得的FIX抑制劑。通過將測試樣品的凝固時(shí)間與FIX水平標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比4支來說明FIX分析的結(jié)果，其是在與FIX不足血漿混合之前通過在緩沖劑中連續(xù)稀釋正常血漿來制備的。表1示出了利用正常的人血漿完成的典型FIX水平標(biāo)準(zhǔn)曲線[注該分析中的絕對(duì)APTT時(shí)間是由試劑決定的。如表1中所觀察到的，F(xiàn)IX水平是正常值的25%(即降低75%)時(shí)，APTT凝固時(shí)間在基線上增加1.4倍，而當(dāng)FIX水平是正常值的~3%(即降低97%)時(shí)，APTT凝固時(shí)間在基線上增加2倍，而當(dāng)FIX水平〈正常值的1%(即降低>99%)時(shí)，APTT凝固時(shí)間相對(duì)于基線增加了2.5倍。血友病B的載體(即正常FIX水平的~50%)顯示出正常的APTT值(Bolton-MaggsandPasi,2003),這與才艮據(jù)FIX水平標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的數(shù)據(jù)一致。合起來看，這些，見測顯示顯著百分比的FIX活性在APTT將纟皮延長之前必須纟皮抑制。表l.在人血漿中FIX活性檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*100%FIX水平代表正常匯合的人血漿在緩沖劑中的1:5稀釋液因?yàn)橹饕窃谑中g(shù)室和導(dǎo)管室中采用ACT測定來監(jiān)測操作期間的抗凝作用，所以關(guān)于ACT如何受到降低的FIX/FIXa活性的影響存在很少的數(shù)據(jù)，因?yàn)榛佳巡〉膫€(gè)體通常是在進(jìn)行這種操作之前被用因子替代治療(或類似治療)進(jìn)行治療。然而，由于ACT是以帶電顆粒開始的凝固終點(diǎn)測定，所以在ACT測定中FIXa的藥理學(xué)抑制效果很可能反映出在APTT測定中觀察到的那些。即，預(yù)期在直到達(dá)到實(shí)質(zhì)程度的FIXa抑制水平(>50%)之前不會(huì)觀察到ACT的延長。因此，類似于APTT測定，與采用未分級(jí)的肝素所觀察到的延長相比，ACT延長量很可能是中度的。最后，響應(yīng)FIXa抑制，該測定4艮可能達(dá)到々包和。在非臨床毒性研究中，在用各種劑量RB006處理的猴子中證明了APTT和ACT響應(yīng)的這種相j以性。的影響前述數(shù)據(jù)顯示在體外或者在靜脈內(nèi)給藥到動(dòng)物之后，抗FIXa適體沒有延長PT(Rusconi等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8;Rusconi等人，2002,Nature419(6902):90-4;Dyke,2006,Circulation.114(23):2490-7)。如圖3所示，RB006在體外在匯合的正常人血漿中引起依賴性的APTT增加。該數(shù)據(jù)指示，RB006APTT劑量-反應(yīng)曲線在0和30-50|ug/mL之間最敏感，然后開始達(dá)到平臺(tái)。包括APTT劑量-反應(yīng)曲線的上升期和平臺(tái)期的這些特征在來自其中RB006或初始抗FIX適體表現(xiàn)出交聯(lián)反應(yīng)性的所有種類的血漿中是一致的，該所有種類包括人、豬、鼠和猴子(Rusconi等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8)。響應(yīng)體外用抗FIXa適體處理血漿中達(dá)到的APTT最大值取決于所采用的APTT試劑和種類。然而重要的是，該APTT最大值與FIXa活性的完全抑制或接近完全抑制相一致。這一皮以下事實(shí)所證明，即響應(yīng)抗FIXa適體的APTT最大值等價(jià)于在含有<1%正常FIX含量(但其它所有凝固因子水平正常)的人血漿中APTT并且等價(jià)于在FIX-敲除小鼠的血漿中APTT(Ruscom等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8)。因此，響應(yīng)RB006的APTT的平臺(tái)或i午反映了由于FIX/FIXa抑制^皮適體所々包和。另夕卜，將圖3中的數(shù)據(jù)與表l中血漿FIX分析標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較提供了可深入了解RB006的效力。在~5ng/mL的RB006濃度下響應(yīng)RB006的APTT增力卩~1.44咅，指示RB006的這個(gè)濃度足以抑制~75%血漿FIX活性。此外，才艮據(jù)血漿FIX分析，在10-15|ng/mL的RB006濃度下達(dá)到幾乎95。/。的血漿FIX抑制(APTT增力。2倍)。通過測量來自個(gè)體血漿中依賴于RB006濃度的APTT的延長，已經(jīng)進(jìn)行了體外研究來評(píng)估RB006的抗凝血?jiǎng)┬Ч膫€(gè)體變異性。在匯合的4交示于圖4中。如圖4中所示，依賴于RB006濃度的APTT增加非常類似于來自每一個(gè)體的血漿中的情況。此夕卜，依賴于RB006濃度的個(gè)體血漿APTT增加非常類似于匯合的正常人血漿(每個(gè)匯合20個(gè)供體)。如ACT分析中所測得的，RB006還延長了凝固時(shí)間(Ruscom等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8)。然而，在這個(gè)時(shí)候，對(duì)作為RB006濃度的33函數(shù)的ACT變化的解釋說明是有限的，這是由于難于進(jìn)行關(guān)于ACT的體外劑量-響應(yīng)研究所致，因?yàn)樵摲治鲂枰迈r的全血，并且是時(shí)間敏感性的。已經(jīng)利用APTT分析在體外測量了RB006抗凝活性被解毒劑RB007的中和。如圖5所示，相對(duì)于在匯合的人血漿中RB006的固定濃度，RB007濃度增加了。APTT值變化恢復(fù)到基線水平，指示RB007抗凝活性被完全中和。體外人血漿中全部RB006中和所需的最小過量RB007摩爾數(shù)約為3-4倍(即抗體相對(duì)于適體寡核苦酸部分的摩爾比)。這與測得的RB006-RB007雙螺旋穩(wěn)定性是一致的(Tm為~90°C).。圖5中所示的數(shù)據(jù)也用作用于選擇非臨床安全藥理學(xué)和毒性研究及臨床實(shí)驗(yàn)中采用的解毒劑RB007相對(duì)于藥物RB006的劑量比的基礎(chǔ)。達(dá)到體外人血漿中RB006全部中和必需的相對(duì)于RB006的最小過量RB007摩爾數(shù)為3-4倍。如果得到RB007(5,269Da,鈉鹽)與RB006(-50,964Da,鈉鹽)之間的分子量差異，就將此轉(zhuǎn)換成0.5:1解毒劑藥物的重量對(duì)重量比。因?yàn)檫@是一個(gè)體外結(jié)果并因此不能預(yù)知任一成分的藥物動(dòng)力學(xué)將如何影響體內(nèi)的藥物中和，解毒劑藥物的0.5:1的重量比反映出可預(yù)期解毒劑的最小比率來有效中和該藥物。因此，解毒劑藥物的重量對(duì)重量比為2:1，小倍數(shù)的體外最低有效劑量被選擇為非臨床和臨床研究的開始劑量。總之，抗FIXa適體RB006是一種能夠完全或接近完全抑制FIXa體外活性的凝固FIXa的有效抑制劑。利用APTT和ACT分析可有效地監(jiān)測RB006的抗凝活性，正如適體活性能被被RB007中和一樣。由體外研究可得，關(guān)于RB006已經(jīng)很好地確定了FIX抑制百分比與APTT變化之間的關(guān)系。由體外研究已經(jīng)定義了足以達(dá)到適體活性完全抑制的解毒劑與適體的適當(dāng)摩爾比，該研究得到了被選擇用于REG1抗凝系統(tǒng)的0.5:1的解毒劑:適體劑量比。非臨床藥理學(xué)、藥物分布和毒性REG1抗凝系統(tǒng)及其個(gè)別藥物和解毒劑組分的藥理學(xué)活性(或效力專交小的藥物和解毒劑的原型，分別被稱為RB002和RB004)在體外和臨床相關(guān)動(dòng)物模型中得到了證明。在豬全身抗凝研究(Rusconi等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8)、羊心肺旁路模型和獼猴安全藥理學(xué)研究中評(píng)估了抗FIXa適體的抗凝活性。還在小鼠動(dòng)脈損害模型中證明了抗FIXa適體的抗血栓活性(Rusconi等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8)。在體外人血漿(Ruscom等人，2002,Nature419(6902):90-4)、豬全身抗凝模型、小鼠手術(shù)創(chuàng)傷模型(即高度抗凝血的動(dòng)物的尾部橫切)(Rusconi等人，2004,NatBiotechnol.22(11):1423-8)、羊心肺旁路模型和獼猴安全藥理學(xué)研究中證明了解毒劑的藥物中和活性。另外，在豬全身抗凝研究中證明了解毒劑中和先前的藥物劑量后不久將要被再給藥的藥物能力。REG1抗凝系統(tǒng)的藥物動(dòng)力學(xué)表征需要依賴于新方法論的生物分析策略來確定血漿樣品中適體、解毒劑和適體/解毒劑復(fù)合物的量。將這些方法應(yīng)用于從體內(nèi)毒性研究中收集的樣品，其容許在單次或重復(fù)給藥到猴子和小鼠的條件下測定全部三種分子實(shí)體的藥物動(dòng)力學(xué)。進(jìn)行REG1抗凝系統(tǒng)的徹底的安全性評(píng)估，在初始臨床實(shí)驗(yàn)中模擬該產(chǎn)品目的用途的給藥條件下(即連續(xù)給藥適體3小時(shí)，接著給藥解毒劑)，在猴子和小鼠中進(jìn)行主要毒性研究。在與目的臨床用途相同的劑量比下測試從小至大多個(gè)臨床用的各成分，并且分別測試兩個(gè)種類的適體和解毒劑的效果。在兩者的猴子研究中，根據(jù)模擬初期臨床實(shí)驗(yàn)中預(yù)計(jì)給藥的計(jì)劃中有許多治療組接受單次劑量適體、解毒劑或兩種測試物。而且，在14天小鼠研究和在單次和重復(fù)給藥的猴子毒性研究中，包括在兩周期間給藥重復(fù)的劑量的組(給小鼠14個(gè)每日劑量，而給猴子7個(gè)劑量，每隔一天一次持續(xù)兩周)。在毒性研究中包括了特定的終點(diǎn)來評(píng)估對(duì)于REG1組分的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)和寡核苷酸的分類效果。用在猴子中的安全藥理學(xué)評(píng)估(采用生物遙測學(xué))、一組遺傳毒性測試和血液相容性研究來補(bǔ)充核心的毒性研究。在豬中的抗凝活性和藥物中和效能的研究在豬全身抗凝血才莫型中評(píng)估在解毒劑RB007中和初始劑量適體后再給藥適體RB006的能力。在這些研究中，在給藥解毒劑后30分鐘給藥第二劑藥物。選擇給藥解毒劑和再給藥適體之間的30分鐘窗口以使首次適體劑量的抗凝活性中和作用能夠清楚地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證明。如圖6中所示，達(dá)到第二劑適體抗凝活性峰的抗凝活性峰值和時(shí)間基本上與初始適體劑量相同，證明解毒劑中和適體的首次劑量后再給藥適體是可行的。這些數(shù)據(jù)與在小鼠和猴子兩者中所觀察到的RB007藥物動(dòng)力學(xué)一致，其指示RB007具有非常短的血漿半衰期(即幾分鐘)，并且甚至在明顯高于該研究所采用的劑量下，也沒有積聚成可察覺的血漿濃度。考慮到解毒劑的半衰期，或許能夠在給藥解毒劑后有效地以短于30分鐘的時(shí)間間隔再給藥該適體。在羊心肺分流術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路移才直(CABG)中REG1抗凝系統(tǒng)的效力在冠狀血管再生術(shù)[冠狀動(dòng)脈分流術(shù)移植(CABG)和經(jīng)皮心臟介入(PCI)]中，REG1可用作解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)?，作為解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)┯糜诨颊?，包括患急性冠脈綜合癥的人，并且作為用于其它征兆的抗凝血?jiǎng)?，其中使用解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)┯糜诳鼓蚩寡ㄐ纬芍委熓怯欣?。在此所述的研究試圖定義在進(jìn)行具有CPB的CABG手術(shù)的動(dòng)物中保持心肺旁路(CPB)回路開放所必需的REG1抗凝成分RB006的劑量范圍，并且試圖定義在該才莫型中中和RB006所需REG1解毒劑成分RB007的相應(yīng)劑量。在冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)開始時(shí)將RB006(抗凝血?jiǎng)?4爭月永內(nèi)給藥到10只羊，在手術(shù)結(jié)束時(shí)，靜脈內(nèi)供給RB007(RB006中和劑)以逆轉(zhuǎn)RB006的效果。在28士3天后，將所有動(dòng)物安樂死。收集左右腎、肝、肺及全腦的典型樣品。用乳酸化的林格氏溶液或生理鹽水沖洗心臟直至清除了血液并且在10%中性緩沖的福爾馬林(NBF)下將壓力灌流固定在~100mmHg持續(xù)6小時(shí)。完全固定后，將心臟置于10MNBF中。用100/oNBF浸漬固定在^驗(yàn)尸期間收集的典型組織樣品。以大約每個(gè)1cm將心臟橫切(土司面包型)并且檢查其異常性。從每個(gè)心臟收集IO個(gè)切片并且在石蠟中加工。10片中的3片包括LCX融合、大動(dòng)樂;K融合和中間移才直。剩下的7片包括右心房壁、左心房壁、心房間隔膜、右心室游離壁、左心室游離壁、心室間隔膜和尖端。將含有心肌組織的所有石蠟塊切片兩次，一次用于用蘇木精或曙紅(H&E)著色，并且一次用于用Masson'sVerhoeffElastin(MVE)著色。將腎、肝、肺及腦樣品插入石蠟中并且如下切片從每個(gè)腎切一片，從每個(gè)肝切一片，從每個(gè)肺切一片，以及從四個(gè)腦組織樣品中的每個(gè)切一片，總共8個(gè)切片。將所得全部載物片用H&E著色。關(guān)于該研究的宏觀觀察和組織學(xué)關(guān)系指示大部分損傷要么涉及手術(shù)操作(例如粘連)，要么涉及安樂死(例如在氣管和支氣管中的泡沫)。粘連是這類手術(shù)操作的普通后遺癥并且在該研究中不認(rèn)為是過多的。在一種動(dòng)物的大動(dòng)脈融合處有少量、最小限度依附的血栓。該血栓似乎沒有阻塞血液流入移才直物。對(duì)于該7見測沒有特定的樣0見相關(guān)物。在融合位置的微觀發(fā)現(xiàn)在類型和幅度方面與兩組中的其它研究動(dòng)物相類似。有一種例外，在任何研究動(dòng)物中的冠狀動(dòng)脈旁路的任何部分內(nèi)都沒有血栓癥或閉塞的目視跡象。偶然的血栓形成在該模型中不是罕見的，因此，與RB006給藥的關(guān)系被認(rèn)為是值得懷疑的。在獼猴中REG1抗凝系統(tǒng)的藥物動(dòng)力學(xué)活性在APTT分析中隨濃度而定的凝固時(shí)間延長反映了在獼猴血漿中RB006的體外抗凝活性。如圖7中可見，RB006APTT劑量-響應(yīng)曲線在0和50pg/mL之間是最敏感的，然后是平臺(tái)，如關(guān)于其它種類已經(jīng)看到的。猴子和人劑量-響應(yīng)曲線是類似的，除了在人中響應(yīng)范圍更大。在人血漿中，在達(dá)到約200jug/mL之前有依賴于濃度的APTT延長，而在猴子血漿中，濃度-響應(yīng)曲線在大約50)ug/mL時(shí)達(dá)到平臺(tái)。人血漿曲線的平臺(tái)出現(xiàn)在APTT值等價(jià)于含有〈1。/。血漿FIX活性的人血漿中觀察到的值處，并且很可能是由于將靶FIXa飽和所致。進(jìn)行血漿FIX分析以有助于解釋猴子血漿中的RB006APTT劑量-響應(yīng)曲線。如表2中所示，猴子血漿中的APTT對(duì)FIX水平敏感。然而對(duì)于FIX水平降低的響應(yīng)值是適度的。FIX水平降低75。/。導(dǎo)致APTT增加1.4倍，F(xiàn)IX水平降低〉95%導(dǎo)致APTT加倍，而血漿FIX水平降低99.9%導(dǎo)致APTT增加2.5倍。表2:在獼猴血漿中FIX活性分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>*100%FIX水平代表匯合的正常獼猴血漿在緩沖劑中的l:5稀釋液。人的缺少FIX的血漿(GeorgeKingBiomedical)被用作缺少FIX的血漿源。將圖7中的數(shù)據(jù)與表2中的陳列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較指示，抑制猴子血漿約卯％的FIX活性需要~6pg/mLRB006(即，該濃度產(chǎn)生APTT增加1.6倍)，而>95%的血漿FIX活性抑制發(fā)生在RB006濃度為10-12|ug/mL時(shí)。體外RB006猴子APTT劑量-響應(yīng)曲線的平臺(tái)是在基線上增加約2.5倍時(shí)(基線24秒，APTT最大值-60秒)，其與猴子血漿FIX分析中在<0.1%正常FIX水平時(shí)所觀察到的APTT增加值一致(參見表2)。因此，RB006APTT劑量-響應(yīng)曲線中平臺(tái)可能代表猴子血漿中耙被飽和(即FIX活性被完全抑制)。最后，體外猴子血漿中FIX抑制o/。與血漿RB006濃度的關(guān)系曲線通常類似于在體外人血漿中所觀察到的，主要差異是在基線和APTT最大值之間的RB006濃度范圍在人中更大，而劑量響應(yīng)增加在人血漿中比在猴子血漿中更平緩。獼猴中RB006和RB007體內(nèi)活性在猴子安全藥理學(xué)研究REG1-TOX001中評(píng)估了RB006和RB006/RB007復(fù)合物的抗凝血性能與這些化合物血漿含量之間的關(guān)系，簡要地，將12只猴子分配到三個(gè)治療組。組1接受抗FIXa適體RB006,組2接受RB006的解毒劑RB007,以及組3用REG1抗凝系統(tǒng)處理，即RB006后接著RB007(3小時(shí)之后)。在兩種數(shù)量的測試品中逐步增加劑量，第一劑發(fā)生在研究的第4天，而第二劑發(fā)生在第13天。為了更好地理解RB006劑量-響應(yīng)，將分配到第1組的4只猴子(RB006,單獨(dú)適體)在第13天再細(xì)分成兩組，讓兩個(gè)動(dòng)物接受低劑量(組la,5mg/kgRB006),而讓兩個(gè)動(dòng)物接受高劑量(組lb,30mg/kgRB006)。如圖8中所示，以范圍為5-30mg/kg的劑量給藥RB006導(dǎo)致猴子中抗凝水平極深。在給藥RB006后自0.25-24小時(shí)在每個(gè)劑量水平下的平均APTT超過60秒，其等價(jià)于在猴子中<0.1%正常血漿的FIX水平。響應(yīng)于給藥RB006有依賴于劑量的APTT增加。然而，劑量-響應(yīng)不是立即顯而易見的，這是由于事實(shí)上在給藥RB006后6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)以內(nèi)，RB006血漿水平超過體外APTT劑量-響應(yīng)曲線達(dá)到平臺(tái)時(shí)的濃度(-40-50pg/mL;參見表3和圖7)。在給藥RB006超過6小時(shí)后的時(shí)間，RB006濃度降至該水平以下，劑量-響應(yīng)更加明顯。緊接著APTT直至其回到猴子接受5和15mg/kg劑量RB006時(shí)的基線。在5mg/kg劑量水平時(shí)平均APTT經(jīng)120小時(shí)回到基線，而在l5mg/kg劑量水平時(shí)經(jīng)192小時(shí)，這與體外APTT劑量-響應(yīng)曲線(圖7)和在猴子中觀察到的RB006半衰期約為12小時(shí)(參見表3)相一致。APTT數(shù)據(jù)(未示出)反映了全血活性凝固時(shí)間(ACT)的數(shù)據(jù)。利用雙寡雜交ELISA分析，在給藥RB006后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。如表3所示，RB006濃度增加作為給藥劑量的函數(shù)，并且RB006的半衰期在12小時(shí)范圍內(nèi)。與圖8中所示數(shù)據(jù)一致，RB006血漿水平(表3)與圖7中所示體外劑量-響應(yīng)曲線的比較指示在所有劑量水平給藥RB006后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)動(dòng)物抗凝血程度極深。這些劑量水平很好地在建議的臨床范圍之上。在組la動(dòng)物中在給藥后24小時(shí)的RB006平均濃度和這些動(dòng)物的平均APTT之間具有才及好的對(duì)應(yīng)性。在24小時(shí)用5mg/kgRB006處理的動(dòng)物的RB006平均濃度為15.9|ug/mL，而平均APTT為61.1秒。根據(jù)猴子體外RB006劑量-響應(yīng)曲線，這很有利地與預(yù)期結(jié)果相當(dāng)(參見圖7)。因此，該研究確認(rèn)了APTT可用于在用RB006處理的猴子中監(jiān)測抗凝血水平，并且該數(shù)據(jù)支持采用APTT監(jiān)測初期臨床研究中接受RB006的人的抗凝血狀態(tài)。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*對(duì)于第13天給藥，將動(dòng)物分成組la(5mg/kg)和lb(30mg/kg)。對(duì)于這些劑量水平，記錄每個(gè)劑量水平的兩個(gè)動(dòng)物的平均血漿水平。在預(yù)先的劑量時(shí)間點(diǎn)存在于組la和lb的動(dòng)物中的RB006是來自第4天15mg/kg劑量的殘余RB006。該分析的LLOQ<0.04|ug/mL。在僅用解毒劑RB007處理的組2動(dòng)物中，平均APTT和ACT不受在任一測試的劑量水平(30和60mg/kg)下給藥RB007的影響。利用雙寡雜交ELISA分析，在給藥RB007后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。如表4所示，低但可測量的解毒劑量存在于在第4天注射30mg/kg或第13天注射60mg/kg后0.25小時(shí)接受RB007的動(dòng)物血漿中。這些量可變性極大，但通常是依賴于劑量的。與靜脈內(nèi)注射后適體濃度(組l)相比，解毒劑的后給藥水平非常低。因此，顯而易見的是，當(dāng)單獨(dú)給藥時(shí)，解毒劑在血漿中具有非常短的半衰期，并且在注射后15分鐘內(nèi)大體上#:從循環(huán)中清除掉。表4,組2HEGNTOX001RB007血漿水平(jig/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>來自用RB006處理，接著用RB007處理3小時(shí)后的動(dòng)物(組3)的APTT數(shù)據(jù)示于圖9中。與來自^叉用RB006處理的動(dòng)物的數(shù)據(jù)一致，以這些劑量水平給藥RB006產(chǎn)生極高的抗凝血水平，在給藥后0.25和3小時(shí)的平均APTT's與在兩種劑量水平基本上完全的FIX抑制相一致。后來RB007的給藥迅速并完全地中和了猴子中RB006的抗湊是效果，在RB006/RB007兩者的測試劑量水平上，平均APTT在給藥RB007(所取第一時(shí)間點(diǎn))后15分鐘內(nèi)回到基線。在用30/60mg/kgRB006/RB007處理的組3動(dòng)物中，在RB006給藥5天后，跟著給藥APTT。在該時(shí)間期限內(nèi)收集的APTT數(shù)據(jù)表明RB006抗凝效果被持久地中和，在120小時(shí)內(nèi)沒有抗凝作用回彈的跡象，或在猴子中約為10個(gè)RB006的半衰期(圖9)。解毒劑RB007對(duì)RB006抗凝活性的中和作用的持久性與所觀察到的該藥物_解毒劑復(fù)合物的熱力學(xué)穩(wěn)定性完全一致。在組3動(dòng)物中給藥RB006后24小時(shí)收集毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(表5)。對(duì)于組3動(dòng)物，測量游離RB006(即未被RB007結(jié)合的RB006)和復(fù)合RB006(即被RB007結(jié)合的RB006)血漿濃度兩者。與圖9中所示APTT數(shù)據(jù)一致，在給藥后0.25和3小時(shí)的RB006平均血漿濃度是十分高的。在給藥RB00715分鐘內(nèi)，游離RB006平均濃度下降5，000-10,000倍，達(dá)到j(luò)氐于所采用的該分析定量的下限(LLOQ)的水平。在15/30和30/60mg/kg劑量水平下，伴隨游離RB006含量下降，復(fù)合RB006的平均血漿濃度在從該分析LLOQ以下分別增加到~125-220pg/mL,指示由于RB007與RB006結(jié)合而游離RB006濃度迅速下降。在RB007給藥后3小時(shí)，游離RB006濃度保持在該分析LLOQ以下，這與APTT結(jié)果相一致。在給藥RB007后21小時(shí)(給藥RB006后24小時(shí))，在幾個(gè)動(dòng)物中可發(fā)現(xiàn)非常少量RB006(僅平均0.17|iig/mL或更少)。然而這些RB006量太少而不能產(chǎn)生可測量的抗凝效果，這與在用REG1抗凝系統(tǒng)處理的動(dòng)物中在24小時(shí)和更久沒有APTT延長相一致。表5.組3REG1-TOX001游離和復(fù)合RB006血漿水平(昭/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*計(jì)算中包括1個(gè)在<0.04pg/mL的LLOQ的動(dòng)物**計(jì)算中包括3個(gè)在<0.04jig/mL的LLOQ的動(dòng)物在抽血3小時(shí)后立即在t=3小時(shí)給藥RB007。(ND)未測定在猴子中非臨床藥理學(xué)研究概述所列的研究證明了RB006是猴子的有效抗凝血?jiǎng)?，在以超臨床劑量靜脈內(nèi)團(tuán)注后24小時(shí)或更長的時(shí)間能夠達(dá)到基本上完全抑制FIX活性持續(xù)。比較猴子體外RB006抗凝活性研究與由安全藥理學(xué)研究所得的APTT和毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)證明了預(yù)期和觀察到的APTT延長與血漿RB006濃度關(guān)系曲線之間的良好對(duì)應(yīng)性。因此，APTT分析將被用作監(jiān)測由給藥RB006引起的抗凝作用的有利工具。人和猴子體外RB006-APTT劑量-響應(yīng)曲線之間的相似性啟示由該猴子研究(REG1-TOXOOl)以及在猴子中進(jìn)行的全身大毒性研究(REG1-丁0又003)所得數(shù)據(jù)將用作預(yù)測人對(duì)給藥RB006的響應(yīng)的有益指導(dǎo)。最后，來自REG1-TOXOOl的APTT和毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)證明RB007是非常有效的RB006解毒劑。在RB006治療動(dòng)物的靜脈內(nèi)團(tuán)注給藥RB007后15分鐘內(nèi)，平均APTT時(shí)間回到RB006前治療水平并且保持在該基線水平持續(xù)整個(gè)監(jiān)測期(120小時(shí)以內(nèi))。所觀察到的RB007對(duì)RB006抗凝活性的中和作用可得到毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的充分支持，并且與測得的RB006-RB007復(fù)合物熱力學(xué)穩(wěn)定性相一致。毒性動(dòng)力學(xué)研究證明游離RB006水平在給藥RB007后的15分鐘內(nèi)降低到該分析的LL0Q以下，伴發(fā)復(fù)合RB006濃度顯著增加，并且對(duì)于毒性動(dòng)力學(xué)分析持續(xù)時(shí)間(給藥RB006后24小時(shí))沒有可評(píng)估的游離RB006水平增加。因此，猴子研究所得數(shù)據(jù)證明關(guān)于由靜脈內(nèi)團(tuán)注適體、接著在靜脈內(nèi)團(tuán)注解毒劑下迅速、完全和持久地中和適體活性而達(dá)到穩(wěn)定、持久和可監(jiān)測的抗凝作用，REG1抗凝系統(tǒng)的表現(xiàn)如預(yù)計(jì)的那樣。REG1抗凝系統(tǒng)的這種性能可在由低到高的多種預(yù)計(jì)的臨床劑量范圍下達(dá)到(即用于毒性研究的適當(dāng)劑量)，但對(duì)動(dòng)物沒有不利影響。REG1毒性動(dòng)力學(xué)人們改進(jìn)了生物分析方法并證實(shí)其能夠量化猴子和小鼠血漿中的游離適體(RB006)、游離解毒劑(RB007)和適體/解毒劑(RB0(^/RB007)復(fù)合物的濃度。將這些方法應(yīng)用于分析從猴子安全藥理學(xué)研究(研究號(hào)REG1-TOX001)、14天小鼠研究(研究號(hào)REG1-TOX002)以及猴子的單次/重復(fù)劑量研究(研究號(hào)REGl-TOX003)中收集的樣品。對(duì)于全部三種研究，包括單獨(dú)接受適體、或單獨(dú)接受解毒劑、或接受適體3小時(shí)后接受解毒劑的分別的動(dòng)物組。所有研究中在多種劑量水平的各治療條件下進(jìn)行測試，并且這些研究中的兩種(14天小鼠研究和猴子的單次/重43復(fù)劑量研究)也采用重復(fù)給藥測試物。在這些研究中測試的適體的劑量水平范圍是對(duì)于猴子為0.25-45mg/kg以及對(duì)于小鼠為2.5-22.5mg/kg。測試解毒劑的劑量是那些適體的兩倍(即猴子90mg/kg以內(nèi)，而小鼠45mg/kg以內(nèi))。該比率類似于打算用于臨床實(shí)驗(yàn)的比率。對(duì)于全部三種研究，關(guān)于證明REG1抗凝系統(tǒng)的以下性能，毒性動(dòng)力學(xué)結(jié)果是相似的-在靜脈內(nèi)注射后，適體血漿濃度在寬劑量范圍內(nèi)是與劑量成比例的，具有適度的動(dòng)物間變化，在猴子或小鼠中沒有明顯的性別差異。-從血漿清除適體比較慢(即估計(jì)半衰期對(duì)于猴子至少為12小時(shí)，而對(duì)于小鼠為8小時(shí))。這種緩慢清除可根據(jù)適體的聚乙二醇化結(jié)構(gòu)而預(yù)期，并且與關(guān)于其它聚乙二醇化的寡核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)的文獻(xiàn)記錄相一致。才艮據(jù)測量藥效標(biāo)記，即活化部分l是血激酶時(shí)間和活化i凝血時(shí)間，適體的最小清除率結(jié)合其高IX因子抑制效力在6小時(shí)期間提供了相對(duì)穩(wěn)定的抗凝血程度。該特性是REG1抗凝系統(tǒng)的適體組分的理想性能。-靜脈內(nèi)團(tuán)注解毒劑(沒有用適體在先治療)在血漿中產(chǎn)生非常低的水平，甚至是在注射后第一取樣時(shí)間(10-15分鐘)時(shí)。在這些早期時(shí)間測量的解毒劑水平是低于適體的那些測量值的數(shù)量等級(jí)(即與已經(jīng)單獨(dú)接受了適體的那些組中適體水平相比)，盡管事實(shí)上解毒劑劑量水平是兩倍高。總起來說，解毒劑數(shù)據(jù)指示，當(dāng)單獨(dú)提供時(shí)，其在血漿中具有非常短的半衰期。當(dāng)以比較高劑量水平(30mg/kg)每隔一天給猴子給藥7劑(14天)時(shí)，沒有出現(xiàn)解毒劑在血漿中積聚。-對(duì)于接受適體3小時(shí)后接著接受解毒劑的組(即完全的REG1抗凝系統(tǒng))，游離適體濃度在給藥解毒劑后數(shù)分鐘內(nèi)急劇降低至低于或稍高于定量限度(采用敏感度高的雜交型分析)，指示循環(huán)的適體被解毒劑完全結(jié)合。如用解毒劑單獨(dú)處理所見的，在這些條件下具有非常低水平的游離解毒劑。適體與解毒劑的結(jié)合產(chǎn)生事實(shí)上適體活性完全被中和(即凝固參數(shù)的正常化)，與REG1抗凝系統(tǒng)的預(yù)計(jì)性能相一致。-與除去游離適體同時(shí)，檢測到適體/解毒劑復(fù)合物在血漿中的水平與適體和解毒劑完全結(jié)合相一致。以稍快于游離適體的速率從血漿中除去該復(fù)合物(即，通過與僅用適體處理的組中的適體清除速率進(jìn)行比較)，但是比游離解毒劑的速率低得多，如由該復(fù)合物(得自適體)內(nèi)存在聚乙二醇部分可預(yù)期的那樣。顯而易見的是在給藥解毒劑后21小時(shí)內(nèi)從血漿中廣泛除去了適體/解毒劑復(fù)合物。在將適體和解毒劑(REG1抗凝系統(tǒng))兩周每天重復(fù)給藥到猴子時(shí)，在血液中沒有該復(fù)合物積聚或游離的適體積聚，適體藥物動(dòng)力學(xué)沒有變化(即在給藥解毒劑之前的時(shí)期)，并且沒有由適體產(chǎn)生的累積抗凝血作用跡象。-在小鼠和猴子藥物動(dòng)力學(xué)之間僅有的差異是在猴子中適體半衰期略長(至少12小時(shí)，與在小鼠中8小時(shí)相比)。人的REG1臨床使用在選擇哪種抗凝方法用于個(gè)體病人或病人群體方面，臨床醫(yī)生權(quán)4軒了各種藥理學(xué)策略的特征。記住抗凝作用的主要不利效果是出血(即藥理學(xué)過度)，對(duì)于緊急醫(yī)護(hù)指示，理想的抗凝血?jiǎng)┦莑)靜脈內(nèi)或皮下可輸送的；2)立即治療的；3)易于給藥以致不需要頻繁監(jiān)測，并且最重要的是4)立即并且可預(yù)測地逆轉(zhuǎn)。為了回應(yīng)這種未滿足的醫(yī)療需求即需要有效、安全并且可迅速逆轉(zhuǎn)的抗凝血?jiǎng)?，已?jīng)改進(jìn)了REG1抗凝系統(tǒng)。在需要這種處理的處理人及其它動(dòng)物的許多臨床應(yīng)用中可采用REG1。例如，在與動(dòng)脈疾病和閉塞有關(guān)的冠狀和外周血管再生術(shù)中，REG1可用作解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)Ｌ貏e是在冠狀血管再生術(shù)(冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)和經(jīng)皮心臟介入(PCI))中，REG1可用作解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)?，作為用于急性冠脈綜合癥患者的解毒劑可逆的抗凝血?jiǎng)?，以及作為用于其它征兆的抗凝血?jiǎng)?，在這些征兆中采用解毒劑可逆劑有利于抗凝血或抗血栓形成治療。本發(fā)明方法可用于的病癥和手術(shù)包括但不限于外周血管移植術(shù)，其包括與回腸、頸動(dòng)脈、臂、大動(dòng)脈、腎、腸系膜、股動(dòng)脈、腿彎部、脛骨、和腹膜脈管相關(guān)聯(lián)的那些，預(yù)防深度靜脈血栓、預(yù)防矯形手術(shù)后或癌癥患者中的肺栓塞、預(yù)防心房纖維性顫動(dòng)、預(yù)防血栓形成中風(fēng)；以及需要血液體外循環(huán)的指征，其包括(但不限于)血液透析和體外膜式產(chǎn)氧。本發(fā)明方法可用于的潛在病癥和手術(shù)的另外例子包括(但不限于)進(jìn)行心內(nèi)心肺旁路手術(shù)的患者；具有心內(nèi)血塊形成或外周栓塞的患者；以及處于其它凝固性過高狀態(tài)的患者。本發(fā)明方法也可用于預(yù)防不能動(dòng)的病人的DVT和肺栓塞以及可用于保持留置靜脈內(nèi)導(dǎo)管和動(dòng)脈或靜脈管道的效能。REG1的抗凝血成分RB006的劑量范圍將取決于征兆。例如，RB006劑量可以是在人中為約0.1mg/kg-約10mg/kg。在某些征兆中，劑量范圍可以是約.5mg/kg—約9mg/kg、約.75mg/kg—約8mg/kg、約1mg/kg一纟々7mg/kg、纟々1.5mg/kg-責(zé)々6.0mg/kg、i1々2.0mg/kg—《令5.0mg/kg、約2.5mg/kg-約4.0mg/kg.。在某些征兆中，以保持手術(shù)開^L所需的劑量來給藥藥物成分。在某些征兆中，單獨(dú)給藥RB006,沒有隨后給藥中和解毒劑。中和或部分中和RB006所需的REG1解毒劑成分RB007的相應(yīng)劑量范圍取決于RB006的給藥量。以解毒劑藥物重量比(解毒劑毫克數(shù):藥物毫克數(shù))，解毒劑劑量范圍可以是約0丄1-約20:1、約.25:l-約15:1、約.5:1-約12:1、約.75-約10:1、約1:1-約9:1、約1.5:1-約8:1、約2:1-約7.5:1、約2.5:1—約6:1、約3:1-約5:1.。對(duì)其臨床應(yīng)用安全有信心的REG1抗凝系統(tǒng)的最重要性能是解毒劑以依賴于劑量的方式可預(yù)測地逆轉(zhuǎn)適體的藥理學(xué)活性的早已確立的能力。對(duì)人的REG1抗凝系統(tǒng)的評(píng)估該研究是首次對(duì)人進(jìn)行REG1抗凝系統(tǒng)評(píng)估。在健康人志愿者中進(jìn)行REG1抗凝系統(tǒng)的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量-梯度研究。在該研究中，受治療者^皮隨機(jī)地分配到三條線路之一、為4個(gè)不同劑量水平之一的凈皮研究物或安慰劑。在每條線路的每個(gè)劑量水平，受治療者被隨機(jī)安排為7:1的治療對(duì)安慰劑，受治療者接受REG1或安慰劑。全部安慰劑注射采用0.9%USP氯化鈉注射液。隨機(jī)安排受治療者來接受每一劑量水平的REG1或安慰劑。為了使參與該研究的受治療者風(fēng)險(xiǎn)減至最小并且使其安全性最大化，以如下順序指定三條線路線路1:安慰劑藥物緊接著活性RB007解毒劑成分或安慰劑藥物緊接著安慰劑解毒劑；線路2:活性RB006藥物緊接著活性RB007成分或安慰劑藥物緊接著安慰劑解毒劑；線路3:活性RB006藥物緊接著安慰劑解毒劑或安慰劑藥物緊接著安慰劑解毒劑。；線路1評(píng)估REG1抗凝系統(tǒng)的解毒劑成分(RB007)。該線路中每個(gè)受治療者在0時(shí)間(即首次團(tuán)注給藥的時(shí)間)接受安慰劑注射，3小時(shí)以后，該受治療者接受靜脈內(nèi)注射活性解毒劑成分(RB007)，同時(shí)一個(gè)受治療者接受安慰劑。線路2評(píng)估REG1抗凝系統(tǒng)的活性藥物成分(RB006)緊接著REG1抗凝系統(tǒng)的活性解毒劑成分(RB007)的組合。該線路中的受治療者在O時(shí)間接受活性藥物成分(RB006)注射，并且一個(gè)接受安慰劑。3小時(shí)以后，接受活性藥物成分的受治療者接受注射活性解毒劑成分(RB007),同時(shí)接受安慰劑代替藥物成分的一個(gè)受治療者接受安慰劑代替解毒劑。線路3評(píng)估REG1抗凝系統(tǒng)的活性藥物成分(RB006)。該線路中的受治療者在0時(shí)間接受活性藥物成分(RB006)注射，并且一個(gè)接受安慰劑代替解毒劑。3小時(shí)以后，全部受治療者接受安慰劑代替解毒劑。在4個(gè)劑量水平上給藥活性研究藥物成分(RB006):(l)低劑量(l5mgRB006);(2)中低劑量(30mgRB006);(3)中高劑量(60mgRB006);以及(4)高劑量(90mgRB006)。選擇開始劑量和隨后的增加達(dá)到最大血漿濃度目標(biāo)，其定義了在匯合的正常人血漿中RB006體外APTT劑量響應(yīng)曲線的三(3)個(gè)關(guān)4建方面在RB006體外劑量響應(yīng)曲線中APTT開始上升時(shí)達(dá)到最大血漿濃度目標(biāo)的低劑量(4jag/mL);二(2)個(gè)在RB006體外APTT劑量響應(yīng)曲線中支持IC50達(dá)到血漿濃度目標(biāo)的中劑量(~8-16|ug/mL);以及在體外RB006APTT劑量響應(yīng)曲線開始穩(wěn)定時(shí)達(dá)到血漿濃度目標(biāo)的高劑量(~25|Lig/mL)。在等價(jià)于兩倍藥物(RB006)劑量水平(基于mg/kg)的四(4)個(gè)相應(yīng)劑量水平下給藥活性研究解毒劑成分(RB007):(l)低劑量(30mgRB007);(2)中低劑量(60mgRB007);(3)中高劑量(120mgRB007);以及(4)高劑量(180mgRB007)。表6略述了用于1A這個(gè)階段研究的每一線路中的劑量。在一(1)分鐘期間注射來提供各研究藥物成分(RB006)、研究解毒劑成分(RB007)、及其各自安慰劑。在0時(shí)間提供REG1研究藥物成分或安慰劑并且在三(3)小時(shí)后提供解毒劑成分或安慰劑。表6:三條治療線路la階段計(jì)劃劑量組線路1:線路2:線路3:安慰劑藥物(RB006),mg藥物(RB006),mg+++解毒劑解毒劑(RB007),mg安慰劑(RB007),mg劑量水平1:30153015低劑量劑量水平2:60306030低中劑量劑量水平3:1206012060中高劑量劑量水平4:1809018090高劑量在健康志愿者中評(píng)估REG1以測定安全性曲線并描述REG1抗凝系統(tǒng)的PK和PD響應(yīng)。該研究是首次將利用適體和適體的低解毒劑核苷酸的抗凝系統(tǒng)給藥到人。結(jié)果指示在靜脈內(nèi)團(tuán)注藥物之后可見APTT劑量響應(yīng)曲線，在靜脈內(nèi)團(tuán)注解毒劑之后迅速持久地回到APTT基線。ACT遵循與APTT類似的圖形。與基線相比PT仍然沒有變化。在零時(shí)間以靜脈內(nèi)團(tuán)注射將RB006或0.9%生理鹽水給藥到受治療者，通過超時(shí)測量血漿APTT來評(píng)估該治療的抗凝血效果(圖10)。每個(gè)治療組的APTT值被表示為相對(duì)APTT的平均值土SEM。相對(duì)APTT是單個(gè)受試者在給定取樣時(shí)間的APTT值除以給藥RB006前受治療者的APTT基線值。值1指示對(duì)于RB006沒有響應(yīng)，而值>1指示一種抗凝血效果。當(dāng)RB006劑量從15mg逐步上升到60mg時(shí)，在相對(duì)APTT值中可觀察到清楚的劑量-響應(yīng)。通過APTT分析評(píng)定的RB006藥效活性半衰期似乎至少為12-18小時(shí)，因?yàn)檫@是用60mgRB006治療的受治療者的平均相對(duì)APTT衰減到在用30mgRB006治療的受試者中所觀察到的最大相對(duì)APTT所需要的時(shí)間。在零時(shí)間以靜脈內(nèi)團(tuán)注方式將RB006或0.9%生理鹽水(安慰劑)48給藥到受治療者，然后在給藥RB006后3小時(shí)以靜脈內(nèi)團(tuán)注方式將RB007或安慰劑給藥到受治療者，通過超時(shí)測量血漿APTT來評(píng)估RB006治療的抗凝血效果(圖11)。每個(gè)治療組的APTT值纟皮表示為相對(duì)APTT的平均值±SEM。相對(duì)APTT是個(gè)別受試者在給定取樣時(shí)間的APTT值除以給藥RB006前受治療者APTT的基線值。當(dāng)RB006劑量從15mg逐步上升到90mg時(shí),在相對(duì)APTT值中可^見察到清楚的劑量-響應(yīng)。給藥RB007導(dǎo)致RB006藥理學(xué)活性被完全、迅速(5分鐘內(nèi))且持久地中和，如給藥RB007后相對(duì)APTT回到基線值所證明的。如以上圖10和11所述的治療。在用60mgRB006治療后接著在3小時(shí)用RB007與用安慰劑治療的受試者中進(jìn)行藥效響應(yīng)比較證明了RB007的迅速且持久的中和效能(圖12)。給藥RB007有效地消除了受試者受到進(jìn)一步的抗凝血作用，如比較給藥RB007和沒有給藥RB007下在3和24小時(shí)之間的APTT響應(yīng)曲線下面積所看到的。在靈長類中能夠以靜脈內(nèi)團(tuán)注來給藥REG1抗凝系統(tǒng)結(jié)果沒有產(chǎn)生補(bǔ)體激活是令人驚訝的，這是考慮到補(bǔ)體激活和由此的毒性的相關(guān)性，它是先前用這種團(tuán)注來給藥其它類型寡核苷酸分子所觀察到的。參見例如Galbraith等人(1994)"猴子靜脈內(nèi)注射給藥磷硫酰寡核苷酸后的補(bǔ)體激活和血液動(dòng)力學(xué)變化(Complementactivationandhemodynamicchangesfollowingintravenousadministrationofphosphorothioateoligonucleotidesinthemonkey)"AntisenseResearchandDevelopment4:201-206;andLevin,A.A.,Monteith,D.K.,Leeds,J.M.,Nicklin,P.L.,Geary,R.S.,Butler，M.,Templin,M.V,andHenry,S.P.(1998)。寡核苷酸治療劑的毒性，(在實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè)中)InHandbookofExperimentalPharmacology,G.V.R.e.a.Born,ed.(Berlin:Springer-Verlag),pp.169-215。定量給藥參數(shù)的策略分析圖13示出了對(duì)于接受RB006的所有受治療者APTT從0至3小時(shí)在基準(zhǔn)上的相對(duì)增長。與來自猴子實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)一致，APTT水平達(dá)到最大值和穩(wěn)定水平持續(xù)幾小時(shí)。通過評(píng)估相對(duì)APTT曲線下的面積與治療后第一個(gè)3小時(shí)測得的基線相比來分析該數(shù)據(jù)。圖19示出了RB006響應(yīng)與％FIX抑制相關(guān)性如何。該數(shù)據(jù)顯示利用抗凝血?jiǎng)┮苑植降姆绞娇梢种啤?9。/qFIX活性。圖14示出了由RB006劑量水平(15,30,60或90mg)組織的各受治療者的AUC0-3。因?yàn)橄鄬?duì)效果是在3小時(shí)內(nèi)測量的，所以值"3"表示沒有響應(yīng)，值6表示在基線上平均增加兩倍等。圖15示出了作為RB006劑量水平的函數(shù)的RB006體重調(diào)節(jié)的劑量。圖16描述了RB006藥效(AUC0-3)和RB006"體重調(diào)節(jié)的"劑量之間的關(guān)系。該體重調(diào)節(jié)的劑量范圍為0.2mg/kg-1.6mg/kg,AUC0-3范圍約為3-10個(gè)單位。該圖顯示在響應(yīng)和體重調(diào)節(jié)的劑量之間具有清晰的關(guān)系，對(duì)于抗凝血?jiǎng)┰谑苤委熣咧g變化性相當(dāng)?shù)汀Ｈ鐖D20和21中所見，在參與的受治療者體重指數(shù)(BMI)與RB006劑量水平之間具有清晰的關(guān)系。BMI為19-25是正常，25-30是超重，以及>30肥胖。在該研究中受治療者的范圍從BMI約為16到BMI超過35。體重指數(shù)(BMI)是由人的體重和身高計(jì)算出的數(shù)。BMI是人身體肥胖度的可靠指標(biāo)。BMI沒有直接測量身體脂肪，但是研究已經(jīng)顯示BMI與身體脂肪的直接測量值相關(guān)，例如水下稱重和雙能X-線吸收法(DXA)。BMI可被認(rèn)為是直接測量身體脂肪的替代選擇，用同樣的方法計(jì)算成人和兒童兩者的BMI。該計(jì)算是根據(jù)如下公式"測量單位公式和計(jì)算千克和米(或厘米)磅和英寸公式體重(kg)/[身高(m)]2計(jì)算[體重(kg)/身高(m)/身高(m)]在米制下，BMI的/>式是用以千克表示的體重除以用米表示的身高的平方。由于身高通常以厘米測量，將以厘米表示的身高除以100而得到以米表示的身高。公式體重(lb)/[身高(in)]2x703計(jì)算[體重(lb)/身高(in)/身高(in)]x703將以磅(lbs)表示的體重除以以英寸(in)表示的身高的平方并乘以換算因子703來計(jì)算BMI。圖17顯示了用RB006處理受試者的BMI調(diào)節(jié)的劑量作為RB006劑量水平的函數(shù)。圖18描述了RB006的AUC0-3和體重調(diào)節(jié)的劑量之間的關(guān)系。劑量范圍為0.5mg/BMI-約4.5mg/BMI.,AUC0-3范圍在50約3-IO個(gè)單位之間。如由該圖可見的，藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)和BMI調(diào)節(jié)劑量之間具有清晰的關(guān)系，該關(guān)系甚至比體重調(diào)節(jié)的劑量關(guān)系更顯著，變化性更低。BMI與相對(duì)AUC0-3的關(guān)系指示該藥物可能主要分布在中央身體隔室，而不在脂肪或相關(guān)組織。該分布為REG1系統(tǒng)用作腸胃外給藥的抗凝血?jiǎng)┨峁┝肆硗獾闹С帧Ｔ诰哂蟹€(wěn)定的CAD患者中評(píng)估REG1系統(tǒng)對(duì)服用阿司匹林和/或氯吡才各雷的50個(gè)穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈病患者進(jìn)行研究。將患者隨機(jī)地分到三組(單獨(dú)的RB006、RB006緊接著RB007或單獨(dú)的安慰劑)之一跨越4個(gè)RB006和RB007劑量水平?；€特征包括61歲中年(四分位數(shù)間距(IQR)56-68),20%女性，80%先前經(jīng)皮冠狀動(dòng)1^介入治療，以及34%先前冠狀動(dòng)力永傍^各移才直術(shù)。靜脈內(nèi)團(tuán)注低、中低、中高、高劑量RB006之后10分鐘aPTT中值為29.2秒(IQR28.1-29.8)、34.6秒(IQR30.9-40.0)、46.9秒(IQR40.3-51.1)和52.2秒(IQR46.3-58.6)，pO細(xì)l,UPTT正常范圍為27-401-2)(圖1),7天以內(nèi)沒有回彈增加。'盡管在38%的受試者中使°;雙重抗血d、板治療，但是沒有大出血或其它嚴(yán)重的不利結(jié)果。圖20顯示出了四種適體/解毒劑劑量與安慰劑的APTT響應(yīng)比4支的結(jié)果。組l"低劑量"是在O時(shí)間給藥15mgRB006和在3小時(shí)靜脈內(nèi)團(tuán)注RB007解毒劑30mg。組2"中低劑量'，是在0時(shí)間給藥30mgRB006和在3小時(shí)靜脈內(nèi)團(tuán)注RB007解毒劑60mg。組3"中高劑量"是在0時(shí)間給藥50mgRB006和在3小時(shí)靜脈內(nèi)團(tuán)注RB007解毒劑100mg。組4"高劑量，，是在0時(shí)間給藥75mgRB006和在3小時(shí)靜脈內(nèi)團(tuán)注RB007解毒劑150mg。在50和75mg/kgRB006兩者中，可見aPTT強(qiáng)勁上升，其在2倍適體濃度的RB007給藥下完全逆轉(zhuǎn)。REG1系統(tǒng)的重復(fù)給藥對(duì)38個(gè)通常健康良好的病人進(jìn)行研究。確定三個(gè)治療組組l,其中受治療者在第1、3和5天接受單次劑量的適體(0.75mg/kgRB006),1小時(shí)后緊接著接受固定劑量的解毒劑(1.5mg/kgRB007),而組2和3，其中受治療者在第1、3和5天接受單次劑量的適體RB006(0.75mg/kg),1小時(shí)后緊接著給藥可變單次劑量的解毒劑RB007。組2和3受試者的RB007滴定劑量一皮示于下表A中。表A.組2和3解毒劑(RB007)與藥物(RB006)的劑量比率<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>第5天測試的解毒劑藥物比為0.1:1和1:1,并且是基于第1和3天產(chǎn)生的aPTT結(jié)果。解毒劑的劑量為0.075mg/kg_0.75mg/kg。根據(jù)對(duì)RB006的體重調(diào)節(jié)響應(yīng)來選擇RB006劑量(0.75mg/kg)。平均起來，該RB006體重調(diào)節(jié)的劑量使受治療者的APTT提高2倍。在一(1)分鐘的時(shí)期內(nèi)以注射供給每人RB006適體、解毒劑及其各自的安慰劑。圖21示出了在第1、3和5天給藥RB006(0.75mg/kg)后經(jīng)不同的解毒劑治療的時(shí)間加權(quán)的APTT。圖22示出了對(duì)于在各組中給藥RB006的APTT效果％。在全部3組中給藥75mg/kg適體后可見APTT增加約270%并且經(jīng)過三個(gè)治療日沒有明顯的不同。圖23示出了與RB006相比，在以各種不同比率給藥RB006(0.75mg/kg)和RB007的組中的平均APTT。在0時(shí)間給藥RB006,而在1小時(shí)時(shí)以列出的比率給藥RB007。如圖中可見，RB007逆轉(zhuǎn)了適體解毒劑的抗凝血?jiǎng)┝?。此外，如圖23中可見，在各個(gè)測試的比率下RB007的逆轉(zhuǎn)作用在時(shí)間上是比較穩(wěn)定的，如同對(duì)該化合物的預(yù)期，RB006的藥效活性隨時(shí)間逐漸降低。圖24示出了與RB006相比，在以各種不同比率給藥RB006(0.75mg/kg)和為各RB007的組中的時(shí)間加權(quán)的APTT恢復(fù)％。在0時(shí)間給藥RB006,而在1小時(shí)時(shí)以列出的比率給藥RB007。在測試的最低比率0.125:1下，RB007逆轉(zhuǎn)了大約40%的RB006效果。在0.2:1下，RB007逆轉(zhuǎn)了大約50%的RB006效果。在0.3:1下，RB007逆轉(zhuǎn)了大約75%的RB006效果。在0.5:1下，RB007逆轉(zhuǎn)了大約85%的RB006效果。而在更高比率1:1或2:1下，RB007有效地完全逆轉(zhuǎn)了RB006效果。權(quán)利要求1.一種給藥適體的方法，該方法包括a.測量宿主的體重指數(shù)(BMI)；b.表征所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)；以及c.根據(jù)每個(gè)BMI的劑量與藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的比較，將一定劑量的適體給藥到宿主以達(dá)到所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。2.權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括將一定劑量的所述適體的解毒劑給藥到宿主，其中所述解毒劑的劑量基于已知的預(yù)先給藥的適體劑量，并且所述解毒劑:適體比率基于所需的適體活性減小量。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)是最大抗凝水平。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述適體的給藥劑量為4mg/BMI或更大。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)為約75%最大抗凝水平。6.權(quán)利要求5.所述的方法，其中所述適體的給藥劑量約為3.0-4.0mg/BMI。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)為約50%最大抗凝水平。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述適體的給藥劑量為約2.0-3.0mg/BMI。9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝繛?.1-10mg/BMI。10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝考s為5mg/BMI。11.一種給藥適體的方法，該方法包括a.測量宿主的以kg表示的體重；b.表征所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)；c.根據(jù)每千克劑量與藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的比較，將一定劑量的適體給藥到所述宿主以達(dá)到所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)；以及d.將一定劑量的所述適體解毒劑給藥到所述宿主，其中僅根據(jù)解毒劑與適體的比例來提供解毒劑的劑量。12.權(quán)利要求11所述的方法，該方法還包括將一定劑量的所述適體的解毒劑給藥到宿主，其中所述解毒劑的劑量基于已知的預(yù)先給藥的適體劑量，并且所述解毒劑:適體比率基于所需的適體活性減小量。13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)是最大抗凝水平。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝繛榧s1.4mg/kg或更大。15.權(quán)利要求11所述的方法，其中所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)為約75%最大抗凝水平。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝考s為1.0mg/kg。17.權(quán)利要求11所述的方法，其中所需的藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)為約50%最大抗凝水平。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝考s為.6-.8mg/kg。19.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝繛?.1-2mg/kg.。20.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗凝血?jiǎng)┑膭┝繛?-10mg/kg.。21.權(quán)利要求1或11所述的方法，其中所述解毒劑是寡核苷酸解毒劑。22.^又利要求1或11所述的方法，其中所述適體包括SEQIDNO1。23.權(quán)利要求1或11所述的方法，其中所述藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)是在血凝固分析中測得的。24.權(quán)利要求1或11所述的方法，其中所述適體是以靜脈內(nèi)團(tuán)遞來給藥的。25.權(quán)利要求1或11所述的方法，其中所述適體是以皮下注射來給藥的。26.權(quán)利要求2或12所述的方法，其中所述適體和解毒劑的給藥比率為1:1。27.權(quán)利要求2或12所述的方法，其中所述適體和解毒劑的給藥比率為至少2:1。28.權(quán)利要求2或12所述的方法，其中所述適體和解毒劑的給藥比率為0.5:1或更小。29.權(quán)利要求2或12所述的方法，其中適體活性被逆轉(zhuǎn)少于90%。30.權(quán)利要求2或12所述的方法，其中適體活性被逆轉(zhuǎn)約50%。全文摘要提供了一種給藥適體和解毒劑系統(tǒng)來控制宿主血凝固的改進(jìn)方法來達(dá)到所需藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，其基于該系統(tǒng)成分的體重調(diào)節(jié)或體重指數(shù)調(diào)節(jié)的給藥劑量。另外，提供了一種將適體活性逆轉(zhuǎn)至所需程度的方法，其中解毒劑劑量僅基于其與適體劑量的關(guān)系。文檔編號(hào)A01N43/04GK101453891SQ200780019405公開日2009年6月10日申請(qǐng)日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日發(fā)明者C·P·拉斯科尼,R·M·通肯斯申請(qǐng)人:雷加多生物科學(xué)公司