專利名稱：：使用單個(gè)納米新月形表面增強(qiáng)拉曼散射探針檢測(cè)蛋白酶和蛋白酶活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用納米探針檢測(cè)蛋白酶的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及在前列腺癌的診斷應(yīng)用中前列腺特異性抗原(PSA)和有蛋白水解活性的PSA的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是歐洲和北美的男性中最常見的癌癥(Crawford(2003)t/ra/o^62:3-12;Gronberg等人92003361:859-864;Pienta等人(2006)t/ra/ogy48:676-683)。前列腺癌的臨床診斷方式之一是測(cè)量前列腺特異性抗原(PSA或hK3)的血漿蛋白濃度，該抗原是通常從前列腺內(nèi)腔上皮細(xì)胞分泌的大的激肽釋放酶(hK)蛋白酶家族中的一員(回顧參見，例如，Yousef和Diamandis(2001)iev.，22:184-204;Denmeade和Isaacs(2002)淑Tev.C畫er2:389-396;Denmeade和Isaacs(2004)5Jf7/"93Suppl1:10-15)。與其它激肽釋放酶家族成員不同，PSA是類胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶(Robert等人(1997)Aoc/^m^o;36:3811-3819)。在前列腺癌中，借助于蛋白水解活性，PSA與對(duì)抗細(xì)胞外基質(zhì)的組織改造有關(guān)，對(duì)肺瘤入侵或發(fā)展的關(guān)鍵控制機(jī)制有作用。其它蛋白酶也在癌癥中具有相似的作用。始于二十世紀(jì)八十年代的血漿PSA篩查的引入已經(jīng)極大地改善了前列腺癌的診斷、分期和處置(Denmeade和Isaacs(2002)Ato.Ca"cer2:389-396);然而，血漿PSA濃度的測(cè)量并沒有將前列腺癌病人與良性前列腺增生病人區(qū)分開，導(dǎo)致高的錯(cuò)誤陽性率，需要更昂貴的活檢，并且甚至進(jìn)行不必要的外科程序(Denmeade和Isaacs(2004)93Suppl1:10-15;Robert等人(1997)歷0c/2e附&^y36:3811-3819)。提高PSA的臨床價(jià)值以進(jìn)行前列腺癌早期檢測(cè)的努力包括對(duì)PSA的各種分子異構(gòu)物的表征(Mikolajczyk等人(2004)C7/".Ozem"50:1017-1025;Mikolajczyk和Rittenhouse(2003)/Med52:86-91;Mikolajczyk等人(2004)C7/".歷oc/zem.37:519-528)。在那些各種異構(gòu)物當(dāng)中，PSA的有蛋白水解活性的亞群被接受作為是比血清PSA濃度更有效的胂瘤標(biāo)志物和惡性預(yù)測(cè)物(Wu等人(2004)尸mstote58:354-353;Wu等人(2004)C7/w.Oze肌，50:125-129)。通過常規(guī)的免疫染色方法對(duì)PSA存在的簡(jiǎn)單檢測(cè)不能揭示PSA的蛋白水解活性；因此，開發(fā)新的方法以區(qū)分蛋白水解活性異構(gòu)物是非常重要的。已經(jīng)證實(shí)精液攜帶有大量的有蛋白水解活性的PSA并且是用于蛋白酶活性測(cè)定的PSA生物資源(Brillard隱Bourdet等人(2002)>/A0c/2em.,269:390-395;Rehault等人(2002)所oc/h.附.Jcto1596:55-62)。有蛋白水解活性的PSA在精液中的濃度為10-150|aM(Rehault等人(2002)S/oc/>w.所0;7/7,爿cto1596:55-62),而其在血漿中的濃度則低得多，從健康個(gè)體中小于O.lnM到有前列腺疾病的病人中高于lnM(Rittenhouse等人(1998)O".C7/w.丄W.5W.，35:275-368)。然而，測(cè)量精液中或來自細(xì)針抽吸的活組織檢查樣品中PSA的蛋白水解活性的測(cè)定仍沒有被廣泛接受，這是由于蛋白水解活性的快速衰減，以及從年老病人可獲得的精液量或活組織檢查樣品的量有限?，F(xiàn)有檢測(cè)方法的靈敏度達(dá)到了PSA蛋白質(zhì)的亞納摩濃度(Acevedo等人(2002)C7/".C/n'm.爿cto317:55-63;Charrier等人(1999)五/ecra//wm^20:1075-1081;Bjartell等人C""cwPD2:140-147)(大部分通過抗體對(duì)PSA的結(jié)合親和力確定)，并且需要相對(duì)大的樣品體積(毫升)。然而，酶的化驗(yàn)并不享有相同的靈敏度增強(qiáng)。
發(fā)明內(nèi)容在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明展示了使用單一的至少具有納摩靈敏度的肽8結(jié)合納米新月體表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)指示物(探針)的蛋白酶體外檢測(cè)。該指示物能夠以極小的體積檢測(cè)蛋白水解活性。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)體積小于約80飛升(femtoliter)，優(yōu)選小于約50飛升，更優(yōu)選小于約40或30飛升，且進(jìn)一步更優(yōu)選小于約20或15飛升。在某些實(shí)施方式中，使用高度聚焦的激發(fā)源允許檢測(cè)體積僅為約10飛升。在各種實(shí)施方式中，納摩樣品的實(shí)際蛋白酶分子數(shù)小于約40個(gè)分子，優(yōu)選小于約40個(gè)分子，更優(yōu)選小于約30、20、或10個(gè)，且在某些實(shí)施方式中接近于單分子水平。與其它癌生物標(biāo)志物檢測(cè)測(cè)定相比，本發(fā)明的生物結(jié)合的納米新月體允許檢測(cè)飛升體積中蛋白水解活性蛋白酶分子的納摩濃度，特別是對(duì)于單一癌細(xì)胞水平的癌癥篩查來說，這是關(guān)鍵的。小體積性能的主要優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用之一是其可用于在單一細(xì)胞水平下檢測(cè)癌細(xì)胞的蛋白酶例如前列腺特異性抗原(PSA)的活性。小體積的要求和靈敏度水平能夠在捕獲的循環(huán)前列腺癌細(xì)胞中檢測(cè)PSA活性用于指示轉(zhuǎn)移，這對(duì)于常規(guī)技術(shù)來說是不可行的。在精液中，PSA濃度為10-150)LiM,其中約三分之二的PSA有酶活性。用納米新月體PSA探針(納摩范圍)實(shí)現(xiàn)的靈敏度水平對(duì)基于精液的測(cè)定是足夠的，因此，這里描述的納米新月體SERS平臺(tái)可用于臨床應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，底物是納米新月體表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針由綴合到納米新月體芯和殼的肽組成，其中該探針的特征在于連接到拉曼活性標(biāo)記的可以由蛋白酶特異性剪切的序列(例如，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))。因此，該肽綴合的納米新月體可用作特定的篩查工具以提供生物性樣品中一種或多種蛋白酶的存在、濃度和蛋白水解活性的信息，所述蛋白酶包括但不限于各種癌癥的生物標(biāo)志物，例如前列腺特異性抗原(PSA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該納米新月體包括芯和殼，具有綴合或粘連到該納米新月體表面的肽。該肽包括被待檢測(cè)的相應(yīng)蛋白酶特異識(shí)別和剪切的底物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)蛋白酶有特異性的其它肽底物可用于納米探針?？赡艽嬖谶@樣的情況，具有較好的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的底物肽可以用于加快檢測(cè)過程。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)PSA具有較好特異性的其它肽也可用于更精確地檢測(cè)PSA。9在各種實(shí)施方式中，不僅測(cè)量蛋白質(zhì)的存在，實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)還提供有關(guān)蛋白酶活性的信息。不同的拉曼標(biāo)記分子都可以使用并成功地用于實(shí)施例中，從而證明了可以通過多重化肽綴合納米新月體進(jìn)行兩種或更多種類型的癌癥相關(guān)(或其它)的蛋白酶的檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，芯可包括磁性材料以允許獨(dú)立納米顆粒的空間訪問。在某些實(shí)施方式中，在特異性上彼此正交或有少量重疊的不同的肽底物可以用于檢測(cè)相應(yīng)的蛋白酶。肽庫可以綴合到納米新月體探針并以隨機(jī)陣列或有序微陣列的形式在空間上分開。肽納米新月體雜化探針的多重化陣列可以用于同時(shí)檢測(cè)多種蛋白酶。也可通過激光或磁場(chǎng)操作納米新月體以以高的空間精確度編址(Liu等人(2006)A^Ma^5:27-32),使得它們能夠多重化為高密度陣列(具有亞微升體積)。另外，磁場(chǎng)或激光可操作性允許在期望位置進(jìn)行生物傳感(Liu等人(2005)A/v.M^ec17:2683-2688)，有利于在細(xì)胞內(nèi)獲得原位測(cè)量。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)活性蛋白酶的指示物(探針)。該指示物通常包括附接于肽(底物)的納米新月體，其中該肽包括蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該指示物進(jìn)一步包括附接于該肽的拉曼標(biāo)簽。合適的拉曼標(biāo)簽包括但不限于熒光團(tuán)、生色團(tuán)、量子點(diǎn)、熒光微球、生物素等。在某些實(shí)施方式中，該拉曼標(biāo)簽包括羅丹明、焚光素、或外源化學(xué)分子。在某些實(shí)施方式中，該拉曼標(biāo)簽包括選自下列的部分TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對(duì)苯二曱酸、間苯二曱酸、甲苯基堅(jiān)牢紫、曱苯基藍(lán)紫、亮?xí)醣交{(lán)、對(duì)氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，，7，-二曱氧基熒光素、5-羧基-2，,4，,5，，7，-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、石克醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。該拉曼標(biāo)簽可直接或通過接頭(linker)附接于肽。類似的，肽可直接或通過接頭附接于納米新月體。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括殼而沒有芯。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括芯和殼。在各種實(shí)施方式中，該芯包括提供恒定拉曼光i普的材料(例如，塑料(如聚苯乙烯)、二氧化硅或其它m族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、磁性材料等)。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括選自下列的金屬Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它們的氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結(jié)的基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體具有約20-約800nm的外徑。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體具有約10nm到約500nm的內(nèi)徑。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體通過內(nèi)徑r、和外徑R、以及內(nèi)徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表征，其中r為約10nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約300nm。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體通過內(nèi)徑r、和外徑R、以及內(nèi)徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表征，其中r為約25nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約200nm。在各種實(shí)施方式中，該肽包括選自下列的蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和谷氨酸蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，該肽包括細(xì)胞凋亡路途徑中蛋白酶(例如，胱天氨酸蛋白酶)的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該肽包括選自下列胱天氨酸蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)胱天氨酸蛋白酶-8、胱天氨酸蛋白酶-9、胱天氨酸蛋白酶-3、胱天氨酸蛋白酶-6、和胱天氨酸蛋白酶-7。在某些實(shí)施方式中，該肽包括凝血酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該肽包括絲氨酸蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該肽包括PSA識(shí)別位點(diǎn)(例如，HSSKLQ(SEQIDNO:l))。在各種實(shí)施方式中，該肽的長(zhǎng)度為2個(gè)氨基酸到10、20、或30個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，該肽通過硫醇基團(tuán)附接于納米新月體。在某些實(shí)施方式中，兩種不同的底物(例如，肽)附接于該納米新月體。在某些實(shí)施方式中，多于兩種不同的肽附接于該納米新月體。在某些實(shí)施方式中，該指示物為拉曼活性底物的組分。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)活性核酸酶的指示物。這些指示物基本上與上述蛋白酶指示物相同，除了用核酸(例如，雙鏈或單鏈核酸)替代肽(底物)。在某些實(shí)施方式中，該核酸包括一個(gè)或多個(gè)核酸識(shí)別/剪切位點(diǎn)(例如，限制位點(diǎn))。在某些實(shí)施方式中，附接于該納米新月體的底物(例如，肽、核酸、糖、碳水化合物等)可以包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(而不是剪切位點(diǎn))用于檢測(cè)例如同源結(jié)合配偶體(例如，受體、核酸結(jié)合蛋白、配體等)。還提供檢測(cè)或量化樣品中至少一種蛋白酶的存在、量或活性的方法。該ii方法包括使樣品與包括附接于肽的納米新月體的指示物接觸，所述肽包括蛋白酶(例如，如上所述的蛋白酶)的識(shí)別位點(diǎn)；和監(jiān)測(cè)檢測(cè)的表面拉曼散射光鐠的光譜特征中的差別，該差別是樣品中蛋白酶的存在、量或活性的指示。在各種實(shí)施方式中，樣品包括選自下列的材料全血、血級(jí)分、淋巴、腦脊液、口腔液(oralfluid)、粘液、尿、糞便、支氣管灌洗液(lavage)、腹水液、精液、骨髓抽出物、胸膜流出物、尿、和腫瘤細(xì)胞或組織。在各種實(shí)施方式中，該指示物還包括附接于肽的拉曼標(biāo)簽。合適的拉曼標(biāo)簽包括但不限于熒光團(tuán)、生色團(tuán)、量子點(diǎn)、熒光微球、生物素等。在某些實(shí)施方式中，該拉曼標(biāo)簽包括羅丹明、熒光素、或外源化學(xué)分子。在某些實(shí)施方式中，該拉曼標(biāo)簽包括選自下列的部分TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對(duì)苯二曱酸、間苯二曱酸、曱苯基堅(jiān)牢紫、曱苯基藍(lán)紫、亮?xí)醣交{(lán)、對(duì)氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基熒光素、5-羧基-2，，4，,5，,7，-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四曱基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。該拉曼標(biāo)簽可以直接或通過接頭附接于肽。類似的，肽可以直接或通過接頭附接于納米新月體。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括殼而沒有芯。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括芯和殼。在各種實(shí)施方式中，該芯包括提供恒定拉曼光譜的材料(例如，塑料(例如，聚苯乙烯)、二氧化硅或其它III族、IV族、或V族材沖+、右旋糖香、》茲性材料等)。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括選自下列的金屬Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo,和它們的氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結(jié)的基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體具有約20-約800nm的外徑。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體具有約10nm到約500nm的內(nèi)徑。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體通過內(nèi)徑r、和外徑R、以及內(nèi)徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表征，其中r為約10nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約300nm。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體通過內(nèi)徑r、和外徑R、以及內(nèi)徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表征，其中r為約25nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約200nm。在各種實(shí)施方式中，該肽包括選自下列的蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和谷氨酸蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，該肽包括在細(xì)胞凋亡路途徑中蛋白酶(例如，胱天氨酸蛋白酶)的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該肽包括選自下列胱天氨酸蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)胱天氨酸蛋白酶-8、胱天氨酸蛋白酶-9、胱天氨酸蛋白酶-3、胱天氨酸蛋白酶-6、和胱天氨酸蛋白酶-7。在某些實(shí)施方式中該肽包括凝血酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該肽包括絲氨酸蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該肽包括PSA識(shí)別位點(diǎn)(例如，HSSKXQ,SEQIDN0:1)。在各種實(shí)施方式中，該肽的長(zhǎng)度為2個(gè)氨基酸到10、20、或30個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，該肽通過硫醇基團(tuán)附接于納米新月體。在某些實(shí)施方式中，兩種不同的底物(例如，肽)附接于該納米新月體。在某些實(shí)施方式中，多于兩種不同的肽附接于該納米新月體。在某些實(shí)施方式中，該指示物為拉曼活性底物的組分。還提供用于檢測(cè)兩種或更多種活性蛋白酶的存在或活性的庫。該庫通常包括多種蛋白酶指示物，該指示物包括附接于例如如上所述的肽的納米新月體，其中該肽包括蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)；其中不同的納米新月體附接了不同的肽使得不同的納米新月體檢測(cè)不同的蛋白酶。在各種實(shí)施方式中，該庫進(jìn)行空間編址使得對(duì)不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物定位于底物上的不同位置。在各種實(shí)施方式中，該庫任進(jìn)行光學(xué)編址使得對(duì)不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物產(chǎn)生不同的信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，該庫包括至少3種或更多、優(yōu)選至少10種或更多、更優(yōu)選至少20、40、80、或100或更多的不同的蛋白酶指示物。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體包括磁性芯且指示物的空間隔離通過磁場(chǎng)提供。在某些實(shí)施方式中，該指示物以離子方式或化學(xué)方式耦聯(lián)和/或吸附到底物。還提供檢測(cè)活性蛋白酶的試劑盒。該試劑盒通常包括含有附接于肽(例如，本文描述的)的納米新月體的容器，其中該肽包括所述蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該試劑盒還包括附接于所述肽的拉曼標(biāo)簽。在某些實(shí)施方式中，該試劑盒還包括教導(dǎo)指示物的使用的指導(dǎo)材料，該指示物使用表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)用于檢測(cè)活性蛋白酶的存在、濃度或活性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)核酸酶的指示物。該指示物包括附接于單鏈或雙鏈寡核苷酸的納米新月體(例如，本文描述的)，其中該寡核香酸包括所述核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該指示物還包括附接于該寡核苷酸的拉曼標(biāo)簽。還提供檢測(cè)分析物的存在或量的方法。該方法典型地包括使指示物與包含分析物的樣品接觸，該指示物包括附接于底物的納米新月體，該底物在拉曼標(biāo)記的部分的存在下特異性地或優(yōu)先地被分析物結(jié)合，該拉曼標(biāo)記的部分與分析物為結(jié)合到該底物而竟?fàn)?；和檢測(cè)該指示物的拉曼光鐠，其中通過拉曼標(biāo)簽部分從底物的解離產(chǎn)生的拉曼光譜中的變化提供了樣品中分析物的存在或量的測(cè)量。在某些實(shí)施方式中，該底物是肽或核酸。在某些實(shí)施方式中，附接于納米新月體的肽不是抗體或抗體片段。定義術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)，，在這里可互換地使用以表示氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中的一種或多種氨基酸殘基是相應(yīng)的自然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，并且該術(shù)語也適用于自然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"活性蛋白酶"是指處于以下形式的蛋白酶，即當(dāng)該蛋白酶在支持該蛋白酶活性的條件下與底物接觸時(shí)，能夠剪切(水解)該蛋白酶的底物中的肽鍵的形式。術(shù)語"納米新月體"是指納米顆粒，其橫截面的輪廓類似具有銳邊的新月。這里使用的"分析物"是利用本發(fā)明在測(cè)試樣品中待檢測(cè)的物質(zhì)。該分析物可以是任何物質(zhì)，例如，這樣的酶，存在對(duì)該酶來說特異性結(jié)合成員如底物，或這樣的酶，可以為該酶制備特異性結(jié)合成員，并且該分析物在測(cè)定中可以與一種或多種特異性結(jié)合成員結(jié)合。術(shù)語"分析物，'還包括任意的酶、抗原物質(zhì)、半抗原、抗體、以及它們的組合。該分析物可以包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、碳水化合物、荷爾蒙、類固醇、維生素、包括為治療目的而給藥的那些以及為不正當(dāng)目的而給藥的那些在內(nèi)的藥物、細(xì)菌、病毒、和任意上述物質(zhì)的代謝物或抗體。這里使用的"輻射"是電磁輻射形式的能量，該能量當(dāng)應(yīng)用到測(cè)試混合物時(shí)，引起由其中的拉曼活性標(biāo)簽產(chǎn)生的拉曼光譜，并且引起金屬表面通過拉曼活性標(biāo)簽支持表面增強(qiáng)的拉曼光散射，所述拉曼標(biāo)簽變得與微粒表面有關(guān)。"拉曼標(biāo)簽"、"拉曼標(biāo)記"、或"拉曼活性標(biāo)簽"是當(dāng)用合適波長(zhǎng)的輻射照射時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的拉曼光譜的物質(zhì)，該拉曼光譜區(qū)別于存在的其它組分的拉曼光譜。用于拉曼活性標(biāo)簽的其它術(shù)語可以包括染料和指示分子。這里使用的"特異性結(jié)合成員"是特異性結(jié)合對(duì)的成員，該特異性結(jié)合對(duì)即兩個(gè)不同的分子，其中一個(gè)分子通過化學(xué)或物理方式特異性地結(jié)合到第二個(gè)分子。除了抗原和抗體特異性結(jié)合對(duì)之外，其它特異性結(jié)合對(duì)包括生物素和抗生素蛋白、碳水化合物和外源凝集素、互補(bǔ)核苷酸序列(包括檢測(cè)目標(biāo)核酸序列的DNA雜化測(cè)定中使用的探針和捕獲的核酸序列)、互補(bǔ)肽序列、效應(yīng)物和受體分子、輔酶因子和酶、酶抑制劑和酶等。而且，特異性結(jié)合對(duì)可以包括為原始特異性結(jié)合成員的類似物的成員。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即，分析物-類似物，只要其具有至少一個(gè)與分析物相同的表位。免疫反應(yīng)性特異性結(jié)合成員包括抗原、半抗原、抗體、和包括通過重組DNA方法或肽合成形成的那些的它們的絡(luò)合物。術(shù)語"測(cè)試混合物"是指用于應(yīng)用本發(fā)明以檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的測(cè)試樣品和其它物質(zhì)的混合物。這些物質(zhì)的實(shí)例包括特異性結(jié)合成員、輔助結(jié)合成員、分析物-類似物、拉曼活性標(biāo)簽、緩沖液、稀釋劑、和具有能夠引起表面增強(qiáng)拉曼光語的表面的顆粒、以及其它。這里使用的術(shù)語"測(cè)試樣品"是指含有待利用本發(fā)明進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)定的分析物的樣品。該測(cè)試樣品除了所述分析物之外還可以含有其它組分，可以具有液體或固體的物理性質(zhì)，并且可以為任意尺寸或體積，包括例如，流動(dòng)液體的流。該測(cè)試樣品除了分析物之外還可以含有任意的物質(zhì)，只要其它物質(zhì)不干擾與特異性結(jié)合成員的特異性結(jié)合或不干擾分析物或分析物-類似物。測(cè)試樣品的實(shí)例包括但不限于血清、血漿、唾液、精液、尿、其它體液、組織和細(xì)胞樣品(例如，胂瘤樣品、器官樣品等)和環(huán)境樣品例如地下水或廢水、土壤提取物和殺蟲劑殘留物。圖1A、1B、1C說明用于PSA檢測(cè)的肽綴合納米新月體、制造過程、和檢測(cè)。圖1A:制造過程。納米級(jí)Au層蒸鍍?cè)诰郾揭蚁┘{米顆粒上以形成TEM圖像中所示的Au納米新月體，其中該新月體頂端顯示出較小的密度。厶力iffl拉曼標(biāo)記分15子、生物素或R19(未顯示)，和用于兩個(gè)版本的標(biāo)記肽的半胱氨酸終止。肽通過Au-S鍵綴合到納米新月體的Au表面。圖1B:PSA檢測(cè)方案。在蛋白水解反應(yīng)之前，肽綴合納米新月體的SERS譜含有拉曼標(biāo)記分子、聚苯乙烯納米顆粒、和肽的特征峰；在PSA的消化反應(yīng)之后，肽在Q之后被剪切。含有拉曼標(biāo)記分子的剪切片段從納米新月體表面擴(kuò)散開，而其它片段保留在納米新月體的表面上。肽的SERS譜變得不同并且得自拉曼標(biāo)記分子的特征峰消失。圖1C:(l)通過納米新月體的模擬局部電場(chǎng)振幅增強(qiáng)。納米新月體的頂端區(qū)域具有100倍的電磁增強(qiáng)因子。(2)納米新月體上的極性電場(chǎng)能量分布。幾乎100%的能量集中在占納米新月體總面積~1/6的頂端區(qū)域附近。圖2A、2B和2C說明具有銳邊的金納米新月體。圖2A:納米新月體SERS底物的概圖。金表面可用生物分子接頭功能化以識(shí)別特定生物分子。納米新月體的銳邊可增強(qiáng)拉曼散射強(qiáng)度使得可以檢測(cè)其上的生物分子。圖2B:納米新月體的幾何圖。具有銳邊的金納米新月集合了納米環(huán)和納米頂端的幾何特征。圖2C:兩種納米新月體的透射電子顯微鏡圖像。顯示的納米新月體均有300nm的內(nèi)徑、100nm的底部厚度，但具有不同的取向。比例尺為100nm。圖3說明納米新月體的制造過程。(a)將單層的球形聚苯乙烯膠體澆鑄在光刻膠涂布的玻璃基底上。(b)通過電子束蒸鍍將金層涂布在聚苯乙烯膠體的表面上。在沉積期間樣品以相對(duì)于金靶一定的角度保持旋轉(zhuǎn)。納米新月體的苯乙烯球從該基底剝離。(d)金納米新月體的掃描電鏡照片。膠體顆粒的溶解將該納米新月體釋放到懸液中。然后收集該納米新月并放置在底物上。為方便在SEM中展示，顯示的納米新月體沒有和在我們的光學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的納米新月體一樣在水中進(jìn)行稀釋。比例尺為200nm。圖4說明納米新月體的幾何結(jié)構(gòu)，其中如兩個(gè)部分重疊的圓所示，r是內(nèi)徑、R是外徑、且d是圓心距。圖5說明SERS顯微光譜學(xué)系統(tǒng)和納米新月體的可視化。肽綴合納米新月體懸浮在封閉的透明微室中的反應(yīng)緩沖液中。該納米新月體可使用暗場(chǎng)照明從斜角可視化，如插圖中所示的亮點(diǎn)。激發(fā)激光通過顯微物鏡聚焦在納米新月體上。SERS信號(hào)通過相同的物鏡收集并通過分光計(jì)分析。圖6A和6B顯示分別用生物素(圖6A)和作為拉曼標(biāo)記分子的R19(圖6B)進(jìn)行PSA消化前后的肽綴合納米新月體的典型SERS光譜。圖7A、7B、7C和7D顯示在PSA消化反應(yīng)中時(shí)間分辨SERS光譜。圖7A:以作為拉曼標(biāo)記分子的生物素通過420nMPSA進(jìn)行的肽消化中的SERS光譜。圖7B:以作為拉曼標(biāo)記分子的R19通過420nMPSA進(jìn)行的肽消化中的SERS光譜。圖7C:以作為拉曼標(biāo)記分子的R19在抑制劑存在下通過420nMPSA進(jìn)行的肽消化中的SERS光譜。圖7D:以作為拉曼標(biāo)記分子的R19通過420nM粒酶B進(jìn)行的肽消化中的SERS光譜。圖8A和8B顯示PSA消化反應(yīng)中與時(shí)間有關(guān)的拉曼峰強(qiáng)度。圖8A:分別以O(shè)M(緩沖溶液)、4.2nM、42nM和420nM的PSA進(jìn)行的消化反應(yīng)中生物素在525cm"下的拉曼峰強(qiáng)度。圖8B:分別以420nMPSA、具有抑制劑的420nMPSA、和420nM的粒酶B進(jìn)行的消化反應(yīng)中R19在1183cm"下的拉曼峰強(qiáng)度。具體實(shí)施例方式在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及新的指示物，其提供對(duì)樣品中一種或多種蛋白酶的存在和/或量和/或活性的測(cè)量。在某些實(shí)施方式中，該指示物包括一種或多種附接于用于一種或多種蛋白酶分子的底物(例如，多肽)的納米新月體結(jié)構(gòu)，參見例如圖1A。該指示物可任選地進(jìn)一步包括一種或多種附接于底物的拉曼標(biāo)記。該指示物起到對(duì)拉曼散射檢測(cè)體系來說非常靈敏的探針(例如，表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針)的作用。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及使用肽綴合納米新月體表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針進(jìn)行蛋白水解活性生物分子的體外、原位、或在某些情況下的體內(nèi)的檢測(cè)。這里描述的探針可以至少實(shí)現(xiàn)納摩的靈敏度，從而能夠以極低的濃度(例如，一或幾個(gè)分子)和/或以極小的體積(例如，飛升體積)檢測(cè)蛋白水解(或其它生物學(xué)的)活性。在各種實(shí)施方式中，指示物的納米級(jí)尺度和指示物高的局部電磁場(chǎng)增強(qiáng)(圖1C)能夠在其表面上進(jìn)行生物分子反應(yīng)的高靈敏度光學(xué)檢測(cè)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該指示物包括納米新月體表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針。該表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針可以包括綴合到納米新月體結(jié)構(gòu)(例如，納米新月體芯和殼)的肽，其中該肽含有蛋白酶識(shí)別和剪切的特定氨基酸序列(蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))。在各種實(shí)施方式中，該肽附接于拉曼標(biāo)記上。17該肽通過"目標(biāo)"蛋白酶的剪切提供了拉曼光譜中容易檢測(cè)的強(qiáng)烈變化。因此，該肽綴合納米新月體可以用作特定篩選工具以提供一種或多種蛋白酶例如癌癥的生物標(biāo)志物如生物樣品中的前列腺特異抗原(PSA)的存在、濃度和蛋白水解活性的信息。納米新月體組合物和制造本發(fā)明的指示物通常包括一種或多種耦聯(lián)到生物分子(優(yōu)選肽)的納米新月體。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體可以包括芯和殼。當(dāng)存在時(shí)，該芯可以由具有基本上恒定拉曼光譜的塑料(例如，聚苯乙烯)、二氧化硅或其它礦物質(zhì)、或其它III族、IV族、或v族材料、右旋糖酐、》茲性材料、或任意其它材料組成。該納米新月體"月球"結(jié)構(gòu)具有允許局部電磁場(chǎng)增強(qiáng)的納米頂端和納米環(huán)兩個(gè)特征(圖2A)。在橫截面圖中，納米新月體的形狀類似具有尖銳頂端的將該SERS"熱位點(diǎn)"從頂端擴(kuò)展至環(huán)線(即，一組納米頂端)，如圖2B所示。從俯視圖看，納米新月體的形狀類似尖銳度比之前展示的納米環(huán)(Aizpurua等人(2003)尸—.丄饑90:057401)高的納米環(huán)，所以納米新月體的圓形銳邊可以具有較強(qiáng)的場(chǎng)發(fā)射或"天線，，效應(yīng)。在各種實(shí)施方式中，該金納米新月體具有如圖2C所示的亞10nm的銳邊。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體可通過如圖4所示的幾何結(jié)構(gòu)表征，其中如兩個(gè)部分重疊的圓所示，r是內(nèi)徑、R是外徑、且d是圓心距。在各種實(shí)施方式中，R是約20nm到約800nm,優(yōu)選約40nm到約600nm,更優(yōu)選約50nm到約500或400nm,且最優(yōu)選從約100nm到約200nm或300nm。在各種實(shí)施方式中，r是約10nm到約500nm，優(yōu)選約20nm到約400nm，更優(yōu)選約50nm到約300nm，且最優(yōu)選約100nm到約200nm。在各種實(shí)施方式中，d是約IO到約400nm,優(yōu)選約20nm到約200nm或300nm,更優(yōu)選約30nm、40nm或50nm到約100或150nm。該納米新月體殼可以由金屬(例如，金、銀、鵠、柏、鈦、鐵、錳等，或它們的氧化物或合金)、半導(dǎo)體材料、多層金屬、金屬氧化物、合金、聚合物、碳納米材料等組成。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體殼包括下列的一種或多種鴒、鉭、和鈮、Ga、Au、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它們的氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。在各種實(shí)施方式中，該芯的直徑為約30nm到約500nm,優(yōu)選約50nm到約200nm、300nm、或400nm,更優(yōu)選約50nm到約100nm或150nm，jt^^A^w^r8trmr^^t^3iini^W3Dlimnnj^步更優(yōu)選約8nm到約20或30nm，且最優(yōu)選約10nm到約20nm或約25nm。通過選擇不同的芯尺寸和殼厚度，可以調(diào)節(jié)等離子體共振波長(zhǎng)和表面增強(qiáng)因子以與各種應(yīng)用相配。圖1A示意地展示了本發(fā)明的納米新月體指示物的一個(gè)實(shí)施方式并且提供了其電子顯微照片。在某些實(shí)施方式中，該納米新月體優(yōu)選通過在旋轉(zhuǎn)納米顆粒(例如，聚苯乙烯納米顆粒模板)上將納米新月體材料(例如，4艮、金等)成角度的沉積而制造，如Lu等人(2005)iVa"o丄eW5,119-124描述，其通過引用納入本申請(qǐng)。制造過程示意性地展示在圖3中。如圖3所示，該方法包括將單層的球形芯材料(例如，聚苯乙烯膠體)澆注在涂布有光刻膠的基底(例如，玻璃基底)上。該納米新月體殼材料(例如，金、銀等)通過電子束蒸鍍涂布在所述芯的表面上。該樣品在沉積期間在相對(duì)于所述金(或其它材料)靶某個(gè)角度下保持旋轉(zhuǎn)。該納米新月的形狀除了取決于所述芯結(jié)構(gòu)(例如，聚苯乙烯球)的尺寸之外還取決于沉積的角度。該涂布的納米新月體可使用合適的溶劑(例如，丙S同)從該基底剝離。該芯可以任選地通過使用合適的溶劑(例如，曱苯)從該納米新月體移除。然后可以收集該納米新月體并置于基底上。在一個(gè)展示性的實(shí)施方式中，該納米新月體包括IOOnm的聚苯乙烯芯和1020nm的金新月體殼。該納米級(jí)Au層蒸鍍?cè)诰郾揭蚁┘{米顆粒上以形成圖1C中TEM圖像中所示的Au納米新月體，其中該新月體頂部顯示較小的密度。在某些實(shí)施方式中，該納米顆粒芯不被移除并起到SERS檢測(cè)中內(nèi)部對(duì)照(internalcontrol)的作用。該制造過程是展示性的而不是限制性的。使用這里提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本實(shí)驗(yàn)方案和其它納米新月體制造方法的各種變型。蛋白酶底物這里描述的納米新月體指示物可以利用多肽序列，該序列包括任意期望檢測(cè)的蛋白酶的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。蛋白酶(蛋白水解活性)不僅需要用于維持正常的細(xì)胞功能，而且對(duì)于各種人類疾病的發(fā)病機(jī)理也是重要的。寄生蟲病(例如血吸蟲病和瘧疾)、真菌(例如人白色念珠菌(C.ablicans))和病毒感染(例如HIV、皰瘆和肝炎)，以及癌癥、炎癥、呼吸性疾病、心臟血管疾病和神經(jīng)變性疾病，包括阿爾海默癥，需要蛋白水解活性用于發(fā)展。因此蛋白酶的存在、量或活性的檢測(cè)作為疾病的存在或可能性的診斷/預(yù)測(cè)標(biāo)志物是有用的。另外，蛋白酶活性(或其抑制)的檢測(cè)對(duì)于處理大量病理的蛋白酶抑制劑療法的篩查是有用的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明檢測(cè)和/或量化的"蛋白酶"典型地是使位于多肽鏈中氨基酸對(duì)之間肽鍵水解的酶，也稱作內(nèi)切蛋白酶。蛋白酶典型地通過參照酶的催化中心中的親核體而定義。最常見的親核體來自絲氨酸、天冬氨酸、和半胱氨酸的側(cè)鏈，產(chǎn)生蛋白酶家族，例如絲氨酸蛋白酶(Paetzel等人(1997)7ewfe說0c/2e附.22;28-31)、天冬氨酰蛋白酶(Spinelli等人(1991)所oc/zem/e73:1391-1396)、和半胱氨酸蛋白酶(Altschuh等人(1994)尸ra/.五"g.7:769-75,1994)。金屬蛋白酶通常在催化位點(diǎn)含有鋅催化金屬(Klimpel等人(1994)Mo/.M/craWo/.13:1093-1100)。這些蛋白酶家族各成員的展示性實(shí)例提供在表1中。表1.展示性蛋白酶和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(*是指被水解的肽鍵)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>"蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，，是通過肽鍵連接的氨基酸的連續(xù)序列，其含有通過特定蛋白酶水解的肽鍵連接的氨基酸對(duì)。任選地，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)可以包括在待水解的肽鍵的任一側(cè)上的一種或多種氨基酸，該氨基酸也結(jié)合有蛋白酶的4崔4匕^f立點(diǎn)(Schecter和Berger，(1967)5/oc/zew.5/op/z;^Commww.27:157-62)，或者在蛋白酶底物上的識(shí)別位點(diǎn)和剪切位點(diǎn)可為通過一個(gè)或多個(gè)(例如，2-4個(gè))氨基酸分開的兩個(gè)不同的位點(diǎn)。蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)中氨基酸的特異性序列典型地取決于該蛋白酶的催化機(jī)理，其通過該蛋白酶活性位點(diǎn)處官能團(tuán)的性質(zhì)限定。例如，胰島素水解通過賴氨酸或精氨酸殘基賦予羰基官能的肽鍵，而于多肽《連的長(zhǎng)度或氨基酸序列無關(guān)。然而，凝血因子Xa識(shí)別特異性序列Ile-Glu-Gly-Arg(SEQIDNO:19)并使Arg的C端側(cè)上的肽鍵水解。因此，在各種實(shí)施方式中，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、或IO或更多個(gè)氨基酸。任選的，額外的氨基酸可以存在于識(shí)別位點(diǎn)的N端和/或C端。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)還可以為已知蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)的變體，只要其通過蛋白酶識(shí)別/剪切。各種優(yōu)選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括，但不限于下列酶的識(shí)別位點(diǎn)來自絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、或金屬蛋白酶、或來自半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、和/或來自天冬氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、和/或來自谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的絲氨酸蛋白的識(shí)別位點(diǎn)包括但不限于下列酶的識(shí)別位點(diǎn)類胰凝乳蛋白酶、和/或類枯草桿菌蛋白酶、和/或a/卩水解酶、和/或信號(hào)肽酶。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的金屬蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括但不限于金屬羧基肽酶或金屬肽內(nèi)酶的識(shí)別位點(diǎn)。蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。對(duì)于基本上每個(gè)已知的蛋白酶已經(jīng)確定了其識(shí)別位點(diǎn)。因此，例如，胱天蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)(肽底物)由Earnshaw等人在(1999)^""".說oc/ze肌，68:383-424中描述，該文獻(xiàn)通過引用納入本文(也見表2)。表2.胱天蛋白酶的展示性肽底物(*是指被水解的肽鍵)名稱肽底物SEQIDNO胱天蛋白酶1YEVD*X20(ICE)WEHD*X21胱天蛋白酶2VDVAD*X22(lch-IL)DEHD*X23胱天蛋白酶3DMQD*X24(CPP32，Apopain)DEVD*X25胱天蛋白酶4LEVD*X26(Icere|IITx，Ich-2)(W/L)EHD*X27胱天蛋白酶5(W/L)EHD*X28(ICErelIII,Ty)胱天蛋白酶6VEID*N29(Mch2)VEHD*X30胱天蛋白酶7DEVD*X31(Mch3,CMH-l,ICE-LAP3)胱天蛋白酶8IETD*X32LED*X33胱天蛋白酶9LEHD*X34胱天蛋白酶10IEAD*X35在一個(gè)檢測(cè)PSA的展示性實(shí)施方式中，肽設(shè)計(jì)引入具有絲氨酸殘基的22PSA-特異性肽的活性位點(diǎn)的氨基酸序列和可以通過PSA識(shí)別的側(cè)翼序列。因此，例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，肽含有已經(jīng)顯示對(duì)蛋白水解活性PSA具有非常高的特異性的序列HSSKLQ-LAAAC(SEQIDNO:36)(參見，例如，Denmeade,等人(1997)C朋cer7^57:4924-4930)。已經(jīng)顯示出在小鼠模型的體內(nèi)HSSKLQ-L(SEQIDNO:37)由PSA剪切但不由任何其它的蛋白酶剪切(Denmeade，等人(2003)JA^/./"W.95:990-1000)。因此，在另一實(shí)施方式中，可產(chǎn)生多種肽，各自具有隨機(jī)或已知的序列部分，只要各自引序列。在一個(gè)展示性實(shí)施方式中，PSA消化位點(diǎn)在肽HSSKLQ-LAAAC(SEQIDNO:36)中谷氨酸(Q)和亮氨酸(L)殘基之間。該肽消化成2個(gè)片段，HSSKLQ(SEQIDNO:l)和LAAAC(SEQIDNO:38)。該肽優(yōu)選地附接于納米新月體表面，使得該肽不受PSA酶的空間位阻，從而可最優(yōu)地處理。預(yù)期在從而提高檢測(cè)靈敏度。但是這樣做拉曼標(biāo)記分子的距離可能更遠(yuǎn)離納米新月體的表面，導(dǎo)致較低的拉曼強(qiáng)度水平。然而，類線圈的短肽結(jié)構(gòu)導(dǎo)致末梢的拉曼標(biāo)記分子與納米新月體表面接觸的可能性大。在某些實(shí)施方式中，肽包含至少一個(gè)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。在各種實(shí)施方式中，肽可以包含兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。所述位點(diǎn)可以是用于相同的蛋白酶的并具有都被該蛋白酶識(shí)別的不同的基序。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)可以是相同的。在某些實(shí)施方式中，肽可以包括多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，各自用于不同的蛋白酶，從而允許檢測(cè)或量化多種蛋白酶中任意一種的存在或活性。通常，肽具有足夠的長(zhǎng)度以引入期望的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，肽比蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)并含有額外的氨基酸殘基，例如，作為間隔區(qū)和/或有助于通過蛋白酶的識(shí)別。通常，肽的長(zhǎng)度為約2、3、4、5、6、8、或10個(gè)氨基酸中的任一種情況至約20、30、50、80、或100個(gè)氨基酸中的任一種情況。在某些實(shí)施方式中，底物肽是長(zhǎng)度為約3-12、或約4-12、或約6-12、或約8-12、或約10-12個(gè)氨基酸殘基的寡肽。然而，在某些實(shí)施方式中，肽可以短至4個(gè)氨基酸殘基，和長(zhǎng)至100個(gè)氨基酸。23拉曼標(biāo)記在各種實(shí)施方式中，可以將一種或多種拉曼標(biāo)簽(拉曼標(biāo)記)附接于附接到納米新月體上的底物(例如，多肽)。這種拉曼標(biāo)記的存在可以增強(qiáng)由肽的剪切產(chǎn)生的拉曼信號(hào)的變化?，F(xiàn)有技術(shù)(例如，美國專利5，306，403;6,002,471;6,174,677，這些通過引用納入本文)中已知多種拉曼標(biāo)簽并且可以使用任何這些已知的拉曼標(biāo)簽。標(biāo)簽通常具有特征性的(例如，獨(dú)特的)并高可視化的/可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)。標(biāo)記分子的非限制性實(shí)例包括TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對(duì)苯二曱酸、間苯二曱酸、曱苯基堅(jiān)牢紫、曱苯基藍(lán)紫、亮?xí)醣交{(lán)、對(duì)氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基熒光素、5-羧基-2，，4，，5，，7，-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四曱基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有這種部分的化合物。在某些實(shí)施方式中，可以使用碳納米管、量子點(diǎn)(參見，例如，EvidentTechnologies,TroyN.Y.;Invitrogen/MolecularProbes,efc.)、或樣O求(例如，熒光樣U求(參見，例如，4尋自Invitrogen/MolecularProbes6勺Transfluosphres⑧)yf乍為才立曼才示"i己。多種拉曼標(biāo)簽是可商購的(例如，得自Invitrogen/MolecularProbes)并且經(jīng)常提供為附接于接頭上的和/或衍生有一種或多種官能團(tuán)的，以促進(jìn)與其它部分的耦聯(lián)。底物與納米新月體的耦聯(lián)肽(蛋白酶底物)和/或存在的拉曼標(biāo)簽可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中任一種彼此耦聯(lián)。肽(或其它底物)可以例如通過底物(肽)和/或納米新月體上的反應(yīng)性基團(tuán)直接耦聯(lián)到新月體?；蛘唠?或其它底物)可以通過接頭附接于新月體。類似的，當(dāng)存在時(shí)，拉曼標(biāo)簽可以直接地(例如，通過官能團(tuán))或也通過接頭附接于肽(或其它底物)。例如，在某些實(shí)施方式中，依靠形成共價(jià)鍵的金-硫醇反應(yīng)，利用肽的羧基端處的半胱氨酸基團(tuán)，將底物肽粘連到金納米新月體殼的表面上以將肽附接于金表面。在各種實(shí)施方式中，納米新月體(例如，金)表面和/或底物(例如，蛋白酶底物)可以衍生有，例如，胺、羧基、烷基、鏈烯基、羥基、或其它官能團(tuán)使得肽(或其它底物)可以直接地連接到納米新月體表面和/或拉曼標(biāo)簽或通過接頭耦聯(lián)。在另一實(shí)施方式中，納米顆?？赏扛灿校?，具有胺、羧基、或其它官能團(tuán)的二氧化硅殼以附接于肽(或其它底物)。合適的接頭包括但不限于含有兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)性位點(diǎn)的異雙功能團(tuán)分子或同雙功能性分子，該反應(yīng)性位點(diǎn)均可與分別的結(jié)合配偶體(即拉曼標(biāo)記、肽(或其它底物)、納米新月體表面或其上的官能團(tuán)等)形成共價(jià)鍵。適合用于連接這種部分的接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，蛋白質(zhì)分子可容易地通過多種接頭中的任一種連接，該多種接頭包括但不限于肽接頭、直鏈或帶支鏈的碳鏈接頭、或通過雜環(huán)碳接頭連接。異雙功能團(tuán)交聯(lián)劑例如N-乙基馬來酰亞胺的活性酯已經(jīng)被廣泛用于將蛋白質(zhì)連接到其它部分(參見，例如，Lerner等人(1981)尸rac.7VWJcW.(USA),78:3403陽3407;Kitagawa等人(1976)/5/oc/zem.,79:223-236;Birch和Lennox(1995)單克隆抗體原理和應(yīng)用(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications)中的第四章，Wiley-Liss,N.Y.等)。在某些實(shí)施方式中，可利用生物素/抗生素蛋白的相互作用將納米新月體和/或拉曼標(biāo)簽與肽(或其它底物)結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，可以將例如具有不耐光保護(hù)基團(tuán)的生物素或抗生素蛋白附接于納米新月體上。在承載有相應(yīng)抗生素蛋白或鏈霉抗生素蛋白、或生物素的期望部分的存在下照射納米新月體，導(dǎo)致該部分與納米新月體耦聯(lián)。對(duì)于一種或多種部分(例如，納米新月體，肽(或其它底物，和/或拉曼標(biāo)簽))承載反應(yīng)性基團(tuán)或衍生以承載反應(yīng)性基團(tuán)來說，可容易提供多種耦聯(lián)方法。因此，例如，游離氨基進(jìn)行?；磻?yīng)，所述酰化反應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種羧基活化接頭擴(kuò)展(linkerextension)。接頭擴(kuò)展可以在該階段進(jìn)行以產(chǎn)生末端活化基團(tuán)例如活性酯、異氰酸酯、馬來酰亞胺等。例如，肽或氨基衍生的納米新月體與雙羧酸如對(duì)苯二曱酸的同雙功能性N-羥基琥珀酰亞胺酯的一端的反應(yīng)將產(chǎn)生可用于綴合到胺的穩(wěn)定的N-羥基琥珀酰亞胺酯封端的接頭加合物。接頭擴(kuò)展還可以用異雙功能性試劑例如馬來酰亞胺鏈烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯完成以產(chǎn)生末端馬來酰亞胺基團(tuán)用于后續(xù)的與硫醇基團(tuán)的綴合。氨基封端的接頭可以用異雙功能性硫醇化試劑擴(kuò)展，該硫醇化試劑進(jìn)行反應(yīng)以在一端形成酰胺鍵并在另一端形成游離的或受保護(hù)的硫醇。25現(xiàn)有技術(shù)中熟知的這種硫醇化試劑的一些實(shí)例有2-亞氨基四氫噻吩(2-iminothiolane)(2-IT)、琥珀酰亞氨基乙?；虼狨?SATP)和琥珀酰亞氨基-2-硫代吡咬基二硫代丙酸酯(SPDP)。然后在去保護(hù)之后可獲得初期硫醇基團(tuán)，與馬來酰亞胺基部分或溴乙?；糠中纬闪虼济鸦蛑苯优c金表面相互作用。在各種實(shí)施方式中，例如通過在酸的存在下與堿金屬亞硝酸鹽反應(yīng)，氨基例如氨基封端的接頭的氨基可以轉(zhuǎn)化為重氮基團(tuán)，因此該物質(zhì)轉(zhuǎn)化為重氮鹽，然后，該重氮鹽與合適的親核部分(例如，但不限于肽的酪氨酸殘基等)有反應(yīng)性。用于向這種重氮鹽轉(zhuǎn)化的合適氨基封端的接頭的實(shí)例包括但不限于芳族胺(苯胺)，并且還可包括上述的氨基己酸酯和類似的物質(zhì)。這種苯胺可容易地通過在如上所述的可獲得的羥基和N保護(hù)的氨基酸之間的耦聯(lián)反應(yīng)中代入相應(yīng)氨基酸而獲得，其中氨基由芳族胺(即苯胺)組成，其中胺作為例如N-乙?；騈-三氟乙酰基而合適地被保護(hù)，然后使用本領(lǐng)域已知成重氮鹽的胺前體。異雙功能性接頭的其它有利類型是混合的活性酯/酰氯，例如琥珀酰亞氨基-氧羰基-丁酰氯。該接頭的反應(yīng)性較強(qiáng)的酰氯端先使例如肽上的氨基或羥基?；灾苯犹峁㎞-羥基琥珀酰亞氨基酯接頭加成物。本發(fā)明中有用的另一種末端活化基團(tuán)是醛基。醛基可以通過以下方式產(chǎn)生使游離羥基(例如在肽或衍生納米新月體上的)與烷基酸或芳基酸耦聯(lián)而產(chǎn)生，該烷基酸或芳基酸在co位(末端)取代有屏蔽的醛基如乙縮醛基，例如1,3-二氧雜環(huán)戊-2-基或1,3-二氧雜環(huán)己-2-基部分，隨后使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行該基團(tuán)的去屏蔽。在各種實(shí)施方式中，在co位取代有保護(hù)的羥基(例如，乙酸基部分)的烷基或芳基羧酸可以用于耦聯(lián)反應(yīng)中，隨后在合適的溶劑，優(yōu)選二氯曱烷中用如重鉻酸吡啶錯(cuò)鹽的試劑進(jìn)行羥基的去保護(hù)和輕度氧化，從而提供相應(yīng)的醛。產(chǎn)生醛封端的物質(zhì)的其它方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是明顯的。在某些實(shí)施方式中，相同或不同的多個(gè)肽綴合到相同或不同的納米新月體的表面。在多種實(shí)施方式中，約5-500，更優(yōu)選約10-約400，進(jìn)一步更優(yōu)選約20、30、或40-約200、250、或300,且最優(yōu)選約50-約150個(gè)底物分子(例如肽)附接于納米新月體。在一個(gè)實(shí)施方式中，約100個(gè)肽利用Au與肽上硫醇基團(tuán)的直接反應(yīng)綴合到納米新月體。26在各種實(shí)施方式中，底物，例如可以通過蛋白水解活性蛋白酶特異性剪切的肽，綴合或粘連到納米新月體的表面上。在優(yōu)選實(shí)施方式中，底物肽是長(zhǎng)度約10-12個(gè)氨基酸殘基的寡肽。然而，在多種實(shí)施方式中，肽可以短至4個(gè)氨基酸殘基，和長(zhǎng)至100個(gè)氨基酸。在各種實(shí)施方式中，肽包括通過相應(yīng)的蛋白酶特異性識(shí)別和剪切的底物。肽可以合成以及商業(yè)化地獲得，或者肽可以根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法制備。在某些實(shí)施方式中，在肽的氨基末端，拉曼活性分子例如生物素(圖1A)或羅丹明6G(R19)(圖1A)優(yōu)選地通過短的聚乙二醇或氨基戊酸接頭接枝。上述耦聯(lián)方法M示性的而不是限制性的。利用本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到將底物耦聯(lián)到納米新月體的，以及任選地將拉曼標(biāo)簽耦聯(lián)到底物的各種方法。拉曼指示物的檢測(cè)在拉曼光語中有潛在用途的多種檢測(cè)單元在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的且可使用任意已知的拉曼檢測(cè)單元。拉曼檢測(cè)單元的一個(gè)非限制性實(shí)例公開于美國專利6,002,471中。在該實(shí)例中，激發(fā)束通過Nd:YAG激光器在532nm(納米)波長(zhǎng)下產(chǎn)生或者通過Ti:藍(lán)寶石激光器在365nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生。可使用脈沖激光束或連續(xù)激光束。激發(fā)束穿過共焦光學(xué)系統(tǒng)(confocaloptics)和顯微鏡物鏡，并且可聚焦在含有附著的生物分子靶的基底上。拉曼發(fā)射光靶可以通過顯微鏡物鏡和共焦光學(xué)系統(tǒng)聚集，耦聯(lián)到用于光譜分離的單色器。該共焦光學(xué)系統(tǒng)可以包括二向色濾光片、阻擋濾光片、共焦孔、透鏡、和用于減少背景信號(hào)的鏡片的組合。還可以使用標(biāo)準(zhǔn)全場(chǎng)光學(xué)系統(tǒng)作為共焦光學(xué)系統(tǒng)。拉曼發(fā)射信號(hào)可以通過拉曼檢測(cè)器檢測(cè)。該檢測(cè)器可以包括與用于信號(hào)計(jì)數(shù)和數(shù)字化的計(jì)算機(jī)接口連接的的雪崩光電二極管。其中對(duì)靶陣列進(jìn)行分析，光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)可設(shè)計(jì)為檢測(cè)拉曼信號(hào)和將拉曼信號(hào)定位于芯片或網(wǎng)格上的特定位置。例如，發(fā)射光可引導(dǎo)至CCD(電荷耦合器件)照相機(jī)或其它能夠在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)同時(shí)測(cè)量來自多個(gè)像素或多組像素的光發(fā)射的檢測(cè)器。拉曼檢測(cè)單元的其它實(shí)例公開于，例如，美國專利5,306,403,包括SpexModel1403雙光柵分光光度計(jì)，其配有以單光子計(jì)數(shù)模式操作的砷化鎵光電自SpectmPhysics的514.5nm線的氬離子激光器Model166，和647.1nm線的氪離子激光器(Innova70，Coherent)。27各種激發(fā)源包括但不限于337nm下的氮激光器(LaserScienceInc.)和325nm下的氦-鎘激光器(Uconox)(美國專利6,174,677)。該激發(fā)束可以用帶通濾光片(Corion)進(jìn)行光譜純化并可使用6倍物鏡(Newport,ModelL6X)聚焦在基底140上。該物鏡可用于通過使用全息分束器(KaiserOpticalSystems,Inc.,ModelHB647-26N18)激發(fā)指示物和聚集拉曼信號(hào)，以產(chǎn)生對(duì)于激發(fā)束和發(fā)射拉曼信號(hào)來說的直角幾何結(jié)構(gòu)?？梢允褂萌⑾莶V波器(KaiserOpticalSystems,Inc.)以減少瑞利散射輻射。其它拉曼檢測(cè)器包括但不限于配備有紅色增強(qiáng)的強(qiáng)化電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測(cè)系統(tǒng)的ISAHR-320攝譜儀(PrincetonInstruments)?？墒褂闷渌愋偷臋z測(cè)器，例如電荷注入器件、光導(dǎo)二極管陣列或光電晶體管陣列。使用如圖5所示的包括具有拉曼分光計(jì)的顯微鏡系統(tǒng)的一種典型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)配置以從單個(gè)納米新月體獲得拉曼散射光譜。在一個(gè)實(shí)施方式中，該系統(tǒng)由配備有數(shù)字照相機(jī)和具有攝譜儀CCD照相機(jī)的單色儀的倒置顯微鏡例如CarlZeissAxiovert200(CarlZeiss,德國)、激光源和光學(xué)透鏡組成。在各種實(shí)施方式中，激光波長(zhǎng)可以在可見光區(qū)和近紅外區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用785nm的半導(dǎo)體激光器作為拉曼散射的激發(fā)源，并且激光束通過40X物鏡聚焦在納米新月體上。785nm或其它近紅外光源可以確保由樣品中生物組織的吸收較少和較低的熒光背景。然而，對(duì)于某些應(yīng)用，較低的波長(zhǎng)激發(fā)光可能是更有利的，且甚至UV光激發(fā)可以用于應(yīng)用。激發(fā)功率也可通過光度計(jì)測(cè)量以確保在某些實(shí)施方式中~0.5到1.0mW的輸出。拉曼散射光可以通過相同的光路穿過長(zhǎng)通濾波器聚集并通過分光計(jì)分析。在各種實(shí)施方式中，確定生物樣品中蛋白酶的存在、和/或濃度、和/或活性。生物樣品可以包括基本上任意期望測(cè)定的生物材料。這種生物材料包括但不限于生物流體例如血液和血液組分、淋巴、腦脊液、精液、尿、口腔液等、組織樣品、細(xì)胞樣品、組織或器官活檢或抽出物、組織學(xué)標(biāo)本等。在各種實(shí)施方式中，優(yōu)選在封閉的透明微室中，肽綴合的納米新月體用懷疑含有蛋白酶分子的樣品培養(yǎng)。該微室安置在具有用于納米顆?？梢暬陌祱?chǎng)照明的倒置拉曼顯微鏡的熱板(例如，在37匸下的)上。該納米新月體利用暗場(chǎng)照明從傾斜的角度可視化，如插圖中的亮點(diǎn)所示。激發(fā)激光通過顯微鏡物鏡聚焦在納米新月體上。SERS信號(hào)用相同的物鏡聚集并通過分光計(jì)分析。插圖顯示聚焦在單個(gè)納米新月體上的~0.8mW的激發(fā)激光斑。消化反應(yīng)的實(shí)時(shí)^r測(cè)可以在30分鐘內(nèi)發(fā)生。然而，在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)可以短至1-5分鐘和長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，或者，如果應(yīng)用需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間則更長(zhǎng)。在初始離心分級(jí)之后，粗細(xì)胞溶解產(chǎn)物、尿樣品、精液、腦脊液、血液、或其它樣品材料中的可溶物可以直接用探針培養(yǎng)。探針的濃度不是關(guān)鍵的，因?yàn)槊看蝺H檢測(cè)一個(gè)或幾個(gè)探針。為了特異性地抑制綴合肽的蛋白酶介導(dǎo)的蛋白水解，可以在加入蛋白酶之前引入蛋白酶抑制劑。例如，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，加入抑制劑之后抑制了超過90%的通過PSA進(jìn)行的肽消化。蛋白酶的存在、濃度和活性的一個(gè)檢測(cè)方案如圖1B所示。在該方法中，將肽綴合SERS探針提供給溶液或樣品。在蛋白水解反應(yīng)之前，肽綴合的納米新月體的SERS光譜含有拉曼標(biāo)記分子、聚苯乙烯納米顆粒、和肽的特征峰。通過蛋白酶進(jìn)行的消化反應(yīng)應(yīng)該在預(yù)定的剪切位點(diǎn)剪切肽。例如，在通過PSA進(jìn)行的消化反應(yīng)期間，在Q和L殘基之間剪切肽HSSKLQ-L(SEQIDNO:37)，這里用點(diǎn)劃線表示。人工肽的SERS光譜在用蛋白酶的剪切之后改變，因?yàn)楹欣鼧?biāo)記分子的剪切片段從納米新月體表面上擴(kuò)散離開，同時(shí)其它片段保留在納米新月體表面上。具有拉曼活性標(biāo)記的分子部分的特征SERS峰消失，這是由于在肽消化之后標(biāo)記分子從納米新月體表面擴(kuò)散錯(cuò)位到溶液中；因此溶液中有蛋白水解活性的PSA的存在和濃度可以通過監(jiān)測(cè)肽綴合的納米新月體的SERS光譜進(jìn)行探測(cè)。然后，附接肽的拉曼散射信號(hào)通過納米新月體放大且通過如上所述的含有拉曼分光計(jì)的顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)，以從單個(gè)納米新月體獲得拉曼散射光譜。優(yōu)選將拉曼散射分光計(jì)連接到計(jì)算機(jī)，從而能夠控制分光計(jì)并且能夠獲得光譜，并且可觀察光譜圖。消化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可通過時(shí)間分辨的SERS光譜采集進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，光語圖中見到的來自拉曼標(biāo)記分子的峰，例如，圖6A中來自生物素的525cm-1處的峰和圖6B中來自R19的1183cm-1處的峰，這些峰在消化反應(yīng)完成之后幾乎完全消失(圖6A和B)。如圖6A中時(shí)滯SERS光譜所示，用525cm"處的生物素峰的消失監(jiān)測(cè)的各納米新月體上肽的消化，在420nM的PSA濃度下花費(fèi)30分鐘。對(duì)于具有R19作為拉曼標(biāo)記分子的肽，在通過420nM的PSA消化之后也可以觀察到1183cm"處R19峰的消失(圖6B)。因此，肽的消化可以通過拉曼標(biāo)記分子的釋放和其拉曼峰的消失而確認(rèn)。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的時(shí)間分辨率(tempomlresolution)可以為約幾秒且反應(yīng)通常持續(xù)10~20分鐘。光譜檢測(cè)可以用普通的光譜多色計(jì)(spectralpolychrometer)和致冷CCD照相機(jī)進(jìn)行。拉曼峰的監(jiān)測(cè)波數(shù)為400cm"-2000cm"。在某些實(shí)施方式中，消化反應(yīng)中納米新月體SERS探針中的拉曼活性標(biāo)記的拉曼峰的時(shí)滯強(qiáng)度分別用蛋白酶、具有抑制劑的蛋白酶、和陰性對(duì)照物獲得。所有的峰強(qiáng)度值歸一化至內(nèi)部對(duì)照峰(例如，測(cè)量聚苯乙烯芯的峰強(qiáng)度為1003cm")和陽性或陰性對(duì)照物的波數(shù)處的初始峰強(qiáng)度。陰性對(duì)照物可以為納米新月體-肽混雜物，其中該肽不是感興趣的蛋白酶的底物并且不被所研究的蛋白酶剪切。結(jié)果應(yīng)該表明，通過拉曼活性標(biāo)記的峰強(qiáng)度的逐漸消失，肽通過PSA有效地和特異性地剪切。納米新月體顆粒起到納米信號(hào)放大器的作用并且檢測(cè)到的拉曼信號(hào)來自粘連在納米新月體顆粒表面上的所有肽。在某些實(shí)施方式中，每個(gè)納米新月體最多附接IOO個(gè)肽分子，可能沒有完全利用具有最高SERS信號(hào)的納米新月體表面，并且僅有小百分比的肽附接于在電磁場(chǎng)中提供最大增強(qiáng)的區(qū)域(圖1C)。數(shù)值模擬(圖1C)表明局部電場(chǎng)的振幅可以增強(qiáng)近MdB(100倍)，特別在銳邊周圍。由于電場(chǎng)振幅和拉曼增強(qiáng)因子之間的四次方關(guān)系，肽拉曼信號(hào)可通過納米新月體放大108倍。而且，由于平均有幾十到幾百個(gè)肽用于對(duì)各納米新月體的綴合反應(yīng)，來自標(biāo)記分子的特征拉曼峰的消失不是驟然的。由于大部分增強(qiáng)的區(qū)域集中在占納米新月體總面積的~1/6的頂端區(qū)域周圍，即使假設(shè)綴合效率為100%，在該高的增強(qiáng)區(qū)域中貢獻(xiàn)于拉曼散射信號(hào)的實(shí)際分子數(shù)也小于20個(gè)。在某些實(shí)施方式中，作為對(duì)于各種蛋白酶(例如PSA)濃度的PSA消化時(shí)間的函數(shù)，用于陽性對(duì)照物的拉曼峰的強(qiáng)度在檢測(cè)樣品中蛋白酶(例如PSA)的存在或活性之前獲得。具有用于PSA綴合物的陽性對(duì)照生物素和R19拉曼標(biāo)記分子的肽綴合的納米新月體的典型SERS光譜分別如圖6A和6B所示。通過對(duì)比肽消化實(shí)驗(yàn)前和肽消化實(shí)驗(yàn)2小時(shí)后的SERS光譜，得自納米新月體芯的拉曼峰(例如，聚苯乙烯芯，例如1003cm")保持恒定，并因此還可以起到內(nèi)部對(duì)照物的作用。消化速率與PSA濃度有關(guān)，且對(duì)于lnM濃度PSA活性通常(生物素信號(hào)強(qiáng)度降低~50%,未顯示數(shù)據(jù))在30分鐘內(nèi)觀察到。某些來自在消化之后保留在納米新月體表面上的部分氨基酸鏈的拉曼峰可能仍在光譜中出現(xiàn)，雖然峰位置有輕微的變化并且由于肽剪切時(shí)可能的構(gòu)象變化而使峰強(qiáng)度降低。在某些實(shí)施方式中，實(shí)施陰性對(duì)照物以顯示肽是通過樣品中存在的蛋白酶特異性地剪切的。實(shí)施例1使用其它絲氨酸蛋白酶例如粒酶B(其可以起到陰性對(duì)照物的作用)顯示了綴合肽對(duì)PSA的特異性。圖7C和7D顯示了具有R19標(biāo)記分子的PSA綴合納米新月體在分別用PSA抑制劑和絲氨酸蛋白酶粒酶B的兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的時(shí)滯SERS光譜，其中粒酶B具有與PSA的正交底物特異性。在用420nM粒酶B進(jìn)行的肽消化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)速率沒有顯示出與抑制劑處理的反應(yīng)有統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。還預(yù)期粒酶B無能力剪切肽，因?yàn)镻SA已經(jīng)顯示是HSSKLQ-LAAAC(SEQIDNO:36)序列在體內(nèi)唯一的蛋白酶。在各種實(shí)施方式中，肽綴合納米新月體可以用作特異性篩查工具以提供在臨床環(huán)境(clinicalsetting)中從病人獲得的生物樣品中的蛋白酶癌癥生物標(biāo)志物例如PSA和其它物質(zhì)的濃度和蛋白水解活性的信息。預(yù)計(jì)這里描述的指示物的一種應(yīng)用是將納米新月體顆粒結(jié)合到可以自動(dòng)化和促進(jìn)樣品傳輸和洗滌過程的微流體設(shè)備中。該納米新月體顆粒還可以實(shí)時(shí)傳輸或固定在該設(shè)備中。其它應(yīng)用包括將納米新月體顆粒引入到活的細(xì)胞或組織中，使得可以在細(xì)胞或組織中實(shí)時(shí)測(cè)量蛋白酶活性。這些實(shí)例旨在展示且是非限制性的。利用這里提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將獲得其它用途和測(cè)定。其它指示物雖然上述討論涉及納米新月體-肽綴合物(指示物)的使用以檢測(cè)活性蛋白酶，將認(rèn)識(shí)到相同的方法可以用于檢測(cè)其它水解性生物分子的存在。因此，例如，肽蛋白酶底物可以用單鏈或雙鏈核酸(RNA或DNA)替代，并且該指示物可以檢測(cè)和/或量化活性核酸酶的存在。在這種情況下，核酸底物通常包括用于核酸酶(例如，限制性內(nèi)切酶)的一個(gè)或多個(gè)的識(shí)別位點(diǎn)。該核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的長(zhǎng)度通常在約3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp至約15bp、20bp、25bp或30bp的范圍內(nèi)。在各種實(shí)施方式中，核酸長(zhǎng)度的范圍可以在約3bp到約200bp，優(yōu)選約4bp到約100bp，更優(yōu)選約6、8、10、16、或20bp到約80、60、40、或30bp。本發(fā)明的指示物也不僅限于檢測(cè)水解/蛋白水解活性。指示物還可以用于檢測(cè)和/或量化結(jié)合相互作用(例如，蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)/DNA相互作用、抗體/抗原相互作用、受體/配體相互作用等)。31因此，例如，可提供耦聯(lián)到一種或多種納米新月體的蛋白質(zhì)、和/或糖、和/或復(fù)合碳水化合物、和/或脂質(zhì)、和/或核酸"底物"。當(dāng)該底物被識(shí)別并通過同源結(jié)合配偶體結(jié)合時(shí)，拉曼光譜將改變并檢測(cè)到相互作用。因此，例如，可以提供附接于納米新月體的核酸底物，其中該核酸包括一個(gè)或多個(gè)用于例如DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的識(shí)別位點(diǎn)。通過DNA結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行的核酸結(jié)合改變了拉曼光譜從而產(chǎn)生了可檢測(cè)的信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，該底物還承載有上述一種或多種拉曼標(biāo)簽。雖然拉曼標(biāo)簽可能不在簡(jiǎn)單的結(jié)合相互作用中被切斷，但由結(jié)合部分引起的增加的空間位阻降低了拉曼標(biāo)簽與納米新月體的締合，從而顯著地改變了拉曼光譜。其它實(shí)施方式利用"竟?fàn)?測(cè)定形式用于結(jié)合測(cè)定。在這種測(cè)定中，分析物與承載拉曼標(biāo)簽的類似部分為附接了納米新月體的底物上的結(jié)合位點(diǎn)竟?fàn)帯Ｓ欣鼧?biāo)記的部分從其在底物上的結(jié)合位置被待測(cè)定的樣品中的靶分析物替代，提供了拉曼光譜中可檢測(cè)的變化，這是樣品中存在的分析物量的量度。這些測(cè)定旨在展示且是非限制性的。利用這里提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將獲得其它測(cè)定形式。試劑盒在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于實(shí)施這里描述的方法的試劑盒。該試劑盒通常包括含有這里描述的納米新月體的容器。該試劑盒還可以含有一種或多種底物(例如，蛋白酶底物、核酸底物等)。該底物可以在單獨(dú)的容器中提供用于后續(xù)與納米新月體的綴合，或者它們可作為納米新月體綴合物提供。該試劑盒還可以包括一種或多種拉曼標(biāo)簽。該標(biāo)簽可以單獨(dú)提供或作為底物納米新月體綴合物的組分提供。在各種實(shí)施方式中，該試劑盒任選地包括一種或多種這里描述的對(duì)照試劑(例如，綴合到不能剪切的底物的納米新月體)。在各種實(shí)施方式中，該試劑盒任選地包括用于收集和/或處理生物樣品的裝置(例如，注射器、藥簽等)和/或試劑(例如，稀釋劑和/或緩沖液)。另外，該試劑盒任選地包括對(duì)實(shí)施這里描述方法提供指導(dǎo)(即協(xié)議)的標(biāo)簽性和/或說明材料。在某些實(shí)施方式中，該說明材料描述了使用一種或多種本發(fā)明的指示物檢測(cè)和/或量化蛋白酶的存在或活性。在各種實(shí)施方式中，該說明材料教導(dǎo)了使用指示物和SERS檢測(cè)方案以檢測(cè)核酸水解和水解反應(yīng)。32可以檢測(cè)各種酶例如核酸酶和水解酶的存在、濃度和活性。雖然該說明材料通常包括書面的或打印的材料，但它們不限于此。本發(fā)明預(yù)期能夠存儲(chǔ)這種說明并將它們與最終用戶溝通的任意介質(zhì)。這種介質(zhì)包括但不限于電子存儲(chǔ)介質(zhì)(例如，磁盤、錄像帶(tape)、盒式磁帶、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如，CDROM)等。這種介質(zhì)可包括提供這種說明材料的英特網(wǎng)網(wǎng)站的地址。實(shí)施例提供下列實(shí)施例以展示，但不限于要求保護(hù)的本發(fā)明。實(shí)施例1用于蛋白酶的光學(xué)檢測(cè)的肽-納米新月體混雜SERS探針蛋白酶的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)對(duì)于早期癌癥篩查和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究是關(guān)鍵的。然而，在小體積(例如，低于lnL)下用熒光或放射探針是難以實(shí)現(xiàn)這種檢測(cè)的。在該實(shí)施例中，我們展示了將人工標(biāo)記分子結(jié)合到納米新月體顆粒肽的混雜光學(xué)探針的用途。我們使用PSA(—種最顯著的前列腺癌標(biāo)志物)和病人精液和血清中存在的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行概念驗(yàn)證(proof-of-concept)研究。來自標(biāo)記分子的拉曼光譜信號(hào)通過納米新月體增強(qiáng)并且該信號(hào)在接近于單個(gè)蛋白水解活性PSA分子的水平下以飛升反應(yīng)體積作為肽剪切的指示物而監(jiān)測(cè)。該肽的高的反應(yīng)特異性和監(jiān)測(cè)的拉曼信號(hào)也最小化了其它絲氨酸蛋白酶的錯(cuò)誤檢測(cè)和背景拉曼信號(hào)，這導(dǎo)致高保真度和高信噪比的可以容易地引入到納米/微流體設(shè)備中的癌癥納米探針。這里，我們介紹一種PSA蛋白水解活性的光學(xué)分光檢測(cè)方法，該方法基于PSA特異性底物肽(Robert等人(1997)所oc/ze脂:^y36:3811-3819;Wu等人(2004)C7/".C/^m.'50:125-129;Brillard畫Bourdet等人(2002)￡wk/歷oc/zem.,269:390-395;Rehault等人(2002)AocWm.歷op/y^.」cto1596:55-62;Malm等人(2000)/mtote45:132-139)綴合的新月體形狀拉曼納米探針，該方法可用在結(jié)合到微流體中或細(xì)胞內(nèi)引入的微小的樣品體積(飛升)上，并且可用于實(shí)時(shí)光學(xué)監(jiān)測(cè)PSA蛋白水解反應(yīng)。該納米新月體可以起到單獨(dú)的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)底物的作用(Lu等人(2005)5:119-124)。拉曼是一種具有豐富的原子水平信息而無需熒光團(tuán)進(jìn)行標(biāo)簽的用于探測(cè)生物化學(xué)組成的分光檢測(cè)方法(Raman(1928)A^wre121:619-619)，然而拉曼信號(hào)強(qiáng)度(散射橫截面)比熒光低得多。已經(jīng)開發(fā)了各種SERS底物將底物表面上化學(xué)和生物分子檢測(cè)中弱的拉曼散射信號(hào)增強(qiáng)了幾個(gè)數(shù)量級(jí)(Lu等人(2005)iVa"o5:119-124;Lu等人(2005)iV朋o5:119-124;Lu等人(2005)丄幼.5:5-9;Haes等人(2005)J爿w,C7zew.127:2264-2271;Jackson和Halas(2004)尸rac.iVa//.Jcad5W.,USA，101:17930-17935;Nie和Emory919975Wewce275:1102-1106;Liu和Lee(2005)p/.尸一￡饑87:074101)。納米新月體由100nm的聚苯乙烯芯和10~20nm的金新月體殼組成。圖1A顯示該納米新月體的示意圖和透射電子顯微照片。該納米新月體通過在旋轉(zhuǎn)的聚苯乙烯納米顆粒模版上成角度的Au沉積而制造(Lu等人(2005)A^w丄e".5:119-124)。制造細(xì)節(jié)如前所述(同前)。在該實(shí)施例中，不移除聚苯乙烯納米顆粒芯，并且其起到SERS檢測(cè)中內(nèi)部對(duì)照物的作用。然后我們將可以通過有蛋白水解活性的PSA特異性地剪切的底物肽粘連在Au納米新月體的表面上。該肽含有HSSKLQ序列(SEQIDNO:37)，該序列已經(jīng)顯示出對(duì)有蛋白水解活性的PSA具有非常高的特異性(Denmeade等人(1997)Ca"cer57,4924-4930)。在小鼠體內(nèi)模型中，已經(jīng)顯示出HSSKLQ(SEQIDNO:37)只通過PSA剪切而不通過任何其它蛋白酶剪切(Denmeade等人(2003)JAto/.C，cw/m.95:990-1000)。肽的羧基末端處的半胱氨酸基團(tuán)用于將肽附接于Au表面，依靠Au-硫醇反應(yīng)以形成共價(jià)鍵。在肽的氨基末端，將拉曼活性分子例如生物素(圖1A)或羅丹明6G(R19)(圖IB)通過短的聚乙二醇或氨基戊酸接頭接枝。檢測(cè)方案如圖IB所示。人工肽的SERS光譜在通過PSA剪切后改變，并且具有生物素或R19標(biāo)記的分子部分的特征SERS峰由于在肽消化后標(biāo)記分子從納米新月體表面的擴(kuò)散位移進(jìn)入溶液中而消失；因此，溶液中有蛋白水解活性的PSA的存在和濃度可以通過監(jiān)測(cè)肽綴合納米新月體的SERS光譜進(jìn)行探測(cè)。附接的肽的拉曼散射信號(hào)通過納米新月體放大。我們的數(shù)字模擬(圖IC)表明局部電場(chǎng)的振幅可以增強(qiáng)到接近于20dB(100倍)，特別在銳邊周圍。由于電場(chǎng)振幅和拉曼增強(qiáng)因子之間的四次方關(guān)系，肽拉曼信號(hào)可通過納米新月體放大108倍。圖5顯示實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)配置。將肽綴合納米新月體和PSA分子在密閉的透明微室中培養(yǎng)。該微室安置在具有用于納米顆?？梢暬陌祱?chǎng)照明的倒置拉曼顯微鏡上的37。C的熱板上。插入圖顯示聚焦在單個(gè)納米新月體上的~340.8mW的激發(fā)激光斑。具有生物素和R19拉曼標(biāo)記分子的肽綴合納米新月體的典型SERS光譜分別如圖6A和圖6B所示。通過對(duì)比肽消化實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)2小時(shí)后的SERS光譜，來自聚苯乙烯芯的拉曼峰(例如1003cm")保持恒定，其起到內(nèi)部對(duì)照物的作用。一些拉曼峰來自在消化之后保留在納米新月體表面上的部分氨基酸鏈，并且它們?nèi)猿霈F(xiàn)在光譜中，但峰位置已輕微變化并且峰強(qiáng)度降低，這是由于肽剪切時(shí)可能的構(gòu)象變化。來自拉曼標(biāo)記分子的那些峰，例如圖6A中來自生物素的525cm"處的峰和圖6B來自R19的1183cm"處的峰，在完成消化反應(yīng)之后幾乎完全消失(圖6A和B)。消化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可以通過實(shí)時(shí)分辨的SERS光譜采集進(jìn)行監(jiān)測(cè)。由于在綴合反應(yīng)中對(duì)于各納米新月體平均使用~100個(gè)肽，來自標(biāo)記分子的特征拉曼峰的消失不是驟然的。由于大部分增強(qiáng)場(chǎng)集中在占納米新月體總面積的~1/6的頂端區(qū)域周圍，即使假設(shè)綴合效率為100%,在該高的增強(qiáng)區(qū)域中貢獻(xiàn)于拉曼散射信號(hào)的實(shí)際分子數(shù)量小于20(圖1C)。如圖6A中時(shí)滯SERS光譜所示，通過在525cm"處的生物素峰的消失所監(jiān)測(cè)的各納米新月體上肽的消化，在420nM的PSA濃度下花費(fèi)~30分鐘。對(duì)于具有作為拉曼標(biāo)記分子的R19的肽，在420nM的PSA進(jìn)行消化之后也可觀察到1183cm-1處R19峰的消失(圖6B)。為了特異性地抑制綴合肽的PSA介導(dǎo)的蛋白水解，在加入420nMPSA之前引入蛋白酶抑制劑。我們還使用其它絲氨酸蛋白酶例如粒酶B(其在這里起到陰性對(duì)照物的作用)測(cè)試綴合肽對(duì)PSA的特異性。圖7C和7D顯示了具有R19標(biāo)記分子的納米新月體在上述兩組分別用PSA抑制劑和絲氨酸蛋白酶粒酶B的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的時(shí)滯SERS光譜，其中粒酶B具有與PSA的正交底物特異性。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，加入抑制劑之后通過PSA進(jìn)行的肽消化被抑制了超過90%。在用420nM粒酶B進(jìn)行的肽消化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)速率沒有顯示出與抑制劑處理反應(yīng)在統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。還預(yù)期粒酶B無法剪切肽，因?yàn)镻SA已經(jīng)顯示是對(duì)于HSSKLQ(SEQIDN0:1)序列來說在體內(nèi)唯一的蛋白酶(Denmeade等人(2003)J!A^/.Owcer/wW.95:990-1000)。消化速率與PSA濃度有關(guān)，并且我們觀察了在30分鐘內(nèi)對(duì)于lnM濃度的(生物素信號(hào)強(qiáng)度降低~50%,未顯示數(shù)據(jù))PSA的活性。由于每個(gè)納米新月體最多附接IOO個(gè)肽分子，可能沒有完全利用具有最高SERS信號(hào)的納米35新月體表面，并且僅有小的百分比的肽附接于在電磁場(chǎng)中提供最大增強(qiáng)的區(qū)域(圖1C)。圖8A顯示對(duì)于OM(緩沖溶液)、4.2nM、42nM和420nM的PSA濃度，作為PSA消化時(shí)間函數(shù)的525cm"處生物素拉曼峰的強(qiáng)度。圖8B分別顯示與420nMPSA、具有抑制劑的420nMPSA、和420nM粒酶B的消化反應(yīng)中1183cm"處R19拉曼峰的時(shí)滯強(qiáng)度。所有的峰強(qiáng)度值歸一化到1003cm"處的內(nèi)部對(duì)照物峰和525或1183cm"處的初始峰強(qiáng)度。結(jié)果表明肽有效地和特異性地通過PSA剪切，因此該肽綴合納米新月體可以用作特異篩選查工具以提供癌癥生物標(biāo)志物PSA的濃度和蛋白水解活性的信息?？偠灾?，我們已經(jīng)展示了使用具有至少納摩靈敏度的單個(gè)肽綴合納米新月體SERS探針進(jìn)行蛋白水解活性PSA的體外檢測(cè)。由于我們使用高度聚焦的激光束作為我們的激發(fā)源，檢測(cè)體積僅為約10飛升。納摩樣品的實(shí)際PSA分子數(shù)目接近于單分子水平。與其它癌癥生物標(biāo)志物檢測(cè)測(cè)定相比，我們的生物綴合納米新月體允許以飛升體積檢測(cè)中蛋白水解活性PSA分子的納摩濃度，這對(duì)于單個(gè)癌細(xì)胞水平的癌癥篩查是關(guān)鍵的。小體積的要求和靈敏度水平使其可檢測(cè)用于轉(zhuǎn)移的指示的捕獲的循環(huán)前列腺癌細(xì)胞中PSA活性，而這對(duì)于常規(guī)技術(shù)是不可行的。在精液中，PSA濃度為10-150pM，其中大約三分之二的PSA有酶活性(Malm等人(2000)45:132-139)。用納米新月體PSA探針(納摩范圍)實(shí)現(xiàn)的靈敏度水平足以進(jìn)行基于精液的測(cè)定，因此這里的納米新月體SERS平臺(tái)可以具有潛在的臨床應(yīng)用。在當(dāng)前階段設(shè)計(jì)中，PSA消化位點(diǎn)在谷氨酸(Q)和亮氨酸(L)殘基之間，并且非常接近Au表面，因此PSA肽可以受PSA酶的空間位阻并且不是最佳可接近的。我們預(yù)想到，在底物肽序列HSSKLQ(SEQIDNO:l)和半胱氨酸殘基之間合成額外的隔離體，我們可以改善PSA底物肽HSSKLQ(SEQIDN0:1)在表面上的存在，從而提高檢測(cè)靈敏度。實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)不僅只測(cè)量蛋白質(zhì)的存在，還提供PSA活性的關(guān)鍵信息。這里成功利用了兩種不同拉曼標(biāo)記分子，表明多重化肽綴合納米新月體以檢測(cè)兩種或多種癌癥相關(guān)的蛋白酶的潛力。該芯可以由磁性材料制成以允許單獨(dú)納米顆粒進(jìn)行空間編址(Liu等人(2005)爿dv.Mafer.17:2683-2688)。該納米新月體也可以通過激光操作以在高的精確性下進(jìn)行空間編址(Liu等人(2006)A^M^er5:27-32),由此其可作為高密度陣(具有亞微升體積)多重化。微米陣列或納米陣列形式中多種蛋白酶的額外空間多重化是可能的。而36且，磁的或激光的可操作性允許在期望的位置進(jìn)行生物傳感(Liu等人(2005)A/v.17:2683-2688)，這對(duì)于獲得細(xì)胞內(nèi)原位測(cè)量是有利的。材料和方法PSA的制備PSA購自Ca舊iochem(SanDiego,CA)。固定在Au納米新月體上的底物肽的剪切在50mMTris-HCl、pH8.0、100mMNaCl和0.1mMEDTA的緩沖液中進(jìn)行，并且該反應(yīng)在37。C下實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。PSA抑制劑從CalBiochem獲得并根據(jù)制造商的說明加入反應(yīng)溶液中，使得最終反應(yīng)溶液含有5|iMAEBSF、4.2nM抑肽酶、200nM彈性酶抑制劑和10nM的GGACK。肽合成生物素-Ttds-HSSKLOLAAAC-NH2(1)〖SEOIDNO:36).將200mg(0.140mmol)的RinkAmideAM聚苯乙烯樹脂(負(fù)載0.69mmol/g)加入6mL的燒結(jié)注射器并用DMF(4mL)溶脹。除去芴基曱氧羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)[用DMF(2mL)中20%的哌啶處理25分鐘]，并過濾該樹脂并用DMF洗滌(3x3mL)。為加載a-氨基酸殘基，該樹脂經(jīng)受反復(fù)循環(huán)的耦聯(lián)條件，隨后進(jìn)行洗滌(3x3mL的DMF)和Fmoc去保護(hù)[用DMF(2mL)中20%的旅咬處理25分鐘]，并再次洗滌(3x3mL的DMF)。用于將a-氨基酸耦聯(lián)到該樹脂的條件如下在適當(dāng)保護(hù)的酸[Fmoc-Cyl(Trt，三苯曱基)-OH(375mg)、Fmoc-Ala-OH(199mg)、Fmoc畫Leu-OH(226mg)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(391mg)、Fmoc-Lys(Boc,叔丁氧羰基)-OH(300mg)、Fmoc-Ser(0+Bu)-OH(245mg)、或Fmoc-His(Trt)-OH(397mg)]的0.4M溶液(0.640mmol)中處理該樹脂，所述溶液已通過與DIC(100^L，0.640mmol)和HOBt(98mg，0.64mmol)在DMF(1.5mL)中一起溫浴10分鐘而預(yù)活化。每次耦聯(lián)允許進(jìn)行4小時(shí)。在最終oc-氨基酸殘基的耦聯(lián)和去保護(hù)之后，通過使樹脂在Fmoc-Ttds-OH(303mg,0.560mmol)的0.4M溶液中進(jìn)行處理來加入Ttds接頭，所述溶液已通過與DIC(88jiL,0.56mmol)和HOBt(86mg，0.56mmol)在DMF(1.2mL)中一起培養(yǎng)10分鐘而預(yù)活化。該耦聯(lián)允許進(jìn)行過夜。該樹脂用DMF(3x3mL)洗滌，除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并且再次用DMF(3x3mL)洗滌該樹脂。通過將生物素(137mg，0.560mmol)、PyBOP(281mg，0.540mmol)、和/-Pr2NEt(94|_iL，0.54mmol)在無水DMF(1.5mL)中的漿料加入到該樹脂而引入生物素基團(tuán)。在過夜攪拌該樹脂之后，該樹脂用DMF(lx4mL)中的20%哌啶、DMF(3x4mL)、THF(3x4mL)、MeOH(3x4mL)、THF(3x4mL)、和CH2C12(3x4mL)充分地洗滌。通過用94:2:2:2的TFA/三異丙基硅烷/水/乙二硫醇(3mL)培養(yǎng)1小時(shí)底物從樹脂剪切，使用預(yù)備的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1%TFA，5-60%進(jìn)行50分鐘，8mL/min，210/220/254nm檢測(cè)100分鐘，tR=31.8分鐘)純化，并凍干。純度通過HPLC-MS分析(CH3CN/H2O-0.1%TFA，5-95%進(jìn)行14分鐘，0.4mL/min,220nm檢測(cè)22分鐘，tR-6.5分鐘)來檢查。MS(ESI),對(duì)于(:711112^1902282來說計(jì)算的w/z:1655.8。實(shí)測(cè)丫直m/z828.2(M+2H)2+。R19-Ava-HSSKLOLAAAC-NH2(2)(SEOIDNO:36).將40lmg(0.277mmol)的RinkAmideAM聚苯乙烯樹脂(負(fù)載0.69mmol/g)加入12mL的燒結(jié)注射器并用N-曱基吡咯烷S同(NMP)(4mL)溶脹。通過用1:2:2哌咬/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)處理30分鐘而除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，和過濾該樹脂并用NMP(3x3mL)和CH2C12(3x3mL)洗滌。為加載a-氨基酸殘基，該樹脂經(jīng)受反復(fù)循環(huán)的耦聯(lián)條件(方法A或方法B)，隨后進(jìn)行洗滌(5x3mLNMP，5x3mLCH2Cl2),Fmoc去保護(hù)[用1:2:2哌咬/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)處理30分鐘]，并用NMP(5x3mL)和CH2C12(5x3mL)再次洗滌。第一種ot-氨基酸殘基通過將預(yù)先形成的Fmoc陽Cys(Trt)-OH(117g,2.00mmo1)、PyBOP(1.04g，2.00mmo1)、和HOBt(270mg,2.00mmo1)在1:1的NMP/CH2Cl2(2mL)t的溶液加入到該樹脂上而加載，并將所得漿料在機(jī)械腕搖擺器(wrist-actionshaker)上攪拌5分鐘，隨后加入/-Pr2EtN(0.55mL，4.0mmol)。該反應(yīng)允許進(jìn)行5小時(shí)。然后將該樹脂過濾、洗滌(5x3mLNMP，5x3mLCH2C12)、并在高真空下干燥。確定Cys的加載為0,60mmol/g(78%的產(chǎn)率)。連續(xù)的耦聯(lián)通過方法A或方法B實(shí)現(xiàn)。方法A由以下步驟組成加入預(yù)先形成的Fmoc-保護(hù)的氨基酸[Fmoc-Cyl(Trt)-OH(U7g,2.00mmol)、Fmoc-Ala-OH(622mg，2.00mmo1)、Fmoc-Leu-OH(707mg,2.00mmo1)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.22g,2.00mmol)、Fmoc-Ser(>Bu)-OH(767mg，2.00mmol)、和Fmoc畫His(Trt)-OH(1.24g,2.00mmo1)]、PyBOP(1.04g，2.00mmo1)、和HOBt(270mg,2.00mmol)在NMP/CH2C12(1:1，2mL)中的溶液，隨后加入/-Pr2EtN(0.55mL，4.0mmol)。該反應(yīng)允許進(jìn)行至少4小時(shí)。方法B由下列步驟組成使該樹脂在適當(dāng)保護(hù)的酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH(375mg)]的0.4M溶液中處理，該溶液已通過與DIC(130|uL,0.84mmol)和HOBt(108mg，0.800mmol)在DMF(1.2mL)中一起溫浴10分鐘而預(yù)活化。耦聯(lián)允許進(jìn)行4小時(shí)。在各次耦聯(lián)之后，過濾樹脂并洗滌(NMP:5x3mL,CH2C12:5x3mL)，隨后除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)。在最終ot-氨基酸殘基的耦聯(lián)和去保護(hù)之后，接頭通過使樹脂在Fmoc-S-Ava-OH(272mg，0.800mmol)的0.4M溶液中處理而加入氨基戊酸接頭，所述溶液已通過與DIC(120iaL，0.80mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)在NMP(lmL)中一起溫浴10分鐘而預(yù)活化。耦聯(lián)允許進(jìn)行過夜。過濾該樹脂并洗滌(NMP:5x3mL,CH2C12:5x3mL)，除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，且再次洗滌樹脂。羅丹明基團(tuán)通過加入羅丹明19的0.4M溶液摻入，所述溶液已與DIC(130iliL，0.84mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)在NMP(2mL)中一起溫浴10分鐘而預(yù)活化。該反應(yīng)允許進(jìn)行6小時(shí)，再次重復(fù)耦聯(lián)步驟并該反應(yīng)允許進(jìn)行過夜。通過用TFA/三異丙基硅烷/H20/乙二硫醇的94:2:2:2的溶液(3mL)培養(yǎng)2小時(shí)而從樹脂剪切底物，使用預(yù)備的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1%TFA，5-95%進(jìn)行50分鐘，20mL/min，220/254/280nm檢測(cè)100分鐘，tR=24.3min)純化，并凍干。MS(MALDI),對(duì)于C78H116N19017S來說計(jì)算的m/z:1622.85。實(shí)測(cè)值w/z1623.90。SERS光鐠使用具有拉曼分光計(jì)的顯微系統(tǒng)從單個(gè)納米新月體采集拉曼散射光譜。該系統(tǒng)由CarlZeissAxiovert200倒置顯微鏡(CarlZeiss,德國)組成，該顯微鏡配置有數(shù)碼照相機(jī)和具有1024x265像素的致冷攝譜CCD照相機(jī)(RoperScientific,NJ)的300mm焦距的單色儀(ActonResearch,MA)。我們的實(shí)驗(yàn)中使用785nm半導(dǎo)體激光器作為拉曼散射的激發(fā)源，并且激光束通過40X物鏡聚焦在納米新月體上。激發(fā)功率通過光度計(jì)(Newport,CA)測(cè)量為-0.8mW。然后，拉曼散射光通過穿過長(zhǎng)通濾光片的相同光路聚集并通過分光計(jì)分析。應(yīng)理解，本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于展示性目的，并且根據(jù)它們的各種調(diào)整和改變將啟示本領(lǐng)域技術(shù)人員并包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。為了各種目的，將本文引用的所有出版物、專利、和專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引用納入本申請(qǐng)，并且各文件也是通過引用以相同的程度特定地和單獨(dú)地納入。39權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)活性蛋白酶的指示物，所述指示物包括附接于肽的納米新月體，其中所述肽包括所述蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。2.權(quán)利要求1的指示物，其中所示指示物進(jìn)一步包括附接于所述肽的拉曼標(biāo)簽。3.權(quán)利要求2的指示物，其中所述拉曼標(biāo)簽選自熒光團(tuán)、生色團(tuán)、量子點(diǎn)、焚光微球、和生物素。4.權(quán)利要求2的指示物，其中所述拉曼標(biāo)簽包括羅丹明、熒光素、或外源化學(xué)分子。5.權(quán)利要求2的指示物，其中所述拉曼標(biāo)簽包括選自下列的部分TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對(duì)苯二曱酸、間苯二曱酸、曱苯基堅(jiān)牢紫、甲苯基藍(lán)紫、亮?xí)醣交{(lán)、對(duì)氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基熒光素、5-羧基-2，，4，,5，,7，-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四曱基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃噪呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。6.權(quán)利要求2的指示物，其中所述拉曼標(biāo)簽直接附接于所述肽。7.權(quán)利要求2的指示物，其中所述拉曼標(biāo)簽通過接頭附接于所述肽。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的指示物，其中所述納米新月體包括殼而沒有芯。9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的指示物，其中所述納米新月體包括芯和殼。10.權(quán)利要求9的指示物，其中所述芯包括提供恒定拉曼光譜的材料。11.權(quán)利要求10的指示物，其中所述芯包括選自下列的材料塑料、二氧化硅或其它in族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、和磁性材料。12.權(quán)利要求ll的指示物，其中所述芯包括聚苯乙烯。13.權(quán)利要求9的指示物，其中所述納米新月體包括選自下列的金屬Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它們的氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。14.權(quán)利要求9的指示物，其中所述納米新月體具有約20-約800nm的外徑。15.權(quán)利要求9的指示物，其中所述納米新月體具有約10nm-約500nm的內(nèi)徑。16.權(quán)利要求9的指示物，其中所述納米新月體通過內(nèi)徑r、和外徑R、以及所述內(nèi)徑r和所述外徑R限定的所述圓的圓心之間的圓心到圓心的距離來表征，其中r為約10nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約300nm。17.權(quán)利要求9的指示物，其中所述納米新月體通過內(nèi)徑r、和外徑R、以及所述內(nèi)徑r和所述外徑R限定的所述圓的圓心之間的圓心到圓心的距離來表征，其中r為約25nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約200nm。18.權(quán)利要求9的指示物，其中所述肽包括蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述蛋白酶選自絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和谷氨酸蛋白酶。19.權(quán)利要求9的指示物，其中所述肽包括細(xì)胞凋亡路途徑中蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。20.權(quán)利要求19的指示物，其中所述肽包括胱天蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。21.權(quán)利要求19的指示物，其中所述肽包括胱天蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述胱天蛋白酶選自胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、和胱天蛋白酶-7。22.權(quán)利要求18的指示物，其中所述肽包括凝血酶的識(shí)別位點(diǎn)。23.權(quán)利要求18的指示物，其中所述肽包括絲氨酸蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。24.權(quán)利要求23的指示物，其中所述肽包括PSA識(shí)別位點(diǎn)。25.權(quán)利要求23的指示物，其中所述肽包括包含氨基酸序列HSSKLQ(SEQIDN0:1)的識(shí)別位點(diǎn)。26.權(quán)利要求9的指示物，其中所述肽的長(zhǎng)度為2個(gè)氨基酸到30個(gè)氨基酸。27.權(quán)利要求26的指示物，其中所述肽的長(zhǎng)度為2個(gè)氨基酸到10個(gè)氨28.權(quán)利要求9的指示物，其中所述肽直接地附接于所述納米新月體。29.權(quán)利要求9的指示物，其中所述肽通過接頭附接于所述納米新月體。30.權(quán)利要求9的指示物，其中所述肽通過硫醇基團(tuán)附接于所述納米新月體。31.權(quán)利要求2的指示物，其中兩種不同的肽附接于所述納米新月體。32.權(quán)利要求2的指示物，其中多于兩種的不同的肽附接于所述納米新月體。33.權(quán)利要求l的部分，其中所述指示物是拉曼活性底物的組分。34.—種檢測(cè)或量化樣品中至少一種蛋白酶的存在、量、或活性的方法，所述方法包括使所述樣品與包括附接于肽的納米新月體的指示物接觸，其中所述肽包括所述蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)；和監(jiān)測(cè)檢測(cè)的表面拉曼散射光譜的光譜特征中的差別，所述差別是存在于該樣品中的蛋白酶的存在、量或活性的指示物。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述指示物進(jìn)一步包括附接于所述肽的拉曼標(biāo)簽。36.權(quán)利要求34或35中任一項(xiàng)的方法，其中所述監(jiān)測(cè)包括監(jiān)測(cè)表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)。37.權(quán)利要求34或35中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包括選自下列樣品的材料，所述下列樣品選自全血、血漿、血清、滑液、腦脊液、支氣管灌洗液、腹水液、精液、骨髓抽出物、胸膜流出物、尿、和腫瘤細(xì)胞或組織。38.權(quán)利要求34或35中任一項(xiàng)的方法，其中所述肽包括蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述蛋白酶是癌癥存在或發(fā)展的標(biāo)志物。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述肽包括PSA的識(shí)別位點(diǎn)。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述肽包括包含氨基酸序列HSSKLQ(SEQIDNO:l)的識(shí)別位點(diǎn)。41.權(quán)利要求34的方法，其中所述樣品包括選自下列的材料全血、血級(jí)分、淋巴、腦脊液、口腔液、粘液、尿、糞便、和精液。42.用于檢測(cè)兩種或更多種活性蛋白酶的存在或活性的庫，所述庫包括多種蛋白酶指示物，所述指示物包括附接于肽的納米新月體，其中所述肽包括所述蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)；其中不同的納米新月體附接于不同的肽使不同的納米新月體檢測(cè)不同的蛋白酶。43.權(quán)利要求42的庫，其中所述庫進(jìn)行空間編址使得對(duì)不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物定位于底物上的不同位置。44.權(quán)利要求42的庫，其中所述庫進(jìn)行光學(xué)編址使得對(duì)不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物產(chǎn)生不同的信號(hào)。45.權(quán)利要求42或43中任一項(xiàng)的庫，其中所述庫包括至少3種或更多種不同的蛋白酶指示物。46.權(quán)利要求42或43中任一項(xiàng)的庫，其中所述庫包括至少IO種或更多不同的蛋白酶指示物。47.權(quán)利要求42或43中任一項(xiàng)的庫，其中所述納米新月體包括磁性芯，并且指示物的空間隔離通過-茲場(chǎng)提供。48.權(quán)利要求42或43中任一項(xiàng)的庫，其中所述指示物以離子方式或化學(xué)方式耦聯(lián)到底物。49.權(quán)利要求42或43中任一項(xiàng)的庫，其中所述指示物吸附到底物上。50.用于檢測(cè)活性蛋白酶的試劑盒，所述指示物包括含有附接于肽的納米新月體的容器，其中所述肽包括所述蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。51.權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包括附接于所述肽的拉曼標(biāo)簽。52.權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包括說明材料，所述說明材料教導(dǎo)所述指示物用于利用表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)檢測(cè)活性蛋白酶的存在、濃度或活性的用途。53.用于檢測(cè)核酸酶的指示物，所述指示物包括附接于單鏈或雙鏈寡核香酸的納米新月體，其中所述寡核香酸包括所述核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)。54.權(quán)利要求1的指示物，其中所述指示物進(jìn)一步包括附接于所述寡核苷酸的拉曼標(biāo)簽。55.—種用于檢測(cè)分析物的存在或量的方法，所述方法包括使包含所述分析物的樣品與指示物接觸，所述指示物包括附接于底物的納米新月體，所述底物在拉曼標(biāo)記的部分的存在下特異性地或優(yōu)先地被所述分析物結(jié)合，所述拉曼標(biāo)記的部分與所述分析物為結(jié)合到所述底物而竟?fàn)?；和檢測(cè)所述指示物的拉曼光譜，其中通過所述拉曼標(biāo)記的部分從所述底物的解離而產(chǎn)生的拉曼光譜的變化提供所述樣品中所述分析物的存在或量的測(cè)量。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述底物是肽或核酸。全文摘要本發(fā)明涉及使用單個(gè)的肽綴合納米新月體表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)探針以至少納摩的靈敏度進(jìn)行蛋白酶的體外檢測(cè)。所述探針能夠以極小的體積和低濃度下檢測(cè)蛋白水解活性。在某些實(shí)施方式中，所述探針包括用于檢測(cè)活性蛋白酶的指示物，其中所述指示物包括附接于肽的納米新月體，其中所述肽包括蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)和附接于所述肽的拉曼標(biāo)記。文檔編號(hào)A01N37/18GK101484002SQ200780024900公開日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年5月2日優(yōu)先權(quán)日2006年5月3日發(fā)明者喬納森·A·埃爾曼,剛劉,盧克·P·李,陳帆青申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)