專利名稱：：減少炎癥介質釋放的方法和可用于該方法的肽的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及肽或肽組合物和使用它們來減少(或抑制或降低)炎癥過程中炎癥介質自炎性細胞的刺激型釋放的方法。本發(fā)明還涉及這些肽或肽組合物用于調變調節(jié)炎癥介質自炎性細胞分泌的細胞內信號機制的用途。
背景技術：
：炎癥性白細胞合成多種炎癥介質，這些炎癥介質在細胞內是分離的并儲存在細胞質膜結合型的顆粒中。此類介質的實例包括，但不限于，中性粒細胞的髓過氧化物酶(MPO)(例如參見BorregaardN，CowlandJB.Granulesofthehumanneutrophilicpolymorphonuclearleukocyte.1997;89:3503-3521)、嗜酸性粒細胞的嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)和主要堿性蛋白(majorbasicprotein,MBP)(例如參見GleichGJ.Mechanismsofeosinophil-associatedinflammation./j〃ergyC7/"/mmwwo/2000;105:651-663)、單豐亥細胞/巨噬細胞的溶菌酶(例如參見HoffT,SpenckerT,EmmendoerfferA.，Goppelt-StruebeM.EffectsofglucocorticoidsontheTPA畫inducedmonocyticdifferentiation./丄e"A:oc5z'o/1992;52:173-182;禾卩BalboaMA,SaezY，BalsindeJ.Calcium-independentphospholipaseA2isrequiredforlysozymesecretioninU937promonocytes.J/mww"o/2003;170:5276-5280)、和天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性淋巴細胞的粒酶(例如參見BochanMR,GoebelWS,BrahmiZ.StablytransfectedantisensegranzymeBandperforinconstructsinhibithumangranule-mediatedlyticability.CW//mmwwo/1995;164:234-239;GongJH"MakiG,KlingemannHG.Characterizationofahumancellline(NK-92)withphenotypicalandfunctionalcharacteristicsofactivatednaturalkillercells.7丄ewfem/a1994;8:652-658;MakiG,KlingemannHG，MartinsonJA，TamYK.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.Jifewflto^er&ewCe//ies2001;10:369-383;和TakayamaH,TrennG，SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.7mmw"o/1987;104:183-190)。此類介質在損失部位釋放并促進例如肺部和其他部位的炎癥和組織修復。已知白細胞通過胞吐機制釋放這些顆粒(例如參見BurgoyneRD，MorganA.Secretorygranuleexocytosis.尸/z戸'o/iev2003;83:581-632;禾口LoganMR,OdemuyiwaSO,MoqbelR.Understandingexocytosisinimmuneandinflammatorycells:themolecularbasisofmediatorsecretion.J力/e/^yC/z'"/mm柳o/2003;111:923-932)，但參與這一胞吐過程的調節(jié)分子和具體途徑尚未充分揭示。一些外源性刺激可促進白細胞脫顆粒，這涉及通過蛋白激酶C活化并隨后石粦酸化的事件的途徑(例如參見BurgoyneRD，MorganA.Secretorygranuleexocytosis.尸/z戸'o/iev2003;83:581-632;LoganMR,OdemuyiwaSO，MoqbelR.Understandingexocytosisinimmuneandinflammatorycells:themolecularbasisofmediatorsecretion./W/ergyC7z'wT/wtw"o/2003;111:923-932;SmolenJE，SandborgRR.Ca2+-inducedsecretionbyelectropermeabilizedhumanneutrophils:therolesofCa2+，nucleotidesandproteinkinaseC.5/oc/n,w爿"a1990;1052:133-142;NiessenHW，VerhoevenAJ.Roleofproteinphosphorylationinthedegranulationofelectropermeabilizedhumanneutrophils,",op/yAs.^cta1994;1223:267-273;禾口NauclerC，GrinsteinS,SundlerR.,TapperH.Signalingtolocalizeddegranulationinneutrophilsadherenttoimmunecomplexes.JXewA:oc2002;71:701-710)。MARCKS蛋白(其中MARCKS在這里指的是"豆蔻?；槐彼峒っ窩底物"(MyristoylatedAlanine-RichCKinaseSubstrate))是蛋白激酶C(PKC)的遍在性磷酸化靶，并高度表達于白細胞(例如參見AderemAA，AlbertKA，KeumMM，WangJK，GreengardP,CohnZA.Stimulus-dependentmyristoylationofamajorsubstrateforproteinkinaseC.iVafwre1988;332:362-364;ThelenM，RosenA,NairnAC,AderemA.RegulationbyphosphorylationofreversibleassociationofamyristoylatedproteinkinaseCsubstratewiththeplasmamembrane.TVa^re1991;351:320-322;禾口HartwigJH，ThelenM，RosenA，JanmeyPA，NairnAC,AderemA.MARCKSisanactinfilamentcrosslinkingproteinregulatedbyproteinkinaseCandcalcium-calmodulin.TVia/wre1992;356:618-622)。MARCKS蛋白機械性參與排列在呼吸道內的杯狀細胞的粘蛋白胞吐性分泌過程(例如參見Lietal.，J歷o/C7zem2001;276:40982-40990;和Singeretal.，AW2004;10:193-196)。MARCKS通過MARCKS蛋白氨基酸序列的N-端氨基酸的酰胺鍵在位于氨基酸序列N端的甘氨酸(g卩，位置l)的ci-胺位置被豆蔻酰化。在氣道上皮細胞中，MARCKS的豆蔻?；疦-端區(qū)域似乎是分泌過程所必需的。所謂MARCKS蛋白的N-端指的是MANS肽，其具有豆蔻?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)'均為L-氨基酸。此外，在此公開的MANS肽的肽片段也優(yōu)選地由L-氨基酸組成。其機制似乎涉及MARCKS，一種豆蔻?；牡鞍踪|，與細胞內顆粒的膜結合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自MARCKS的N-端的N-端豆蔻?；碾淖钄嗾车鞍追置谝约癕ARCKS與杯狀細胞內粘蛋白顆粒膜的結合(例如參見Singeretal.，JVa/10:193-196)。該肽含有MARCKS蛋白的24個氨基酸，始自MARCKS蛋白的通過酰胺鍵而被豆蔻?；腘-端甘氨酸，稱為豆蔻?；腶-N-端序列(MANS);艮P，豆蔻?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)。此外，VergeresW"/.，J歷oc/zew.1998,330;5-11也公開了MARCKS蛋白的N-端甘氨酸殘基通過由豆蔻?；鵆oA:蛋白質N-豆蔻酰基轉移酶(NMT)催化的反應而被豆蔻?；?。在炎性疾病例如哮喘、COPD和慢性支氣管炎中；在遺傳性疾病例如囊性纖維化中；在過敏性疾病(特應性、過敏性炎癥)中；在支氣管擴張癥中；以及在多種急性感染性呼吸道疾病例如肺炎、鼻炎、流感或普通感冒、關節(jié)炎或自身免疫病中，炎性細胞通常見于或者遷移至與炎性疾病狀態(tài)有關的損傷或感染區(qū)域，特別是患有此類疾病的患者的呼吸道或者氣道內。這些炎性細胞可通過它們釋放的炎癥介質造成組織損傷，由此在疾病的病理學中起著極大的作用。在囊性纖維化患者中可觀察到通過這種慢性炎癥造成的此類組織損傷或破壞的一個實例，其中中性粒細胞所釋放的介質(例如，髓過氧化物酶(MPO))引起氣道上皮組織脫落。MARCKS是大約82kD的蛋白質，其具有3個進化保守性區(qū)域(Aderemetal.，Nature1988;332:362-364;Thelenetal.，Nature1991;351:320-322;Hartwigetal"Nature1992;356:618-622;Seykoraetal.,JBiolChem1996;271:18797-18802):N-端、磷酸化位點結構域(或PSD)、和多重同源性2(MH2)結構域。人MARCKScDNA和蛋白質是已知的，參見Harlan"a/.，j;5fo/.C/zew.1991，266:14399(GenBankAccessionNo.M68956)禾口Sakaida/"G^"wm'1992,14:175。WO00/50062也給出這些序列，在此通過引用將其全部內容并入本申請。該N-端是包含24個氨基酸殘基的a-氨基酸序列，具有通過酰胺鍵連接于N-端甘氨酸殘基的豆蔻酸部分，該N-端參與MARCKS與細胞內膜(Seykoraetal.，JBiolChem1996;271:18797-18802)以及可能地與鈣調蛋白(Matsubaraetal.,JBiolChem2003;278:48898-48902)的結合。該24個氨基酸的序列稱為MANS肽。
發(fā)明內容MARCKS蛋白參與從侵潤性白細胞的顆粒釋放炎癥介質與所有組織和器官的疾病的炎癥相關，包括特征為氣道炎癥的肺部疾病，例如哮喘、COPD和囊性纖維化。不過，氣道的炎癥和粘液分泌是兩個分開且獨立的過程(Lietal"/編C7e附2001;276:40982-40990;Singeretal.,淑Md2004;10:193-196)。盡管多種因素可促進粘液的產(chǎn)生和分泌，其中包括由炎性細胞釋放的介質，但目前沒有過量粘液導致炎癥的直接關聯(lián)。在本發(fā)明的一個方面，MANS肽可在降低炎癥性白細胞釋放炎癥介質顆?；蚰遗莸乃俣群?或量上發(fā)揮作用。在另一個方面，衍生自MARCKSN-端的肽，特別是衍生自所述24個氨基酸的N-端序列的肽，艮P，衍生自具有位置1的甘氨酸的MARCKSN-端1至24位氨基酸的序列內的活性連續(xù)肽片段，以及此類片段的N-端酰胺例如此類片段的N-端乙酸酰胺，和/或以及此類片段的C-端酰胺例如與氨形成的C-端酰胺，可抑制或降低炎癥介質自炎癥性白細胞的釋放的速度和/或量。對釋放的這種抑制或降低包括抑制MARCKS相關性炎癥介質自炎癥性白細胞的釋放。在另一個方面，衍生自MARCKSN-端的肽，特別是衍生自1至24位氨基酸的N-端序列的肽，艮P，衍生自具有位置1的甘氨酸的MARCKSN-端1至24位氨基酸的序列內的活性連續(xù)肽片段，以及此類片段的N-端酰胺例如此類片段的N-端乙酸酰胺，以及此類片段的C-端酰胺例如與氨形成的C-端酰胺，可通過抑制炎癥性白細胞內的脫顆粒過程而抑制炎癥介質釋放的速度和/或量，例如抑制本發(fā)明所鑒定的那些炎癥介質。在另一個方面，MANS肽及其活性片段以及在此所述的此類片段的活性酰胺，可在炎性細胞中與天然的MARCKS蛋白競爭結合膜，以減少(減弱或降低)MARCKS-相關性炎癥介質自此類炎性細胞中的含有此類炎癥介質的顆?；蚰遗莸尼尫拧鹩诜鸩フT導的PKC活化而分泌特異性顆粒成分的白細胞細胞類型和模型細胞類型可用于在體外證實本發(fā)明的肽和本發(fā)明的取代的肽(例如，a-N-酰胺、C-端酰胺和酯)的功效?？墒褂萌说陌准毎毎祦碜C實本發(fā)明的化合物和組合物減少膜結合型炎癥介質的釋放。例如，自人血中分離的中性粒細胞可用于證實髓過氧化物酶(MPO)釋放的減少或抑制。人的早幼粒細胞細胞系HL-60克隆15可用于證實本發(fā)明的化合物和組合物減少或抑制嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)的釋放或分泌(例如參見FischkoffSA.GradedincreaseinprobabilityofeosinophilicdifferentiationofHL-60promyelocyticleukemiacellsinducedbycultureunderalkalineconditions.LeukRes1988;12:679-686;RosenbergHF，AckermanSJ，TenenDG.Humaneosinophilcationicprotein:molecularcloningofacytotoxinandhelminthotoxinwithribonucleaseactivity.JExpMed1989;170:163-176;TiffanyHL,LiF，RosenbergHF.Hyperglycosylationofeosinophilribonucleasesinapromyelocyticleukemiacelllineandindifferentiatedperipheralbloodprogenitorcells.JLeukocBiol1995;58:49-54;禾口BadewaAP,HudsonCE，HeimanAS.Regulatoryeffectsofeotaxin，eotaxin-2,andeotaxin-3oneosinophildegranulationandsuperoxideaniongeneration.ExpBiolMed2002;227:645-651)。單核細胞白血病細胞系U937可用于證實本發(fā)明的化合物和組合物減少或抑制溶菌酶的釋放或分泌(例如參見HoffT,SpenckerT,EmmendoerfferA.,Goppelt-StruebeM.EffectsofglucocorticoidsontheTPA隱inducedmonocyticdifferentiation.JLeukocBiol1992;52:173-182;BalboaMA,SaezY,BalsindeJ.Calcium-independentphospholipaseA2isrequiredforlysozymesecretioninU937promonocytes.JImmunol2003;170:5276-5280;禾卩SundstromC,NilssonK.Establishmentandcharacterizationofahumanhistiocyticlymphomacellline(U-937)。IntJCancer1976;17:565-577)。淋巴可用于證實本發(fā)明的化合物和組合物減少或抑制粒酶的釋放(例如參見GongJH.,MakiG，KlingemannHG.Characterizationofahumancellline(NK-92)withphenotypicalandfimctionalcharacteristicsofactivatednaturalkillercells.Leukemia1994;8:652-658;MakiG,KlingemannHG，MartinsonJA,TamYK.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.JHematotherStemCellRes2001;10:369-383;禾口TakayamaH,TrennG，SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.JImmunolMethods1987;104:183-190)。在抑制或減少炎癥介質(例如在此所述的那些)釋放的體外方法中，將各種細胞類型與多種濃度范圍的本發(fā)明的肽化合物或肽組合物預溫育，隨后將這些細胞與炎癥介質釋放的刺激物例如佛波酯進行溫育。確定與缺乏所述肽化合物或肽組合物的情況下所述介質的釋放相比，炎癥介質釋放被抑制的百分數(shù)，例如以所釋放的介質的濃度的分光光度讀數(shù)的形式。為了證實相對氨基酸序列位置在本發(fā)明的肽中的重要性，比較了如下兩類肽抑制或降低所釋放的炎癥介質的量的相對能力，其一為與MARCKS蛋白N-端區(qū)域的24個氨基酸的序列(gp，MANS—豆蔻?；腶-N-端序列肽)相同的l太，另一雖含有與MANS相同的24個氨基酸殘基，但相對于MANS中的序列順序而言這些殘基的順序是隨機的(即，RNS肽，或者稱為"隨機N-端序列肽")。在所檢測的各種細胞類型中，MANS肽以濃度依賴型方式在0.5-3.0小時期間減少了炎癥介質的釋放，而RNS肽則不能。這些結果提示，與MARCKS蛋白、特別是與其N-端區(qū)域、且更加具體地是與其24個氨基酸殘基的N-端區(qū)域中的順序相同的本發(fā)明的肽內的相對氨基酸序列位置，參與了處理抑制白細胞脫顆粒的至少一種細胞內途徑。本發(fā)明涉及所述24個氨基酸的肽序列的新用途，并涉及所述a-N-端乙酰化的肽序列、所述豆蔻?；亩嚯模卜Q為MANS肽，并涉及其活性片段，所述活性片段可選自具有MANS肽氨基酸序列的4到23個連續(xù)氨基酸殘基的肽，且所述片段如果不以SEQIDNO:l的位置1的N-端甘氨酸作為起始，它們可以是N-端-豆蔻?；?，或者它們的N-端可以被C2至C12的?；；?，包括N-端乙酰化，和/或它們的C-端以NH2酰胺化。本發(fā)明還涉及阻斷MARCKS-相關性細胞分泌過程的新方法，特別是那些涉及自炎性細胞的MARCKS-相關性炎癥介質釋放的過程，其刺激途徑涉12及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白和自細胞內囊泡或顆粒釋放成分。本發(fā)明涉及抑制自至少一種炎性細胞胞吐釋放至少一種炎癥介質的方法，包括將細胞與有效量的至少一種肽相接觸，所述細胞包含位于所述細胞內的囊泡內的至少一種炎癥介質，所述至少一種肽選自MANS肽及其在此所述的活性片段，以使得所述炎癥介質自所述炎性細胞的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下可能自相同類型的炎性細胞釋放的所述炎癥介質相比被降低。本發(fā)明進一步涉及抑制自對象的組織或體液內的至少一種炎性細胞釋放至少一種炎癥介質的方法，包括給所述對象的包含至少一種炎性細胞的組織和/或體液施用治療有效量的藥物組合物，所述至少一種炎性細胞包含位于所述細胞內的囊泡內的至少一種炎癥介質，所述組合物包含治療有效量的選自MANS肽及其活性片段的至少一種肽，以使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下可能自至少一種相同類型的炎性細胞釋放的所述炎癥介質相比被降低。更具體地，抑制炎癥介質的釋放包含阻斷或降低炎癥介質自炎性細胞的釋放。更具體地，本發(fā)明包括降低對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含MANS肽(即，N-豆蔻酰基-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l))或其活性片段?；钚云蔚拈L度為至少4個氨基酸且優(yōu)選地至少6個氨基酸。在此，MARCKS蛋白的"活性片段"指的是這樣的片段，其影響(抑制或降低)MARCKS蛋白介導的釋放，例如MARCKS蛋白介導的炎癥介質釋放?；钚云慰蛇x自GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV(SEQIDNO:2);GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQIDNO:4);GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQIDNO:7);GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQIDNO:11);GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQIDNO:16);GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQIDNO:22);GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQIDNO:29);GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQIDNO:37);GAQFSKTAAKGEAAA(SEQIDNO:46);GAQFSKTAAKGEAA(SEQIDNO:56);GAQFSKTAAKGEA(SEQIDNO:67);GAQFSKTAAKGE(SEQIDNO:79);GAQFSKTAAKG(SEQIDNO:92);GAQFSKTAAK(SEQIDNO:106);GAQFSKTAA(SEQIDNO:121);GAQFSKTA(SEQIDNO:137);GAQFSKT(SEQIDNO:154);GAQFSK(SEQIDNO:172);GAQFS(SEQIDNO:191)和GAQF(SEQIDNO:211)。這些肽在N-端氨基酸不含有豆蔻?；糠?，而是要么不含任何化學部分，要么在N-端氨基酸含有非豆蔻?；瘜W部分和/或在C-端氨基酸含有化學部分，例如上述的N-端乙酰基和/或C-端酰胺基。MANS肽及其N-端豆蔻?；钠沃写嬖谑杷訬-端豆蔻?；糠挚稍鰪娝鼈兣c質膜的相容性并可能增強其對質膜的通透性，并可能使得所述肽被細胞攝取。豆蔻酰基疏水性插入膜的脂雙層可提供高達104M-1的脂質分配系數(shù)或表觀締合常數(shù)或大約8kcal/mo1的單一吉布斯自由結合能(例如參見Peitzsch,R.M.,andMcLaughlin,S.1993,Bindingofacylatedpeptidesandfattyacidstophospholipidvesicles:pertinencetomyristoylatedproteins.Biochemistry.32:10436-10443)，這足以(至少部分地)允許MANS肽和豆蔻?；腗ANS肽片段分配入細胞的質膜內，同時MANS肽(其是豆蔻?；?內部和豆蔻?；腗ANS肽片段內部的額外的官能團及其相互作用可增強它們的相對膜通透性。所述片段可各自展現(xiàn)代表其相應結構的分配系數(shù)和膜親和力?？赏ㄟ^本領域已知的肽合成方法制備所述片段，例如通過固相肽合成法(例如參見Chan，WengC.andWhite,PeterD.Eds.,FmocSolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,NewYork(2000》禾口Lloyd-Williams,P.etal.ChemicalApproachestotheSynthesisofPeptidesandProteins(1.997)所述的方法)，并可通過本領域已知的方法純化，例如通過高壓液相色譜法。可通過質譜分析確定各種肽的分子量，其中各種肽顯示為具有適當分子質量的峰。使用本文實施例中所公開的方法，無需過多的實驗即可容易地確定這些單個的肽或各種肽的組合(例如，2種所述肽的各種組合、3種所述肽的各種組合、4種所述肽的各種組合)在本發(fā)明的方法中的功效。優(yōu)選的組合可包括兩種所述的肽；所述肽的優(yōu)選的摩爾比可以是從50:50(即，l:l)至99.99至0.01，可使用本文實施例中所公開的方法容易地確定該比率。優(yōu)選地，將MANS肽或其活性片段置于用于阻斷炎癥的藥物組合物中。本發(fā)明還包括抑制對象的細胞分泌過程的方法，該方法包括施用治療有效量的化合物，所述化合物包括抑制對象的炎癥介質的MANS肽或其活性片段。所述施用通常選自局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、吸入和鼻部或口服，其中肺部施用通常包括氣溶膠、干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器、或噴霧器。施用用于人或動物的包含脫顆粒抑制量的MANS肽或脫顆粒抑制量的MANS肽活性片段的組合物，例如MANS肽或其活性片段的藥物組合物，可將MANS肽或其活性片段至少提供至炎性粒細胞所處的或者炎性粒細胞將侵入的組織的內部或表面的部位處，或者提供至與所述組織的表面相接觸的含液體層中，由此使得MANS肽或其活性片段接觸炎性粒細胞。在一個方面，可在炎癥剛發(fā)作或者剛檢測到時、或在人或動物剛感覺到炎癥時、或人或動物的炎癥水平剛出現(xiàn)可感知的變化時，施用該組合物以使得炎癥的量低于在缺乏MANS肽或其活性片段的情況下可能出現(xiàn)的炎癥的量。在另一個方面，可在人或動物的組織的炎癥進展過程中進行施用，以降低在缺乏MANS肽或其活性片段的情況下可能出現(xiàn)的額外的炎癥的量。施用的劑量和頻率可通過臨床評價而確定，并與疾病或炎癥來源以及組織受累的程度和患者的年齡和個頭有關，而可預期的是，在首次施用所述藥物組合物的3到8小時之后、優(yōu)選地6到8小時之后，可重復施用藥物組合物。本發(fā)明還包括減輕對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的抑制MARCKS-相關性炎癥介質釋放的化合物，從而對象的至少一種炎癥介質的釋放與缺乏所述治療時可能出現(xiàn)的情況相比是降低的。在本文中，"降低"通常指的是炎癥效應的減輕。優(yōu)選地，通過在此公開的方法抑制或阻斷炎癥介質的釋放。本發(fā)明的另一個實施方式包括減輕對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的抑制MARCKS-相關性炎癥介質釋放的化合物，從而對象的炎癥與缺乏所述治療時可能出現(xiàn)的情況相比是降低的。本發(fā)明還公開了減輕或抑制對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的有效抑制炎癥部位的炎癥介質的MANS肽或其活性片段。術語"抑制"指的是炎癥介質分泌的量降低。術語"完全抑制"指的是炎癥介質分泌的量降低至零。同樣，如上所述，活性片段的長度為至少4個、且優(yōu)選地至少6個氨基酸。術語"胞吐過程"是指胞吐作用，即細胞分泌或排泄的過程，其中包含于位于細胞內部囊泡內的物質通過囊泡的囊泡膜與細胞外膜的融合而被排出。"脫顆粒"指的是釋放細胞顆粒成分。術語"脫顆粒抑制"指的是降低炎性細胞顆粒內所含炎癥介質的釋放。因此，脫顆粒抑制量的MANS肽和/或其活性片段是指這些肽的量足以使得顆粒內所含炎癥介質的釋放與缺乏同樣的肽的情況下的釋放相比被降低。說在參照肽GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)中，在參照肽的N-端位置處，G位于第l位；與1位的G相鄰的是2位的A;與2位的A相鄰的是3位的Q;與3位的Q相鄰的是4位的F;與4位的F相鄰的是5位的S;與5位的S相鄰的是6位的K;與6位的K相鄰的是7位的T;與7位的T相鄰的是8位的A;與8位的A相鄰的是9位的A;與9位的A相鄰的是10位的K;與10位的K相鄰的是11位的G;與11位的G相鄰的是12位的E;與11位的G相鄰的是13位的A;與13位的A相鄰的是14位的A;與14位的A相鄰的是15位的A;與15位的A相鄰的是16位的E;與16位的E相鄰的是17位的R;與17位的R相鄰的是18位的P;與18位的P相鄰的是19位的G;與19位的G相鄰的是20位的E;與20位的E相鄰的是21位的A;與21位的A相鄰的是22位的A;與22位的A相鄰的是23位的V;而與23位的V相鄰的是24位的A，其中第24位是該參照肽的C-端位置。參照肽的"變體"或參照肽的4-23個氨基酸片段的變體是具有這樣的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列與參照肽的氨基酸序列或參照肽的片段的氨基酸序列分別在參照肽或參照肽片段氨基酸序列中的至少一個氨基酸位置上不同，但是仍保持粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分別是所述參照肽或片段的活性的0.1-10倍，優(yōu)選分別是參照肽或片段的活性的0.2-6倍，更優(yōu)選分別是參照肽或片段的活性的0.3-5倍。參照氨基酸序列的"變體"或參照氨基酸序列的4-23個氨基酸片段的變體是這樣的氨基酸序列，其與參照氨基酸序列或參照氨基酸序列的片段有至少一個氨基酸不同，但具有這樣的肽的氨基酸序列，所述肽保持參照氨基酸序列編碼的所述肽或片段的粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分別是參照序列的肽或片段的活性的0.1-10倍，優(yōu)選分別是參照序列的肽或片段的活性的0.2-6倍，更優(yōu)選分別是參照序列的肽或片段的活性的0.3-5倍。取代變體肽或取代變體氨基酸序列通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸取代而與參照肽或參照氨基酸序列不同(即有差異)；缺失變體肽或缺失變體氨基酸序列通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸缺失而與參照肽或參照氨基酸序列不同(即有差異)；而添加變體肽或添加變體氨基酸序列通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸添加而與參照肽或參照氨基酸序列不同(即有差異)。變體肽或變體氨基酸序列可為參照序列中一或多個氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸取代)的結果，或者可為參照序列中一或多個氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸缺失)的結果，或者可為參照序列中一或多個氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸添加)的結果，或其以任何順序的組合。取代變體4-23個氨基酸的肽片段或者取代變體4-23個氨基酸的片段序列可通過參照氨基酸片段序列中的一或多個氨基酸的取代而與參照4-23個氨基酸的肽片段或參照4-23個氨基酸的片段序列不同(即有差異)；缺失變體4-23個氨基酸的肽片段或者4-22個氨基酸的缺失變體氨基酸片段序列可通過參照氨基酸片段序列中的一或多個氨基酸的缺失而與5-23個氨基酸的參照肽片段或5-23個氨基酸的參照氨基酸片段序列不同(即有差異)；而4-23個氨基酸的添加變體肽或者4-23個氨基酸的添加變體氨基酸序列可通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸的添加而與4-22個氨基酸的參照肽序列或4-22個氨基酸的參照氨基酸序列不同(即有差異)。4-23個氨基酸的變體肽或4-23個氨基酸的變體氨基酸序列可為參照氨基酸序列的4-23個氨基酸的片段中一或多個氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8個氨基酸取代)的結果，或者可為相對較大的參照氨基酸序列中一或多個氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸缺失)的結果，或者可為相對較小的參照氨基酸序列中一或多個氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸添加)的結果，或其以任何順序的組合。優(yōu)選地，變體肽或氨基酸序列與參照肽或參照肽的片段或參照氨基酸序列或參照氨基酸序列的片段分別通過以下變化而不同少于10個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于8個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于6個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于5個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于4個氨基酸取代、缺失和/或添加。最優(yōu)選所述變體氨基酸序列與參照肽或片段氨基酸序列通過1個或2個或3個氨基酸而不同。"序列相同性"意指，就兩條肽的氨基酸序列而言，具有相同氨基酸的位置的數(shù)目除以兩條序列中較短一條中的氨基酸的數(shù)目。"基本相同"意指，就兩條肽的氨基酸序列的比較或兩條肽片段(例如參照肽氨基酸序列的片段)的氨基酸序列的比較而言，肽或肽片段的氨基酸序列具有至少75%序列相同性，優(yōu)選至少80%序列相同性，更優(yōu)選至少90%序列相同性，且最優(yōu)選至少95%序列相同性。術語"肽"在本文中包括肽及其可藥用的鹽。本文中的"分離的"肽意指天然存在的肽，其已經(jīng)通過純化、重組合成或化學合成而與其天然伴隨的細胞組分(例如核酸和其他肽)分離或基本分離，并且也包括己經(jīng)從細胞成分、生物物質、化學前體或其他化學物質中純化或基本純化的非天然存在的重組或化學合成的肽。以下三字母和單字母氨基酸簡寫在全文使用丙氨酸(Ala)A;精氨酸(Arg)R;天冬酰胺(Asn)N;天冬氨酸(Asp)D;半胱氨酸(Cys)C;谷氨酰胺(Gln)Q;谷氨酸(Glu)E;甘氨酸(Gly)G;組氨酸(His)H;異亮氨酸(Ile)I;亮氨酸(Leu)L;賴氨酸(Lys)K;甲硫氨酸(Met)M;苯丙氨酸(Phe)F;脯氨酸(Pro)P;絲氨酸(Ser)S;蘇氨酸(Thr)T;色氨酸(Trp)W;酪氨酸(Tyr)Y;纈氨酸(Val)V。本文所用的其他氨基酸三字母符號包括，見括號中，(Hyp)代表羥脯氨酸，(Nle)代表正亮氨酸，(Om)代表鳥氨酸，(Pyr)代表焦谷氨酸，以及(Sar)代表肌氨酸。通常，肽的氨基端(或N-端)出現(xiàn)在所示肽的氨基酸序列的左側末端，而羧基端(或C-端)出現(xiàn)在所示氨基酸序列的右側末端。肽的氨基酸序列可以用單字母符號書寫來代表肽中通過肽酰胺鍵共價相連的氨基酸。MANS肽的活性片段可用于預防或降低動物組織內由炎癥介質引起的炎癥的量。MANS肽的活性片段還可用于預防或降低動物體內由炎癥介質產(chǎn)生或引起的組織損失的量。MANS肽的活性片段由MANS肽(SEQIDNO:l)的至少4個連續(xù)氨基酸且不超過23個連續(xù)氨基酸組成。術語"活性片段"在本發(fā)明中旨在涵蓋那些能夠預防或降低炎癥介質自炎性細胞釋放的MANS肽片段。與參照肽例如MANS肽相比，所述活性片段可使得炎癥介質的釋放降低至少5%到至少99%。表1中是單字母簡寫形式的氨基酸序列的列表以及相應的肽編號和SEQIDNO。參照肽氨基酸序列(MANS肽)是肽1。肽2至231是本發(fā)明的肽的氨基酸序列，它們具有參照氨基酸序列的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，此外肽232是包含MANS肽的氨基酸的隨機N-端序列(RNS)的氨基酸序列。在此所述的本發(fā)明的肽的氨基酸序列的代表性變體氨基酸序列是肽233至245和247至251。列出的這些變體肽無意于作為限制性的一組肽，而僅僅是作為本發(fā)明變體肽的代表性實例而給出的。還給出了本發(fā)明的肽的代表性反向氨基酸序列(肽246)和代表性隨機氨基酸序列(肽232)。表中的反向和隨機氨基酸序列不是本發(fā)明的代表。表1給出了本發(fā)明的肽及其相應的氨基酸序列的列表以及相應的SEQIDNO。表l:肽和氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表1中所列的肽的氨基酸序列可經(jīng)化學方法修飾。例如，如果表1中所列的肽的氨基酸序列在N-端胺進行化學修飾以便與羧酸形成酰胺化合物，產(chǎn)生的肽在本發(fā)明中有時表示為羧酸的標識符作為前綴通過連字符與肽編號相連的組合。例如，例如，以肽79為例，N-端豆蔻酰化的肽79有時在本文可稱為"豆蔻?；碾?9"或"myr-肽79";N-端乙酰化的肽79有時在本文可稱為"乙?；?肽79"或"Ac-肽79"。環(huán)化形式的肽79可稱為"環(huán)形-肽79"或"cyc-肽79"。此外，例如如果表1中所列肽的氨基酸序列在C-端羧基進行化學修飾，例如通過胺諸如氨以形成C-端酰胺，產(chǎn)生的肽有時在本文通過胺殘基的標識符作為后綴通過連字符與肽編號相連的組合來表示。因此，例如，肽79的C-端酰胺有時可稱為"肽-NH2"。如果肽(例如，肽79)的N-端胺通過例如豆蔻?；M行化學修飾，并且C-端羧基通過例如氨基團進行化學修飾以形成上述的酰胺，利用前綴和后綴說明，產(chǎn)生的肽有時可稱為"myr-肽79-NH2"。本發(fā)明涉及具有包含少于24個氨基酸的氨基酸序列的肽，其中所述氨基酸序列與MANS肽的氨基酸序列相關(即，MANS肽是豆蔻酰-肽1，而MANS肽的參照24個氨基酸的序列是肽1)。本發(fā)明的肽由含有少于24個氨基酸的氨基酸序列組成，并且可由8-14個、10-12個、9-14個、9-13個、10-13個、10-14個、至少9個、至少IO個等等的氨基酸組成。所述肽通常為直鏈的，但是也可為環(huán)狀的。此外，所述肽可為分離的肽。對于肽1(SEQIDNO:l)，即24個氨基酸的參照序列，參照氨基酸序列的23個連續(xù)氨基酸的片段有時在本文稱為23-聚體。類似地，參照序列的22個連續(xù)氨基酸的片段有時在本文稱為22-聚體；21個氨基酸的序列稱為21-聚體；20個氨基酸的序列稱為20-聚體；19個氨基酸的序列稱為19-聚體；18個氨基酸的序列稱為18-聚體；17個氨基酸的序列稱為17-聚體；16個氨基酸的序列稱為16-聚體；15個氨基酸的序列稱為15-聚體；14個氨基酸的序列稱為14-聚體；13個氨基酸的序列稱為13-聚體；12個氨基酸的序列稱為12-聚體；11個氨基酸的序列稱為ll-聚體；10個氨基酸的序列稱為10-聚體；9個氨基酸的序列稱為9-聚體；8個氨基酸的序列稱為8-聚體；7個氨基酸的序列稱為7-聚體；6個氨基酸的序列稱為6-聚體；5個氨基酸的序列稱為5-聚體；而4個氨基酸的序列稱為4-聚體。在一個方面，這些"4-到23-聚體"的氨基酸序列其本身是肽(有時在本文記為H2N-肽-COOH)，其中的任何一種，可獨立地被化學方法修飾，例如通過化學修飾，其中所述化學修飾可選自下組(i)在N-端胺基(H2N-肽-)形成酰胺，諸如與例如C,或優(yōu)選地與C2(乙酸)至C22羧酸；(ii)在C-端羧對-肽-COOH)形成酰胺，諸如與例如氨或與d至C22的伯胺或仲胺；和(iii)其組合。所述肽具有的氨基酸序列選自如下一組(a)具有參照序列(肽l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)與(a)中所定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中所定義的氨基酸序列的變體，所述變體選自下組取代變體、缺失變體、添加變體、及其組合。在一些實施方式中，所述肽具有的氨基酸序列選自如下一組(a)具有參照序列(肽l)的8至14個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)與(a)中所定義的序列基本上相同的氨基酸序列；和(c)(a)中所定義的氨基酸序列的變體，所述變體選自取代變體、缺失變體、添加變體、及其組合。在其他實施方式中，所述肽具有的氨基酸序列選自如下一組(a)具有參照序列(肽l)的10至12個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)與(a)中所定義的序列基本上相同的氨基酸序列；和(c)(a)中所定義的氨基酸序列的變體，所述變體選自取代變體、缺失變體、添加變體、及其組合。在進一步的實施方式中，所述肽具有的氨基酸序列具有參照序列(肽l)的至少9個、至少10個、9-14個、9-13個、10-13個、10-14個等等的連續(xù)氨基酸；與其基本相同的氨基酸序列；或其變體，所述變體選自下組取代變體、缺失變體、添加變體、及其組合。如下文進一步解釋的那樣，肽的一或多個氨基酸(例如N-端和/或C-端氨基酸)任選地可獨立地進行化學修飾；在一些實施方案中，肽的一或多個氨基酸可經(jīng)過化學修飾，而在其他實施方案中，肽的氨基酸無一被修飾。在一個方面，優(yōu)選的修飾可出現(xiàn)在肽或肽片段的N-端氨基酸的胺基(H2N-)(該胺基假如是位于肽序列的內部而不是N-端位置則形成肽酰胺鍵)。在另一個方面，優(yōu)選的修飾可出現(xiàn)在所述肽或肽片段的C-端氨基酸的羧基(-COOH)(該羧基假如是位于肽序列的內部而不是C-端位置則形成肽酰胺鍵)。在另一個方面，優(yōu)選的修飾可同時出現(xiàn)在N-端胺基(H2N-)和C-端羧基(-COOH)。在一些實施方式中，肽的氨基酸序列始自參照序列肽1的N-端氨基酸。例如，肽可具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列肽1的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列始自參照序列的N-端氨基酸(g卩，肽2、肽4、肽7、肽ll、肽16、肽22、肽29、肽37、肽46、肽56、肽67、肽79、肽92、肽106、肽121、肽137、肽154、肽172、肽191、或肽211);(b)與(a)中定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定義的氨基酸序列的變體。這些肽不含有化學部分或者其N-端甘氨酸上的化學部分不是豆蔻?；?。優(yōu)選地，化學部分是形式為酰胺鍵的酰基，例如乙?；蜊?。25在其他實施方式中，肽的氨基酸序列終止于參照序列肽1的c-端氨基酸。例如，肽可具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列肽1的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列終止于參照序列的C-端氨基酸(即，肽3、肽6、肽IO、肽15、肽21、肽28、肽36、肽45、肽55、肽66、肽78、肽91、肽105、肽120、肽136、肽153、肽171、肽190、肽210、或肽231);(b)與(a)中定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定義的氨基酸序列的變體。在其他實施方式中，肽的氨基酸序列不是始自參照序列肽1(SEQIDN0:1)的N-端氨基酸，而是始自參照序列肽1的位置2的氨基酸至位置21的氨基酸。例如，肽可具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列肽1的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列始自參照序列的位置2至位置21之間的任一氨基酸。這些肽的長度可在4至23個連續(xù)氨基酸之間，且可代表參照序列肽1中間的肽；(b)與(a)中定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定義的氨基酸序列的變體。這些肽公開于表1或2。這些肽可不含有共價結合的化學部分，或在N-端氨基酸含有化學部分，該化學部分不是來自氨基酸序列SEQIDNO:l的N-端甘氨酸或與之等價的N-端甘氨酸。優(yōu)選地，該化學部分是?；缫阴；蚨罐Ⅴ；?，其形式為酰胺鍵，或者是烷基。肽氨基酸序列可用于本發(fā)明中以抑制哺乳動物中的粘蛋白分泌過多，并用于降低哺乳動物中的粘蛋白分泌過多，并用于抑制粘蛋白分泌過多的方法中以及減少粘蛋白分泌過多的方法中，所述肽氨基酸序列包括本發(fā)明的分離的肽的氨基酸序列以及任選地含有N-端和/或C-端化學修飾的基團的肽的氨基酸序列，所述肽氨基酸序列選自如下一組23-聚體(即具有23個氨基酸的序列的肽)肽2;和肽3;22-聚體(即具有22個氨基酸的序列的肽)肽4;肽5;和肽6;21-聚體(即具有21個氨基酸的序列的肽)肽7;肽8;肽9;和肽10;20-聚體(即具有20個氨基酸的序列的肽)肽11;肽12;肽13;肽14;和肽15;19-聚體(即具有19個氨基酸的序列的肽)肽16;肽17;肽18;肽19;肽20;和肽21;18-聚體(即具有18個氨基酸的序列的肽)肽22;肽23;肽25;肽26;肽27;和肽28;17-聚體(即具有17個氨基酸的序列的肽)肽29;肽30;肽31;肽32;肽33;肽34;肽35;和肽36;16-聚體(即具有16個氨基酸的序列的肽)肽37;肽38;肽39;肽40;肽41;肽42;肽43;肽44;和肽45;15-聚體(即具有15個氨基酸的序列的肽)肽46;肽47;肽48;肽49;肽50;肽51;肽52;肽53;肽54;和肽55;14-聚體(即具有14個氨基酸的序列的肽):肽56;肽57;肽58;肽59;肽60;肽61;肽62;肽63;肽64;肽65;和肽66;13-聚體(即具有13個氨基酸的序列的肽)肽67;肽68;肽69;肽70;肽71;肽72;肽73;肽74;肽75;肽76;肽77;和肽78;12-聚體(即具有12個氨基酸的序列的肽)肽79;肽80;肽81;肽82;肽83;肽84;肽85;肽86;肽87;肽88;肽89;肽90;和肽91;ll-聚體(即具有11個氨基酸的序列的肽)肽92;肽93;肽94;肽95;肽96;肽97;肽98;肽99;肽100;肽101;肽102;肽103;肽104;和肽105;10-聚體(即具有10個氨基酸的序列的肽)肽106;肽107;肽108;肽109;肽110;肽111;肽112;肽113;肽114;肽115;肽116;肽117;肽118;肽119;和肽120;9-聚體(即具有9個氨基酸的序列的肽)肽121;肽122;肽123;肽124;肽125;肽126;肽127;肽128;肽129;肽130;肽131;肽132;肽133;肽134;肽135;和肽136;8-聚體(即具有8個氨基酸的序列的肽)肽137;肽138;肽139;肽140;肽141;肽142;肽143;肽144;肽145;肽146;肽147;肽148;肽149;肽150;肽151;肽152;和肽153;7-聚體(即具有7個氨基酸的序列的肽)肽154;肽155;肽156;肽157;肽158;肽159;肽160;肽161;肽162;肽163;肽164;肽165;肽166;肽167;肽168;肽169;肽170;和肽171;6-聚體(即具有6個氨基酸的序列的肽)肽172;肽173;肽174;肽175;肽176;肽177;肽178;肽179;肽180;肽181;肽182;肽183;肽184;肽185;肽186;肽187;肽188;肽189;和肽190;5-聚體(即具有5個氨基酸的序列的肽)肽191;肽192;肽193;肽194;肽195;肽196;肽197;肽198;肽199;肽200;肽201;肽202;肽203;肽204;肽205;肽206;肽207;肽208;肽209;和肽210;和4-聚體(即具有4個氨基酸的序列的肽)肽211;肽212;肽213;肽214;肽215;肽216;肽217;肽218;肽219;肽220;肽221;肽222;肽223;肽224;肽225;肽226;肽227;肽228;肽229;肽230;和肽231。本發(fā)明的分離的肽和N-端-和/或C-端-化學修飾的肽的優(yōu)選的氨基酸序列選自如下一組23-聚體肽2;和肽3;22-聚體肽4;肽5;和肽6;21-聚體肽7;肽8;肽9;和肽10;20-聚體肽11;肽12;肽13;肽14;和肽15;19-聚體肽16;肽17;肽18;肽19;肽20;和肽21;18-聚體肽22;肽23;肽24;肽25;肽26;肽27;和肽28;17-聚體肽29;肽30;肽31;肽32;肽33;肽34;肽35;和肽36;16-聚體肽37;肽38;肽39;肽40;肽41;肽42;肽43;肽44;和肽45;15-聚體肽46;肽47;肽48;肽49;肽50;肽51;肽52;肽53;和肽54;14-聚體肽56;肽57;肽58;肽59;肽60;肽61;肽62;肽63;和肽64;13-聚體肽67;肽68;肽69;肽70;肽71;肽72;肽73;肽74;和肽75;12-聚體肽79;肽80;肽81;肽82;肽83;肽84;肽85;肽86;和肽87;ll-聚體肽92;肽93;肽94;肽95;肽96;肽97;肽98;肽99;和肽100;lO-聚體肽106;肽107;肽108;肽109;肽110;肽111;肽112;肽113;和肽114;9-聚體肽122;肽123;肽124;肽125;肽126;肽127;肽128;和肽129;8-聚體:肽139;肽140;肽141;肽142;肽143;肽144;和肽145;7-聚體肽157;肽158;肽159;肽160;肽161;和肽162;6-聚體肽176;肽177;肽178;肽179;和肽180;5-聚體:肽196;肽197;肽198;和肽199;和4-聚體:肽217;和肽219。本發(fā)明的分離的肽和N-端和/或C-端化學修飾的肽的更優(yōu)選的氨基酸序列選自如下一組23-聚體肽2;和肽3;22-聚體肽4;肽5;和肽6;21-聚體肽7;肽8;肽9;和肽10;20-聚體肽11;肽12;肽13;肽14;和肽15;19-聚體肽16;肽17;肽18;肽19;肽20;和肽21;18-聚體肽22;肽23;肽24;肽25;肽26;肽27;和肽28;17-聚體肽29;肽30;肽31;肽32;肽33;肽34;肽35;和肽36;16-聚體:肽37;肽38;肽39;肽40;肽41;肽42;肽43;肽44;和肽45;15-聚體肽46;肽47;肽48;肽49;肽50;肽51;肽52;肽53;和肽54;14-聚體肽56;肽57;肽58;肽59;肽60;肽61;肽62;肽63;和肽64;13-聚體肽67;肽68;肽69;肽70;肽71;肽72;肽73;肽74;肽80;肽81;肽82;肽83;肽84;肽85;肽86;和肽87;ll-聚體:肽92;肽93;肽94;肽95;肽96;肽97;肽98;肽99;和肽100;10-聚體肽106;肽108;肽109;肽110;肽111;肽112;肽113;和肽114;9-聚體肽124;肽125;肽126;肽127;肽128;和肽129;8-聚體肽141;肽28142;肽143;肽144;和肽145;7-聚體:肽159;肽160;肽161;和肽162;6-聚體:肽178;肽179;和肽180;5-聚體:肽198;和肽199;和4-聚體肽219。在其他實施方式中，肽的氨基酸序列包括連續(xù)殘基A、K、G、E，如參照序列肽1的肽219中那樣。例如，肽可具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列肽1的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其中肽的氨基酸序列如參照肽1的肽219中那樣包括連續(xù)殘基A、K、G、和E(例如，肽219、肽45、肽79、肽67、肽80等)；(b)與(a)中定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定義的氨基酸序列的變體。含有參照肽氨基酸序列(肽l)的氨基酸序列AKGE的肽片段的實例包括(a)23-聚體肽2;和肽3;22-聚體肽4;肽5;和肽6;ll-聚體肽7;肽8;肽9;和肽10;20-聚體肽ll;肽12;肽13;肽14;和肽15;19-聚體肽16;肽17;肽18;肽19;肽20;和肽21;18-聚體肽22;肽23;肽24;肽25;肽26;肽27;和肽28;17-聚體肽29;肽30;肽31;肽32;肽33;肽34;肽35;和肽36;'16-聚體肽37;肽38;肽39;肽40;肽41;肽42;肽43;肽44;和肽45;15-聚體肽46;肽47;肽48;肽49;肽50;肽51;肽52;肽53;和肽54;14-聚體:肽56;肽57;肽58;肽59;肽60;肽61;肽62;肽63;和肽64;13-聚體肽67;肽68;肽69;肽70;肽71;肽72;肽73;肽74;和肽75;12-聚體肽79;肽80;肽81;肽82;肽83;肽84;肽85;肽86;和肽87;ll-聚體肽93;肽94;肽95;肽96;肽97;肽98;肽99;和肽100;10-聚體肽108;肽109;肽110;肽111;肽112;肽113;和肽114;9-聚體肽124;肽125;肽126;肽127;肽128;和肽129;8-聚體肽141;肽142;肽143;肽144;和肽145;7-聚體肽159;肽160;肽161;和肽162;6-聚體肽178;肽179;和肽180;5-聚體肽198;和肽199;和4-聚體肽219、(b)與(a)中定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中所定義的氨基酸序列的變體，所述變體選自取代變體、缺失變體、添加變體、及其組合，其中所述片段包含4至23個連續(xù)氨基酸或由4至23個連續(xù)氨基酸組成。在另一個實施方式中，優(yōu)選的肽序列具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列(肽l)的10至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)與(a)中定義的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中所定義的氨基酸序列的變體，所述變體選自取代變體、缺失變體、添加變體、及其組合，其中優(yōu)選的氨基酸序列包含23-聚體肽2;22-聚體肽4;21-聚體肽7;20-聚體肽11;19-聚體肽16;18-聚體肽22;17-聚體肽29;16-聚體肽37;15-聚體肽46;14-聚體肽56;13-聚體肽67;12-聚體肽79;ll-聚體:肽92;禾口10-聚體肽106。在進一步的實施方式中，肽的氨基酸序列始自參照序列肽1的N-端氨基酸并如參照序列肽1的肽219那樣包括連續(xù)殘基A、K、G、和E，而在其他實施方式中，肽的氨基酸序列終止于參照序列肽1的C-端氨基酸并如參照序列肽1的肽219那樣包括連續(xù)殘基A、K、G、和E。所述肽相對于參照氨基酸序列而言可包含一或多個氨基酸缺失、取代和/或添加。優(yōu)選地，所述取代可為保守氨基酸取代，或所述取代可為非保守氨基酸取代。在一些實施方式中，所述肽，包括具有的氨基酸序列與參照氨基酸序列基本相同或為其變體的肽，與參照氨基酸序列的相應連續(xù)氨基酸相比不具有缺失或添加，但可具有保守性或非保守性取代?？稍诒景l(fā)明的肽中對參照氨基酸序列進行的氨基酸取代包括，但不限于，以下取代丙氨酸(A)可被取代為賴氨酸(K)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、或異亮氨酸(I);谷氨酸(E)可被取代為天冬氨酸(D);甘氨酸(G)可被取代為脯氨酸(P);賴氨酸(K)可被取代為精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、或天冬酰胺(N);苯丙氨酸(F)可被取代為亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、異亮氨酸(1)、或丙氨酸(A);脯氨酸(P)可被取代為甘氨酸(G);谷氨酰胺(Q)可被取代為谷氨酸(E)或天冬酰胺(N);精氨酸(R)可被取代為賴氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、或天冬酰胺(N);絲氨酸(S)可被取代為蘇氨酸；蘇氨酸(T)可被取代為絲氨酸(S);和纈氨酸(V)可被取代為亮氨酸(L)、異亮氨酸(1)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、或正亮氨酸(Nle)。例如，可在本發(fā)明的肽中對參照氨基酸序列進行的取代包括-.用丙氨酸(A)取代苯丙氨酸(F)(例如，在參照氨基酸序列的氨基酸位置4)、谷氨酸(E)取代谷氮酰胺(Q)(例如，在參照氨基酸序列的氨基酸位置3)、賴氨酸(K)取代丙氨酸(A)(例如，在參照氨基酸序列的氨基酸位置2和/或8)、和/或絲氨酸(S)取代蘇氨酸(TM例如，在參照氨基酸序列的氮基酸位置7)。如果相對于參照氨基酸序列而言在本發(fā)明的肽(所述肽包含未經(jīng)修飾的肽以及通過化學方法修飾的肽例如通過N-端和/或C-端修飾諸如通過酰胺形成而修飾的肽)的氨基酸序列中引入取代，優(yōu)選所述肽的氨基酸序列與參照氨基酸序列具有至少80%序列相同性。具有5至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括一處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約80%至大約96。/。(g卩，~95.7%)的序列相同性。具有10至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括一處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約90%至大約96%(g卩，95.7%)的序列相同性。具有20至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括一處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約95%至大約96%(g卩，~95.7%)的序列相同性。具有IO至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括2處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約80%至大約92%(即，91.3%)的序列相同性。具有16至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括2處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約87.5%至大約92%(§卩，~91.3%)的序列相同性。具有20至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括2處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約90%至大約92%(艮卩，~91.3%)的序列相同性。具有15至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括3處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約大約80%至大約87%的序列相同性。具有20至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括3處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約85%至大約87%的序列相同性。具有20至23個氨基酸并且相對于參照氨基酸序列而言包括4處氨基酸取代的肽與所述參照氨基酸序列具有大約80%至大約83%(即，~82.6%)的序列相同性。在本發(fā)明的肽中，就參照肽(其為24-聚體)的連續(xù)氨基酸序列而言，在選自該24個氨基酸的參照序列中的連續(xù)23個氨基酸的序列(23-聚體)中，一個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽中同所述23-聚體具有相同性的氨基酸片段具有95.65%(或~96%)的序列相同性。類似地，在所述23-聚體中的2、3、4、和5個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有91.30%(或91%)、86.96%(或87%)、82.61%(或83%)、和78.27%(或~78%)的序列相同性。類似地，在22-聚體中的1、2、3、4、和5個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有95.45%(或~95%)、90.91%(或~91%)、86.36%(或~86%)、81.82%(或~82%)、禾Q77.27%(或~77%)的序列相同性。類似地，在21-聚體中的1、2、3、4、和5個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有95.24%(~95%)、90.48(~91%)、85.71%(~86%)、80.95(~81%)、和76.19%(~76%)的序列相同性。類似地，在20-聚體中的1、2、3、4、和5個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有95.00%(95%)、90.00%(0%)、85.00%(85%)、80.00%(80%)、和75.00%(75%)的序列相同性。類似地，在19-聚體中的1、2、3、和4個氨基酸的取代所提供的肽的氯基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有94.74%(~95%)、89.47%(~89%)、84.21%(~84%)、和78.95%(~79%)的序列相同性。類似地，在18-聚體中的1、2、3、和4個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有94.44%(~94%)、88.89%(~89%)、83.33%(~83%)、和77.78%(78%)的序列相同性。類似地，在17-聚體中的1、2、3、和4個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有94.12%(~94%)、88.23%(~88°/。)、82.35%(82%)、和76.47%(76%)的序列相同性。類似地，在16-聚體中的1、2、3、和4個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有93.75%(~94%)、87.50%(~88%)、81.25%(81%)、和75.00%(75%)的序列相同性。類似地，在15-聚體中的1、2、和3個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有93.33%(~93%)、86.67%(~87°/。)、和80.00%(80%)的序列相同性。類似地，在14-聚體中的1、2、和3個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有92.86%(~93%)、85.71%(~86%)、和78.57%(79%)的序列相同性。類似地，在13-聚體中的1、2、和3個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有92.31%(~92%)、84.62%(85%)、和76.92°/。(77%)的序列相同性。類似地，在12-聚體中的1、2、和3個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有91.67%(92%)、83.33%(~83%)、和75.00%(75%)的序列相同性。類似地，在11-聚體中的1和2個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有90.91%(~91%)和81.82%(~82%)的序列相同性。類似地，在10-聚體中的1和2個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有90.00%(90%)和80.00%(80%)的序列相同性。類似地，在329-聚體中的1和2個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有88.89%(89%)和77.78%(78%)的序列相同性。類似地，在8-聚體中的1和2個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有87.50%(88%)和75.00%(75%)的序列相同性。類似地，在7-聚體、6-聚體、5-聚體、和4-聚體中的1個氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列與所述參照肽氨基酸序列分別具有85.71%卜86%)、83.33%(~83.3%)、80.00%(80%)、禾H75.00°/。(75%)的序列相同性。本發(fā)明優(yōu)選的氨基酸序列與參照序列中的氨基酸序列具有超過80%的序列相同性，更優(yōu)選地與參照序列中的氨基酸序列具有81%至96%的序列相同性，且更優(yōu)選地與參照序列中的氨基酸序列具有80%至96%的序列相同性。優(yōu)選的氨基酸序列任選地可在末端肽氨基處與C2至C22線性脂肪族羧酸部分、更優(yōu)選C2至C16線性脂肪族羧酸部分、更優(yōu)選C2或C16線性脂肪族羧酸部分通過酰胺鍵而發(fā)生N-端化學健合，并且任選地可在末端肽羧基處與胺通過酰胺鍵而發(fā)生C-端化學鍵合，所述胺諸如氨或伯胺或仲胺，諸如Cl至C16線性脂肪族伯胺。肽79是12-聚體，其取代變體的實例包括，例如，肽238，其中肽79中位置3的Q被序列238中的E取代；肽233，其中肽79中位置2的A被肽233中的K取代；肽234，其中肽79中位置8的A被肽234中的K取代；肽235，其中肽79中位置2和8的A被肽235中的K取代；肽237，其中肽79中位置4的F被肽237中的A取代；肽239，其中肽79中位置10的K被肽239中的A取代；肽240，其中肽79中位置11的G被肽240中的A取代；和肽241，其中肽79中位置12的E被肽241中的A取代。肽106是10-聚體，其取代變體的實例包括，例如，肽236，其中肽106中位置4的F被肽236中的A取代；肽242，其中肽106中位置1的G被肽242中的A取代；肽243，其中肽106中位置3的Q被肽243中的A取代；肽244，其中肽106中位置5的S被肽244中的A取代；肽245，其中肽106中位置6的K被肽245中的A取代；肽247，其中肽106中位置7的T被肽247中的A取代；肽248，其中肽106中位置10的K被肽248中的A取代；和肽249，其中肽106中位置16和10的K均被肽249中的A取代。8-聚體的肽137的取代變體的實例包括，例如，肽250，其中肽137中位置4的F被肽250中的A取代。4-聚體的肽219的取代變體的實例包括，例如，肽251，其中肽219中位置2的K被肽251中的A取代。本文描述的取代變體肽可以為分離的肽的形式或者化學修飾的肽的形式，例如N-端酰胺如本文所述的豆蔻?；０?、乙?；０返?，以及例如C-端酰胺如與氨形成的酰胺，以及例如既有N-端酰胺也有C-端酰胺。如果相對于參照氨基酸序列而言本發(fā)明的肽的氨基酸序列中引入了缺失，則優(yōu)選地，所述肽的氨基酸序列與參照氨基酸序列具有至少80%的序列相同性。具有5至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括一個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有80%至大約96%(即，~95.7%)的序列相同性。具有10至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括一個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約90%至大約96%(即，~95.7%)的序列相同性。具有20至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括一個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有95%至大約96%(即，~95.7%)的序列相同性。具有10至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括2個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約80%至大約92%(即，~91.3%)的序列相同性。具有16至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括2個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約87.5%至大約92%(SP，~91.3%)的序列相同性。具有20至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括2個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約卯％至大約92%(即，~91.3%)的序列相同性。具有15至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括3個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約80%至大約87%的序列相同性。具有20至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括3個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約85%至大約87%的序列相同性。具有20至23個氨基酸并相對于參照肽而言包括4個氨基酸缺失的肽與所述參照氨基酸序列具有大約80%至大約83%(g卩，~82.6%)的序列相同性。如上所述，所述肽的一或多個氨基酸也可經(jīng)過化學修飾。可利用本領域已知的任何方法對所述肽的氨基酸序列進行本領域已知的任何氨基酸修飾。在一些實施方式中，N-端和/或C-端氨基酸可被修飾。例如，肽的N-端a-氨基酸可在a-N-端(N-端)氨基(oi-H2N-)處烷基化、酰胺化、或?；?，以及例如，肽的C-端氨基酸可在C-端羧基(-COOH)酰胺化或酯化。例如，N-端氨基可通過?；M行修飾，以引入任何?；蛑觉；孕纬甚０罚ㄒ阴；?即，CH3-C(K))-或豆蔻?；瑑烧吣壳熬鶠閮?yōu)選的基團)。在一些實施方式中，N-端氨基可經(jīng)修飾以引入化學式為-C(O)R的?；?，其中R是具有1至15個碳原子線性或分支烷基，或可經(jīng)過修飾以引入化學式為-C(O)Rl的酰基，其中Rl是具有1至15個碳原子的線性烷基。N-酰胺也可以是甲酰胺(R=H)。肽的C-端氨基酸也可通過化學方法修飾。例如，C-端氨基酸的C-端羧基可通過轉化為甲酰胺(carboxamidegroup)以替代羧基而被化學修飾(即，酰胺化)。在一些實施方式中，N-端和/或C-端氨基酸不被化學修飾。在一些實施方式中，N-端基團被修飾而C-端基團不被修飾。在一些實施方式中，N-端和C-端基團均被修飾。所述肽可在N-端氨基酸的氨基處酰化以與選自下組的酸形成N-端酰胺(i-a)C2(乙酰)至C13脂肪族(飽和的或任選地不飽和的)羧酸(例如，與乙酸(其是優(yōu)選的基團)、丙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸形成的N-端酰胺)，所述羧酸可以是線性的、分支的(大于C3)、或含有環(huán)(大于C3);(i-b)飽和的C14脂肪族羧酸，其可以是線性的、分支的、或含有環(huán)；(i-c)不飽和的C14脂肪族羧酸，其可以是線性的、分支的、或含有環(huán)；(i-d)C15至C24脂肪族(飽和的或任選地不飽和的)羧酸，其可以是線性的、分支的、或含有環(huán)(例如，十四烷酸(豆蔻酸，其是優(yōu)選的基團)、十六烷酸、9-十六碳烯酸、十八烷酸、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9,12-十八碳二烯酸、9，12,15-十八碳三烯酸、6，9，12-十八碳三烯酸、二十垸酸、9-二十碳烯酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,1U4,17-二十碳五烯酸、二十二烷酸、13-二十二碳烯酸、4,7，10,13,16,19-二十二碳己烯酸、二十四垸酸等等)；(ii)三氟乙酸；(iii)苯甲酸；禾口(iv-a)Cl至C12脂肪族垸基磺酸，其形成脂肪族烷基磺酰胺，其中所述磺酸的Cl至C12脂肪族垸基碳鏈結構類似于上述脂肪族烷基羧酸的脂肪族垸基羧酸鏈。例如，可利用表示為(Cl-Cll)-烷基-C(O)OH的羧酸基團通過活化該羧酸基團進行脫水偶聯(lián)對所述肽進行?；纬杀硎緸?Cl-Cll)-烷基-C(O)-NH-肽的酰胺。類似地，可通過使磺酸種類(表示為(Cl-CU)-垸基-S(02)-X，例如，其中X為鹵素或OCH3或其他相容的離去基團)與N-端氨基反應形成(Cl-C12)-烷基-S(02)-NH-肽所表示的磺酰胺來形成磺酰胺。(iv-b)C14至C24脂肪族烷基磺酸，其形成脂肪族烷基磺酰胺，其中所述磺酸的C14至C24脂肪族烷基碳鏈結構類似于上述脂肪族烷基羧酸的脂肪族烷基羧酸鏈。例如，可利用表示為(C13-C23)-垸基-C(0)OH的羧酸基團通過活化該羧酸基團進行脫水偶聯(lián)對所述肽進行?；纬杀硎緸?^13《23)-烷基-C(O)-NH-肽的酰胺。類似地，可通過使磺酸種類(表示為(C14-C24)-烷基-S(02)-X，例如，其中X為鹵素或OCH3或其他相容的離去基的與N-端氨基反應形成(C14-C24)-烷基-S(02)-NH-肽所表示的磺酰胺來形成磺酰胺。作為另一實例，N-端氨基酸的N-端氨基可用Cl至C12脂肪族烷基烷基化，所述脂肪族垸基的結構如上所述。烷基化可例如通過利用脂肪族垸基鹵化物或脂肪族垸基磺酸酯(甲磺酸酯、甲苯磺酸酯等)來實現(xiàn)，優(yōu)選利用伯烷基鹵化物或伯烷基磺酸酯?？稍谀┒税被揎桸-端氨基酸以引入任何酰基或脂肪族?；觉；鳛轷０?，包括乙?；?即，"C(0)CH3，其是優(yōu)選的基團)、豆蔻?；?其是優(yōu)選的基團)、丁酰基、己?；⑿刘；?、癸酰基、十二烷?；⑹耐轷；⑹；?、9-十六碳烯酰基、十八烷酰基、9-十八碳烯?；?、11-十八碳烯?；?、9，12-十八碳二烯酰基、9,12,15-十八碳三烯酰基、6，9，12-十八碳三烯?；?、二十垸?；?、9-二十碳烯酰基、5,8，11，14-二十碳四烯?；?,8，11,14，17-二十碳五烯?；⒍轷；?3-二十二碳烯?；?，7，10，13,16,19-二十二碳己烯?；?、二十四烷?；@些基團通過酰胺鍵與肽上的末端氨基共價相連。本發(fā)明的肽的C-端氨基酸的C-端羧酸基團也可被化學修飾。例如可通過將所述肽的C-端羧酸基團與胺反應形成酰胺基團來修飾C-端氨基酸，所述酰胺基團例如為，氨(其是優(yōu)選的基團)的酰胺；Cl至C12脂肪族烷基胺的酰胺，優(yōu)選地為線性脂肪族烷基胺的酰胺；羥基取代的C2至C12脂肪族烷基胺的酰胺；線性2-(Cl至C12脂肪族烷基)氧乙基胺基的酰胺；和(O-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙基胺基(也稱為co-甲氧基-PEG-(x-胺基或(o-甲氧基-(聚乙二醇)胺基)的酰胺，其中n為0-10。肽的C-端氨基酸的C-端羧酸可為選自如下一組的酯的形式Cl至C12脂肪族垸基醇的酯、2-(0)-甲氧基-聚(乙烯氧)11)-乙醇基團的酯，其中n為0-10。在一個方面，優(yōu)選地，諸如PEG酯、MPEG酯、PEG酰胺、MPEG酰胺等等中的聚乙二醇組分的分子量為大約500至40,000道爾頓，更優(yōu)選地為1000至25,000道爾頓，且最優(yōu)選地為大約1000至大約10,000道爾頓。肽的C-端羧酸基團可表示為化學式肽-C(O)OH，其也可通過轉化成活性形式而得以酰胺化，所述活性形式諸如羧酸鹵化物、羧酸酸酐、N-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯基(OPfp)酯、3-羥基-2，3-二氫-4-氧代-苯并-三嗪酮(ODhbt)酯等，以促進與氨或伯或仲胺的反應，優(yōu)選氨或伯胺，且優(yōu)選地，肽中的任何其他活性基團通過肽合成領域已知的合成的化學相容性保護基團也得以保護，尤其是肽固相合成的合成的化學相容性保護基團，諸如苯甲基酯、叔丁基酯、苯基酯等。產(chǎn)生的肽酰胺可表示為化學式肽-C(0)-NR3R4(胺在肽的C末端)，其中R3和R4獨立選自氫；Cl至C12垸基例如甲基、乙基、丁基、異丁基、環(huán)丙甲基、己基、十二基；和任選地更高的垸基例如C14至C24垸基，如十四基等如上所述的那些。C-端氨基酸的C-端羧酸也可轉化為羥基取代的C2至C12脂肪族烷基胺(羥基附著于胺的碳原子而不是胺的氮原子)的酰胺，例如2-羥基乙基胺、4-羥基丁基胺、和12-羥基十二基胺等。C-端羧酸也可轉化為羥基-取代的C2至C12脂肪族烷基胺的酰胺，其中羥基可被酰化與上述C2至C12脂肪族羧酸形成酯。優(yōu)選地，在所述肽中，肽的C-端酰胺表示為化學式肽-C(0)NR5R6，R5是氫，R6選自氫、Cl至C12烷基和羥基-取代的Cl至C12垸基。C-端氨基酸的C-端羧酸可轉化為線性2-(Cl至C12脂肪族烷基)氧乙基胺的酰胺。制備所述酰胺可例如通過使線性Cl至C12脂肪族醇與鉀的氫化物在含有2-氯乙醇的二甘醇二甲醚中反應提供線性Cl至C12脂肪族烷基乙醇，其可通過氧化成醛轉化成胺，然后還原胺化成胺(例如利用氨)，或通過轉化成垸基鹵化物(例如利用亞硫酰氯化物)然后利用胺諸如氨進行處理。C-端氨基酸的C-端羧酸也可轉化成線性PEG-胺(例如，o)-羥基-PEG-oc-胺；co-(Cl至C12)-PEG-a-胺例如co-甲氧基-PEG-a-胺，艮卩MPEG-胺)的酰胺。在一個方面，優(yōu)選地，聚乙二醇或PEG組分的分子量為大約500至40,000道爾頓，更優(yōu)選地為1000至25,000道爾頓，且最優(yōu)選地為大約1000至大約10,000道爾頓。C-端氨基酸的C-端羧酸也可轉化成(o-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙胺的酰胺，其中n為0-10，其可從相應的a)-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙醇制備，例如通過如上所述將醇轉化為胺。在另一個實施方式中，C-端羧基可轉化為化學式為肽-C(0)-NR7R8的酰37胺，其中R7是氫，R8是線性2-(C1至C12脂肪族垸基)氧乙基，其中Cl至C12脂肪族垸基部分如上所述并包括基團如甲氧乙基(即，CH30-CH2CH2-)、2-十二基氧乙基等；或R7是氫，R8是co-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中聚(氧化乙烯)部分的n為0-10，諸如2-甲氧基乙基(gp，CH30-CH2CH2-)、co-甲氧基乙氧基乙基(即，CH30CH2CH20-CH2CH2-)直至lJCH30-(CH2CH20)10-CH2CH2-。所述肽的C-端氨基酸的C-端羧酸基團也可為Cl至C12脂肪族烷基醇的酯的形式，醇的脂肪族烷基部分如上所述。肽的C-端氨基酸的C-端羧酸基團也可為2-(Q)-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基團的酯的形式，其中n為0-10，其可從作為2-甲氧基脫氫乙酸鈉(sodium2-methoxyethanolate)形式的2-甲氧基醇與化學量(stoichiometricamount)的環(huán)氧乙烯反應來制備，其中所述化學量取決于n的大小。肽中氨基酸的側鏈也可被化學修飾。例如，苯丙氨酸或酪氨酸中的苯基可被選自如下一組的取代基替代Cl至C24脂肪族垸基(g卩，線性或分支的，和減飽和的或不飽和的，和/或含有環(huán)狀基團)，如甲基(優(yōu)選的)、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)丙基、2-甲基環(huán)丙基、環(huán)己基、辛基、癸基、十二基、十六基、十八基、二十基、二十二基、二十四基、9-十六碳烯基、9-十八碳烯基、11-十八碳烯基、9，12-十八碳二烯基、9,12，15-十八碳三烯基、6，9，12-十八碳三烯基、9-二十碳烯基、5，8,11,14-二十碳四烯基、5,8,11，14，17-二十碳五烯基、13-二十二碳烯基、和4，7,10,13,16，19-二十二碳六烯基；在不飽和位置以外的至少一個碳原子上被羥基取代的Cl至C12脂肪族烷基，所述羥基垸基的實例包括羥基甲基、羥基乙基、羥基十二基等；羥基取代的Cl至C12烷基，該羥基被酸的C2至C25脂肪族羧基酯化，所述酸例如為乙酸、丁酸、已酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、9-十六烯酸、十八酸、9-十八烯酸、11-十八烯酸、9，12-十八二烯酸、9，12,15-十八碳三烯酸、6,9，12-十八碳三烯酸、二十酸、9-二十烯酸、5，8，11，14-二十碳四烯酸、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、二十二酸、13-二十二碳烯酸、4,7,10，13，16,19-二十二碳六烯酸、二十四酸等；二羧酸如琥珀酸；或羥基酸諸如乳酸，其中酯取代基的碳原子的總數(shù)為3至25;鹵素例如氟-、氯-、溴-、和碘-;硝基-;氨基-例如NH2、甲基氨基、二甲基氨基；三氟甲基-；羧基(-COOH);Cl至C24烷氧基(例如可通過酪氨酸的烷基化形成)，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙基氧基、丁氧基、異丁基氧基、環(huán)丙氧基、2-甲氧基環(huán)丙氧基、環(huán)己氧基、辛基氧基、癸基氧基、十二基氧基、十六基氧基、十八基氧基、二十基氧基、二十二基氧基、二十四基氧基、9-十六碳烯基氧基、9-十八碳烯基氧基、11-十八碳烯基氧基、9,12-十八碳二烯基氧基、9,12,15-十八碳三烯基氧基、6,9,12-十八碳三烯基氧基、9-二十碳烯基氧基、5,8,11,14-二十碳四烯基氧基、5,8,11,14,17-二十碳五烯基氧基、13-二十二碳烯基氧基、和4,7，10,13,16,19-二十二碳己烯基氧基；C2至C12羥基垸氧基，例如2-羥基乙基氧基及其與上述羧酸或三氟乙酸形成的酯。絲氨酸羥基可被選自如下一組的取代基酯化如上所述的C2至C12脂肪族羧酸基團；三氟乙酸基團；和苯甲酸基團。賴氨酸中的s氨基可通過化學方法修飾，例如通過與以下物質形成酰胺如上所述的C2至C12脂肪族羧酸基團(例如，通過胺與羧酸的化學活性形式反應，所述羧酸例如酸的氯化物、酸酐、N羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯基(OPfp)酯、3-羥基-2,3-二氫-4-氧代-苯并-三嗪酮(ODhbt)酯等)，或苯甲酸基團，或氨基酸基團。此外，賴氨酸中的s氨基可通過用一或兩個Cl至C4脂肪族烷基烷化來進行化學修飾。谷氨酸中的羧酸基團可通過與胺形成酰胺來修飾，所述胺例如氨；Cl至C12伯脂肪族垸基胺(其烷基部分如上所述)，包括甲基胺；或者氨基酸的氨基。谷氨酸中的羧酸基團可通過與如上所述的Cl至C12脂肪族羥基烷基基團形成酯來修飾，優(yōu)選與Cl至C12脂肪族烷基的伯醇形成的酯，所述醇例如甲醇、乙醇、l-丙醇、正十二醇等如上所述。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明包括抑制至少一種炎癥介質自對象的組織和/或體液中的至少一種炎性細胞內的顆粒中釋放的方法，所述方法包括給所述組織和/或體液施用治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含至少一種肽，所述肽具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的氨基酸序列；和(c)與(a)中所定義的序列基本上相同的氨基酸序列，其中所述肽的C-端氨基酸任選地獨立地被化學修飾，且所述肽的N-端氨基酸獨立地通過使用羧酸進行?；换瘜W修飾或者不被化學修飾，所述羧酸選自如下一組C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14飽和的(豆蔻酸)或不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，條件是當所述肽的氨基酸序列以所述參照序列的序列GAQF為起始時，所述肽通過僅使用選自如下一組的羧酸進行?；货；揎椈蛘卟槐换瘜W修飾C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，其中所述肽，任選地與藥用可接受的載體相組合，并以降低炎癥介質釋放的治療有效量，使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞中的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下所述炎癥介質自至少一種相同類型的炎性細胞中的釋放相比被降低。優(yōu)選地使用可在N-端(x氨基酸被乙?；碾倪M行所述方法。所述肽可由至少10個連續(xù)氨基酸殘基組成且優(yōu)選地為乙?；?肽106(SEQIDNO:106)。該方法也可使用由至少4個連續(xù)氨基酸殘基且更優(yōu)選地由至少6個連續(xù)氨基酸殘基組成的肽。此外，肽的N-端a氨基酸可以是豆蔻?；摹Ｔ摲椒ㄟ€可使用可用氨在C-端a氨基酸進行酰胺化的肽。在進一步的實施方式中，該方法使用的肽包含如下氨基酸序列(a)具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其中(a)的氨基酸序列的N-端氨基酸選自參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的第2至21位氨基酸。此外，這些肽的N-端a氨基酸可以是豆蔻酰化的，且其C-端a氨基酸還可用氨進行酰胺化。本發(fā)明的施用方法將降低炎癥介質的釋放定義為阻斷或抑制自所述對象內的炎性細胞釋放炎癥介質的機制。所述施用方法包括將所述的肽與藥用可接受的載體合并或混合以形成藥物組合物。本發(fā)明的施用方法以釋放抑制量抑制至少一種炎癥介質的釋放，使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞中的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下所述炎癥介質自至少一種相同類型的炎性細胞中的釋放相比被降低。所述對象的炎性細胞可以是白細胞、粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞或其組合。自至少一種炎性細胞的至少一種顆粒中釋放的炎癥介質選自髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶、組胺、蛋白聚糖、蛋白酶、趨化因子、細胞因子、花生四烯酸代謝物、防衛(wèi)素、殺菌性通透性增強蛋白(BPI)、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、P-D-葡糖醛酸糖苷酶、a-甘露糖苷酶、磷脂酶A2、4-硫酸軟骨素、蛋白酶3、乳鐵蛋白、膠原酶、補體激活物、補體受體、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體、層粘連蛋白受體、細胞色素b558、單核細胞-趨化因子、組胺酶、維生素B12結合蛋白、明膠酶、纖溶酶原激活物、P-D-葡糖醛酸糖苷酶、及其組合。優(yōu)選地所述炎癥介質選自髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶及其組合。權利要求13的方法，其中所述降低炎癥介質釋放的有效量的所述肽包含脫顆粒抑制量的肽，其使得自至少一種炎性細胞釋放的炎癥介質的量與缺乏所述肽的情況下自至少一種炎性細胞釋放的量相比降低大約1%至大約99°/。，或優(yōu)選地降低大約5-50%至大約99%。本發(fā)明的方法可用于治療患有呼吸道疾病的對象。所述呼吸道疾病可以是哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和囊性纖維化?？赏ㄟ^本發(fā)明而治療的對象優(yōu)選地是哺乳動物例如人、犬、馬和貓科動物。本發(fā)明的肽的施用方法可以是局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、鼻部施用和口服。更優(yōu)選地，肺部施用包括氣溶膠，其可由干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器或噴霧器產(chǎn)生。此外，給對象施用還可包括施用選自如下一組的第二分子抗生素、抗病毒化合物、抗寄生蟲化合物、抗炎化合物、和免疫調節(jié)劑。該方法還可用于治療患有選自如下一組的疾病的對象腸病、皮膚病、自身免疫病、疼痛綜合征、及其組合。更具體地，腸病選自潰瘍性結腸炎、克羅恩病和腸激惹綜合征。本方法可治療的皮膚病包括紅斑痤瘡、濕疹、銀屑病和重度痤瘡。本發(fā)明還可治療患有關節(jié)炎的對象。本發(fā)明的一個實施方式涵蓋施用包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列與具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列(a)基本上相同。優(yōu)選地，這些肽選自如下一組SEQIDNO:233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、247、248、249、250、251和252。這些肽還可以是N-端a氨基酸乙酰化的或N-端a氨基酸豆蔻?；?，且任選地其C-端a氨基酸被氨進行酰胺化。通過施用如上所述的本發(fā)明的肽，本發(fā)明的方法還可用于降低對象的粘液分泌過多，并可用于降低對象的粘液分泌細胞或組織的MARCKS-相關性粘液分泌過多，由此與缺乏施用所述肽時可能出現(xiàn)的情況相比，對象的粘液分泌過多被降低。本發(fā)明涉及分離的肽，其具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的氨基酸序列；和(c)與(a)中所定義的序列基本上相同的氨基酸序列，其中所述肽的C-端氨基酸任選地獨立地被化學修飾，且所述肽的N-端氨基酸獨立地通過使用羧酸進行?；换瘜W修飾或者不被化學修飾，所述羧酸選自如下一組C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，條件是當所述肽的氨基酸序列以所述參照序列的序列GAQF為起始時，所述肽通過僅使用選自如下一組的羧酸進行?；货；揎椈蛘卟槐换瘜W修飾C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，其中所述肽，任選地與藥用可接受的載體相組合，并以降低炎癥介質釋放的治療有效量，使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞中的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下所述炎癥介質自至少一種相同類型的炎性細胞中的釋放相比被降低。42所述分離的肽的N-端CX氨基酸可以被乙酰化。所述分離的肽由至少10個連續(xù)氨基酸殘基組成，且優(yōu)選地是由乙?；?肽106(SEQIDNO:106)組成的分離的肽。在另一個實施方式中，所述肽由至少4個連續(xù)氨基酸殘基組成或者所述肽由至少6個連續(xù)氨基酸殘基組成。所述肽的N-端a氨基酸可以是豆蔻?；暮?或所述肽的C-端a氨基酸可以用氨進行酰胺化。所述分離的肽還可包含上述(a)的氨基酸序列，(a)具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；其中所述(a)的氨基酸序列的N-端氨基酸選自參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的第2至21位氨基酸。所述肽的N-端a氨基酸還可以是豆蔻?；幕蛞阴；模蛉芜x地用氨使C-端a氨基酸酰胺化。在另一個實施方式中，所述分離的肽的氨基酸序列與(a)的氨基酸序列基本上相同，所述(a)的氨基酸序列具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸。這些肽優(yōu)選地選自如下一組SEQIDNO:233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、247、248、249、250、251和252。這些肽可進一步在N-端a氨基酸被乙?；蛟贜-端a氨基酸被豆蔻?；?，且任選地用氨使C-端a氨基酸酰胺化。(c)的氨基酸序列與選自SEQIDNO:233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、247、248、249、250、251和252的(a)的氨基酸序列基本上相同。本發(fā)明還涵蓋包含以上數(shù)段以及本文中所公開的分離的肽和賦形劑的組合物。本發(fā)明還涵蓋以上數(shù)段以及本文中所公開的分離的肽和藥用可接受的載體的藥物組合物。所述藥物組合物進一步優(yōu)選地可以是無菌的、可消毒的或滅菌的。這些肽可與用于施用的試劑一起置于試劑盒中。圖1A-1B顯示了PKC-依賴性磷酸化將MARCKS從質膜釋放至細胞質。圖2A-2C顯示PKG通過活化PP2A而誘導MARCKS去磷酸化。圖3給出的條線圖證實PP2A是粘蛋白分泌途徑的必需組分。4圖4的凝膠顯示MARCKS與細胞質中的肌動蛋白和肌球蛋白相結合。圖5描繪了控制中性粒細胞中的MPO分泌的信號機制。圖6的條線圖描繪了MANS肽能夠阻斷分離的犬中性粒細胞分泌髓過氧化物酶。圖7的條線圖描繪了MANS肽能夠阻斷分離的人中性粒細胞分泌髓過氧化物酶。圖8的條線圖顯示PMA刺激可小量增加從LPS-刺激的人中性粒細胞分泌的MPO，以8-Br-cGMP進行共刺激使之以濃度依賴性方式被增強。圖9的條線圖顯示8-Br-cGMP刺激對LPS-刺激的人中性粒細胞分泌MPO幾乎沒有作用，直至用PMA以濃度依賴性方式進行共刺激。圖IO的條線圖顯示PMA剌激可小量增加從LPS-刺激的犬中性粒細胞分泌的MPO，以8-Br-cGMP進行共刺激使之以濃度依賴性方式被增強。圖11的條線圖顯示8-Br-cGMP刺激對LPS-刺激的犬中性粒細胞分泌MPO幾乎沒有作用，直至用PMA以濃度依賴性方式進行共刺激。圖12的條線圖顯示PMA+8-Br-cGMP的共刺激對于LPS-刺激的犬中性粒細胞的MPO分泌最大化是必需的。發(fā)明詳述以下結合描述本發(fā)明優(yōu)選實施方式的附圖更加充分地描述本發(fā)明。不過，本發(fā)明可以不同的形式來實施，而不應被理解為局限于在此給出的具體實施方式。相反，給出這些具體實施方式是為了使得公開充分而完整，以便使得本領域人員充分了解本發(fā)明的范圍。除非另有說明，否則本文所用的所有技術和科技術語均具有本發(fā)明所屬
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的普通技術人員通常所了解的含義。所有的出版物、專利申請、專利以及本文提及的其它參考文獻均通過引用以其全部內容并入本文。文中的"一"("a"或"an")在用于描述本發(fā)明的任何方面是要理解成指的是一個或多個。本發(fā)明涉及抑制自至少一種炎性細胞胞吐釋放至少一種炎癥介質的方法，包括將所述至少一種炎性細胞與有效量的至少一種肽相接觸，所述至少一種炎性細胞包含位于所述細胞內的囊泡內的至少一種炎癥介質，所述至少一種肽選自MANS肽及其在此所述的活性片段，以使得所述炎癥介質自所述炎性細胞的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下可能自相同類型的炎性細胞釋放的所述炎癥介質相比被降低。本發(fā)明進一步涉及抑制自對象的組織或體液內的至少一種炎性細胞釋放至少一種炎癥介質的方法，包括給所述對象的包含至少一種炎性細胞的組織和/或體液施用治療有效量的藥物組合物，所述至少一種炎性細胞包含位于所述細胞內的囊泡內的至少一種炎癥介質，所述組合物包含治療有效量的選自MANS肽及其活性片段的至少一種肽，以使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下可能自至少一種相同類型的炎性細胞釋放的所述炎癥介質相比被降低。更具體地，降低炎癥介質的釋放包含阻斷或抑制炎癥介質自炎性細胞釋放的機制。本發(fā)明涉及將前述以及整個說明書所述的肽接觸和/或施用給可能位于對象的組織或體液內的任何已知的炎性細胞，所述細胞含有位于所述細胞內的囊泡內的至少一種炎癥介質。炎性細胞優(yōu)選地是白細胞，更優(yōu)選地是粒細胞，后者可進一步分為中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞或其組合。本發(fā)明的方法中所接觸的炎性細胞也可以是單核細胞/巨噬細胞。本發(fā)明旨在減少炎性細胞的囊泡中所含的炎癥介質的釋放，這些炎癥介質選自如下一組髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶、組胺、蛋白聚糖、蛋白酶、趨化因子、細胞因子、花生四烯酸代謝物、防衛(wèi)素、殺菌性通透性增強蛋白(BPI)、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、卩-D-葡糖醛酸糖苷酶、(x-甘露糖苷酶、磷脂酶A2、4-硫酸軟骨素、蛋白酶3、乳鐵蛋白、膠原酶、補體激活物、補體受體、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體、層粘連蛋白受體、細胞色素b558、單核細胞-趨化因子、組胺酶、維生素B12結合蛋白、明膠酶、纖溶酶原激活物、卩-D-葡糖醛酸糖苷酶、及其組合。優(yōu)選地，這些炎癥介質選自髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶及其組合。本發(fā)明將有效量的所述肽與炎性細胞相接觸，其中所述有效量被定義為脫顆粒抑制量的MANS肽或其活性片段，其使得與缺乏MANS肽或其活性片段的情況下自至少一種炎性細胞釋放的量相比，自至少一種炎性細胞釋放的炎癥介質的量降低大約1%至大約99%。該量也稱為有效的炎癥介質釋放降低量。更優(yōu)選地，所述有效量的用于接觸的肽包括脫顆粒抑制量的MANS45肽或其活性片段，其使得與缺乏MANS肽或其活性片段的情況下自至少一種炎性細胞釋放的量相比，自至少一種炎性細胞釋放的炎癥介質的量降低大約5-50%至大約99%。在一個實施方式中，本發(fā)明旨在將治療有效量的至少一種包含MANS肽及其活性片段的肽施用至對象的組織或體液中，其中所述對象患有呼吸道疾病，優(yōu)選地是哮喘、慢性支氣管炎或COPD。在另一個實施方式中，所述對象患有腸病、皮膚病、自身免疫病、疼痛綜合征、及其組合。腸病可以是潰瘍性結腸炎、克羅恩病或腸激惹綜合征。對象可以是患有皮膚病，例如紅斑痤瘡、濕疹、銀屑病或重度痤瘡。對象也可以是患有關節(jié)炎，例如類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。患有囊性纖維化的對象也可用本發(fā)明的方法和肽來治療。本發(fā)明的方法優(yōu)選地用于治療對象，例如哺乳動物，優(yōu)選地為人、犬、馬和貓科動物。通過給對象施用包括在此所述的MANS肽或活性片段的一或多種肽的本發(fā)明的治療方法包括局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、鼻部施用或口服。更具體地，肺部施用選自氣溶膠、干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器、和噴霧器。此外，本發(fā)明的方法還可包括給對象施用選自如下一組的第二分子抗生素、抗病毒化合物、抗寄生蟲化合物、抗炎化合物、和免疫調節(jié)劑。在一個方面，本發(fā)明涉及施用藥物組合物的方法。所述藥物組合物包含治療有效量的已知化合物和藥用可接受的載體。"治療有效"量在本文中是足以減輕對象所表現(xiàn)出的癥狀的化合物的量。治療有效量可隨著患者的年齡和身體條件、被治療患者的基本嚴重程度、治療的持續(xù)時間、任何同時的治療的性質、所用的藥用可接受的載體以及本領域人員所知的其他類似因素而變化。藥用可接受的載體優(yōu)選地是固體劑型例如片劑和膠囊。也可使用口服的液體制劑，其可制備為糖漿和懸液的形式，例如，含有活性成分、糖以及乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物的溶液。需要的話，此類液體制劑可包括一或多種以下組分著色劑、調味劑和糖精。此外，還可使用增稠劑例如羧甲基纖維素以及其他可接受的載體，本領域人員知道如何對其進行選擇。如上所述，本發(fā)明涉及用于調節(jié)細胞分泌過程的方法，特別是涉及用于調節(jié)炎癥介質自炎性細胞釋放的細胞分泌過程的方法。在本文中，術語"調節(jié)"指的是阻斷、抑制、減少、降低、增加、增強或者刺激。一些細胞分泌過程涉及細胞內的膜結合型囊泡或顆粒釋放成分。膜結合型囊泡或顆粒被定義為細胞內顆粒，其主要是泡狀的(或細胞內的囊泡)，并含有可被分泌的儲存物質。以及國內發(fā)現(xiàn)，這些囊泡的一些成分，例如炎性細胞中所含的那些，造成大量哺乳動物組織中的各種病理學。這些分泌的一些效應似乎包括在炎癥過程中損傷以往健康的組織。本發(fā)明提供阻斷從膜結合型囊泡、包括從炎性細胞中的那些膜結合型囊泡的分泌的手段，這是通過用合成的肽靶向細胞內分泌途徑中的特定重要分子而實現(xiàn)的。該方法對于治療人和動物的多種分泌過度和炎癥疾病具有治療意義。更具體地，本發(fā)明靶向炎性細胞，這些炎癥細胞在細胞質內的一或多種顆?；蚰遗葜泻醒装Y介質。將細胞與選自MANS肽或其活性片段的一或多種肽相接觸，說明書對這些肽進行了詳細描述。優(yōu)選地，通過給患有疾病的對象施用肽而使得肽與炎性細胞接觸，在所述疾病中，這些炎性細胞出現(xiàn)在特定的組織或組織的體液中。經(jīng)施用后或者所述肽與細胞接觸后，所述肽競爭性競爭并競爭性抑制天然的MARCKS蛋白與含有炎癥介質的細胞內顆?；蚰遗莸哪さ慕Y合。由此阻斷MARCKS蛋白與炎性細胞內的囊泡的結合，因此這些細胞內的這些囊泡不會象它們受到向細胞外胞吐釋放其炎癥介質成分的刺激時通常所做的那樣移向細胞的質膜。因此，本發(fā)明的方法抑制囊泡向細胞質膜的移動，由此減少了炎性細胞的炎癥介質釋放。由于介質自炎癥細胞釋放的速度和釋放的量均取決于所施用的且與炎性細胞相接觸的肽的濃度，因此隨時間而從細胞釋放的炎癥介質的量得以降低。本發(fā)明的一個優(yōu)勢在于其可組合包括直接阻斷粘液分泌的治療和獨特的抗炎治療。本發(fā)明優(yōu)于目前的影響免疫系統(tǒng)的廣泛抑制的抗炎治療的一個優(yōu)勢在于所述的肽被認為僅阻斷從炎性細胞分泌的細胞內成分的分泌。因此，盡管炎癥介質被抑制，但免疫系統(tǒng)的許多方面仍將起作用。本發(fā)明的化合物可調節(jié)，即阻斷，炎癥介質自細胞的釋放。對于預防和治療多種疾病，例如，涉及炎癥的疾病和病理情況，抑制炎癥介質釋放是一種有吸引力的手段。因此，本發(fā)明的化合物可用于治療此類病癥。這些疾病包括氣道疾病和慢性炎性疾病，后者包括，但不限于，骨關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、Guillain-Barre綜合征、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、銀屑病、移植物抗宿主病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。本發(fā)明的化合物還可用于治療與促炎癥介質和酶的活性水平升高相關的其他疾病如對各種感染物的反應，以及多種自身免疫疾病例如類風濕性關節(jié)炎、中毒休克綜合征、糖尿病和炎性腸病。本發(fā)明的肽和方法的用途包括對抗炎癥的治療以及將所述肽的抗炎活性與其阻斷粘液分泌的能力相結合的治療?？赏ㄟ^所述肽的同時阻斷炎癥和粘液分泌的能力而治療的疾病包括，但不限于，炎性腸病、消化系統(tǒng)疾病(即，膽囊炎、Menetier病)和炎性氣道疾病。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其他促炎癥介質與多種與中性粒細胞侵入炎癥或損傷部位相關的疾病狀態(tài)相關。已經(jīng)證實阻斷抗體可用于治療急性炎癥中的中性粒細胞相關性組織損傷(Harada"1996，Mo/ecw/arM"http://c/"e7bda_y2，482)。除中性粒細胞以外的其他可釋放炎癥介質的細胞包括其他白細胞，例如嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，并可以針對這些細胞的分泌進行治療。中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞均為粒細胞的類型，艮P，它們是細胞質內具有顆粒的白細胞。白細胞合成多種炎癥介質，它們被包裝并儲存于細胞漿的顆粒內。這些介質例如為中性粒細胞內的髓過氧化物酶(MPO)(BorregaardN,CowlandJB.Granulesoftheneutrophilicpolymorphonuclearleukocyte.Blood1997;89:3503-3521)、嗜酸性粒細胞內的嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)和主要堿性蛋白(MBP)(GleichGJ.Mechanismsofeosinophil-associatedinflammation.JAllergyClinImmunol2000;105:651-663)、單核細胞/巨噬細胞內的溶菌酶(HoffT,SpenckerT,EmmendoerfferA.,Goppelt-StruebeM.EffectsofglucocorticoidsontheTPA-inducedmonocyticdifferentiation.JLeukocBiol1992;52:173-182;BalboaMA,SaezY,BalsindeJ.Calcium-independentphospholipaseA2isrequiredforlysozymesecretioninU937promonocytes.JImmunol2003;170:5276-5280)、和天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性淋巴細胞內的粒酶(BochanMR,GoebelWS，BrahmiZ.StablytransfectedantisensegmnzymeBandperforinconstructsinhibithumangranule-mediatedlyticability.CellImmunol1995;164:234-239;GongJH.，MakiG，KlingemannHG.Characterizationofahumancellline(NK-92)withphenotypicalandfunctionalcharacteristicsofactivatednaturalkillercells.Leukemia1994;8:652-658;MakiG，KlingemannHG，MartinsonJA，TamYK.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.JHematotherStemCellRes2001;10:369-383;禾口TakayamaH，TrennG，SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.JImmunolMethods1987;104:183-1907-10)。作為這些細胞侵潤至損傷或疾病的組織部位的結果，這些介質和釋放于損傷部位并可促成炎癥和修復，例如在肺部和其他部位。白細胞通過胞吐機制釋放這些顆粒(BurgoyneRD,MorganA.Secretorygranuleexocytosis.PhysiolRev2003;83:581-632;LoganMR,OdemuyiwaSO，MoqbelR.Understandingexocytosisinimmuneandinflammatorycells:themolecularbasisofmediatorsecretion.JAllergyClinImmunol2003;111:923-932)。肥大細胞通常不在血流中循環(huán)，其和嗜堿性粒細胞含有分泌型細胞質顆粒，這些顆粒儲存并(當細胞被活化后)釋放炎癥(過敏)介質，例如組胺；蛋白聚糖，例如肝素和硫酸軟骨素；蛋白酶，例如類胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、和組織蛋白酶G-樣蛋白酶；趨化因子、細胞因子和花生四烯酸代謝物，它們作用于血管、平滑肌、結締組織、粘液腺和炎性細胞。中性粒細胞也稱為多形核白細胞(PMN)，其占循環(huán)白細胞總數(shù)的50至60%。中性粒細胞對抗那些穿透感染或損傷部位的肌體物理屏障的感染物，例如細菌、真菌、原蟲、病毒、感染病毒的細胞、以及腫瘤細胞。中性粒細胞的成熟經(jīng)歷6個形態(tài)學階段原粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞、非分葉核(桿狀核)中性粒細胞、和分葉核(具有功能活性的)中性粒細胞。在中性粒細胞中，炎癥介質儲存于初級(嗜天青)、次級(特異性)和三級(明膠酶)顆粒以及分泌性囊泡中。在多種炎癥介質中，初級(嗜天青)顆粒含有髓過氧化物酶(MPO)、溶菌酶、防衛(wèi)素、殺菌性通透性增強蛋白(BPI)、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、P-D-葡糖醛酸糖苷酶、a-甘露糖苷酶、磷脂酶A2、4-硫酸軟骨素、和蛋白酶3(例如參見HartwigJH,ThelenM,RosenA,JanmeyPA,NairnAC,AderemA.MARCKSisanactinfilamentcrosslinkingproteinregulatedbyproteinkinaseCandcalcium-calmodulin.Nature1992;356:618-622);次級(特異性)顆粒含有溶菌酶、乳鐵蛋白、膠原酶、補體激活物、磷脂酶A2、補體受體例如CR3、CR4、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體、層粘連蛋白受體、細胞色素bs58、單核細胞-趨化因子、組胺酶、和維生素B12結合蛋白；而小儲存顆粒含有明膠酶、纖溶酶原激活物、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、J3-D-葡糖醛酸糖苷酶、a-甘露糖苷酶和細胞色素bs58。中性粒細胞顆粒含有抗微生物或細胞毒性物質、中性蛋白酶、酸性水解酶和大量細胞質膜受體。在嗜天青顆粒成分中，髓過氧化物酶(MPO)是將過氧化氫轉化為次氯酸的關鍵酶。其與過氧化氫和鹵化物輔因子共同形成白細胞的有效殺微生物和細胞毒性機制一一髓過氧化物酶系統(tǒng)。防衛(wèi)素占嗜天青顆粒蛋白質的30至50%，它們是小分子的(分子量<4000)強抗微生物肽，對大量細菌、真菌和某些病毒具有細胞毒性。其毒性可能在于對耙細胞的膜通透作用，這類似于其他的通道形成蛋白(穿孔蛋白)。細菌通透性增加(BPI)蛋白是穿孔蛋白成員。其對革蘭氏陰性菌具有高度毒性，但對革蘭氏陽性菌或真菌則不具有，其也可中和內毒素，即革蘭氏陰性菌細胞被膜的毒性脂多糖成分。乳鐵蛋白螯合游離鐵，由此防止沒有被殺死的攝入的微生物的生長并增加細菌對溶菌酶的通透性。絲氨酸蛋白酶例如彈性蛋白酶和組織蛋白酶G水解細菌細胞被膜中的蛋白質。粒細胞彈性蛋白酶的底物包括膠原蛋白交聯(lián)物和蛋白聚糖，以及血管、韌帶和軟骨的彈性蛋白成分。組織蛋白酶D裂解軟骨蛋白聚糖，而粒細胞膠原酶可活躍裂解來自骨、軟骨和肌腱的I型膠原蛋白以及(程度稍低地)裂解III型膠原蛋白。膠原蛋白斷裂產(chǎn)物對中性粒細胞、單核細胞和成纖維細胞具有趨化活性。蛋白酶抑制劑例如a2-巨球蛋白和al-抗蛋白酶介導了溶酶體蛋白酶的組織破壞能力的調節(jié)。這些抗蛋白酶存在于血清和滑膜液中。它們通過結合并覆蓋蛋白酶的活性位點而起作用。蛋白酶-抗蛋白酶失衡在肺氣腫的發(fā)病機理中具有重要作用。嗜天青顆粒主要在細胞內環(huán)境中(在吞噬溶酶體空泡內)起作用，其中它們參與殺死并降解微生物。中性粒細胞特異性顆粒易于釋放其成分至細胞外，并在炎癥的起始方面發(fā)揮重要作用。特異性顆粒代表了細胞內儲備的各種質膜成分，包括細胞色素b(NADPH氧化酶的成分，該酶負責產(chǎn)生過氧化物)、補體片段iC3b(CR3、CR4)的受體、層粘連蛋白的受體、和甲酰甲硫氨酰-肽趨化因子。除其他之外，還有與組胺降解有關的組胺酶、維生素結合蛋白、以及負責形成纖溶酶并從C5裂解出C5a的纖溶酶原激活物。從對這些顆粒具有先天異常的一些患者的研究中抗清楚地看出中性粒細胞顆粒在炎癥中的重要性?；加蠧h6diak-Higashi綜合征的患者在建立炎癥應答的速度方面具有嚴重異常并具有異常巨大的溶酶體顆粒。這種先天性特異性顆粒缺陷綜合征是極其罕見的疾病，其特征為炎癥應答減低和皮膚和深部組織嚴重的細菌感染。盡管對調節(jié)這些顆粒的胞吐性分泌的機制僅有部分了解，但已經(jīng)鑒定了該過程中的一些關鍵性分子，包括細胞內Ca2+瞬變(Ca2+transients)(Richteretal.ProcNatlAcadSciUSA1990;87:9472—9476;Blackwoodetal.，BiochemJ1990;266:195-200)、G蛋白、酪氨酸和蛋白激酶(PK，特別是PKC)(Smolenetal.，BiochimBiophysActa1990;1052:133-142;Niessenetal.，Biochim.Biophys.Acta1994;1223:267-273;Naucleretal.，Pettersenetal.,Chest2002;121;142-150)、Rac2(Abdel畫Latifetal"Blood2004;104:832-839;Lacyetal.，JImmunol2003;170:2670-2679)和各種SNARE、SNAP和VAMP(Sollneretal"Nature1993;362:318-324;Lacy,PharmacolTher2005;107:358-376)。SNARE(可溶性N-乙基馬來酰亞胺附著蛋白受體)蛋白是一族膜相關性蛋白質，其特征為被稱為SNARE基序的cx-螺旋巻曲螺旋結構域(Lietal.，Cell.Mol.LifeSci.60:942-960(2003))。基于它們在囊泡上的位置和耙膜，這些蛋白質被分類為v-SNARE類和t-SNARE類；基于SNARE基序中心的保守性精氨酸或谷氨酰胺殘基的另一種分類方案將其分為R-SNARE類和Q-SNARE類。SNARE位于分泌和內吞交通途徑的分離的膜性腔室中，并促成細胞內膜融合過程的特異性。t-SNARE結構域由4個具有巻曲螺旋扭曲的螺旋束組成。SNARE基序促成兩個膜的融合。SNARE基序分為4類突觸融合蛋白la(t-SNARE)同源物、VAMP-2(v-SNARE)、以及SNAP-25的N-端和C-端SNARE基序。來自各類的一個成員可相互作用形成SNARE復合體。SNARE基序見于某些突觸融合蛋白家族成員例如突觸融合蛋白la的N-端結構域，其是神經(jīng)遞質釋放所必需的(Lermanetal.,Biochemistry39:8470-8479(2000))，andsyntaxin6,whichisfoundinendosomaltransportvesicles(Misuraetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:9184-9189(2002))。SNAP-25(突觸小體相關蛋白25kDa)蛋白是SNARE復合體的成分，其可造成膜融合的特異性并通過形成緊密復合體(SNARE復合體或軸心復合體(corecomplex))而直接實現(xiàn)融合，所述復合體將突觸囊泡與質膜帶到一起。SNARE構成一個大蛋白家族，這些蛋白質以稱為SNARE基序的60個殘基的序列為特征，所述基序高度傾向于形成巻曲螺旋且通常位于羧基端跨膜區(qū)域之前。突觸軸心復合體由4個SNARE基序形成(2個來自SNAP-25，來自突觸泡蛋白和突觸融合蛋白1的各一個)，它們在分離的情況下是松散的，但組裝后形成平行的4螺旋束。軸心復合體的晶體結構揭示所述螺旋束高度扭曲且表面含有若干鹽橋，并具有內部疏水性殘基層。復合體中心的極性層由3個谷氨酰胺(2個來自SNAP-25，一個來自突觸融合蛋白1)和一個精氨酸(來自突觸泡蛋白)形成(Rizoetal.,NatRevNeurosci3:641-653(2002))。SNAP-25家族的膜含有一簇半胱氨酸殘基，它們可被十六?；?，用于膜附著(Risingeretal.,J.Biol.Chem.268:24408-24414(1993))。中性粒細胞的主要作用是吞噬并破壞感染物。它們還可在獲得性(特異性)免疫應答出現(xiàn)之前限制某些微生物的生長。盡管中性粒細胞對于宿主防御是必需的，但也認為它們參與了多種慢性炎癥疾病的病理和缺血再灌注損傷。在從炎癥部位分離的液體中可檢測到來自中性粒細胞的水解性酶和氧化滅活的蛋白酶抑制劑。正常情況下，中性粒細胞可遷移至感染部位而不破壞宿主組織。不過，有時可出現(xiàn)有害的宿主組織損傷。這種損傷可通過多種獨立的機制發(fā)生。這些包括遷移過程中的提前活化，殺傷某些微生物的過程中毒性產(chǎn)物釋放至細胞外，作為組織重建的第一步將感染的或損傷的宿主細胞和碎片移除，或未能終止急性炎癥反應。缺血再灌注損傷與中性粒細胞進入受累組織并隨后活化有關。這可由被破壞的宿主細胞釋放的物質引發(fā)或者是通過黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的過氧化物所引起。在正常情況下，血液可含有正常的、初步活化的(primed)、活化的和衰竭的(spent)中性粒細胞。在炎癥部位主要是活化的和衰竭的中性粒細胞?；罨闹行粤＜毎a(chǎn)生活性氧中間體(ROI)。在急性細菌感染患者和成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者的血液中檢測到了具有旺盛呼吸爆發(fā)的中性粒細胞亞群。這是中性粒細胞矛盾現(xiàn)象的一個實例。中性粒細胞被認為參與了這一病癥的病理學，原因在于這些細胞大量進入肺部，且活化中性粒細胞所釋放的氧化劑和水解酶引起了相關的組織破壞。當ARDS加重時，由炎癥產(chǎn)物在局部誘導的中性粒細胞殺微生物活性的損害，可能是宿主方面的一種保護性反應。熱損傷的急性期也與中性粒細胞活化相關，隨后出現(xiàn)各種中性粒細胞功能的廣泛損害?；ひ褐械拿庖邚秃衔镆鸬闹行粤＜毎罨斐深愶L濕性關節(jié)炎的病理。中性粒細胞的慢性活化還可觸發(fā)腫瘤的發(fā)生，因為中性粒細胞產(chǎn)生的某些ROI破壞DNA，而蛋白酶促進腫瘤細胞遷移。在重度燒傷患者中，發(fā)現(xiàn)細菌感染的發(fā)生與抗體和補體受體陽性中性粒細胞的比例和絕對數(shù)降低之間的關聯(lián)性。還發(fā)現(xiàn)來自中性粒細胞的氧化劑氧化低密度脂蛋白(LDL)，使得后者更加有效地通過特異性清道夫受體而結合于巨噬細胞的質膜。這些氧化的LDL被巨噬細胞攝取后可引起動脈硬化。此外，在患有原發(fā)性高血壓、霍奇金病、炎性腸病、銀屑病、結節(jié)病和敗血病的患者中發(fā)現(xiàn)存在初步活化的中性粒細胞，其中的初步活化與高濃度的循環(huán)TNF-a(惡病質素)有關?？寡趸瘎┖涂沟鞍酌傅姆雷o作用失效后，可出現(xiàn)宿主組織的水解破壞和慢性炎癥疾病?？沟鞍酌溉毕荼徽J為可造成肺氣腫的病理學。多種抗蛋白酶是絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPIN)家族的成員。盡管血液循環(huán)中富含抗蛋白酶，但由于中性粒細胞粘附于其靶上，使得這些大分子蛋白質可能被選擇性排除在炎癥部位之外。氧化應激可通過將細胞外的抗蛋白酶濃度降低至低于抑制被釋放出的蛋白酶所需水平以下而起始組織破壞。含氯氧化劑和過氧化氫可滅活抗蛋白酶例如al-蛋白酶抑制劑和a2-巨球蛋白(它們是彈性蛋白酶的內源性抑制劑)，但同時激活潛伏的金屬蛋白酶例如膠原酶和明膠酶，它們則進一步造成抗蛋白酶的失活。中性粒細胞的細胞質組分還可能是產(chǎn)生特異性抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)的一個原因，ANCA與系統(tǒng)性血管炎和腎小球腎炎的發(fā)生密切相關。ANCA是針對主要位于中性粒細胞的嗜天青顆?；虺跫夘w粒內部的酶的抗體。ANCA有三種類型，通過在常規(guī)乙醇固定的中性粒細胞上進行間接免疫熒光檢測時它們所產(chǎn)生的模式可對其加以區(qū)分。彌漫性細顆粒狀細胞質熒光(cANCA)典型地見于韋格納肉芽腫、某些顯微鏡下多動脈炎和ChurgStrauss綜合征病例、以及新月體性和節(jié)段環(huán)死性腎小球腎炎的某些病例。靶抗原通常是蛋白酶3。核周型熒光(pANCA)見于顯微鏡下多動脈炎和腎小球腎炎的許多病例。這些抗體通常針對的是髓過氧化物酶，但其它的靶包括彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白、溶菌酶和(3-D-葡糖醛酸糖苷酶。稱為"不典型"ANCA的第三組包括中性粒細胞核熒光和一些少見的細胞質模式，而且盡管少數(shù)靶抗原與pANCA相同，但其它的抗原還未得到鑒定。三分之一的克羅恩病也出現(xiàn)pANCA。有關ANCA在類風濕性關節(jié)炎和SLE中的陽性率的報道差異性很大，但其模式主要是pANCA和不典型ANCA。嗜酸性粒細胞是終末分化的終末期白細胞，主要位于粘膜下組織并募集于特異性免疫應答(包括過敏性疾病)部位。嗜酸性粒細胞的細胞質含有大橢圓形顆粒，其具有電子致密性結晶核和部分通透性基質。除了這些大的初級晶體狀顆粒，還有另一種較小的(小顆粒)且缺乏晶體核的顆粒類型。嗜酸性粒細胞的大特異性顆粒含有至少四種不同的陽離子蛋白質主要堿性蛋白(MBP)、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)、嗜酸性粒細胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)、和嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)，它們對宿主細胞和微生物耙具有一系列生物學作用。嗜堿性粒細胞所含的主要堿性蛋白相對于嗜酸性粒細胞的四分之一，其還含有可檢測量的EDN、ECP禾tlEPO。中性粒細胞中也有少量的EDN禾口ECP(GleichGJ.Mechanismsofeosinophil-associatedinflammation.JAllergyClinImmunol2000;105:651-663)。MBP似乎是缺乏酶活性但具有高度陽離子性的多肽，其可通過與脂質膜相互作用使之紊亂而施加其毒性活性。MBP和EPO均可作為結合M2毒蕈堿受體的激動劑的選擇性別構抑制劑。這些蛋白質可造成M2受體功能紊亂并在哮喘中加重迷走介導的支氣管收縮。EDN可特異性破壞神經(jīng)元的髓磷脂鞘。嗜酸性粒細胞的大特異性顆粒還具有組胺酶和多種水解性溶酶體酶。嗜酸性粒細胞小顆粒內的酶包括芳基硫酸酯酶、酸性磷酸酶、和一種92kDa的金屬蛋白酶，即明膠酶。嗜酸性粒細胞可產(chǎn)生細胞因子，.包括那些對嗜酸性粒細胞具有潛在自分泌生長因子活性的細胞因子以及那些在急性和慢性炎癥反應中具有潛在作用的細胞因子。三種細胞因子對嗜酸性粒細胞具有生長因子活性粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-3和IL-5。由人嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的在急性和慢性炎癥反應中可能具有活性的其它細胞因子包括IL-l-a、IL-6、IL-8、TNF-a和兩種轉化生長因子TGF-a和TGF-p。嗜酸細胞含有晶體狀顆粒，其含有MBP、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、EPO、和嗜酸性粒細胞衍生的神經(jīng)毒素(Gleich,JAllergyClinImmunol2000;105:651-663)。人早幼粒細胞細胞系HL-60克隆15可由于檢測EPO的分泌。該細胞系是這樣建立的，先將一株HL-60在高pH下生長2個月(Fischkoff,LeukRes1988;12:679-686)，然后以丁酸處理使細胞分化，以便其展現(xiàn)出外周血嗜酸性粒細胞的特征，包括表達嗜酸性粒細胞特異性顆粒蛋白(Rosenbergetal.，JExpMed1989;170:163-176;Tiffanyetal.,JLeukocBiol541995;58:49-54;Badewaetal.,ExpBiolMed2002;227:645-651)。嗜酸細胞可參與超敏反應，特別是通過兩種脂質炎癥介質，即白三烯C4(LTC"和血小板活化因子(PAF)。這兩種介質均收縮氣道平滑肌、促迸粘液分泌、改變血管通透性并引起嗜酸性粒細胞和中性粒細胞侵潤。除了這些嗜酸性粒細胞衍生的介質的直接活性，MBP還可刺激嗜堿性粒細胞和肥大細胞釋放組胺，而MBP可刺激肥大細胞釋放EPO。嗜酸性粒細胞可作為特異性脂質介質的局部來源并誘導肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介質。在類似于中性粒細胞顆粒的刺激物的刺激下嗜酸性粒細胞顆粒成分可被釋放，例如在吞噬被調理的顆粒過程中或者由趨化因子刺激。中性粒細胞溶酶體酶主要作用于吞噬溶酶體中所吞入的物質，而嗜酸性粒細胞顆粒成分主要作用于細胞外靶結構例如寄生蟲和炎癥介質。單核細胞和巨噬細胞在骨髓中發(fā)育并經(jīng)歷如下階段干細胞；定向干細胞；原單核細胞；幼單核細胞；骨髓中的單核細胞；外周血中的單核細胞；和組織中的巨噬細胞。單核細胞在骨髓中快速分化(1.5至3天)。分化過程中在單核細胞細胞質中形成顆粒，可按照中性粒細胞那樣將其分為至少兩類。不過，它們要少于和小于其中性粒細胞的對應物(嗜天青顆粒和特異性顆粒)。它們的酶成分相似。單核細胞/巨噬細胞的顆粒結合型酶包括溶菌酶、酸性磷酸酶和P-葡糖醛酸糖苷酶。作為體內研究模型，使用的是來自U937細胞的溶菌酶分泌。該細胞系衍生自人組織細胞型淋巴瘤，并已經(jīng)用作單核細胞細胞系，其可被多種激動劑活化，例如PMA(Hoffetal.，JLeukocBiol1992;52:173-182;Balboaetal"JImmunol2003;170:5276-5280;Simdstrometal.，IntJCancer1976;17:565-577)。天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性淋巴細胞含有強效細胞毒顆粒，包括穿孔素(一種孔道形成蛋白)和粒酶(淋巴細胞特異性絲氨酸蛋白酶)。例如，NK-92細胞系是IL-2-依賴性人細胞系，其建立自一名快速進展型非霍奇金淋巴瘤患者(GongJH.，MakiG，KlingemannHG.Characterizationofahumancellline(NK-92)withphenotypicalandfunctionalcharacteristicsofactivatednaturalkillercells.Leukemia1994;8:652-658)。NK-92細胞表達高水平的參與針對多種惡性細胞的穿孔素-粒酶細胞毒途徑的分子(Gongetal,videinfra，andMakiG,KlingemannHG，MartinsonJA，TamYK.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.JHematotherStemCellRes2001;10:369-383)。粒酶是由細胞毒T細胞和天然殺傷細胞內的細胞質顆粒釋放的外源性絲氨酸蛋白酶。粒酶可誘導感染病毒的細胞發(fā)生凋亡，由此將其破壞。粒細胞(或白細胞)向細胞外釋放炎癥介質(炎性介質)以及粒細胞(或白細胞)向細胞外釋放多于一種的炎癥介質(炎性介質)在本文中有時被稱為脫顆粒。在優(yōu)選的實施方式中，釋放炎癥介質包括從位于粒細胞或白細胞內部的顆粒中釋放所述介質。釋放炎癥介質優(yōu)選地是從這些顆粒釋放炎癥介質。經(jīng)促炎因子(炎癥刺激物)例如TNFa初步刺激后，嗜中性粒細胞和巨噬細胞顯著增加其MARCKS蛋白的合成中性粒細胞應答于TNFa或脂多糖(LPS)而合成的新的蛋白質中有多達90%是MARCKS(ThelenM，RosenA，NairnAC,AderemA.Tumornecrosisfactoralphamodifiesagonist-dependentresponsesinhumanneutrophilsbyinducingthesynthesisandmyristoylationofaspecificproteinkinaseCsubstrate.ProcNatlAcadSciUSA1990;87:5603-5607)。因此，當含顆粒細胞(例如中性粒細胞和巨噬細胞)受到激動劑(特別是那些通過活化PKC而起作用的激動齊U)刺激時，MARCKS可能在隨后的炎癥介質釋放過程中發(fā)揮重要的作用(Burgoyneetal.,PhysiolRev2003;83:581-632;Loganetal.JAllergyClinImmunol2003;111:923-932;Smolenetal.，BiochimBiophysActa1990;1052:133-142;Niessenetal.，Biochim.Biophys.Acta1994;1223:267-273;Naucleretal.,JLeukocBiol2002;71:701-710)。在本發(fā)明的一個方面，將在此所述的脫顆粒抑制量的MANS肽或其活性片段施用至對象的炎癥部位(所述炎癥部位是對象的所述炎癥部位出現(xiàn)疾病、病癥、創(chuàng)傷、外來物侵入及其組合而造成的)，所述施用可降低炎癥部位侵潤性白細胞釋放的炎癥介質的量，其中白細胞優(yōu)選地是粒細胞。施用MANS肽和/或其至少一種活性片段可降低侵潤至炎癥部位內的白細胞如粒細胞所釋放的炎癥介質的量。脫顆粒抑制量的MANS肽或脫顆粒抑制量的其活性片段足以降低或抑制從侵潤至所述部位的炎性細胞內所含的顆粒中胞吐釋放炎癥介質。在施用MANS肽或其活性片段之后的某一時間測定脫顆粒抑制功效，這可通過比較所述細胞(白細胞或粒細胞或其它炎性細胞)釋放的炎癥介質相對于在缺乏所述MANS肽和/或缺乏其活性片段的情況下在大致相同的時間所釋放或產(chǎn)生的所述炎癥介質的水平或量或濃度的抑制百分數(shù)(即，降低的百分數(shù))而進行測定。此外，本領域人員可通過測定已知可作為該疾病的指征的癥狀或炎癥參數(shù)而確定該組織部位的炎癥是否已經(jīng)降低，以便確定是否已經(jīng)施用了足夠的或治療有效量的MANS肽和/或其活性片段。足夠的脫顆粒抑制量是指，與在缺乏所述MANS肽或其活性片段的情況下在相同條件下測定到的從所述粒細胞釋放的所述炎癥介質的量相比，該脫顆粒抑制量使得炎癥部位處的粒細胞所釋放的炎癥介質減少的百分數(shù)為大約1%至大約99%，優(yōu)選地5%至大約99%，更優(yōu)選地大約10%至大約99%，甚至更優(yōu)選地大約25%至99%，以及甚至更優(yōu)選地大約50%至大約99%。在本發(fā)明的一個方面，將脫顆粒抑制量的MANS肽施用至動物的炎癥刺激部位(該炎癥刺激部位是通過將炎癥刺激量的炎癥剌激物施用至所述部位而產(chǎn)生的)，所述施用可使得由位于所述炎癥刺激部位處的經(jīng)所述炎癥刺激物刺激的粒細胞所釋放的炎癥介質的量，與在存在相同的炎癥刺激量的所述炎癥刺激物但缺乏MANS肽的情況下從所述粒細胞釋放的所述炎癥介質的量相比，減少大約1%至大約99%，優(yōu)選地5%至大約99%，更優(yōu)選地大約10%至大約99%，甚至更優(yōu)選地大約25%至99%，以及甚至更優(yōu)選地大約50%至大約99%。在本發(fā)明的另一個方面，將脫顆粒抑制量的MANS肽施用至動物的炎癥刺激部位(所述炎癥刺激部位是通過給所述部位施用炎癥刺激量的炎癥刺激物而產(chǎn)生的)，使得位于所述炎癥刺激部位處的經(jīng)所述炎癥刺激物剌激的粒細胞釋放的炎癥介質的量，與在存在相同的炎癥刺激量的炎癥剌激物但缺乏MANS肽的情況下從所述粒細胞釋放的所述炎癥介質的量相比，減少100%。本文體外實施例所使用的炎癥刺激物的實例是(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)。在嗜堿性粒細胞脫顆粒釋放組胺方面，單核細胞化學引誘蛋白(MCP-1)幾乎與C5a同樣有效，且大大強于IL-8。以趨化因子(即，化學引誘細胞因子)、RANTES和MIP-1刺激后可引起組胺釋放。在優(yōu)選的實施方式中，相對于炎癥刺激部位處的MARCKS肽的基礎濃度，施用于動物炎癥刺激部位處的脫顆粒抑制量的MANS肽是所述炎癥刺激部位處MARCKS肽濃度的大約l倍至大約l，OOO,OOO倍，優(yōu)選地是所述炎癥刺激部位處MARCKS肽濃度的大約l倍至大約100,000倍，更優(yōu)選地是所述炎癥剌激部位處MARCKS肽濃度的大約l倍至大約10,000倍，甚至更優(yōu)選地是所述炎癥刺激部位處MARCKS肽濃度的大約l倍至大約1,000倍，甚至更優(yōu)選地是所述炎癥刺激部位處MARCKS肽濃度的大約1倍至大約100倍，以及甚至更優(yōu)選地是所述炎癥刺激部位處MARCKS肽濃度的大約1倍至大約10倍。在優(yōu)選的實施方式中，粒細胞位于動物(優(yōu)選地是人)的氣道上或氣道內，且通過吸入施用MANS肽，例如吸入包含MANS肽的藥物組合物，例如包含MANS肽和水性溶液的藥物組合物，所述組合物以氣溶膠的形式施用，或是包含干粉形式的MANS肽的藥物組合物，所述組合物通過干粉噴霧吸入器施用。也可使用本領域已知的用于通過吸入而施用溶液或干粉的其它方法和裝置，例如小滴、噴霧劑和噴霧器。在一些實施方式中，有可能本發(fā)明的肽可阻斷具有生理學重要性的分泌過程，包括基礎分泌功能。盡管無意于受到本發(fā)明的任何具體理論的限制，但認為調節(jié)基礎分泌的機制不同于調節(jié)刺激型分泌的機制?；蛘撸A分泌機制需要的MARCKS蛋白可能少于刺激型分泌。由于所有阻斷MARCKS介導的分泌的治療均不會使得MARCKS功能完全消失，因此基礎分'泌得以保留。在本文中，術語"MARCKS核苷酸序列"指的是衍生自編碼MARCKS蛋白的基因的任何核苷酸序列，包括，例如，DNA或RNA序列、所述基因的DNA序列、任何轉錄的RNA序列、前體mRNA或mRNA轉錄本的RNA序列和結合于蛋白質的DNA或RNA。精確輸送MARCKS-阻斷肽也可克服任何阻斷重要分泌過程的潛在局限性。采用吸入型配制品可容易地將此類藥物輸送至呼吸道。由于這些藥物可用于治療炎性腸病，因此可以預期通過灌腸或栓劑將這些阻斷劑輸送至直腸/結腸/小腸內。關節(jié)內注射或經(jīng)皮輸送至發(fā)炎的關節(jié)內可通過減少局部炎性細胞的分泌而使得關節(jié)炎或自身免疫病患者緩解。注射至神經(jīng)末梢周圍區(qū)域可抑制某些類型的神經(jīng)遞質的分泌，阻斷嚴重疼痛的傳遞或頑固性肌肉痙攣。采用本領域已知的各種表面用配制品可容易地輸送所述肽用于治療炎性皮膚病。認為MARCKS與細胞質內的肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，因此有可能將所述顆粒束縛(tether)于細胞收縮機制上，由此介導隨后的顆粒運動和胞吐作用。通過活化PKC和PKG可使得炎癥介導性MPO自中性粒細胞的分泌被最大化。MARCKS有可能充當了這兩種控制自炎性細胞的膜結合型腔室的分泌(即，自中性粒細胞分泌MPO)的蛋白激酶之間協(xié)調作用的交匯點。本發(fā)明證實，同時活化PKC和PKG使得犬或人的中性粒細胞炎癥介質MPO的分泌被增強，而任何一種激酶獨自活化均不足以誘導最大的分泌應答。文獻報道在NHBE細胞中以及如本申請在中性粒細胞中所證實的，PMA單獨即可增強分泌應答，不過應答的幅度遠低于他人在大鼠杯狀細胞系中所觀測到的程度。見Abdullahetal，見上。此外，盡管以前報道了cGMP類似物可誘導培養(yǎng)的豚鼠氣管上皮細胞顯著分泌粘蛋白(Fischer"a/.,見上)，但要注意到這一應答直到暴露8小時才達到顯著水平。具有如此之長的滯后期的分泌應答不太可能是一種直接的結果，而很可能是涉及了蛋白質的從頭合成，而非事先合成并儲存的細胞質顆粒的釋放。如上所述，本發(fā)明可用于藥物配制品中。在特定的實施方式中，藥物產(chǎn)品存在于適合于口服的固體藥物組合物中?？尚纬杀景l(fā)明的固體物質組合物并與賦形劑混合和/或以其稀釋。固體物質組合物還可置于載體中，例如其可以是膠囊、藥囊、片劑、'紙或者其它容器。如果賦形劑用作稀釋劑，其可以是固體、半固態(tài)或者液體物質，充當物質組合物的載具、載體、或基質。各種合適的賦形劑是本領域人員已知的并可參見7V加'o"a/Formw/a^，19:2404-2406(2000)，將其中的2404至2406頁的全部內容并入本文。合適的賦形劑的實例包括，但不限于，淀粉、阿拉伯樹膠、硅酸鈣、微晶纖維素、甲基丙烯酸鹽、蟲膠、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、和甲基纖維素。藥物產(chǎn)品配制品可額外含有潤滑劑例如滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑,-乳化劑和混懸劑；防腐劑例如羥苯甲酯和羥苯丙酯；甜味劑；或調味劑。還可使用多元醇、緩沖劑和惰性填料。多元醇的實例包括，但不限于，甘露醇、山梨醇、木糖醇、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、右旋糖等等。合適的緩沖劑包括，但不限于，磷酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽等等。可使用的其它惰性填料包括本領域已知的且可用于制備各種劑型的那些惰性填料。如果需要，固體配制品可包括其它成分例如填充劑和/或粒化劑等等。通過本領域己知的方法，本發(fā)明的藥物產(chǎn)品可被配制為使其在施用于患者后能夠活性成分的迅速釋放、緩釋或控釋。為了形成口服片劑，可通過直接壓片法制備本發(fā)明的物質組合物。該方法中，活性藥物成分可與以下物質混合固體粉狀載體，例如乳糖、蔗糖、59山梨醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素衍生物或明膠、及其組合；以及抗磨劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸牽丐、和聚乙二醇蠟類。然后可使用具有合適的沖床和模具的機械將混合物壓制為片劑以獲得所需的片劑大小。本領域人員可選擇機械的操作參數(shù)。或者，可通過濕化造粒方法形成口服片劑?；钚运幬锍煞挚膳c賦形劑和/或稀釋劑混合。固體物質經(jīng)研磨或過篩得到所需的粒徑。將粘合劑加至藥物中A粘合劑。粘合劑可在合適的溶劑中懸浮并均質化?；钚猿煞趾洼o料也可與粘合劑溶液混合。用溶液將所得干混合物均勻濕化。濕化通常導致顆粒輕度聚集，然后將所得物質通過具有所需孔徑的不銹鋼篩。然后將混合物在控制型干燥單元內干燥預定長度的時間，以便達到所需的粒徑和稠度。干燥混合物的顆粒過篩以除去粉末?？上蚧旌衔镏屑尤氡澜鈩?、抗磨劑、和/或抗粘附劑。最后，使用具有合適的沖床和模具的機械將混合物壓制為片劑以獲得所需的片劑大小。本領域人員可選擇機械的操作參數(shù)。如果需要包衣片劑，可對上述制備的片心進行包衣，這可使用糖或者纖維素聚合物的濃縮溶液，其可含有阿拉伯樹膠、明膠、滑石粉、二氧化鈦、或使用溶解于揮發(fā)性有機溶劑或溶劑混合物中的漆。對此包衣，可加入各種染料以便區(qū)分具有不同活性化合物或者具有不同量的活性化合物的片劑。在一個具體實施方式中，活性成分存在于片心中，其外面包有一或多個層次，包括腸溶包衣層?？芍苽滠浢髂z膠囊，其中含有活性成分和植物油的混合物。硬明膠膠囊可含有活性成分顆粒以及固體粉狀載體，例如，乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、支鏈淀粉、纖維素衍生物、和/或明膠?？芍苽涮菨{或混懸液形式的口服液體制劑，例如，含有活性成分、糖、和乙醇、水、甘油、和丙二醇的混合物的溶液。如果需要，此類液體制劑可包括一或多種以下成分著色劑、調味劑、和糖精。還可使用增稠劑例如羧甲基纖維素。如果上述藥物用于胃腸外施用，所述配制品可包括無菌水性注射液、非水性注射液、或者兩者，它們包含本發(fā)明的物質組合物。如果制備水性注射液，物質組合物可以是水溶性藥用可接受的鹽的形式。胃腸外制劑可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和溶質，后者使得制劑與使用對象的血液等滲。水性和非水性無菌混懸液可包含混懸劑和增稠劑。所述配制品可置于單位劑量200780035710.6說明書第55/87頁或多劑量容器內，例如密封安瓿和小管內。可使用上述各種無菌粉劑、顆粒和片劑制備當場使用的注射液和混懸液。物質組合物也可被配制為適合用于局部施用(例如，皮膚霜劑)。這些配制品可含有各種本領域人員已知的賦形劑。合適的賦形劑可包括，但不限于，十六烷基酯蠟、鯨蠟醇、白蠟、單硬脂酸甘油酯、丙二醇、單硬脂酸鹽、硬脂酸甲酯、苯甲醇、十二烷基硫酸鈉、丙三醇、礦物油、水、卡波姆、乙醇、丙烯酸酯粘合劑、聚異氰酸酯粘合劑、和硅酮類粘合劑。在優(yōu)選的實施方式中，肽片段公開于表2，它們的長度為至少4至23個氨基酸殘基并具有與MANS肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中肽的N-端氨基酸選自MANS肽序列(SEQIDNO:l)的位置2至21。更加優(yōu)選的肽片段長度為至少6個氨基酸至23個氨基酸。優(yōu)選地，這些肽的N-端a氨基酸被?；?，更優(yōu)選地，這些肽的a-N-端氨基酸位置是豆蔻?；摹?肽編號序列序列號肽3AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA'SEQIDNO:肽5AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVSEQIDNO:5肽8AQFSKTAAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:8肽12AGFSKTAAKGEAAAERPGEASEQIDNO:12肽17AQFSKTAAKGEAAAERPGESEQIDNO:17肽23AQFSKTAAKGEAAAERPGSEQIDNO:23肽30AQFSKTAAKGEAAAERPSEQIDNO:30肽38AQFSKTAAKGEAAAERSEQ工DNO:38肽47AQFSKTAAKGEAAAESEQIDNO:47肽57AQFSKTAAKGEAAASEQIDNO:57肽68AQFSKTAAKGEAASEQIDNO:68肽80AQFSKTAAKGEASEQ工DNO:80肽93AQFSKTAAKGESEQIDNO:93肽107AQFSKTAAKGSEQIDNO:107肽122AQFSKTAAKSEQIDNO:122肽138AQFSKTAASEQIDNO:138肽155AQFSKTASEQIDNO:155肽173AQFSKTSEQIDNO:173月太192AQFSKSEQIDNO:192膚212AQFSSEQIDNO:212肽6QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVASEQIDNO:6肽9QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVSEQIDNO:9肽13QFSKTAAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:13肽18GFSKTAAKGEAAAERPGEASEQIDNO:18肽24QFSKTAAKGEAAAERPGESEQIDNO:24QFSKTAAKGEAAAERPGSEQ工DNO:31QFSKTAAKGEAAAERPSEQIDNO:39QFSKTAAKGEAAAERSEQIDNO:48QFSKTAAKGEAAAESEQIDNO:58QFSKTAAKGEAAASEQIDNO:69QFSKTAAKGEAASEQIDNO:81QFSKTAAKGEASEQ工DNO:94QFSKTAAKGESEQIDNO:108QFSKTAAKGSEQ工DNO:123QFSKTAAKSEQIDNO:139QFSKTAASEQIDNO:156GFSKTASEQIDNO:174QFSKTSEQIDNO:193QFSKSEQ工DNO:213FSKTAAKGEAAAERPGEAAVASEQIDNO:10FSKTAAKGEAAAERPGEAAVSEQ工DNO:14FSKTAAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:19FSKTAAKGEAAAERPGEASEQIDNO:25FSKTAAKGEAAAERPGESEQIDNO:32FSKTAAKGEAAAERPGSEQ工DNO:40FSKTAAKGEAAAERPSEQIDNO:49FSKTAAKGEAAAERSEQIDNO:59FSKTAAKGEAAAESEQIDNO:70FSKTAAKGEAAASEQIDNO:82FSKTAAKGEAASEQIDNO:95FSKTAAKGEASEQIDNO:109FSKTAAKGESEQIDNO:124FSKTAAKGSEQIDNO-140FSKTAAKSEQIDNO:157FSKTAASEQIDNO:175FSKTASEQ工DNO:194FSKTSEQIDNO:214SKTAAKGEAAAERPGEAAVASEQIDNO:15SKTAAKGEAAAERPGEAAVSEQIDNO-20SKTAAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:26SKTAAKGEAAAERPGEASEQIDNO:33SKTAAKGEAAAERPGESEQIDNO:41SKTAAKGEAAAERPGSEQIDNO:50SKTAAKGEAAAERPSEQIDNO:60SKTAAKGEAAAERSEQIDNO:71SKTAAKGEAAAESEQ工DNO:83SKTAAKGEAAASEQIDNO:96SKTAAKGEAASEQIDNO:110SKTAAKGEASEQIDNO:125SKTAAKGESEQ工DNO;141SKTAAKGSEQIDNO:1588396433940754*4051819889114023579104952099025024579-1506310013612453345689111111211123445789111111212234567891111汰汰汰汰汰汰汰汰汰汰汰汰汰汰太汰汰太太太汰太太太太太太太太汰汰汰太太汰太太太太太太太太太太太月太176SKTAAKSEQIDNO:176欣195SKTAASEQIDNO:195月太215SKTASEQ工DNO:215肽21KTAAKGEAAAERPGEAAVASEQ工DNO:21肽27KTAAKGEAAAERPGEAAVSEQIDNO:27肽34KTAAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:34肽42KTAAKGEAAAERPGEASEQIDNO:42肽51KTAAKGEAAAERPGESEQIDNO:51肽61KTAAKGEAAAERPGSEQIDNO:61肽72KTAAKGEAAAERPSEQIDNO:72肽84KTAAKGEAAAERSEQIDNO:84肽97KTAAKGEAAAESEQIDNO:97肽lllKTAAKGEAAASEQIDNO:111膚126KTAAKGEAASEQIDNO:126肽142KTAAKGEASEQIDNO:142肽159KTAAKGESEQIDNO:159月太177KTAAKGSEQIDNO:177月太196KTAAKSEQIDNO:196妝216KTAASEQIDNO:216肽28TAAKGEAAAERPGEAAVASEQIDNO:28肽35TAAKGEAAAERPGEAAVSEQ工DNO:35肽43TAAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:43'肽52TAAKGEAAAERPGEASEQIDNO:52肽62TAAKGEAAAERPGESEQIDNO:62肽73TAAKGEAAAERPGSEQIDNO:73肽85TAAKGEAAAERPSEQIDNO:85肽98TAAKGEAAAERSEQIDNO:98肽112TAAKGEAAAESEQIDNO:112妝127TAAKGEAAASEQIDNO:127肽143TAAKGEAASEQIDNO:143肽160TAAKGEASEQIDNO:160肽178TAAKGESEQIDNO:178肽197TAAKGSEQ工DNO:197膚217TAAKSEQIDNO:217肽36AAKGEAAAERPGEAAVASEQIDNO:36肽44AAKGEAAAERPGEAAVSEQIDNO:44肽53AAKGEAAAERPGEAASEQIDNO:53肽63AAKGEAAAERPGEASEQ工DNO:63肽74AAKGEAAAERPGESEQIDNO:74肽86AAKGEAAAERPGSEQIDNO:86肽99AAKGEAAAERPSEQ工DNO:99肽113AAKGEAAAERSEQIDNO:113妝128AAKGEAAAESEQIDNO:128月太144AAKGEAAASEQ工DNO:144肽161AAKGEAASEQ工DNO:161妝179AAKGEASEQIDNO:17963<image>imageseeoriginaldocumentpage64</image>肽202EAAAESEQIDNO:202肽222EAAASEQIDNO:222肽91AAAERPGEAAVASEQIDNO:91月太104AAAERPGEAAVSEQIDNO:104膚118AAAERPGEAASEQIDNO:118肽133AAAERPGEASEQIDNO:133肽149AAAERPGESEQIDNO:149肽166AAAERPGSEQIDNO:166肽184AAAERPSEQIDNO:184月太203AAAERSEQIDNO:203肽223AAAESEQIDNO:223肽105AAERPGEAAVASEQIDNO:105肽119AAERPGEAAVSEQIDNO:119肽134AAERPGEAASEQIDNO:134肽150AAERPGEASEQIDNO:150肽167AAERPGESEQIDNO:167肽185AAERPGSEQIDNO:185肽204AAERPSEQIDNO:204肽224AAERSEQIDNO:224肽120AERPGEAAVASEQ工DNO:120肽135AERPGEAAVSEQIDNO:135月太151AERPGEAASEQIDNO:151月太168AERPGEASEQIDNO:168肽186AERPGESEQIDNO:186肽205AERPGSEQIDNO:205妝225AERPSEQ工DNO:225肽136ERPGEAAVASEQIDNO:136肽152ERPGEAAVSEQIDN〇152欣169ERPGEAASEQIDNO:169膚187ERPGEASEQIDNO:187肽206ERPGESEQIDNO:206肽226ERPGSEQIDNO:226肽153RPGEAAVASEQIDNO:153肽170RPGEAAVSEQIDNO:170膚188RPGEAASEQIDNO:188妝207RPGEASEQIDNO:207妝227RPGESEQIDNO:227妝171PGEAAVASEQIDNO:171肽189PGEAAVSEQIDNO:189肽208PGEAASEQIDNO:208妝228PGEASEQ■IDNO:228肽190GEAAVASEQIDNO:190肽209GEAAVSEQIDNO:209月太229GEAASEQIDNO:229肽210EAAVASEQIDNO:210肽230EAAVSEQIDNO:230肽231aavaseqidno:231參見圖5，MARCKS被PKC磷酸化并隨后從膜轉移至細胞質。在此，PKG似乎誘導MARCKS去磷酸化(圖2A，泳道4，和圖2B)。這一去磷酸化作用被PKG抑制劑Rp-8-Br-PET-CGMP逆轉(圖2A，泳道5)，提示去磷酸化是特異性地PKG-依賴性的。參見圖2，用["P]正磷酸鹽標記NHBE細胞然后暴露于指定試劑。通過免疫沉淀測定法分析MARCKS應答于上述處理的磷酸化情況。參見圖2A，8-Br-cGMP逆轉了PMA誘導的MARCKS磷酸化，而8-Br-cGMP的這種效應可被Rp-8-Br-PET-cGMP(PKG抑制劑)或崗田酸(PP1/2A抑制劑)阻斷。參見圖2B，PMA-誘導的MARCKS磷酸化因細胞隨后暴露于8-Br-cGMP而逆轉。泳道1，單獨培養(yǎng)基處理8分鐘；泳道2，100nMPMA處理3分鐘；泳道3，100nMPMA處理3分鐘隨后1pM8-Br-cGMP處理5分鐘；泳道4，100nMPMA處理8分鐘；泳道5，單獨培養(yǎng)基處理3分鐘隨后100nMPMA+1pM8-Br-cGMP處理5分鐘。參見圖2C，福司曲星(fostriecin)以濃度依賴性方式減弱了8-Br-cGMP-誘導的MARCKS去磷酸化。認為PKG通過活化蛋白磷酸酶而去磷酸化MARCKS。參見圖2A(泳道6)，500nM的崗田酸(該濃度可同時抑制PP1和PP2A)阻斷了PKG-誘導的MARCKS去磷酸化，提示PKG通過活化PP1和/或PP2A引起去磷酸化。使用福司曲星和直接測定磷酸酶活性的進一步研究指出，僅PP2A被PKG活化并造成MARCKS的磷酸基團被移除(圖2C)。很可能是崗田酸或者福司曲星(以抑制PKG-誘導的MARCKS去磷酸化的濃度)減弱了PMA+8-Br-cGMP或UTP誘導的粘蛋白分泌(圖3)。圖3有助于證實PP2A是粘蛋白分泌途徑的必需成分。NHBE細胞與指定濃度的福司曲星、崗田酸(500nM)或僅培養(yǎng)基預溫育15分鐘隨后用PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1jiM)剌激15分鐘或用UTP(100nM)刺激2h。ELISA測定分泌的粘蛋白。數(shù)據(jù)表示為平均值.+/-.8衛(wèi).(各點n=6)，其中*代表顯著區(qū)別于培養(yǎng)基對照(p<0.05);卞代表顯著區(qū)別于PMA+8-Br-cGMP刺激(pO.05);而J代表顯著區(qū)別于UTP刺激(p〈0.05)。因此，PKG-活化的PP2A對MARCKS的去磷酸化似乎是導致粘蛋白顆粒胞吐作用的信號途徑的必需成分。為了揭示MARCKS通過哪些分子事件將激酶活化與粘蛋白分泌聯(lián)系在一起，對應答于PKC/PKG活化的MARCKS磷酸化進行了深入研究。參見圖1A，PMA(100nM)可在NHBE細胞中引起MARCKS磷酸化顯著增加(3至4倍)，而這一磷酸化作用被PKC抑制劑抑激酶素C(500nM)減弱。一旦被磷酸化，MARCKS即從質膜轉移至細胞質(圖1B)。更具體地，圖1A顯示PKC的活化導致NHBE細胞內的MARCKS磷酸化。用["P]正磷酸鹽標記細胞2h隨后暴露于剌激性和/或抑制性試劑。通過如上所述的免疫沉淀分析應答于處理的MARCKS磷酸化情況。泳道1，培養(yǎng)基對照；泳道2，載體，0.1%Me.sub.2SO;泳道3，100nM4a-PMA;泳道4，100nMPMA;泳道5，100nMPMA+500nM抑激酶素C;泳道6，500nM抑激酶素C。圖1B證實磷酸化的MARCKS從質膜轉移至細胞質。"P-標記的細胞被暴露于PMA(100nM)或僅培養(yǎng)基5分鐘，隨后分離膜和細胞質級份。8-Br-cGMP(1^M)造成的PKG活化(這是促使粘蛋白分泌所需的另一激酶活化事件)，沒有導致MARCKS磷酸化，事實上卻觀察到了相反的作用PMA誘導的MARCKS磷酸化被8-Br-cGMP逆轉(圖2A)。8-Br-cGMP的這種作用并非是由于抑制了PKC的活性，因為PMA-誘導的磷酸化能夠被隨后添加給細胞的8-Br-cGMP逆轉(圖2B)。因此，PKG活化很可能導致MARCKS去磷酸化。進一歩的研究證實了PKG-誘導的MARCKS去磷酸化被500nM崗田酸阻斷，后者是蛋白磷酸酶(1和/或2A型(PP1/2A》抑制劑(圖2A，泳道6)。因此，似乎這一去磷酸化作用是PP1和/或PP2A介導的。為了確定所涉及的蛋白磷酸酶的亞型，除了磷酸化研究以外，還使用了一種新的特異性更高的PP2A抑制劑，即福司曲星(IC5()=3.2nM)。參見圖2C，福司曲星以濃度依賴性方式(1-500nM)抑制PKG-誘導的MARCKS去磷酸化，提示PKG通過活化PP2A誘導去磷酸化。為了進一步證實PKG在NHBE細胞內活化PP2A，將細胞暴露于8-Br-cGMP，之后測定了胞漿的PP1和PP2A活性。在8-Br-cGMP的濃度低達O.l]LiM的情況下，PP2A活性仍升高近3倍(從0.1到0.3nmol/min/mg蛋白質，p<0.01)，而PP1活性保持不變。這些數(shù)據(jù)說明，PP2A可被PKG活化并造成MARCKS去磷酸化。因此，該PP2A活性對于粘蛋白分泌似乎是至關重要的；當PKG-誘導的MARCKS去磷酸化被崗田酸或福司曲星阻斷，應答于PKC/PKG活化或UTP剌激的分泌得以改善(圖3)。MARCKS與細胞質中的肌動蛋白和肌球蛋白相結合圖4所示為放射性標記的免疫沉淀測定法，其揭示MARCKS可與細胞質內的其他兩種蛋白質(約200和約40kDa)相結合。參見圖4，NHBE細胞用[3司亮氨酸和[3司脯氨酸標記過夜，按照"實驗方法"所述制備膜和細胞質級份。用非免疫對照抗體(6F6)對分離的級份進行預清理(predear)。細胞質被等分為兩份用于免疫沉淀，在存在10松胞菌素D(Biomol,PlymouthMeeting,Pa.)的條件下進行，分別使用抗-MARCKS抗體2F12(泳道2)和非免疫對照抗體6F6(泳道3)。還使用抗體2F12通過免疫沉淀評價了膜級份內的MARCKS蛋白(泳道1)。通過8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離沉淀的蛋白質復合物并通過增強的放射自顯影來觀察。MARCKS似乎與分子量分別為大約200kDa和大約40kDa的兩種細胞漿蛋白相結合。將這兩種MARCKS-結合型蛋白質從凝膠上切下并通過基質輔助激光解吸離子化/飛行時間質譜/內部觀!l序(matrix-assistedlaserdesorptionionization/timeofflightmassspectrometry/internalsequencing)(Protein/DNATechnologyCenterofRockefellerUniversity,N.Y.)進行分析。利用所獲得的肽質量和序列數(shù)據(jù)，通過InternetprogramsProFound和MS-Fit來搜索蛋白質數(shù)據(jù)庫。結果表明它們分別是肌球蛋白(重鏈，非肌型A(heavychain,non-muscletypeA))和肌動蛋白?；|輔助激光解吸離子化/飛行時間質譜/內部序列分析法(Matrix-assistedlaserdesorptionionization/timeofflightmassspectrometry/internalsequenceanalysis)表明這兩種MARCKS-結合型蛋白質分別是肌球蛋白(重鏈，非肌型A)和肌動蛋白。這些研究提示，這是控制氣道粘蛋白顆粒胞吐性分泌的信號機制的一種新的范例，同時這也給出了被認為能夠證實MARCKS在生理學過程中具有特異性生物學功能的第一個直接證據(jù)。MARCKS充當了調節(jié)人類氣道上皮細胞內粘蛋白顆粒釋放的關鍵介質分子。可以認為，引發(fā)氣道粘蛋白分泌需要PKC和PKG雙雙活化并協(xié)同作用。活化的PKC磷酸化MARCKS，導致MARCKS從質膜的內側面轉移至細胞質內。PKG活化轉而激活PP2A，后者去磷酸化細胞質內的MARCKS。由于MARCKS的膜結合能力依賴于其磷酸化狀態(tài)，因此該去磷酸化抗使其MARCKS恢復其膜結合能力并可能促使MARCKS附著于細胞質粘蛋白顆粒的膜。此外通過與細胞質內的肌動蛋白和肌球蛋白相互作用(圖4)，MARCKS隨后便能夠將顆粒束縛于細胞收縮機制上，介導顆粒向細胞周邊運動并隨后胞吐釋放。MARCKS分布廣泛，這提示此種或者類似的機制可能在正?；蛘卟±項l件下調節(jié)各種細胞類型中膜結合型顆粒的釋放。參見圖5，通過以其N-端結構域與顆粒膜相互作用并以其PSD部位結合于肌動蛋白纖絲，MARCKS可發(fā)揮分子接頭的功能，由此將顆粒束縛于負責運動和胞吐作用的收縮骨架。圖5給出了一種可能的機制，其描繪了粘蛋白促分泌素(secretagogue)與氣道上皮(杯狀)細胞相互作用并活化兩種不同的蛋白激酶，PKC和PKG。活化的PKC磷酸化MARCKS，引起MARCKS從質膜轉移至細胞質，而通過一氧化氮(NO)—GC-S—cGMP—PKG途徑被活化的PKG反過來活化細胞質PP2A，后者去磷酸化MARCKS。這一去磷酸化作用使得MARCKS與顆粒膜的附著穩(wěn)定化。此外，MARCKS還與肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，由此將顆粒連接至細胞收縮機構，由用于隨后的運動和胞吐釋放炎癥介質，例如MPO。MARCKS被釋放至細胞質后，還可被特異性靶向蛋白或者是其中涉及MARCKS的N-端結構域的某些其他形式的蛋白-蛋白相互作用引導，使得MARCKS與顆粒附著。無論是何種情況，MANS肽或其包含至少4個氨基酸的活性片段，均可競爭性抑制MARCKS對粘蛋白顆粒膜的靶向，由此抑制分泌。本發(fā)明還涉及阻斷任何細胞的胞吐分泌過程的新方法，特別是那些由炎性細胞內所含的顆粒釋放炎癥介質的過程，其中的刺激途徑涉及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白以及從膜結合型囊泡釋放成分。具體而言，本發(fā)明人己經(jīng)證實，MANS肽可以濃度依賴性方式阻斷炎癥介質髓過氧化物酶從人(圖6)或犬(圖7)的中性粒細胞的刺激型釋放。具體而言，圖6顯示分離的中性粒細胞被100nMPMA和IO^iM8-Br-cGMP刺激后分泌髓過氧化物酶(MPO)。100nMMANS肽將MPO的分泌降低至對照水平(*，<0.05)。10pMMANS導致MPO的分泌輕度降低。10或100的對照肽(RNS)不影響MPO分泌。參見圖7，分離的中性粒細胞被100nMPMA和108-Br-cGMP刺激后分泌髓過氧化物酶(MPO)。100jiMMANS肽將MPO的分泌降低至對照水平C^p0.05)。10MANS導致MPO的分泌輕度降低。10或100的對照肽(RNS)不影響MPO分泌。因此，所述肽可治療性地用于阻斷侵潤至任何組織內的炎性細胞釋放分泌的炎癥介質。釋放的這些介質有多種是導致在各種慢性炎性疾病(即，呼吸道疾病例如哮喘、慢性支氣管炎和COPD;炎性腸病包括潰瘍性結腸炎和克羅恩??；自身免疫病；皮膚病如紅斑痤瘡、濕疹；和重度痤瘡、關節(jié)炎和疼痛綜合征如類風濕性關節(jié)炎和纖維性多肌痛)中所觀察到的廣泛組織損傷的介質。本發(fā)明可用于治療疾病例如關節(jié)炎、慢性支氣管炎、COPD和囊性纖維化。因此，本發(fā)明可用于治療人類和動物的疾病，特別是那些累及馬、犬、貓科動物以及其他家庭寵物的疾病。圖8-2顯示了人和犬的MPO分泌。在所有這些實驗中，用LPS(濃度為1x10—6M)刺激分離的中性粒細胞IO分鐘，37°C，然后按照圖中所示假如刺激物。LPS初步活化這些細胞，因此它們能夠應答于促分泌素。在一個實施方式中，本發(fā)明公開了調節(jié)對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含MANS肽或其活性片段。在這種實施方式的一個方面中，MANS蛋白的所述活性片段包括至少4個且優(yōu)選地6個氨基酸。在另一個方面，所述炎癥的原因為呼吸道疾病、腸道疾病、皮膚病、自身免疫病和疼痛綜合征。在另一個方面，所述呼吸道疾病選自哮喘、慢性支氣管炎和COPD。在另一個方面，所述腸道疾病選自潰瘍性結腸炎、克羅恩病和腸激惹綜合征。在另一個方面，所述皮膚病選自紅斑痤瘡、濕疹、銀屑病和重度痤瘡。在另一個方面，所述炎癥由關節(jié)炎或囊性纖維化引起。在另一個方面，所述對象是哺乳動物。此外，在另一個方面，所述哺乳動物選自人、犬、馬和貓科動物。在另一個方面，所述施甩步驟選自局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、鼻部施用、吸入和口服。在另一個方面，所述肺部施用選自氣溶膠、干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器和噴霧器。在另一個實施方式中，本發(fā)明公開了用于調節(jié)對象的細胞分泌過程的方法，包括施用治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含至少一種包含MANS肽或其活性片段的化合物，所述化合物調節(jié)對象的炎癥介質。在這種實施方式的一個方面中，MANS蛋白的所述活性片段包括至少4個、且優(yōu)選地6個氨基酸。在另一個方面，所述調節(jié)細胞的分泌過程是阻斷或降低細胞分泌過程。在另一個方面，所述炎癥的原因為呼吸道疾病、腸道疾病、皮膚病、自身免疫病和疼痛綜合征。在另一個方面，所述呼吸道疾病選自哮喘、慢性支氣管炎和COPD。在另一個方面，所述腸道疾病選自潰瘍性結腸炎、克羅恩病和腸激惹綜合征。在另一個方面，所述皮膚病選自紅斑痤瘡、濕疹、銀屑病和重度痤瘡。在另一個方面，所述炎癥由關節(jié)炎或囊性纖維化引起。在另一個方面，所述對象是哺乳動物。在另一個方面，所述哺乳動物選自人、犬、馬和貓科動物。在另一個方面，所述施用步驟選自局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、鼻部施用、吸入和口服。在另一個方面，所述肺部施用選自氣溶膠、干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器和噴霧器。在另一個實施方式中，本發(fā)明公開了降低對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的抑制MARCKS-相關性炎癥介質釋放的化合物，由此使得對象的炎癥介質的釋放與缺乏所述治療時可能出現(xiàn)的情況相比是降低的。在這種實施方式的一個方面中，所述化合物是MARCKS蛋白的至少一種活性片段。在另一個方面，所述活性片段的長度為至少4個且優(yōu)選地6個氨基酸。在另一個方面，所述化合物是MANS肽或其活性片段。在另一個方面，所述化合物是針對MARCKS蛋白或其活性片段的編碼序列的反義寡核苷酸。在另一個方面，所述活性片段的長度為至少4個且優(yōu)選地6個氨基酸。在另一個實施方式中，本發(fā)明公開了減輕對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的藥用活性組合物，該組合物包含抑制MARCKS-相關性炎癥介質釋放的化合物，由此使得所述對象的炎癥與缺乏所述治療時可能出現(xiàn)的情況相比是減輕的。在這種實施方式的一個方面中，所述化合物是MARCKS蛋白的活性片段。在另一個方面，所述活性片段的長度為至少4個且優(yōu)選地6個氨基酸。在另一個方面，所述化合物是MANS肽或其活性片段。在另一個方面，所述化合物是針對MARCKS蛋白或其活性片段的編碼序列的反義寡核苷酸。在另一個方面，所述活性片段的長度為至少4個且優(yōu)選地6個氨基酸。本發(fā)明意欲涵蓋含有一或多種所述MANS肽或其活性片段的組合物及其在抑制炎性細胞的顆?；蚰遗葆尫叛装Y介質的治療中的用途。在另一個實施方式中，本發(fā)明還公開了減輕或抑制對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的至少一種包含MANS肽或其活性片段的肽，所述肽有效抑制炎癥部位處炎癥介質的釋放。在這種實施方式的一個方面中，所述活性片段的長度為至少4個且優(yōu)選地至少6個氨基酸。在另一個方面，產(chǎn)生所述炎癥介質的細胞選自中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞和白細胞。優(yōu)選地，所述細胞是白細胞，更優(yōu)選地是粒細胞，且甚至更優(yōu)選地是中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞或其組合。在另一個方面，所述藥物通過口服、胃腸外、腔內或通過氣道而施用。在另一個方面，所述組合物還包括第二分子，所述第二分子選自抗生素、抗病毒化合物、抗寄生蟲化合物、抗炎化合物和免疫抑制劑。MANS肽的活性片段選自表1中的肽。如本文所述，這些肽在其N-端和/或C-端氨基酸抗含有任選的化學部分。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的方法可以通過使用或者施用表1中公開的本發(fā)明的肽的組合而實施，S卩，可使用或施用這些肽的一或多種。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中使用或者施用單一的肽。應答于炎癥刺激物引起的蛋白激酶C(PKC)活化，通過與MARCKS蛋白的N-端區(qū)域相同的肽預溫育或者共溫育，可減少選自中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞和淋巴細胞的細胞的脫顆粒，其中所述肽選自表1所公開的MANS肽片段。盡管時間過程和濃度方面在不同細胞類型之間可有所不同，但在所有的情況中，MANS肽均減少PKC-誘導的脫顆粒。在描述了本發(fā)明之后，將結合特定的實施例來闡述本發(fā)明，在此引入的這些實施例僅用于舉例說明之目的，它們無意于限制本發(fā)明的范圍。實施例材料和方法及浙絲標記游免茇沉淀粼定法一當標記["P]磷酸鹽時，將細胞與含0.2%牛血清白蛋白的無磷酸DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)預溫育2h，隨后用0.1mCi/ml，P]正磷酸鹽(9000Ci/mmol，PerkinElmerLifeSdences)標記2h。為了標記卩H]豆蔻酸或3H-氨基酸，將細胞與培養(yǎng)基溫育過夜，所述培養(yǎng)基含有50pCi/ml[3司豆蔻酸(49Ci/mmol，PerkinElmerLifeSciences)或0.2mCi/ml卩H]亮氨酸(159Ci/mmol,PerkinElmerLifeSciences)以及0.4mCi/ml[3司脯氨酸(100Ci/mmol,PerkinElmerLifeSciences)。標記后，將細胞暴露于刺激試劑5分鐘。如果使用了抑制劑，則刺激之前將細胞與抑制劑預溫育15分鐘。處理結束后用緩沖液裂解細胞，該緩沖液含有50mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl，1mMEDTA，10%甘油，1%NonidetP-40,1mM苯甲基磺酰氟，1mM芐脒，10pg/ml胃酶抑素A和10ng/ml亮抑酶肽。三氯乙酸沉淀和閃爍計數(shù)可確定各培養(yǎng)物內的放射性標記效率。按照Spizz和Blackshear的方法使用細胞裂解物(具有相同的計數(shù)/分鐘)進行MARCKS蛋白的免疫沉淀。Spizz"a/.,/所o/.Ozew.271,553-562(1996)。用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離沉淀的蛋白質，并通過放射自顯影觀察。檢測中使用的是抗人MARCKS抗體(2F12)和非免疫對照抗體(6F6)。為了分析不同亞細胞級份中的MARCKS或MARCKS-相關性蛋白質復合物，將放射性標記和處理后的細胞刮入勻漿緩沖液(50mMTris-HCl(pH7.5)，10mMNaCl,1mMEDTA,1mM苯甲基磺酰氟，1mM節(jié)脒，10pg/ml胃酶抑素A,10嗎/ml亮抑酶肽)，隨后用氮空穴法(nitrogencavitation)(800磅/平方英寸，20分鐘，4。C)破壞。細胞裂解物在600xg離心IO分鐘，4T以便除去核和未破裂細胞。通過在4°C以400,000xg超速離心30分鐘將去核上清液分離為膜和胞質級份。通過超聲處理將膜沉淀溶于裂解緩沖液。然后如上所述進行免疫沉淀。M4/CXS-^^^it"—在GenemedSynthesis,Inc.(SanFrancisco,Calif.)合成豆蔻?；腘-端序列(MANS)和隨機N-端序列(RNS)肽，隨后用高壓液相色譜法純化(>95%純)，經(jīng)質譜分析確認，其分別顯示具有合適分子質量的一個單峰。組成MANS肽的序列等同于MARCKS的前24個氨基酸，即介導MARCKS插入膜內的豆蔻酰化的N-端區(qū)域，MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l(其中MA是N-端豆蔻酰基鏈)。相應的對照肽(RNS)的氨基酸組成與MANS相同，但隨機排列，MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF(SEQIDNO:232)。這些合成肽中所含的疏水性豆蔻酸鹽部分增強了它們的質膜通透性，使得肽能夠容易地被細胞攝取。為了確定這些肽對粘蛋白分泌的影響，先將細胞與肽預溫育15分鐘，然后添加促分泌素，然后通過ELISA測定粘蛋白分泌。在BiognostikGmbH(Gottingen,Germany)合成MARCKS反義寡核苷酸及其相應的對照寡核苷酸。NHBE細胞用5的反義或對照寡核苷酸頂部處理3天(最初的24h內存在2pg/ml陽離子脂質體(lipofectin))。然后細胞與促分泌素溫育，并用ELISA測定粘蛋白分泌。從處理的細胞分離總RNA和蛋白質。使用人MARCKScDNA為探針，按照常規(guī)方法通過Northern雜交測定MARCKSmRNA。使用純化的抗-MARCKSIgGl(克隆2F12)作為初級檢測抗體通過免疫印跡確定MARCKS蛋白水平。MARCKS的磷酸化位點結構域(PSD)含有PKC-依賴性磷酸化位點和肌動蛋白纖絲結合位點。為了構建PSD-缺失型MARCKScDNA，通過聚合酶鏈反應產(chǎn)生PSD序列側翼的兩個片段(編碼25個氨基酸)，隨后通過Xhol位點連接，該位點連接于為聚合酶鏈反應設計的寡核苷酸引物的5'-73末端。所得突變體cDNA和野生型MARCKScDNA分別插入哺乳動物表達載體pcDNA4/TO(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。通過限制酶消化和DNA測序確認分離的重組構建體。HBE1是乳頭狀瘤病毒轉化的人支氣管上皮細胞系，當培養(yǎng)于氣/液界面中時氣能夠分泌粘蛋白。使用Effectene轉染試齊U(Qiagen，Valencia,Calif.)按照生產(chǎn)商的說明轉染HBE1細胞。簡言之，通過胰蛋白酶/EDTA使得生長于氣/液界面中的分化的HBE1細胞游離，并以1x105個細胞/01112重新接種于12-孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)過夜后使用野生型MARCKScDNA、PSD-截短型MARCKScDNA、或載體DNA轉染細胞。培養(yǎng)細胞48h以便基因表達，隨后暴露于促分泌素，并通過ELISA測定粘蛋白分泌。所有的轉染均在存在pcDNA4/TO/lacZ質粒(Invitrogen)(DNA比率6:1，總共1pgDNA，DNA與Effectene試劑之比=1:25)的情況下進行，以便監(jiān)測轉染效率的變化。結果顯示分離自轉染細胞的細胞裂解物中的P-半乳糖苷酶活性沒有顯著差異，說明不同DNA構建體之間具有相似的轉染效率(結果未顯示)。歪^錄麼艨活絲激定一使用本領域已知的蛋白磷酸酶測定系統(tǒng)(LifeTechnologies,Inc.)測定PP1和PP2A活性，方法略有改動。Huangetal.，Adv.Exp.MedBiol.396,209-215(1996)。簡言之，NHBE細胞用8-Br-cGMP或僅培養(yǎng)基處理5分鐘。然后將細胞刮至裂解緩沖液(50mMTris-HCl(pH7.4)，0.1%.p.-巰基乙醇，0.1mMEDTA，1mMBenaamidine，10|ig/ml胃酶抑素A,10pg/ml亮抑酶肽)中并超聲處理20秒使之破壞，4°C。離心細胞裂解物并收集上清液用于磷酸酶活性測定。使用"P-標記的磷酸化酶A作為底物進行測定。閃爍計數(shù)釋放出的32Pi。通過Bradford測定法確定各個樣品的蛋白質濃度。PP2A活性表示為樣品總磷酸酶活性減去存在1nM崗田酸時殘留的活性。PP1活性表示為分別存在1nM和1崗田酸時殘留活性之間的差異。通過每分鐘每mg總蛋白釋放出的Pi(nmol)來報告蛋白磷酸酶活性。一智應泰絲資/定一通過測定細胞釋放的總乳酸脫氫酶來檢測用于處理NHBE細胞的各種試劑的細胞毒性。使用PromegaCytotox96Kit按照生產(chǎn)商的說明進行該測定。所有實驗均采用非毒性濃度的試劑進行。統(tǒng)^學分稱一使用經(jīng)Bonferroni檢驗后校正(Bonferronipost-testcorrections)的單向方差分析法分析數(shù)據(jù)的顯著性。p<0.05時，認為不同處理之間的差異具有顯著性。應義i分庸戶MV—涉及分離PMN的步驟包括收集10mlACD抗凝血。然后將5ml層鋪在3.5mlPMN分離介質之上，同時確保PMN分離介質(IM)為室溫(RI)。隨后血液在室溫離心30分鐘，550Xg，1700RPM。將較低的白色帶層轉移至15ml錐形離心管(CCFT)。隨后，加入2V含10%胎牛血清(PBS)的HESS，室溫離心10分鐘，400Xg，1400RPM。沉淀重懸于5ml含PBS的HESS。將細胞懸液加至50ml含20ml冰冷的0.88%NH4C1的CCFT中，顛倒2至3次。所得產(chǎn)物離心10分鐘，800Xg，2000RPM，然后吸出并重懸于5ml含F(xiàn)BS的HBSS中。通過計數(shù)和細胞離心涂片器檢測制備物，且優(yōu)選地，對于全血而言，細胞數(shù)應該在109-10"個細胞之間，而對于PMN，細胞數(shù)應該在2-4x107個細胞之間。請參見WangWa/.,JTwmimo/.,"Neutrophil-inducedchangesinthebiomechanicalpropertiesofendothelialcells:rolesofICAM-1andreactiveoxygenspecies,"6487-94(2000)。MPO靡顯色定量分析一使用ELISA試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,Minn.)在96孔圓底微滴定板中測定樣品的MPO活性。簡言之，在各微孔內將20微升樣品與180微升底物混合物(含33mM磷酸鉀，pH6.0,0.56%TritonX-100,0.11mM過氧化氫和0.36mMO-DiannisidineDihydrochloride)混合。測定混合物中的終濃度為30mM磷酸鉀，pH6.0,0.05%TritonX-IOO，0.1mM過氧化氫和0.32mMO-DiannisidineDihydrochloride。經(jīng)過混合，將測定混合物在室溫溫育5分鐘，然后通過分光光度法在550nm確定MPO酶活性。樣品均一式兩份進行測定。實施例1:炎癥介質分泌研究使用了應答于佛波酯誘導的PKC活化分泌特異性顆粒成分的四種不同白細胞類型或模型。中性粒細胞分離自人血并測定這些細胞體外釋放MPO的情況。還評價了商品化的人白細胞細胞系釋放膜結合型炎癥介質的情況。使用人早幼粒細胞細胞系HL-60克隆15分析EPO的釋放(FischkoffSA.GradedincreaseinprobabilityofeosinophilicdifferentiationofHL-60promyelocyteleukemiacellsinducedbycultureunderalkalineconditions.LeukRes1988;12:679-686;RosenbergHF,AckermanSJ，TenenDG.Humaneosinophilcationicprotein:molecularcloningofacytotoxinandhelminthotoxinwithribo薩leaseactivity.JExpMed1989;170:163-176;TiffanyHL,LiF,RosenbergHF.Hyperglycosylationofeosinophilribonucleasesinapromyelocyticleukemiacelllineandindifferentiatedperipheralbloodprogenitorcells.JLeukocBiol1995;58:49-54;BadewaAP，HudsonCE,HeimanAS.Regulatoryeffectsofeotaxin,eotaxin-2，andeotaxin-3oneosinophildegmnulationandsuperoxideaniongeneration.ExpBiolMed2002;227:645-651)。使用單核細胞白血病細胞系U937分析溶菌酶的釋放(HoffT,SpenckerT，EmmendoerfferA.，Goppelt-StruebeM.EffectsofglucocorticoidsontheTPA-inducedmonocyticdifferentiation.JLeukocBiol1992;52:173-182;BalboaMA，SaezY,BalsindeJ.Calcium-independentphospholipaseA2isrequiredforlysozymesecretioninU937promonocytes.JImmunol2003;170:5276-5280;SundstromC,NilssonK.Establishmentandcharacterizationofahumanhistiocyticlymphomacellline(U-937).IntJCancer1976;17:565-577)。使用淋巴細胞天然殺傷細胞系NK-92分析粒酶的釋放(GongJH.，MakiG,KlingemannHG.Characterizationofahumancellline(NK-92)withphenotypicalandfimctionalcharacteristicsofactivatednaturalkillercells.Leukemia1994;8:652-658;MakiG，KlingemannHG，MartinsonJA，TamYK.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.JHematotherStemCellRes2001;10:369-383;TakayamaH，TrennG，SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.JImmunolMethods1987;104:183-190)。在所有情況中，細胞均與一定濃度范圍的與24個氨基酸的MARCKSN-端相同的合成肽(MANS-豆蔻酰化的N-端序列肽；MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)，其中MA是通過酰胺鍵連接于所述肽的N-端胺的豆蔻酰基)或錯義對照肽(RNS:隨機N-端序列肽；MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF，SEQIDNO:232)預溫育，所述錯義對照肽由與MANS肽序列相同的24個氨基酸組成，但這些氨基酸以隨機次序的序列排列，該序列與MANS肽序列的序列相同性低于13%?；蛘?，用以下表3所列的合成的截短型肽處理所述細胞。MANS以濃度依賴性方式減少了各種細胞類型的炎癥介質釋放，而RNS則不能?？捎玫挠^察時間段是0.5-3.0小時。這些結果與MARCKS蛋白N-端區(qū)域參與導致白細胞脫顆粒的細胞內途徑的看法相一致。乂^絲粒^^^^S^"—這些研究得到了人類研究InstitutionalReviewBoard(IRB)的批準。按照先前所述的方法分離人中性粒細胞(見TakashiS，OkuboY，HorieS.ContributionofCD54tohumaneosinophilandneutrophilsuperoxideproduction.JApplPhysiol2001;91:613-622)，方法略有改動。簡言之，從正常健康志愿者獲得肝素抗凝的靜脈血，用RPMI-1640(Cellgro;Mediatech，Inc.,Hemdon,VA)以1:1的比例稀釋，層鋪于Histopaque(密度1.077g/ml;Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MO)之上并400g離心20分鐘，4°C。仔細移除上清液和界面處的單個核細胞，在冰冷的蒸餾水中裂解沉淀中的紅細胞。分離的粒細胞用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗滌兩次，然后重懸于HBSS，置于冰上。用于實驗中的中性粒細胞的純度>98%，嗜酸性粒細胞的污染<2%,經(jīng)臺盼藍染料排除法確定，細胞活力>99%。麥/^^^^游^經(jīng)#1#蘑MPO^絲一為了測定MPO的釋放，將懸浮于HBSS內的純化人中性粒細胞等分為4x1()S個細胞/ml，置于15ml管中，并與50或100pM的MANS、RNS、或一種本發(fā)明的肽在37°C預溫育10分鐘。然后用100nM(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)刺激所述細胞達3小時。如下建立對照參照物(PMA對照參照物)將懸浮于HBSS內的純化人中性粒細胞等分為4x10S個細胞/ml，置于15ml管中，并在缺乏測試肽的情況下用100nM(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)刺激相同的時間。通過將管置于冰上并在4°C、400g離心5分鐘而終止反應。使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)基于先前建立的技術(Abdel-LatifD，StewardM,MacdonaldDL，F(xiàn)rancisGA.，DinauerMC，LacyP.Rac2iscriticalforneutrophilprimarygranuleexocytosis.Blood2004;104:832-839)分析細胞上清液內的MPO活性。簡言之，將100的TMB底物溶液加至96-孔微孔板中的50細胞上清液或人MPO標準品(EMDBiosciences,Inc.,SanDiego，CA)中，然后室溫溫育15分鐘。加入50ptL的1MH2S04終止反應，使用分光光度酶標儀(VERSAmax,MolecularDevices,Sunnyvale,CA)檢領!)450nm的吸光度。飾應綠研究三種人白細胞細胞系，具體地為早幼粒細胞細胞系HL-60克隆15、單核細胞系U937、和淋巴細胞天然殺傷細胞系NK-92,均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC;Rockville，MD)。HL-60克隆15細胞(ATCCCRL-1964)培養(yǎng)于由含L-谷氨酰胺的RPMI1640組成的培養(yǎng)基中，其中補充了10。/。熱滅活的胎牛血清(Gibco;InvitrogenCo.，Carlsbad,CA)、50IU/ml青霉素、50jig/mL鏈霉素和25mMHEPES緩沖液，pH7.8，培養(yǎng)在37°C，5%C02的環(huán)境中。通過在含有0.5mM丁酸(Sigma-AldrichCo.)的上述培養(yǎng)基中將細胞以5x1()S個細胞/ml培養(yǎng)5天而使其終末分化為嗜酸性粒細胞樣表型，方法如前所述(TiffanyHL，LiF，RosenbergHF.Hyperglycosylationofeosinophilribonucleasesinapromyelocyticleukemiacelllineandindifferentiatedperipheralbloodprogenitorcells.JLeukocBiol1995;58:49-54;TiffanyHL，AlkhatibG，CombadiereC，BergerEA,MurphyPM.CCchemokinereceptors1and3aredifferentiallyregulatedbyIL-5duringmaturationofeosinophilicHL-60cells.JImmunol1998;160:1385-1392)。U937細胞(ATCCCRL-1593,2)在37。C、含5%C02的環(huán)境中培養(yǎng)于由含L-谷氨酰胺的RPMI1640組成的完全培養(yǎng)基中，其中補充了10%FBS、50IU/ml青霉素和50|ng/mL鏈霉素。NK-92細胞(ATCCCRL-2407)培養(yǎng)于a-MEM培養(yǎng)基(Sigma-AldrichCo.)，其中補充了20%FBS、100U/ml的白細胞介素畫2(IL-2)(ChemiconInternational,Inc.,Temecula，CA)、5x10陽5M的2-巰基乙醇、50IU/mL青霉素、和50pg/ml鏈霉素，培養(yǎng)在37°C，含5%(302的環(huán)境中。通過Wright-Giemsa染色分析細胞以評判細胞形態(tài)學。通過臺盼藍染料排除法確定所收集的用于實驗的細胞的活力，并使用活力>95%的細胞群體。蘊飾細預繊微HL-60克隆15、U937和NK-92細胞經(jīng)洗滌后以2.5x1(^個細胞/ml的密度重懸于無酚紅的RPMI-1640(Cellgro;Mediated!,Inc.)中，用于全部的脫顆粒測定中。將等份的細胞置于15ml管中，與指定濃度的MANS、RNS、或測試肽在37°C預溫育10分鐘。隨后用PMA刺激細胞達2小時。分別使用HL-60克隆15、U937、和NK-92細胞為各細胞類型建立對照參照物(PMA對照參照物)洗滌所述細胞并以2.5x1(^個細胞/ml的密度重懸于無酚紅的RPMI-1640，并在缺乏MANS、RNS、或測試肽的情況下用PMA刺激相同的時間。通過將管置于冰上并在4。C、400g離心5分鐘而終止反應。對于測定從中性粒細胞釋放的MPO和從U937細胞釋放的溶菌酶，我們可通過分別用人MPO和卵清蛋白作為標準品來定量分泌。對于從HL-60克78隆15細胞釋放的EPO和從NK-92細胞釋放的粒酶，沒有用于定量的標準品。因此，同時測定了釋放的和細胞內的(來自裂解的細胞)EPO和粒酶水平，并將釋放的EPO和粒酶表示為各自總量(細胞內加釋放)的百分數(shù)。為了測定HL-60克隆15細胞的細胞內EPO和NK-92細胞的細胞內粒酶，取適量的等量0.1。/。tritonX-100-裂解細胞用于定量細胞內顆粒蛋白質，方法如下文所述。所有的處理均表示為對照的百分數(shù)，以便將培養(yǎng)物之間的差異性最小化。#/定肌-(^￡尸(9獰,根據(jù)先前建立的技術用TMB測定HL-60克隆15細胞釋放的EPO活性(LacyP，Mahmudi-AzerS,BablitzB，HagenSC，VelazquezJR，ManSF,MoqbelR.RapidmobilizationofintracellularlystoredRANTESinresponsetointerferon-gammainhumaneosinophils.Blood1999;94:23-32)。因此，將100的TMB底物溶液加至96-孔微孔板內的50(pL-微升)樣品中，室溫溫育15分鐘(min=分鐘)。加入50的1.0M112504終止反應，并使用分光光度酶標儀測定450nm(nm-納米)處的吸光度。分泌的EPO量表示為總含量(使用在相同數(shù)量的tritonX-100-裂解細胞中得到的量)的百分數(shù)。激定卓微應搭練分泌采用分光光度測定法測定U937細胞分泌的溶菌酶，方法如前所述，略有改動(BalboaMA，SaezY，BalsindeJ.Calcium-independentphospholipaseA2isrequiredforlysozymesecretioninU937promonocytes.JImmunol2003;170:5276-5280)。因此，100juL的樣品與100的溶壁微球菌(M/cracoccz^/;^o&汰ria^)(Sigma-AldrichCo.)懸液(0.3mg/ml溶于0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.0)在96-孔微孔板中混合。室溫測定450nm處吸光度的下降。使用雞蛋清溶菌酶(EMDBiosciences,Inc.)作為標準品建立校準曲線。激定,潘應繊分泌通過測定Na-芐氧羰基-L-賴氨酸硫代苯甲醇酯(Na-benzyloxycarbonyl-L-lysinethiobenzylester，BLT)的水解來測定NK-92細胞分泌的粒酶，方法基本上如先前所述(TakayamaH,TrennG,SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.JImmunolMethods1987;104:183-190)。簡言之，將50^L上清液轉移至96-孔板，將150pL溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.2)中的BLT溶液(0.2mMBLT;EMDBiosciences,Inc.,和0.22mMDTNB;Sigma-AldrichCo.)(mM=毫摩爾)加至所述上清液中。室溫溫育30分鐘后測定410nm處的吸光度。結果表示為總的細胞內酶含量(使用在相同數(shù)量的tritonX-100-裂解細胞中得到的量)的百分數(shù)。教，學分析采用單向方差分析評價不同處理組之間差異的統(tǒng)計學顯著性。P值<0.05被認為具有顯著性。微乂憤發(fā)鄉(xiāng)微MPO發(fā)現(xiàn)100nMPMA(作為炎癥介質釋放的刺激物)在30分鐘時使得PMA對照參照物內的人中性粒細胞的MPO釋放相對于對照水平升高了大約3倍，3小時后MPO的釋放升高至5-6倍。在30分鐘時，相對于缺乏PMA和缺乏PMA加MANS、RNS、或測試肽的對照MPO活性(100%)，PMA對照參照物的MPO活性為大約275%，PMA加50MANS為大約275%，而100|iMMANS為大約305%。因此，MANS肽在30分鐘時未檢測到作用。不過，到1小時時，更高濃度的MANS(100[iM)產(chǎn)生了顯著的抑制作用(是對照的260%)或相對于PMA對照參照物水平(是對照的大約340%)MPO釋放降低大約25%。50MANS樣品是對照的大約290%或者相對于PMA對照參照物降低大約15%。在2小時并持續(xù)至3小時，MANS肽以濃度依賴性方式顯著減弱MPO活性。在2小時時，PMA對照參照物MPO活性為對照的大約540%，50MANS(是對照的大約375%)導致MPO釋放相對于PMA對照參照物降低大約30%;而100MANS(是對照的大約295%)導致MPO釋放相對于PMA對照參照物降低大約45%。在3小時，PMA對照參照物MPO活性為對照的大約560%,50MANS(是對照的大約375%)導致MPO釋放相對于PMA對照參照物降低大約33%;100MANS(是對照的大約320%)導致MPO釋放相對于PMA對照參照物降低大約40%。RNS肽在任何時間點或測試濃度均不影響PMA-誘導的MPO釋放。下表給出的數(shù)據(jù)代表的是lOOnM濃度的測試肽并與100nMPMA溫育2小時。浙虔組-60潘應/微五i3(9PMA剌激后1和2小時HL-60克隆15細胞上清液中的EPO活性顯著增強。在1小時，相對于對照的EPO活性(100。/。)，PMA對照參照物為大約110%;含10|iMMANS的樣品為大約95%,導致EPO活性相對于PMA對照參照物降低大約15%;含50MANS的樣品為大約78%，導致EPO活性相對于PMA對照參照物降低大約30%;而含100|iMMANS的樣品為大約65%,導致EPO活性相對于PMA對照參照物降低大約40%。在2小時，相對于對照的EPO活性(100%)，PMA對照參照物為大約145%;含10MANS的樣品為大約130%,導致EPO活性相對于PMA對照參照物降低大約10%;含50pMMANS的樣品為大約70。/。，導致EPO活性相對于PMA對照參照物降低大約50%;而含100MANS的樣品為大約72%，導致EPO活性相對于PMA對照參照物降低大約50%。因此，在1和2小時時，50或100pM的MANS均顯著減弱EPO釋放。RNS肽在任何時間點或測試濃度均不影響PMA-增強的EPO釋放。下表給出的數(shù)據(jù)代表的是50^M濃度的測試肽并與100nMPMA溫育2小時。滯劍,7潘應微霧鎌溫育后1小時，PMA刺激增加了U937細胞的溶菌酶分泌，而且在2小時時增加得更多。在1小時，相對于對照U937細胞的溶菌酶分泌(100%)，PMA對照參照物為大約210%;含10MANS的樣品為大約170%，導致U937細胞的溶菌酶分泌相對于PMA對照參照物降低大約20%;含50pMMANS的樣品為大約170%，導致U937細胞的溶菌酶分泌相對于PMA對照參照物降低大約20%;而含100MANS的樣品為大約115%，導致U937細胞的溶菌酶分泌相對于PMA對照參照物降低大約45%。在2小時，相對于對照U937細胞的溶菌酶分泌(100°/。)，PMA對照參照物為大約240%;含10jaMMANS的樣品為大約195%，導致U937細胞的溶菌酶分泌相對于PMA對照參照物降低大約20n/。；含50pMMANS的樣品為大約185%，導致U937細胞的溶菌酶分泌相對于PMA對照參照物降低大約25°/。；而含100jaMMANS的樣品為大約140%，導致U937細胞的溶菌酶分泌相對于PMA對照參照物降低大約40%。因此，100,的MANS顯著減弱了刺激后1和2小時的溶菌酶分泌，而50或10拜的MANS則沒那么多。RNS肽在任何時間點或測試濃度均不影響PMA-增強的溶菌酶分泌。下表給出的數(shù)據(jù)代表的是50iaM濃度的測試肽并與100nMPMA溫育2小時。鄉(xiāng)組"鄉(xiāng)敘欲微使用淋巴細胞天然殺傷細胞系NK-92評價粒酶釋放(GongJH，MakiG，KlingemannHG.Characterizationofahumancellline(NK-92)withphenotypicalandfunctionalcharacteristicsofactivatednaturalkillercells.Leukemia8:652-658,1994;MakiG,KlingemannHG,MartinsonJA，TamYK.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.J.Hematother.StemCellRes"10:369-383,2001;TakayamaH,TrennG,SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.J.Immunol.Methods104:183-190，1987)。測定NK細胞的粒酶分泌通過測定Na-芐氧羰基-L-賴氨酸硫代苯甲醇酯(BLT，EMDBioscience,Inc.)的水解而測定NK-92細胞分泌的粒酶.，方法基本上如前所述(TakayamaH，TrennG，SitkovskyMV.AnovelcytotoxicTlymphocyteactivationassay.J.Immunol.Methods104:183-190,1987)。將等量50卞L的上清液轉移至96-孔板，向所述上清液內加入150jiL溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.2)的0.2mMBLT溶液和0.22mMDTNB(Sigma-AldrichCo.)。室溫溫育30分鐘后測定410nm處的吸光度。結果表示為總的細胞內酶含量(使用在相同數(shù)量的tritonX-lOO-裂解細胞中得到的量)的百分數(shù)。由于沒有可用于定量的NK，92細胞粒酶標準品，我們同時測定了所釋放的和細胞內的(來自裂解的細胞)粒酶的水平，并將釋放的粒酶表示為各自總量(細胞內和釋放)的百分數(shù)。為了測定NK-92細胞的細胞內粒酶，取適量的等量0.1%tritonX-100-裂解細胞用于定量所述酶，方法如上所述。所有的處理均表示為對照的百分數(shù)，以便將培養(yǎng)物之間的差異性最小化。下表給出的數(shù)據(jù)代表的是50pM濃度的測試肽并與100nMPMA溫育2小時。潘應毒絲通過檢測LDH的保持/釋放情況，發(fā)現(xiàn)上述處理均未在細胞中產(chǎn)生毒性反應(結果未顯示)(另見ParkJ-A，HeF，MartinLD，LiY，AdlerKB.HumanneutrophilelastaseinduceshypersecretionofmucinfromhumanbronchialepithelialcellsinvitroviaaPKC5—mediatedmechanism.AmJPathol2005;167:651-661)。在初步的實驗中，下表給出的這些肽對人中性粒細胞釋放MPO、HL-60克隆15細胞釋放EPO、U937細胞釋放溶菌酶、和NK-92細胞釋放粒酶顯示出一定百分數(shù)的抑制作用，其中MA-表示在肽的a-N-端位置存在豆蔻?；〈?；Ac-表示在肽的a-N-端位置存在乙?；〈?；H表示無基團連接于肽；NH2表示C-端位置存在酰胺基。抑制數(shù)據(jù)是多次實驗的平均值。肽在0.5N鹽水pH6.5時的定性溶解度以mg/mL形式顯示于以下表3。改變N-端化學部分的豆蔻酰基可改變在此所公開的肽在水性介質中的溶解度。例如，如表3所示，將豆蔻?；淖?yōu)橐阴；鶎е滤苄栽黾印１?:代表性肽和取代的肽的酶抑制測定結果及其溶解度SEQIDNO:抑制%mg/mLN-1氨基酸序列C-2EPO溶菌酶MPO粒酶溶解度3219AcAKGE87.67.2>20045AcAKGEAAAERPGEAAVA72.334.337AcGAQFSKTAAKGEAAAE56.68.4239AcGAQFSKTAAAGE55.837.2>50248AcGAQFSKTAAA55.228.3>10091AcAAAERPGEAAVA51.229.511AcGAQFSKTAAKGEAAAERPGE48.80.079AcGAQFSKTAAKGE46.743.3>100153AcRPGEAAVA'45.80.0219AcAKGENH245.626.8>20093AcA(JFSKTAAKGENH242.851.8>90141AcSKTAAKGENH242.20>200241AcGAQFSKTAAKGA40.924.1>50143AcTAAKGEAA40.40.5>230251AcAAGE39.136.9>200106AcGAGFSKTAAK35.741.225.3>100249AcGAQFSATAAA35.73.2<101AcGAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA33.739.8>250121AcGA()FSKTAA33.328.9>20106AcGAQFSKTAAK(alld)26,98.940.0>100124AcFSKTAAKGENH225.356.7>10079AcGACFSKTAAKGENH224.738.626.5>60108AcQFSKTAAKGENH215.760.7>150179AcAAKGEA10.69.2>15059AcKTAAKGENH2024.3>200137AcGAQFSKTA00>20079HGA(JFSKTAAKGE27,9>601MAGAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA46.140.831.276.0<5.0N--N-端基團C--C-端基團0.5N鹽水,pH6.583<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>實施例2:MANS和相關的肽體內抑制脂多糖(LPS)-誘導的肺部炎癥本實施例基本上按照以下文獻所述的方法進行Cox，G，Crossley,J.,andXing,Z.;Macrophageengulfinentofapoptoticneutrophilscontributestotheresolutionofacutepulmonaryinflammationinvivo;Am.J.Respir.CellMol.Biol.12:232-237,1995;HiranoS.,Quantitativetime-courseprofilesofbronchoalveolarlavagecellsfollowingintratrachealinstillationoflipopolysaccharideinmice,Ind.Health35:353-358,1997;禾口UlichTR，WatsonLR，YinSM,GuoKZ,WangP,ThangH,anddelCastillo,J.Am.J.Pathol.138:1485-1496，1991。因此，體重15-20g的6至7周齡CD1雌性小鼠得自CharlesRiverLaboratories,每籠5只小鼠分組飼養(yǎng)。動物隨意獲得標準嚙齒動物膳食和經(jīng)過濾的水。遵照NIH的指南規(guī)定將動物飼養(yǎng)在標準溫度(64。至79。F)，相對濕度30至70%條件下。5組實驗小鼠，每組5只，分別給予以下處理PBS繼以PBS;PBS繼以LPS;(豆蔻?；?MANS肽繼以LPS;乙?；碾腟EQIDNO:l繼以LPS;或乙?；碾腟EQIDNO:106繼以LPS。鼻內滴入肽預處理將待分析其體內抑制或降低LPS-誘導的肺部炎癥的能力的本發(fā)明的肽溶解于PBS，濃度為1mM。動物經(jīng)吸入0.8%Isofluorane被麻醉，向一側鼻孔鼻內滴入2x10nL團注量的肽溶液，30分鐘后滴入LPS。鼻內滴入LPS:脂多糖(LPS)內毒素(大腸桿菌C&c/zm'c/^co/Z)血清型011:B4來源的內毒素；Sigma,StLouis,MO;參見Sigma產(chǎn)品信息頁L4130，標題為LipopolysaccharidesfromEscherichiacoli011:B4)溶解于磷酸緩沖鹽水(PBS)，濃度為2,500pg/mL。為了使動物暴露于內毒素，給通過吸入0.8%Isofluorane而被麻醉的動物施用10)iL鼻內團注量的2,500pg/ml的內毒素溶液。將10的團注量施用于一側鼻孔。滴入內毒素后監(jiān)測動物的用力呼吸、嗜睡以及水/食物攝入減少等情況。支氣管肺泡灌洗(BAL):末次滴入后6小時，將動物麻醉(90mg/kg的戊巴比妥鈉)并通過放血處死。用1.0mL的等量PBS連續(xù)灌洗肺部2次。收集的BAL液經(jīng)離心取細胞用于隨后計數(shù)和分類分析。回收的灌洗液用于分析總蛋白、髓過氧化物酶(MPO)、LDH和血紅蛋白。分析等量的BAL液立即用于測定LDH、總蛋白或血紅蛋白水平，使用的是COBASFaraanalyzer(COBASFARAIIautomatedanalyzer;RocheDiagnosticSystemsInc.,Montclair,NJ)。一份等量BAL液冷凍于-80。C，用于隨后通過小鼠特異性ELISA測定法(CellSciences,Inc.,Canton,Mass)定量髓過氧化物酶(MPO)。通過標準技術分析BAL數(shù)據(jù)以便檢査對照組與處理組之間的差異。以下諸表給出的結果證實測試肽可抑制或減輕炎癥。表4:存在MANS肽MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA,SEQIDNO:l時炎癥標記物的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>68.570.05表5:存在MANS肽的N-端乙?；愃莆顰c-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA，SEQIDNO:l時炎癥標記物的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表6:存在乙?；腁c-GAQFSKTAAK，SEQIDNO:106時炎癥標記物的平均值處理方案細胞總數(shù)中性粒細胞總數(shù)嗜中性粒細胞占總計數(shù)的。/。MPO(ng/mL)總蛋白Og/mL)LDH(units/L)Hb(g/dL)PBS/PBSn=5312,62066,52121.34.88113.861.800.00PBS/LPSn=5327,68080,07724.47.19116,478.200.00Ac-SEQIDNO:麗LPSn=5305,6889,1703.01.50131.0106.860.00表7:MANS肽(Myr-SEQIDNO:1);測試肽(Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA)，SEQIDNO:l;禾tlAc-GAQFSKTAAK，SEQIDNO:106對炎癥標記物的抑制作用，與PBS/LPS處理相比處理方案對中性粒細胞遷移的抑制對MPO的抑制MANS/LPS41.4%67.2%SEQIDNO:/LPS35.9%18.75%Ac-SEQIDNO:106/LPS88.5%79.1%PBS/PBS代表僅施用PBS對照，而沒有添加LPS內毒素刺激趨化性中性粒細胞遷移；PBS/LPS代表添加LPS(內毒素)刺激趨化性中性粒細胞遷移；MANS/LPS代表用PBS中的MANS肽預處理繼以LPS刺激以便誘導中性粒細胞遷移。經(jīng)MANS肽處理后，LPS處理組中的中性粒細胞占細胞總數(shù)的百分數(shù)從41.7%降低至30.9%;肽Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA，SEQIDNO:l處理使之從65.5%降低至41.47%;肽Ac-GAQFSKTAAK，SEQIDNO:106處理使之從24.4%降低至3.0%。經(jīng)MANS肽處理后，測定到LPS處理組中的MPO水平從28.98ng/mL降低至9.49ng/mL;具有乙酰化的SEQIDNO:l的肽處理使之從37.9ng/mL降低至30.79ng/mL;而具有乙?；腟EQIDNO:106的肽處理使之從7.19ng/mL降低至1.50ng/mL。實施例3:臭氧誘導的COPD小鼠模型化學刺激物如臭氧引起的氧化應激是慢性阻塞性呼吸道疾病(COPD)的一個被廣泛認知的特征。參見RepineJE，BastA,LankhorstI，andtheOxidativeStressStudyGroup,Am.J.Respir.Crit.CareMed.156:341-357,1997;和alsoHarkemaJRandHotchkissJA，ToxicologyLetters,68:251-263，1993。10周齡的Balb/C雌性小鼠得自CharlesRiverLaboratories,遵照NIH的指南規(guī)定將每籠5只小鼠分組飼養(yǎng)。動物隨意獲得標準嚙齒動物膳食和經(jīng)過濾的水。3個處理組的小鼠，每組5只，分別通過腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)和賽拉嗪(20mg/kg)麻醉，隨后通過氣管內施用25的以下處理進行預處理僅PBS;或溶于PBS的1.0mMMANS肽溶液；或溶于PBS的1.0mM的乙酰化MANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK(命名為乙?；疭EQIDNO:106)溶液。30分鐘后，將動物置于合適的定制室內暴露于臭氧或強制通風。動物暴露于臭氧達2小時(臭氧濃度為1-10ppm)，采用Haddadetal，1995的方法(HaddadE-B，SalmonM，SimJ，LiuS,DasA，AdcockI,BarnesPJ，andChungKF，F(xiàn)EBSLetters,363:285-288,1995)，略加改動。使用臭氧產(chǎn)生裝置OL80F/B(OzoneLab，Burton,BritishColumbia,Canada)產(chǎn)生臭氧。臭氧濃度通過TeledynePhotometric03Analyzer(model400E,TeledyneInstruments,CityofIndustry,CA)連續(xù)監(jiān)測。額外兩組小鼠均未做任何預處理，分別暴露于相同條件下的臭氧或暴露于類似于臭氧處理組但缺乏臭氧條件下的強制通風。暴露后放血處死動物，用1.0mL的等量PBS連續(xù)灌洗肺部2次。收集的支氣管肺泡灌洗(BAL)液經(jīng)離心取細胞用于隨后計數(shù)和分類分析?；厥盏墓嘞匆河糜诜治龅鞍踪|并通過ELISA測定法(試劑盒來自R&DSystems,Minneapolis,MN)額外分析IL-6、IFNy、和KC(鼠的IL-8類似物)。下表給出了與僅使用PBS處理的對照組相比，作為各處理組的函數(shù)的對中性粒細胞遷移至BAL液的抑制百分數(shù)。表8:MANS肽和乙酰化SEQIDNO:106肽Ac-GAQFSKTAAK抑制臭氧誘導的中性粒細胞遷移<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>得到了作為氣管內注射預處理繼以臭氧處理的函數(shù)的BAL液中的IL-6濃度(pg/mL)，如下。IL-6水平為在MANS肽預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約364.5pg/mL;在乙?；腗ANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK200780035710.6(SEQIDNO:106)預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約130.4pg/mL;在PBS預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約1041.3pg/mL;在直接暴露于強制通風而不做任何預處理的小鼠組中為大約43.2pg/mL。得到了作為氣管內注射預處理繼以臭氧處理的函數(shù)的BAL液中的KC濃度(pg/mL)，如下。KC水平為在MANS肽預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約183.6pg/mL;在乙?；腗ANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK(SEQIDNO:106)預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約159.7pg/mL;在PBS預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約466.6pg/mL;在暴露于強制通風而不做預處理的小鼠組中為大約36.3pg/ml。得到了作為氣管內注射預處理繼以臭氧處理的函數(shù)的BAL液中的IFNY濃度(pg/mL)，如下。IFNy水平為在MANS肽預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約7.4pg/mL;在乙酰化的MANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK(SEQIDNO:106)預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約3.6pg/ml;在PBS預處理隨后暴露于臭氧的小鼠組中為大約8.6pg/mL;而在暴露于強制通風的小鼠組中為大約5.0pg/mL。給小鼠施用臭氧顯著增加BAL中的侵潤中性粒細胞數(shù)量以及IL-6和KC水平。與PBS預處理小鼠的對照組相比，MANS肽預處理組以及乙?；碾腁c-GAQFSKTAAK即乙?；疭EQIDNO:106預處理組分別顯示出暴露于臭氧后BAL液中的中性粒細胞侵潤減少(例如，分別為93%±10%和81%±10%，與PBS對照相比)。與此一致，MANS肽和乙?；碾囊阴；疭EQIDNO..106還顯著降低暴露于臭氧后的KC濃度(例如，分別為65.8%±10%和71.3%±10%,與PBS對照相比)和IL-6水平(例如，67.8%±15%(MANS)和91.3%±15。/。(乙?；疭EQIDNO:106)，相比于PBS對照)，但對干擾素-y水平幾乎沒有影響?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明MANS肽和乙?；疭EQIDNO:106肽顯著減少或抑制臭氧誘導的中性粒細胞向氣道內的遷移，并選擇性降低趨化因子和細胞因子。相對于PBS預處理的動物，經(jīng)MANS肽或乙?；碾腟EQIDNO:106預處理的動物BAL液中的IL-6水平分別出現(xiàn)大約68%和91%的抑制。此外，相對于PBS預處理的動物，經(jīng)MANS肽或乙?；碾腟EQIDNO:106預處理的動物BAL液中的KC水平也出現(xiàn)大約65%和71%的抑制。88實施例4:慢性支氣管炎模型采用VoynowJA，F(xiàn)ischerBM,MalarkeyDE,BurchLH，WongT，LongphreM,HoSB,FosterWM，NeutrophilElastaseinducesmucuscellmetaplasiainmouselung,Am.J.Physiol.LungCellMol.Physiol.287丄1293-L1302，2004中所述的方法建立小鼠慢性支氣管炎模型。具體而言，杯狀細胞增生是慢性支氣管炎的標志性病理學特征，通過長期給小鼠氣道內滴入人中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)可誘導杯狀細胞增生。人NE被雄性Balb/c小鼠吸入支氣管內。總共30只小鼠(體重約25-30g)購自供貨商如JacksonLaboratories,BarHarbor,ME。小鼠按照12小時白天周期飼養(yǎng)，隨意獲得食物和水。動物在第1、4、和7天通過口咽吸入而接受NE。云力物經(jīng)吸入Isofluorane(IsoFlofromAbbottLaboratoriesandOpen-CircuitGasAnesthesiaSystemfromStoelting)麻醉后立即以其上切齒懸于60°傾斜板上，將一液體體積的人NE[50ug(43.75單位)/40PBS](ElastinProducts,Owensville，MO)順著動物被牽拉的舌頭輸送至口咽的遠端部分。由于舌頭被牽拉，動物無法吞咽，因此該液體體積被吸入呼吸道內。末次暴露于NE之后第7天，此時杯狀細胞增生最大程度模擬慢性支氣管炎的氣道(見Voynowetal,2004)，給小鼠(每組5只動物)氣管內滴入50|iL的PBS(作為對照)或100pM溶解于PBS的MANS肽溶液、RNS肽溶液、或肽溶液例如乙?；碾腟EQIDNO:106。15分鐘后，通過施用乙酰甲膽堿誘發(fā)粘液分泌，使用Buxco系統(tǒng)噴霧器以提供細微的氣溶膠，輸送大約60mM的乙酰甲膽堿達3分鐘。施用乙酰甲膽堿后15分鐘，通過吸入100%(:02氣體處死小鼠。組織學一經(jīng)上述暴露后，沖洗動物的肺以去除血液，然后充入用鹽水對半稀禾畢的OCT(OptimumCuttingTemperaturemedium(SakuraFinetck,Torrance,CA)。將肺浸沒于PBS中的10%甲醛中4。C過夜，然后石蠟包埋。用高碘酸-希夫/蘇木精處理5pm的切片以便染色氣道內的粘蛋白，例如參見SingerM，VargaftigBB,MartinLD,ParkJJ,GruberAD，LiY，AdlerKB,AMARCKS-relatedpeptideblocksmucushypersecretioninamurinemodelofasthma.，NatureMedicine10:193-196，2004。組織學粘液指數(shù)一在AB/PAS染色的包括中央和外周氣道的切片上進行組織學粘液指數(shù)(WhittakerL，NiuN，TemannU-A,StoddardA，F(xiàn)lavellRA,RayA，HomerRJ,andCohnL，Interleukin-13mediatesafundamentalpathwayforairwayepithelialmucusinducedbyCD4Tcellsandinterleukin-9，Am.J.Respir.CellMol.Biol.27:593—602,2002)。用10X物鏡檢查玻片，數(shù)碼相機獲取圖像。每只動物獲取至少4幅代表性的橫向或徑向氣道截面圖像。僅分析可觀察到完整的氣道周徑并可將其納入圖像中的那些氣道。不分析那些直接敞開至肺泡空間的氣道。可通過一名對各個切片的處理條件不知情的檢查者對圖像中各氣道內PAS-陽性染色的程度進行半定量，采用如下5級系統(tǒng)0級，無PAS染色；l級，25%或以下的氣道上皮具有PAS染色；2級，26-50%的氣道上皮具有PAS染色PAS染色；3級，51-75%的氣道上皮具有PAS染色；和4級，>75%的氣道上皮具有PAS染色。采用這一分級系統(tǒng)來計算各組的粘液指數(shù)評分，結果表示為平均值土SE。所有結果表示為平均值土標準誤(11=5只動物，每只10-20個切片)。將利用SPSS6.1軟件采用單向方差分析繼以Scheffe's檢驗來計算顯著性水平(*==具有p<0.05閾值的數(shù)據(jù)間顯著性)。實施例5:體內分析下組實驗的目的旨在明確通過局部滴入炎癥部位或靜脈注射而體內施用本發(fā)明的肽與對照肽例如RNS相比對炎癥的影響。兩種模型可用于此目的(i)鼠的氣囊(airpouch)炎癥模型和(ii)鼠的巰基醋酸鹽(thioglycollate)誘導的腹膜炎模型。兩者均為充分表征的炎癥模型，中性粒細胞在所述模型中具有關鍵作用。氣囊模型能夠確定肽對短期炎癥(約4小時)的作用，而腹膜炎模型可用于較長期的炎癥(約24小時)?？傮w實驗設計-4項研究，每一模型兩項，其一測試靜脈輸送所述肽，另一個測試局部輸送所述肽，這些研究可用于研究本發(fā)明的肽的作用。每一項研究包括2個實驗組，一個是非炎癥對照(用載體處理)，另一個是炎癥組(即，用炎性刺激物處理)。各組分為5個以及任選地6個處理亞組，各亞組n=6。處理亞組例如為載體、MANS、RNS、測試肽、任選地具有測試肽的亂序序列的肽(該亂序序列稱為"肽-SCR")、和地塞米松。地塞米松充當參照抗炎劑。根據(jù)初步的劑量應答實驗確定如何選擇用于靜脈注射或者局部滴入的合適劑90量?；贛ANS在人中性粒細胞上的抑制活性的試驗劑量為1mg/kg用于靜脈輸送單次施用或者終濃度50pM用于局部輸送(至氣囊或腹腔)。所選的靜脈輸送劑量假定分布容積為2L/kg。氣囊炎癥模型按照文獻所述進行小鼠氣囊內的中性粒細胞侵潤和炎癥分析ClishCB，O'BrienJA，GronertK，StahlGL,PetasisNA，SerhanCN.Localandsystemicdeliveryofastableaspirin-triggeredlipoxinpreventsneutrophilrecruitmentinvivo.ProcNatlAcadSciUSA.1999Jul6;96(14):8247-52。因此，用Isoflumne麻醉白色雄性BALB/c小鼠(6-8wk)，通過在第0天和第3天皮下注射3ml無菌空氣而產(chǎn)生背部氣囊。在第6天，用Isoflumne麻醉小鼠，同時將載體、MANS、RNS、測試肽、或任選地肽-SCR以團注形式，于100無菌的0.9%鹽水中靜脈輸送至尾靜脈內，或者于900的PBS-/-(不含鎂離子或鈣離子的杜伯科磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)，BioWhittaker)中局部輸送至氣囊內。地塞米松(Sigma)以0.1mg/kg于100^無菌0.9°/。鹽水中靜脈輸送或者10ng于900的PBS-/-中局部輸送，充當參照抗炎劑。通過局部注射溶于100mL無菌pbs內的重組鼠腫瘤壞死因子a(TNF-a,20ng)(BoehringerMannheim)在氣囊內誘導炎癥。用Isoflurane麻醉小鼠，同時在首次注射TNF-a后4小時用3mL無菌PBS灌洗氣囊。抽出物2，000rpm離心15分鐘，23。C。去除上清液，細胞懸浮于500的PBS中。取等量上清液用于測定炎癥介質濃度(任選地除外TNFa)、MPO活性和脂質過氧化作用。使用血球計數(shù)器和光學顯微鏡計數(shù)細胞懸液中的總白細胞。將重懸的抽出物細胞(50pL)加至150jxL的30%BSA中并用離心機以2,200rpm離心4分鐘至顯微鏡載片上。在WrightGiemsa染料染色的細胞離心涂片上確定分類白細胞計數(shù)并用于計算每一氣囊滲出液中各類白細胞的絕對數(shù)量。對于顯微鏡分析，用6-mm組織活檢針(Acu-Punch,Acuderm)獲取組織并固定于10%緩沖甲醛中。樣品以石蠟包埋，切片并以蘇木精-伊紅染色。通過計數(shù)每高倍視野的細胞計數(shù)組織切片內的中性粒細胞。用遠處的真皮作為炎癥氣囊真皮的對照。數(shù)據(jù)表示為每一滲出物的中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿91性粒細胞和淋巴細胞的總數(shù)，或者每一組織高倍視野的中性粒細胞數(shù)。所給出的數(shù)值的形式為平均值±SEM(n=6)。通過ANOVA確定任一處理對遷移之影響的顯著性。P〈0.05被認為是具有顯著性。實施例6:炎性腹膜模型使用雄性BALB/c小鼠(6-8wk)并按照如下文獻所述建立巰基醋酸鹽誘導的腹膜炎模型TedderTF，SteeberDA，PizcuetaP.L-selectin-deficientmicehaveimpairedleukocyterecruitmentintoinflammatorysites.JExpMed.1995Junl;181(6):2259-64。將載體、MANS、RNS、測試肽、和任選地肽-SCR以團注形式，于100pL無菌的0.9%鹽水中輸送至尾靜脈內，或者于900的PBS-/-中局部輸送至腹腔內，隨后立即腹腔注射巰基醋酸鹽。地塞米松(Sigma)以0.1mg/kg于100^無菌0.9°/。鹽水中靜脈輸送或者10嗎于卯0的PBS-/-中局部輸送，充當參照抗炎劑。通過給小鼠腹腔注射lmL巰基醋酸鹽溶液(3%wt/vol;SigmaImmunochemicals)引導炎癥。誘導炎癥后24小時對小鼠實施安樂死，并向腹腔內注射5—mL溫(37。C)培養(yǎng)基(RPMI1640,2%FCS，和2mMEDTA)，隨后輕柔按摩腹部。將腹腔灌洗液抽出物在2,000rpm離心15分鐘，23°C。去除上清液，將細胞懸浮于500^L的PBS中。取等量的上清液用于測定MPO活性、炎癥介質濃度和脂質過氧化作用。使用血球計數(shù)器和光學顯微鏡計數(shù)細胞懸液中的總白細胞。將重懸的抽出物細胞(50pL)加至150的30%BSA中并用離心機以2,200rpm離心4分鐘至顯微鏡載片上。在WrightGiemsa染料染色的細胞離心涂片上確定分類白細胞計數(shù)并用于計算每一氣囊抽出液中各類白細胞的絕對數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為每一滲出物的中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和淋巴細胞的總數(shù)。所給出的數(shù)值的形式為平均值±SEM(n=6)。通過ANOVA確定任一處理對遷移之影響的顯著性。P<0.05被認為是具有顯著性。脫顆粒將髓過氧化物酶用作脫顆粒的標志物。如上所述采用TMB方法測定并分析從氣囊或腹腔灌洗液得來的細胞上清液中的髓過氧化物酶活性。炎癥介質濃度使用商品化的ELISA試劑盒(R&DSystems)按照生產(chǎn)商的說明確定氣囊和腹腔灌洗液內的關鍵促炎癥介質TNFa、IL-1(3、IL-IO、IL-6、KC和PGE2的濃度。脂質過氧化作用F2-異前列垸(F2-isoprostane)濃度是中性粒細胞和其他細胞釋放的活性氧中間體所造成的氧化損傷的敏感而特異的測量指標(MilneGL，MusiekES,MorrowJD.F2隱isoprostanesasmarkersofoxidativestressinvivo:anoverview.Biomarkers.2005Nov;10Suppll:S10-23)。使用商品化的ELISA試劑盒(8-IsoprostaneEIA，CaymanChemical)按照生產(chǎn)商的說明確定氣囊和腹腔滲出物上清液內的F2-isoprostane濃度。終點如果局部輸送或者全身輸送測試肽通過一或多種上述抑制炎癥介質釋放的方式減輕了炎癥，則認為這一實驗是成功的。本發(fā)明的活性片段肽抑制中性粒細胞進入氣囊或腹腔以及在其中脫顆粒，由此造成MPO活性降低、脂質過氧化作用減輕、和炎癥介質產(chǎn)生減少。上述實施例是本發(fā)明的例證，因此不能被理解為是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明由所附權利要求書來限定，其中也包括權利要求的各種等價形式。9權利要求1、抑制至少一種炎癥介質自對象的組織和/或體液中的至少一種炎性細胞內的顆粒中釋放的方法，所述方法包括給所述組織和/或體液施用治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含至少一種肽，所述肽具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO1)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO1)的氨基酸序列；和(c)與(a)中所定義的序列基本上相同的氨基酸序列，其中所述肽的C-端氨基酸任選地獨立地被化學修飾，且所述肽的N-端氨基酸獨立地通過使用羧酸進行?；换瘜W修飾或者不被化學修飾，所述羧酸選自如下一組C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，條件是當所述肽的氨基酸序列以所述參照序列的序列GAQF為起始時，所述肽通過僅使用選自如下一組的羧酸進行?；货；揎椈蛘卟槐换瘜W修飾C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，其中所述肽，任選地與藥用可接受的載體相組合，并以降低炎癥介質釋放的治療有效量，使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞中的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下所述炎癥介質自至少一種相同類型的炎性細胞中的釋放相比被降低。2、權利要求l的方法，其中所述肽的N-端a氨基酸被乙酰化。3、權利要求2的方法，其中所述肽由至少10個連續(xù)氨基酸殘基組成。4、權利要求3的方法，其中所述肽由乙?；?06(SEQIDNO:106)組成。5、權利要求l的方法，其中所述肽由至少4個連續(xù)氨基酸殘基組成。6、權利要求l的方法，其中所述肽由至少6個連續(xù)氨基酸殘基組成。7、權利要求l的方法，其中所述肽的N-端(x氨基酸被豆蔻酰化。8、權利要求1的方法，其中使用氨將所述肽的C-端a氨基酸酰胺化。9、權利要求1的方法，其中所述肽包含(a)的氨基酸序列，其中(a)的氨基酸序列的N-端氨基酸選自參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的第2至21位氨基酸。10、權利要求9的方法，其中所述肽的N-端a氨基酸被豆蔻酰化或乙?；?1、權利要求9的方法，其中使用氨將所述肽的C-端a氨基酸酰胺化。12、權利要求1的方法，其中所述降低炎癥介質的釋放包括阻斷或抑制使炎癥介質從所述對象的所述炎性細胞中釋放的機制。13、權利要求1-12中任一項的方法，其中所述肽還包括藥用可接受的載體以形成藥物組合物。14、權利要求12的方法，其中所述炎性細胞是白細胞。15、權利要求12的方法，其中所述炎性細胞是粒細胞。16、權利要求12的方法，其中所述炎性細胞選自中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞及其組合。17、權利要求12的方法，其中所述炎性細胞是單核細胞或巨噬細胞。18、權利要求12的方法，其中所述炎癥介質選自髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶、組胺、蛋白聚糖、蛋白酶、趨化因子、細胞因子、花生四烯酸代謝物、防衛(wèi)素、殺菌性通透性增強蛋白(BPI)、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、p-D-葡糖醛酸糖苷酶、a-甘露糖苷酶、磷脂酶A2、4-硫酸軟骨素、蛋白酶3、乳鐵蛋白、膠原酶、補體激活物、補體受體、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體、層粘連蛋白受體、細胞色素1>558、單核細胞-趨化因子、組胺酶、維生素B12結合蛋白、明膠酶、纖溶酶原激活物、(3-D-葡糖醛酸糖苷酶、及其組合。19、權利要求12的方法，其中所述炎癥介質選自髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶及其組合。20、權利要求1的方法，其中所述降低炎癥介質釋放的有效量的所述肽包含脫顆粒抑制量的肽，其使得自至少一種炎性細胞釋放的炎癥介質的量與缺乏所述肽的情況下自至少一種炎性細胞釋放的量相比降低大約1%至大約99%。21、權利要求1的方法，其中所述降低炎癥介質釋放的有效量的所述肽包含脫顆粒抑制量的肽，其使得自至少一種炎性細胞釋放的炎癥介質的量與缺乏所述肽的情況下自至少一種炎性細胞釋放的量相比降低大約5-50%至大約99%。22、權利要求l的方法，其中所述對象患有呼吸道疾病。23、權利要求22的方法，其中所述呼吸道疾病選自哮喘、慢性支氣管炎、COPD和囊性纖維化。24、權利要求1的方法，其中所述對象是哺乳動物。25、權利要求24的方法，其中所述哺乳動物選自人、犬科、馬科和貓科。26、權利要求1的方法，其中所述施用選自局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、鼻部施用、和口服。27、權利要求26的方法，其中所述肺部施用包括氣溶膠。28、權利要求27的方法，其中所述氣溶膠由干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器或噴霧器產(chǎn)生。29、權利要求1的方法，還包括給所述對象施用第二分子，所述第二分子選自抗生素、抗病毒化合物、抗寄生蟲化合物、抗炎化合物、和免疫調節(jié)劑。30、權利要求1的方法，其中所述對象患有疾病，所述疾病選自腸病、皮膚病、自身免疫病、疼痛綜合征、及其組合。31、權利要求30的方法，其中所述腸病選自潰瘍性結腸炎、克羅恩病和腸激惹綜合征。32、權利要求30的方法，其中所述皮膚病選自紅斑痤瘡、濕疹、銀屑病和重度痤瘡。33、權利要求1的方法，其中所述對象患有關節(jié)炎。34、權利要求1的方法，其中所述與(a)的氨基酸序列基本上相同的(c)的氨基酸序列選自SEQIDNO:233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、247、248、249、250、251和252。35、權利要求34的方法，其中所述肽的N-端a氨基酸被乙?；?。36、權利要求34的方法，其中所述肽的N-端a氨基酸被豆蔻?；?。37、權利要求34的方法，其中使用氨將所述肽的C-端a氨基酸酰胺化。38、一種分離的肽，其具有選自如下一組的氨基酸序列(a)具有參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；(b)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的氨基酸序列；和(c)與(a)中所定義的序列基本上相同的氨基酸序列，其中所述肽的C-端氨基酸任選地獨立地被化學修飾，且所述肽的N-端氨基酸獨立地通過使用羧酸進行酰化而被化學修飾或者不被化學修飾，所述羧酸選自如下一組C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，條件是當所述肽的氨基酸序列以所述參照序列的序列GAQF為起始時，所述肽通過僅使用選自如下一組的羧酸進行酰化而被?；揎椈蛘卟槐换瘜W修飾C2至C13飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、C14不飽和的脂肪族羧酸、C15至C24飽和的或不飽和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，其中所述肽，任選地與藥用可接受的載體相組合，并以降低炎癥介質釋放的治療有效量，使得所述炎癥介質自至少一種炎性細胞中的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下所述炎癥介質自至少一種相同類型的炎性細胞中的釋放相比被降低。39、權利要求38的肽，其中所述肽的N-端a氨基酸被乙?；?0、權利要求39的肽，其中所述肽由至少IO個連續(xù)氨基酸殘基組成。41、權利要求40的肽，其中所述肽由乙?；?06(SEQIDNO:106)組成。42、權利要求38的方法，其中所述肽由至少4個連續(xù)氨基酸殘基組成。43、權利要求38的肽，其中所述肽由至少6個連續(xù)氨基酸殘基組成。44、權利要求38的肽，其中所述肽的N-端a氨基酸被豆蔻?；?5、權利要求38的肽，其中使用氨將所述肽的C-端a氨基酸酰胺化。46、權利要求38的肽，其中所述肽包含(a)的氨基酸序列，其中(a)的氨基酸序列的N-端氨基酸選自參照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQIDNO:l)的第2至21位氨基酸。47、權利要求46的肽，其中所述肽的N-端a氨基酸被豆蔻?；?8、權利要求46的肽，其中使用氨將所述肽的C-端a氨基酸酰胺化。49、權利要求38的肽，其中所述與(a)的氨基酸序列基本上相同的(c)的氨基酸序列選自SEQIDNO:233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、247、248、249、250、251和252。50、權利要求49的肽，其中所述肽的N-端a氨基酸被乙?；?1、權利要求49的肽，其中所述肽的N-端a氨基酸被豆蔻酰化。52、權利要求49的肽，其中使用氨將所述肽的C-端a氨基酸酰胺化。53、組合物，其包含權利要求38至52中任一項的分離的肽和賦形劑。54、藥物組合物，其包含權利要求38至52中任一項的分離的肽和藥用可接受的載體。55、權利要求54的藥物組合物，其中所述組合物無菌的、可消毒的或滅菌的。56、試劑盒，其包含權利要求38至52中任一項的至少一種分離的肽。57、權利要求l-37中任一項的方法，其中施用所述肽降低所述對象的至少一種粘液分泌細胞或組織的MARCKS-相關性粘液分泌過多，由此使得所述對象的粘液分泌過多與不施用所述肽的情況下相比是降低的。全文摘要本發(fā)明包括抑制細胞分泌過程的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過抑制與炎癥介質自炎性細胞的顆粒中釋放有關的機制而抑制或降低炎癥介質自炎性細胞的釋放。就此而言，本發(fā)明公開了細胞內信號機制，這闡明了用于對涉及炎癥介質自炎性細胞的囊泡中分泌的疾病進行藥物干預的多個新的細胞內靶。本發(fā)明所公開的MANS肽的肽片段及其變體可用于此類方法。文檔編號A01N37/18GK101516190SQ200780035710公開日2009年8月26日申請日期2007年7月26日優(yōu)先權日2006年7月26日發(fā)明者I·帕里克申請人:拜歐馬克醫(yī)藥有限公司