專利名稱：用于治療與雌激素受體相關(guān)的疾病的化合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療與雌激素受體相關(guān)的疾病的化合 物、藥物組合物和方法。
背景技術(shù)：
雌激素是與人體中許多關(guān)鍵生理功能有關(guān)的一組激素。雌激素功 能包括使雌性性器官發(fā)育、為懷孕和分娩后的母乳喂養(yǎng)調(diào)理乳腺和子 宮。雌激素還在維持正常心血管功能和骨密度中扮演著重要角色。已 知雌激素會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且可能增大女性罹患癌癥(尤其是乳腺癌 和子宮癌)的風(fēng)險(xiǎn)。
雌激素與目標(biāo)細(xì)胞中的雌激素受體相結(jié)合以調(diào)控細(xì)胞功能。在人 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的雌激素受體，hER-a和hER-(3。它們享有共同 的蛋白結(jié)構(gòu)，各自擁有三個(gè)獨(dú)立但相互作用的功能域N端域(A/B域)、 中心DNA結(jié)合域(C域)和C端配體結(jié)合域(D/E/F域)。N端域具有非配 體依賴性激活功能(AF-1),該功能與跟共激活因子的相互作用以及目標(biāo) 基因在配體不存在時(shí)的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。DNA結(jié)合域在受體二聚和與特 定DNA序列的結(jié)合中扮演重要角色。C端配體結(jié)合域介導(dǎo)配體結(jié)合， 并且具有配體依賴性反式激活功能(AF-2)，在配體存在時(shí)激活基因轉(zhuǎn) 錄。
全長hER-a被鑒定為66 kDa蛋白，并稱作hER-a66。 hER-a66含 有所有三個(gè)功能域。后來發(fā)現(xiàn)了 hER-a66的剪接變體，并將其命名為 hER-a46。 hER-a46具有約46 kDa的分子量，且缺乏hER-a66的N端 AF-1域。近來鑒定出了 一種36 kDa的新型hER-a變體，hER-a36。該變體缺乏hER-a66的N端AF-1域和C端AF-2域(Wang等，所oc/ze肌 5/op/2>^. Comww". 336, 1023-1027 (2005))。
據(jù)信hER-a66通過其目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄激活來介導(dǎo)受雌激素刺激的 細(xì)胞增殖。雌激素與hER-a66的結(jié)合激活了 hER-a66的反式激活域， 由此刺激了下游目標(biāo)基因的表達(dá)并最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖。人們發(fā)現(xiàn)， hER-a46介導(dǎo)由膜引發(fā)且受雌激素刺激的快速NO合成(Li等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 4807-4812 (2003))。還顯示，缺乏AF-1域的hER-a46 抑制hER畫a66的AF-1活性(Flouriot, G.， EMBO， 19, 4688-4700 (2000))。 由于hER-a36缺乏AF-1和AF-2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域，它起到hER-a66和 hER-卩的顯性負(fù)性抑制劑的作用，從而同時(shí)抑制hER-a和hER-卩的AF-1 和AF-2功能。另外，hER-a36主要位于質(zhì)膜上，并且介導(dǎo)膜引發(fā)的促 有絲分裂雌激素信號(hào)傳導(dǎo)，所述雌激素信號(hào)傳導(dǎo)刺激細(xì)胞增殖。(Wang 等，所op/yAs. i 仏Com附w". 336, 1023-1027 (2005); Wang等， 尸rac. A^/Jcad U.S.A. 103: 9063-9068 (2006》。
大量研究顯示，雌激素信號(hào)傳導(dǎo)由經(jīng)典核轉(zhuǎn)錄激活途徑以及非經(jīng) 典膜引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來介導(dǎo)。hER-a66和hER-a46似乎主要在細(xì)胞 核內(nèi)起作用，而hER-a36似乎主要在細(xì)胞核外起作用。
另據(jù)顯示，hER-a36缺乏其原始hER-ot66的配體結(jié)合域的螺旋 8-12，這完全改變了 hER-a36的配體結(jié)合特異性。因此，hER-a36可能 與hER-a66和hER-p結(jié)合不同的配體。
淫羊藿(五p/me^^m)植物含有起激動(dòng)劑或拮抗劑作用的類雌激素化 合物。數(shù)千年來，若干不同品種的淫羊藿在傳統(tǒng)中藥中用作草藥。淫 羊藿藥草被用于治療各種各樣的疾病，如陽痿、遺精、泌尿問題、腰 膝酸軟和疼痛、女性不育、閉經(jīng)、老年抑郁癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血 管功能衰竭、高血壓、慢性支氣管炎、心絞痛等(Wu等，Chemical and pharmacological investigations of Epimedium species: a survey, /VogDrwg i 化60: 1-57(2003))。據(jù)報(bào)道，從淫羊藿藥草中提取的混合物還可降低 罹患與激素相關(guān)的癌癥的風(fēng)險(xiǎn)(U.S. 20030170292)。然而，尚不明確淫 羊藿藥草中的哪些成分可能具有這種功能。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并表征了超過20個(gè)品種的淫羊藿，并且從淫羊藿植物中 鑒定出了 130種以上不同化合物(Wu等，Chemical and pharmacologicalinvestigations of Epimedium species: a survey, /Vog Z>wg 60: 1-57 (2003))。來自淫羊藿植物的化合物主要是黃酮苷類、黃酮類和淫羊藿 次苷類。從淫羊藿植物中分離出的化合物的實(shí)例有芽菜素、大花旋覆 花素、淫羊藿苷、山奈酚、木犀草素、槲皮素等等。
淫羊藿苷是從淫羊藿植物中分離出的黃酮苷化合物。據(jù)顯示，淫 羊藿苷在體外對細(xì)胞增殖沒有影響。然而，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷的兩個(gè)代謝 物—一淫羊藿素和去曱淫羊藿素一一極大地提高了乳腺癌細(xì)胞的增殖 (Liu等，Pharmazie 60: 120-125 (2005); Wang等，Europ. J. Pharm. 504: 147-153 (2004); Ye等，Phytomedicine 12: 735-741 (2005); CN03129242)。
由于雌激素和與雌激素受體相關(guān)的疾病持續(xù)影響許多個(gè)體，因此 仍迫切需要發(fā)現(xiàn)可用于預(yù)防和/或治療這些疾病的新型化合物和方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了用于調(diào)控新型雌激素受體變體 ER-a36的功能的化合物及其衍生物、藥物組合物和方法。本發(fā)明的另 一實(shí)施方式提供了用于預(yù)防和/或治療與ER-a36相關(guān)的疾病的化合物 及其衍生物、藥物組合物和方法。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了用于 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或抑制細(xì)胞增殖、以及用于預(yù)防和/或治療諸如癌癥的 與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的化合物及其衍生物、藥物組合物和方法。 另外，本發(fā)明的另 一實(shí)施方式提供了用于預(yù)防和/或治療哮喘和其它呼 吸系統(tǒng)疾病的化合物及其書f生物、藥物組合物和方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了用于調(diào)控ER-a36的功能的化合物。
能的方法。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了預(yù)防和/或治療與ER-a36的 功能相關(guān)的疾病的方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的化合物。本發(fā) 明的某些實(shí)施方式提供了使用本發(fā)明的化合物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了用于預(yù)防和/或治療與異常細(xì)胞增殖 有關(guān)的疾病的化合物。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了使用本發(fā)明的化合物預(yù)防和或治療受試對象中與異常細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病的方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了用于預(yù)防和/或治療哮喘和其它呼吸 系統(tǒng)疾病的化合物。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了使用本發(fā)明的化合 物預(yù)防和/或治療受試對象中的哮喘和其它呼吸系統(tǒng)疾病的方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了包含本發(fā)明的化合物的藥物組合物。
圖1顯示了說明ER-a66、 ER-a46和ER-a36在人乳腺癌樣品中表 達(dá)的蛋白免疫印跡結(jié)果。道l:正常乳腺組織；道2:浸潤性導(dǎo)管癌； 道3:浸潤性導(dǎo)管癌；道4:侵襲性導(dǎo)管癌；道5:浸潤性小葉癌；道 6:浸潤性小葉癌；道7:非侵襲性導(dǎo)管癌。
圖2(上圖)顯示了用與ER-a36特異性結(jié)合的抗體()染色的 MDA-MB-231細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果(在標(biāo)以"ER-a36"的圖中顯示 陽性染色顯示為綠色)，所述MDA-MB-231細(xì)胞是缺乏ER-a66和 ER-a46的ER陰性乳腺癌細(xì)胞系。細(xì)胞核也用4,6-二脒-2-苯基吲哚染 色(在標(biāo)以"DAPI"的道中顯示陽性染色顯示為藍(lán)色)。融合染色信號(hào) 在標(biāo)以"融合"的道中顯示。當(dāng)將所述抗體與結(jié)合到所述抗體上的免疫 原多肽預(yù)溫育時(shí)觀測到了陰性染色(下圖)。
圖3是用濃度為0、 1 ^M、 5 和10 的淫羊藿素處理1周后 的MDA-MB-231細(xì)胞的顯微鏡照片。
圖4是用濃度為0、 5 jiM、 10 (iM、 20 |iM、 30 nM、 40 和50 的他莫昔芬(TAM)、 ICI 182,780 (ICI)、木犀草素和淫羊藿素處理10天 后的MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞群落數(shù)量的柱狀圖。
圖5a顯示了用濃度為0、 5|liM、 IO]liM、 15 |iM、 20 |uM和25 pM 的他莫昔芬(TAM)、 ICI 182,780 (ICI)、木犀草素和淫羊藿素處理10天 后的MCF7細(xì)胞群落數(shù)量的柱狀圖。圖5b顯示了用濃度為0、 5 pM、 10 pM、 15 fiM、 20 pM和25 |iM的淫羊藿素、IC 163和Y4處理2周 后的存活MCF7細(xì)胞數(shù)量的柱狀圖。
圖6是顯示當(dāng)MCF7細(xì)胞、過表達(dá)ER-a36的MCF細(xì)胞(MCF/ER36) 和抗他莫昔芬MCF7細(xì)胞(MCF7/TAM)用濃度為0、 5 pM、 7.5 和10|iM的淫羊藿素處理2周后的存活細(xì)胞數(shù)量的柱狀圖。
圖7顯示了用濃度為0、20pM和50MM的淫羊藿素處理2周后的 正常乳腺上皮MCF10A細(xì)胞的顯^L照片。
圖8顯示了說明在用17P-雌二醇(E2p)、他莫昔芬(TAM)、血清和 ICI 182,780處理最長達(dá)36小時(shí)后的MCF7細(xì)胞內(nèi)ER-a66、 ER-a46和 ER-a36的表達(dá)模式的蛋白免疫印跡結(jié)果。
圖9顯示了說明在用0-25 iaM的ICI 182,780、淫羊藿素、IC 163 和Y4處理12小時(shí)后的MCF7細(xì)胞內(nèi)ER-a66、 ER-a46和ER-a36的表 達(dá)的蛋白免疫印跡結(jié)果。
圖10是顯示在用濃度為0-10pM的淫羊藿素處理H226肺癌細(xì)胞 (表達(dá)中等水平的ER-a36的肺上皮癌細(xì)胞系)、LNCap細(xì)胞(表達(dá)中等水 平的ER-a36的前列腺癌細(xì)胞系)和PC3細(xì)胞(表達(dá)高水平的ER-a36的 前列腺癌細(xì)胞系)后存活細(xì)胞數(shù)量的柱狀圖。
圖11顯示了說明在用每只小鼠5 mg淫羊藿素的劑量隔天一次地 處理30天后的棵鼠中乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞異種移植體的尺寸減 小的圖片。圖中顯示了處理前和處理后的兩只不同小鼠的兩個(gè)代表性 腫瘤。
圖12顯示了說明在用每只小鼠5 mg淫羊藿素的劑量隔天一次地 處理15天后的小鼠中乳腺癌MCF7細(xì)胞異種移植體的尺寸減小的圖 片。圖中顯示了處理前和處理后的三只不同小鼠的三個(gè)代表性腫瘤。
圖13顯示了(a)顯示在用每只小鼠1 mg淫羊藿素的劑量每周2次 地處理36天后的小鼠中乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞異種移植體尺寸的 圖片，和(b)顯示用淫羊藿素處理的腫瘤的重量變化的柱狀圖。所述淫 羊藿素處理在所述乳腺癌細(xì)胞接種到小鼠內(nèi)之后立即開始進(jìn)行。Gl: 用淫羊藿素處理的小鼠腫瘤。G2:用玉米油處理的小鼠胂瘤。
圖14顯示了植入人乳腺癌BCAP-37細(xì)胞的BALB/c-nu小鼠體內(nèi) 腫瘤的(a)平均腫瘤重量的柱狀圖和(b)肺瘤生長抑制速率的柱狀圖，其 中所述小鼠分別用0.35 mg/鼠/日的他莫昔芬，0.7 mg/鼠/日(高劑量)、 0.35 mg/鼠/日(中劑量)和0.18 mg/鼠/日(低劑量)的淫羊藿素以及0.1 mL 橄欖油(陰性對照)處理；且另外顯示了植入人乳腺癌BCAP-37細(xì)胞的 BALB/c-nu 'J 、鼠體內(nèi)腫瘤的(c)平均腫瘤重量的柱狀圖和(d)肺瘤生長抑制速率的柱狀圖，其中所述小鼠分別用0.35mg/鼠/日的他莫昔芬、0.7 mg/鼠/日的IC 163和等體積的橄欖油(陰性對照)處理。
圖15是顯示植入子宮頸癌U14細(xì)胞的ICR小鼠體內(nèi)腫瘤的(a)平 均腫瘤重量的柱狀圖和(b)腫瘤生長抑制速率的柱狀圖，其中所述小鼠 分別用0.35 mg/鼠/日的他莫昔芬，0.7 mg/鼠/日(高劑量)、0.35 mg/鼠/ 曰(中劑量)和0.18 mg/鼠/日(低劑量)的淫羊藿素以及0.1 mL橄欖油(陰 性對照)處理。
圖16是顯示在MCF7、 PC3前列腺癌細(xì)胞、H226肺癌細(xì)胞和抗他 莫昔芬MCF7細(xì)胞用濃度為0-25 的IC 163處理后的存活細(xì)胞數(shù)量 的柱狀圖。
圖17是顯示在施用高劑量(4 mg/kg/日)和低劑量(l mg/kg/ 曰)IC-163的第4天和第6天由卵白蛋白誘導(dǎo)的哞喘發(fā)作前的潛伏期的 柱狀圖。
圖18是顯示在施用高劑量(4 mg/kg/日)和低劑量(l mg/kg/ 曰)IC-163的第6天在受檢豚鼠的血液中嗜酸性細(xì)胞百分比的柱狀圖。
圖19是顯示在施用高劑量(4 mg/kg/日)和低劑量(l mg/kg/ 曰)IC-163的第6天在受檢豚鼠內(nèi)組胺的血濃度的柱狀圖。
圖20是顯示在施用高劑量(4 mg/kg/日)和低劑量(l mg/kg/ 曰)IC-163的第6天在受才企豚鼠的血液中的IgE的血濃度的柱狀圖。
圖21是顯示在其中用不同濃度的他莫昔芬或淫羊藿素來處理人子 宮內(nèi)膜癌HeclA細(xì)胞的溶液中顏色變化的光密度的線形圖。
具體實(shí)施例方式
化合物及其衍生物
在本文某些實(shí)施方式中提供了用于調(diào)控新型雌激素受體ER-a36 的功能、預(yù)防和/或治療與ER-a36有關(guān)的疾病、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、抑制 細(xì)胞增殖、預(yù)防和/或治療諸如癌癥的與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病、以 及/或者預(yù)防和/或治療哮喘和其它呼吸系統(tǒng)疾病的化合物及其衍生物 以及藥物組合物。
在某些實(shí)施方式中，提供了式(I)的化合物(I)
及其立體異構(gòu)體或前藥，或所述化合物、立體異構(gòu)體和前藥的可藥用 鹽，其中
R，、 R2、 R3、 R4、 R6和R7獨(dú)立地是氫、卣原子、羥基、氨基、-S03H 或其鹽(包括但不限于-S03Na、 -S03K、 -S03Ca1/2、 -S03Mg1/2)、 (C,-C6)
烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C廣C6)烷氧基、(C廣C6)烷基-(CO)-、
曱酰基、曱酰胺基、氰基、硝基、HO-(CK))-、 (C廣C6)烷氧基羰基、氨
基羰基、氨基(C廣C6)烷基、N-(C廣C6)烷基氨基羰基、N,N-[(C!國C6)烷基]2
烷基氨基羰基、N-(C6-do)芳基氨基羰基、N,N-[(CVdo)芳基]2氨基羰基、 N-(d-C6)烷基-N-(d-C6)烷基氨基羰基、N-(C廣C6)烷基-N-(C6-C,o)芳基
氨基羰基、(C6-C一芳基(包括取代芳基)、(C6-do)芳氧基、(Cs-C9)雜芳
基(包括取代雜芳基)、(Cs-C9)雜芳氧基、嗎啉基羰基、(d-C6)烷氧基氨
基羰基、(C廣C6)烷基羰基氨基、(C3-Cg)環(huán)烷基、(C3-Cs)環(huán)烷基曱基、 (C3-C8)雜環(huán)烷基、(C3-C8)雜環(huán)烷基曱基，或R,和R2共同形成為
-CH2CH2C(CH3)20-，且113、 R4、 R6和R7同上述定義。
當(dāng)Y是氫時(shí)，Rs是氬、卣原子、羥基、氨基、(d-C6)烷基、(C2-C6) 烯基、(C2-C6)炔基、(C廣C6)烷氧基、(C廣C6)烷基-(CK))-、曱?；?、曱 酰胺基、氰基、硝基、HO-(C=0)-、 (C,-C6)烷氧基羰基、氨基羰基、氨 基(d-C6)烷基、N-(d-C6)烷基氨基羰基、N,N-[(CrC6)烷基]2氨基羰基、 N-(C6-do)芳基氨基羰基、N，N-[(C6-do)芳基]2氨基羰基、N-(C廣C6)烷基 ->1-((:1-0))烷基氨基羰基、N-(d-C6)烷基-N-(Qrdo)芳基氨基羰基、
(C6-d())芳基、(C6-do)芳氧基、(Cs-C9)雜芳基、(C5-C9)雜芳氧基、嗎啉
基羰基、(C廣C6)烷氧基氨基羰基、(d-C6)烷基羰基氨基、(CrCs)環(huán)烷 基、(C3-Cs)環(huán)烷基曱基、(Q-C8)雜環(huán)烷基、(C3-Cs)雜環(huán)烷基曱基，或Y 和115共同形成為氧代(=0)。
當(dāng)R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6或R7是(C廣C6)烷基基團(tuán)時(shí)，所述(C廣C6) 烷基基團(tuán)上的每個(gè)碳原子可以選擇性地被一至三個(gè)取代基取代，所述取代基獨(dú)立地選自氫、卣原子、(C廣C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-Q)炔
基、(d-Q)烷氧基、(C廣C6)烷基-(C-0)-、曱?；?、曱酰胺基、氰基、 硝基、HO-(CO)-、 (Q-C6)烷氧基羰基、氨基羰基、氨基(C!-C6)烷基、 N-(d-C6)烷基氨基羰基、N,N-[(d-C6)烷基]2氨基羰基、N-(C6-Qo)芳基 氨基羰基、N,N-[(C6-Qo)芳基]2氨基羰基、N-(Q-C6)烷基-N-(d-C6)烷基
氨基羰基、N-(d-C6)烷基-N-(C6-do)芳基氨基羰基、(C6-do)芳基、 (C6-do)芳氧基、(Cs-C9)雜芳基、(C5-C9)雜芳氧基、嗎啉基羰基、(d-C6) 烷氧基氨基羰基、(C廣C6)烷基羰基氨基、(CVC8)環(huán)烷基、(C3-Q)環(huán)烷
基曱基、(CrCs)雜環(huán)烷基、(C3-Cs)雜環(huán)烷基曱基。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括稱作IA1化合物組的一組式(I)的化合 物，其中所述化合物組具有下式
<formula>formula see original document page 14</formula>
其中Rs和R9獨(dú)立地是氫、卣原子、羥基、氨基、(C,-Q)烷基、(C2-C6) 烯基、(CVC6)炔基、(d-C6)烷氧基、(C廣C6)烷基-(C二0)-、曱?；?、曱 酰胺基、氰基、-S03H及其鹽(包括但不限于-S03Na、 S03K、 S03Ca1/2、 S03Mg1/2)、硝基、HO-(C=0)-、 (CrQ)烷氧基羰基、氨基羰基、氨基(d-C6)烷基。
R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 Y同上述定義。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括稱作IA2化合物組的一組式(I)的化合 物，其中所述化合物組具有下式
<formula>formula see original document page 14</formula>
其中R10、 R 、 Ru獨(dú)立地是氫、鹵原子、(C廣C6)烷基、(C2-Q)烯基、(C2-C6)炔基、(C廣C6)烷氧基、氰基、硝基。
R!3和R,4獨(dú)立地是氫、(C廣C6)烷基、(C2-Q)烯基、(C2-C6)炔基、
(d-C6)烷氧基，或共同形成為氧代(K))。
R2、 R3、 R4、 R5、 Re、 R8、 R9、 Y同上述定義。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括稱作IA3化合物組的一組式(I)的化合 物，其中所述化合物組具有下式
R2、 R3、 R4、 R5、 R 、 R10、 Ru、 R12、 R13、 RI4、 Y同上述定義。 本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括稱作IA4化合物組的一組式(I)的化合 物，其中所述化合物組具有下式
其中R2、 R3、 R4、 R5、 &、 R10、 Rn、 Rn和Y同上述定義。 本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括稱作IA5化合物組的一組式(I)的化合 物，其中所述化合物組具有下式
其中R2、 R3、 R4、 R5、 R6和Y同上述定義。 本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括稱作IA6化合物組的一組式(I)的化合物，其中所述化合物組具有下式:
IA6
其中R2是-S03H或其鹽、-OH或其鹽。
R4是-OH或其鹽。
R5和Y共同形成為氧代(=0)。
R^是-OH或其鹽。
特別優(yōu)選的式(I)的化合物的實(shí)例包括但不限于下列化合物 5,7-二羥基-2-(8-(2-羥基-3-曱基丁-3-烯基)-2，2-二曱基-211-色烯-6-
基)-4H-色烯-4-酮；
5,7-二羥基-2-(4-羥基-3-(2-羥基-3-曱基丁-3-烯基)-5-(4-曱基戊-3-
晞基)苯基)-4H-色烯-4-酉同；
5,7-二羥基-2-(8-羥基-2，2-二曱基-2H-色烯-6-基)-4H-色烯-4-酮； 5，7-二羥基-2-(2,2-二曱基-2&色烯-6-基)-4: -色烯-4-酮； 5,7-二羥基-2-(4-羥基-3-(4-曱基戊-3-烯基)苯基)-4H-色烯-4-酮； 3,5,7-三羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮； 3，5,7-三羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-甲基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-
酮；
2-(3-氨基-4-曱氧基苯基)-3,5-二羥基-8-((3,3-二曱基環(huán)氧乙烷-2-基)-4-氧代-4H-色烯-7-基硫酸氫鹽； 3,5-二羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4-氧代-411-色烯-7-基硫酸氫鹽；
3,5-二羥基-2-(4-曱氧基-3-硝基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4-氧代 -4H-色烯-7-基硫酸氫鹽；
2-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-3,5-二羥基-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4-氧代 -4H-色烯-7-基硫酸氫鹽；
3，5-二羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-((3,3-二曱基環(huán)氧乙烷-2-基)曱 基)-4H-色烯-4-酮；3，5-二羥基-2-(4-曱氧基-3-硝基苯基)-8-((3,3-二曱基環(huán)氧乙烷-2-基) 曱基)-4-氧代-4H-色烯-7-基硫酸氫鹽；
3,5-二羥基-8-(2,3-二羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基)-4-氧代 -4H-色烯-7-基硫酸氬鹽；
3，5-二羥基-8-(2，3-二羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基-3-硝基苯基)-4-氧代-4H-色烯-7-基硫酸氫鹽；
2-(3-氨基-4-曱氧基苯基)-3，5-二羥基-8-(2，3-二羥基-3-曱基丁基)-4-氧代-4H-色烯-7-基硫酸氫鹽；
5,7-二羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮；
5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-411-色烯-4-酮；
2,3-二氫-5，7-二羥基-2誦(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)色烯-4-
酮；
7-羥基_2—(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮； 5,7-二羥基-2-(3,4-二羥基苯基)-4&色烯-4-酮； (2S)-2,3-二氫-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-6-(3-曱基-2-丁烯基)-4H-l-苯 并吡喃-4-酮；
(2S)-2,3-二氫-2-(4-羥基苯基)-7-曱氧基-6-(3-曱基-2-丁烯基)-41^-1-苯并p比喃-4-酮；
3,5-二羥基-2-(4-羥基苯基)-8,8-二曱基-9，10-二氫-4H,8H-吡喃并 [2,3-f]色烯-4-酮(本文中也稱作Y4);
3，5-二羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8,8-二曱基-9,10-二氫-4H,8H-吡喃并 [2,3-幻色烯-4-酮；
3,5，7-三羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4H-色烯-4-酮；
3,5,7-三羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(本文中也稱作IC 163)。
本文中提供的化合物和衍生物可以根據(jù)IUPAC (國際純粹與應(yīng)用 化學(xué)聯(lián)合會(huì))或CAS (化學(xué)文摘服務(wù)社，Columbus， OH)命名系統(tǒng)命名。
本文中的各種包含烴類的部分的碳原子含量可以通過標(biāo)明所述部 分中的最小和最大碳原子數(shù)的前綴來表明，例如，前綴(Ca-Cb)烷基表 明具有包括整數(shù)"a"、 "b"在內(nèi)的"a"至"b"個(gè)碳原子的烷基部分。因此，例如，(d-C6)烷基指具有l(wèi)-6個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)。
術(shù)語"烷氧基"指與一個(gè)氧原子鍵合的直鏈的或支鏈的、單價(jià)的、 飽和脂肪族碳原子鏈。烷氧基基團(tuán)的實(shí)例包括曱氧基、乙氧基、丙氧 基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基等等。
術(shù)語"烷基"指直鏈的或支鏈的、單價(jià)的、飽和脂肪族碳原子鏈， 并且包括，例如，曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、 異戊基、己基等等。
術(shù)語"烯基"表示含一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈烴類，并且包括， 例如，乙烯基、烯丙基等等。
術(shù)語"芳基"表示環(huán)狀芳香烴類。芳基基團(tuán)的實(shí)例包括苯基、萘基、 蒽基、菲基等等。
術(shù)語"環(huán)烷基"表示飽和的單環(huán)或多環(huán)環(huán)烷基基團(tuán)，其任選地與芳 香烴基團(tuán)稠合。環(huán)烷基基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán) 己基、環(huán)庚基、茚滿基、四氫萘基等等。
術(shù)語"卣素，，或"卣原子"表示氯、溴、氟和碘原子。
術(shù)語"雜芳基，，表示其中一個(gè)或多個(gè)碳原子已被諸如氮、氧或-琉的 雜原子替代的單環(huán)或多環(huán)芳香烴基團(tuán)。如果雜芳基基團(tuán)含有多于一個(gè) 的雜原子，所述雜原子可以相同或不同。雜芳基基團(tuán)的實(shí)例包括苯并 呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、色烯 基、呋喃基、咪唑基、吲唑基、中氮茚基、巧l哚基、異苯并呋喃基、 異吲哚基、異喹啉基、異蓉唑基、異噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁 嗪基、噁唑基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、哌嗪基、吡唑基、
噠嗪基、吡啶并[3，4-b]吲哚基、p比咬基、嘧咬基、吡咯基、喹嗪基、喹 啉基、p塞二唑基、噻三唑基、噻唑基、噻吩基、三。秦基、三唑基、口占
噸基等等。
術(shù)語"雜環(huán)垸基"表示飽和的單環(huán)或多環(huán)環(huán)烷基基團(tuán)，其任選地與 芳香烴基團(tuán)稠合，其中至少一個(gè)碳原子被諸如氮、氧或硫的雜原子替 代。如果雜環(huán)烷基基團(tuán)含有多于一個(gè)的雜原子，所述雜原子可以相同 或不同。這類雜環(huán)烷基基團(tuán)包括氮雜雙環(huán)庚烷基、氮雜環(huán)丁烷基、。引 哚啉基、嗎啉基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、四氫咬喃基、四氫喹 啉基、四氫吲唑基、四氫吲哚基、四氫異p奎啉基、四氫吡喃基、四氬喹喔啉基、四氬噻喃基、噻唑烷基、硫代嗎啉基、噻噸基、噻噁烷基 等等。
環(huán)狀基團(tuán)可以以 一種以上的方式與另 一個(gè)基團(tuán)鍵合。如果沒有指 定特定的4建合排列，則所有可能的排列均在預(yù)料之中。例如，術(shù)語"P比
啶基"包括2-、 3-或4-吡咬基，而術(shù)語"蓬吩基"包括2-或3-"塞吩基。 術(shù)語"氧代"是指碳原子和氧原子化合形成的羰基基團(tuán)。 術(shù)語"前藥"指作為在向受試對象施用后在體內(nèi)通過化學(xué)或生理過 程(例如，被置于生理pH條件下或通過酶的活性)釋放藥物的藥物前體 的化合物。在ACS Symposium Series vol. 14中T. Higuchi和W. Stella 戶斤著的"Prodrugs as Novel Delivery Systems"以及Edward B. Roche戶斤著 的 Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987中提供了前藥合成和使用的討論， 本文通過參考引用了上述兩者。術(shù)語"前藥"可包括本發(fā)明的化合物的 代謝前體。所述前藥在向受試對象施用時(shí)可以為非活性的，但在體內(nèi) 被轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的化合物。所述前藥可以是天然存在的化合物或合成 化合物。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括了可以在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為3，5,7-三羥 基—2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮、3,5,7-三羥基 —2_(4一曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮、3,5，7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4^色烯-4-酮或3,5,7-三羥基 -8-(3-輕基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基)-4H-色烯-4-酮的前藥。在本發(fā) 明中包括了這些前藥及其體內(nèi)代謝物。
本發(fā)明的前藥的實(shí)例包括但不限于下列化合物
3-[(6-脫氧-a-L-吡喃甘露糖基)氧基]-7-(b-D-吡喃葡萄糖氧基)-5-羥 基—2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基-2-丁烯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮；
7-(b-D-吡喃葡萄糖氧基)-3,5-二羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-甲基 -2-丁烯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮；
3-[(6-脫氧-3丄-吡喃甘露糖基)氧基]-5,7_二羥基-2-(4_曱氧基苯 基)—8_(3—曱基-2-丁烯基)-4H-1 -苯并吡喃-4-酉同；
3-[[4-0-乙酰基-3-O(6-0-乙?；?b-D-葉匕喃葡萄糖基)-6-脫氧-a-L-吡喃甘露糖基]氧基]-7-(b-D-吡喃 葡 萄 糖氧基)-5-羥基-2-(4-曱 氧基苯基)-8-(3-曱基-:丁烯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮；
3-[(6-脫氧-2-0-b-D-吡喃葡萄糖基-a-L-吡喃甘露糖基)氧基]-5,7-二 輕基_2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基-2-丁烯基MH-1 -苯并吡喃-4-酮；
2- [4-[(6-脫氧-a-L-吡喃甘露糖基)氧基]苯基-3，5,7-三羥基-8-(3-曱基 -2-丁烯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
3，5- 二羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁 -2-烯 基)-7-[(2R,3R,4S，5R，6R)-3，4,5-三羥基-6-(羥基曱基)環(huán)氧乙烷-2-基]氧基 _色烯_4-酮；
3- [(2S,3R,4R,5S,6S)-4,5-二羥基-6-甲基-3-[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,4,5隱 三羥基_6-曱基-環(huán)氧乙烷-2-基]氧基-環(huán)氧乙烷-2-基]氧基-5-羥基-2-(4-曱 氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-7-[(2S,3R，4S,5R,6R)-3,4,5-三羥基-6-(羥 基曱基)環(huán)氧乙烷-2-基]氧基-色烯-4-酮；
在本發(fā)明中包括了上面所列前藥及其體內(nèi)代謝物。 短語"可藥用"表示指定載體、載劑、稀釋劑、賦形劑和/或鹽通常
與構(gòu)成所述制劑的其它成分是化學(xué)和/或物理相容的，且與其接受對象
是生理相容的。
術(shù)語"鹽"和"可藥用鹽，，指式(I)的化合物或其立體異構(gòu)體或前藥的 有機(jī)鹽或無機(jī)鹽。這些鹽可以在化合物的最后分離和純化時(shí)原位制備， 或通過將式(I)的化合物或其立體異構(gòu)體或前藥獨(dú)立地與合適的有機(jī)或 無機(jī)的酸或堿反應(yīng)并分離因此所形成的鹽來制備。代表性鹽包括氫溴 酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、苯磺 酸鹽、軟脂酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯曱酸鹽、乳酸鹽、 磷酸鹽、曱苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、 酒石酸鹽、萘二甲酸鹽、曱磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽和十二烷 基磺酸鹽以及類似物。這些鹽也可包括基于堿金屬和堿土金屬的陽離 子，諸如鈉、鋰、鉀、4丐、鎂等等，以及無毒的銨離子、季銨離子和 胺陽離子，包括但不限于銨、四曱基銨、四乙基銨、曱胺、二曱胺、 三曱胺、三乙胺、乙胺等等。更多實(shí)例參見例如，本文通過參考引用 的Berge等，J. Pharm. Sci" 1-19 (1977)。
式(I)的化合物的鹽可以通過將式(I)的化合物溶液與所需酸或堿適 當(dāng)?shù)幕旌蠌亩菀椎刂苽?。所述鹽可從溶液中析出并通過過濾收集或可通過蒸發(fā)溶劑來回收。
術(shù)語"取代的"是指分子中的氫原子已被不同原子或分子替代。替 代氫原子的所述原子或分子稱作"取代基"。
式(I)的化合物可以包含不對稱或手性中心，從而以不同立體異構(gòu) 形式存在?？深A(yù)期的是，所有式(I)的化合物的立體異構(gòu)形式及其混合 物，包括外消旋混合物構(gòu)成本發(fā)明的一部分。此外，也設(shè)想了所有的 幾何和位置異構(gòu)體。例如，如果式(I)的化合物含有雙鍵，則順式和反 式兩種形式及其混合物也都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
非對映異構(gòu)混合物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法(如色 譜和/或分級結(jié)晶)基于它們的物理化學(xué)差異來分離為它們的各個(gè)非對 映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體可以通過將對映異構(gòu)混合物經(jīng)與合適的光學(xué)活
性化合物反應(yīng)來轉(zhuǎn)化為非對映異構(gòu)混合物，分離非對映異構(gòu)體并將各 個(gè)非對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化(例如，水解)為相應(yīng)的純對映異構(gòu)體而得到分離。 另外，某些式(I)的化合物可以為阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體(例如，取代聯(lián)芳烴)且也認(rèn) 作本發(fā)明的一部分。
式(I)的化合物可以以非溶劑化形式或與諸如水、乙醇等等可藥用 溶劑的溶劑化形式存在，且可預(yù)期的是本發(fā)明包括所有溶劑化和非溶 劑化的形式。
這些形式都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在某些實(shí)施方式中，提供了同位素標(biāo)記的式(I)的化合物，所述同 位素標(biāo)記化合物與本文中所列化合物相同，但一個(gè)或多個(gè)原子被具有 與通常發(fā)現(xiàn)于自然界的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不相同的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù) 的原子所替代?？梢砸胧?I)的化合物中的同位素的實(shí)例包括氫、碳、
氮、氧、磷、氟和氯的同位素，分別諸如&、 3H、 '3C、 14C、 15N、 170、 180、 3'P、 32P、 35S、，和^C1。含有上述同位素和/或其它原子的其它 同位素的式(I)的化合物及其立體異構(gòu)體和前藥，以及所述化合物、立 體異構(gòu)體或前藥的可藥用鹽預(yù)期包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
某些同位素標(biāo)記的式(I)的化合物，例如引入了諸如311和14C的放 射性同位素的化合物，可用于化合物和/或底物組織分布分析。氚(即3H) 和碳_14(即"C)同位素因其相對容易制備和易于檢測而特別優(yōu)選。另外，諸如氘(即2H)的較重同位素的可由于更高的代謝穩(wěn)定性(如增加的
體內(nèi)半衰期或減少的劑量要求)從而提供某些治療優(yōu)勢，因此可在某些 情況下優(yōu)選。所述同位素標(biāo)記的式(I)的化合物一般可用本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員已知的方法諸如用同位素標(biāo)記的試劑替代非同位素標(biāo)記的試劑 來制備。
使用方法
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物是ER-a36的選擇性調(diào)控劑， 并可用于調(diào)控體外和體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的ER-a36功能。所述化合物還可用于 預(yù)防和/或治療與ER-a36功能相關(guān)的疾病。在某些實(shí)施方式中，本發(fā) 明的化合物可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或抑制細(xì)胞增殖并因此可用于預(yù)防和/ 或治療與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化 合物可用于預(yù)防和/或治療哮喘和其它呼吸系統(tǒng)疾病。
在某些實(shí)施方式中，提供了調(diào)控細(xì)胞中ER-a36功能的方法，所述 方法包括將表達(dá)ER-a36的細(xì)胞暴露于式(I)的化合物。所述細(xì)胞可以通 過基因工程來內(nèi)源性或外源性地表達(dá)ER-a36。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)ER-a36。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是內(nèi)源性 地表達(dá)ER-a36的癌細(xì)胞。表達(dá)ER-a36的癌細(xì)胞實(shí)例為乳腺癌細(xì)胞、 白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、 結(jié)腸癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表達(dá)ER-a36的 細(xì)胞是內(nèi)源性地表達(dá)ER-a36的乳腺癌細(xì)胞。表達(dá)ER-a36的乳腺癌細(xì) 胞實(shí)例為MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞。內(nèi)源性ER-a36的表達(dá)可以通 過用一種或多種試劑處理而增加或減少。這些試劑的實(shí)例為血清、 E2卩(17(3-雌二醇)、他莫昔芬和ICI 182,780。
在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)基因工程改變以表達(dá)外源性ER-a36。 表達(dá)外源性ER-a36的細(xì)胞可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的基因工程 方法制備(參見Saw6raoA:等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory))。筒言之，制備外源性ER-a36 基因并將其嵌入表達(dá)載體中，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到寄主細(xì)胞內(nèi)，所 述寄主細(xì)胞在適于表達(dá)所述外源性ER-a36的培養(yǎng)溶液中生長。人 ER-a36的基因序列實(shí)例公開在Wang等，Biochem. Biophys. Res.Commun. 336, 1023-1027 (2005) (GenBank登錄號(hào)BX640939)。表達(dá)外 源性ER-a36的細(xì)胞可以表達(dá)或不表達(dá)內(nèi)源性ER-a36。細(xì)胞中內(nèi)源性 或外源性ER-a36的表達(dá)水平可以通過用一種或多種其它試劑處理而 增加或減少。這些試劑的實(shí)例為血清、E2p(17p-雌二醇)、他莫昔芬和 ICI 182,780。
表達(dá)ER-a36的細(xì)胞可以表達(dá)或不表達(dá)諸如ER-a66、 ER-a46和 ER-J3的其它雌激素受體。
在某些實(shí)施方式中，提供了預(yù)防和/或治療受試對象內(nèi)與ER-a36 相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括對所述受試對象施用包含式(I)化合 物的藥物組合物。與ER-a36相關(guān)的疾病的實(shí)例包括4旦不限于骨質(zhì)流 失、骨折、骨質(zhì)疏松、轉(zhuǎn)移性骨病、帕哲氏病、牙周病、軟骨退變、 子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤病、潮熱、LDL膽固醇水平升高、心血管 病、認(rèn)知功能障礙、大腦退行性病變、術(shù)后再狹窄、男性乳房發(fā)育癥、 血管平滑肌細(xì)胞增殖、肥胖、尿失禁、焦慮、雌激素缺乏造成的抑郁、 圍絕經(jīng)期抑郁、產(chǎn)后抑郁、經(jīng)前期綜合征、躁郁、焦慮、癡呆、強(qiáng)迫 癥、注意力不足癥、睡眠障礙、易怒、沖動(dòng)、免疫缺陷、自身免疫性 疾病、憤怒控制、多發(fā)性硬化癥和帕金森癥、炎癥、炎癥性腸病、呼 吸系統(tǒng)疾病、性功能障礙、高血壓、視網(wǎng)膜變性、哮喘和癌癥。優(yōu)選 的是，與ER-a36相關(guān)的疾病包括骨質(zhì)流失、骨折、骨質(zhì)疏松、絕經(jīng)、 經(jīng)前期綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮疾病、陽痿、性功能障礙、LDL 膽固醇水平升高、心血管病、血管平滑肌細(xì)胞增殖、雌激素缺乏造成 的抑郁、圍絕經(jīng)期抑郁、產(chǎn)后抑郁、免疫缺陷、自身免疫性疾病、炎 癥、哮喘和癌癥。更優(yōu)選的是，與ER-a36相關(guān)的疾病包括骨質(zhì)流失、 骨質(zhì)疏+>、陽痿、心血管病、免疫缺乏、炎癥、哮喘和癌癥。所述受 試對象可以為哺乳動(dòng)物，如狗、貓、牛、羊、馬或人，優(yōu)選人。所述 方法的必需治療量根據(jù)具體疾病不同而變化并且可由獲益于本公開的 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。
在某些實(shí)施方式中，提供了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括 將細(xì)胞暴露于有效量的式(I)的化合物。另外，本發(fā)明的某些實(shí)施方式 提供了抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將細(xì)胞暴露于有效量的式(I) 的化合物。所述細(xì)胞可以正?；虍惓ＩL。異常細(xì)胞生長可以為良性或惡性的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為癌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方 式中所述癌癥為肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌(結(jié)腸癌、直腸 癌)、腦癌、乳腺癌、類癌、宮頸癌、內(nèi)分泌癌、子宮內(nèi)膜癌、眼癌、 膽嚢癌、頭頸部癌、卡波濟(jì)肉瘤癌、腎癌、喉癌、白血病、肝癌、肺 癌、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、食管癌、 卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌、前列腺癌、皮膚癌、軟組織肉瘤癌、脊髓 癌、胃癌、睪丸癌、曱狀腺癌、陰道癌、外陰癌或子宮癌。在更優(yōu)選 的實(shí)施方式中，所述癌癥為乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、 白血病、肝癌、肺癌、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌或子宮癌。 在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述癌癥為乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、 肺癌、子宮癌或前列腺癌。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可以內(nèi)源性
或外源性地表達(dá)雌激素受體，尤其是ER-a36。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 所述細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)ER-a36。
用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或細(xì)胞增殖的式(I)的化合物的有效量根據(jù)具 體細(xì)胞類型和治療條件的不同而變化。該有效量可由享有本公開的益 處的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞暴露 于的式(I)的化合物的有效量為至少約5 )iM的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，細(xì)胞暴露于的式(I)的化合物的濃度在約5 jiM-100 范圍內(nèi)。優(yōu) 選的是，所述有效量是在約5 |iM-50 iiM或約5 ^M或約5 pM-25
pM或約5 jiM-20 或約5 jiM-10 |iM范圍內(nèi)的化合物濃度。
在某些實(shí)施方式中，提供了預(yù)防和/或治療受試對象中與異常細(xì)胞 增殖相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括對受試對象施用治療有效量的 包含式(I)化合物的藥物組合物。
所述異常細(xì)胞增殖可為良性細(xì)胞生長或癌性的。在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病是癌癥。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 所述癌癥是肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌(結(jié)腸癌、直腸癌)、 腦癌、乳腺癌、類癌、宮頸癌、內(nèi)分泌癌、子宮內(nèi)膜癌、眼癌、膽嚢 癌、頭頸部癌、卡波濟(jì)肉瘤癌、腎癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、 淋巴癌、黑色素癌、間皮癌、骨髓瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、食管癌、卵巢 癌、胰腺癌、陰莖癌、前列腺癌、皮膚癌、軟組織肉瘤癌、脊髓癌、 胃癌、睪丸癌、曱狀腺癌、陰道癌、外陰癌或子宮癌。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述癌癥是乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、白血 病、肝癌、肺癌、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌或子宮癌。在更 加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述癌癥是乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺 癌、子宮癌或前列腺癌。
在某些實(shí)施方式中，提供了預(yù)防和/或治療受試對象中哮喘和其它 呼吸系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量 的包含式(I)化合物的藥物組合物。哮喘指可逆性氣流阻塞的氣道炎癥。 其它呼吸系統(tǒng)疾病可包括呼吸道和肺功能障礙諸如支氣管炎、嚢性纖 維化、肺氣腫、肺炎、鼻炎和鼻竇炎。
所述受試對象優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳 動(dòng)物是狗、貓、牛、羊、馬或人。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng) 物是人。
式(I)的化合物可以通過任何能使所述化合物輸送到作用位點(diǎn)的方 法來施用于受試對象。這些方法包括但不限于口服施用、經(jīng)口腔施用、
舌下施用、經(jīng)眼施用、局部施用(topical)(例如，透皮施用)、腸胃外施 用(例如，靜脈施用、肌內(nèi)施用、或皮下施用、血管內(nèi)施用或輸注)、經(jīng) 直腸施用、腦池內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、腹腔內(nèi)施用、膀胱內(nèi)施用或經(jīng) 鼻施用方法。
式(I)的化合物可以以每日約0.1 mg-約3,000 mg范圍內(nèi)的劑量水平 施用于受試對象，優(yōu)選的是約0.1 mg/日-約1,000 mg/日，或約1 mg/日 -約500 mg/日，或約1 mg/日-約300 mg/日，或約10 mg/日-約300 mg/ 日，或約10 mg/日-約200 mg/日，或約20 mg/日-約200 mg/日，或約 30 mg/日-約200 mg/日，或約40 mg/日-約200 mg/日，或約50 mg/日-約200 mg/日，或約50mg/日-約100mg/日。對于體重約70kg的正常 成年人，每kg體重約0.01 mg-約100 mg范圍內(nèi)的劑量通常足夠，且 優(yōu)選的是約0.1 mg/kg-約100mg/kg,或約0.5 mg/kg-約100mg/kg,或 約1 mg/kg -約100 mg/kg,或約1 mg/kg隱約75 mg/kg，或約1 mg/kg -約50 mg/kg,或約1 mg/kg -約25 mg/kg，或約1 mg/kg -約10 mg/kg， 或約2mg/kg-約5mg/kg。然而， 一般劑量范圍可能需要一些變化，這 取決于受治療的受試對象的年齡和質(zhì)量、預(yù)期施用途徑、具體施用化 合物等等。獲益于本公開的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員有能力確定用于具體哺乳動(dòng)物受試對象的劑量范圍和最佳劑量。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種或多種化合物可以彼此聯(lián)合使 用。任選的是，本發(fā)明的化合物可以與任何其它用于調(diào)控細(xì)胞功能或 治療疾病的活性試劑聯(lián)合使用。如果使用活性化合物的組合，則它們 可同時(shí)、分別或依次地施用。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物可以與一種或多種其它抗癌 劑聯(lián)合使用。適合的抗癌劑包括但不限于烷基化劑、氮芥、葉酸拮抗 劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑、紡錘體毒素、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、凋 亡誘導(dǎo)劑、血管生成抑制劑、鬼臼毒素、亞硝基脲、抗代謝物、蛋白 合成抑制劑、激酶抑制劑、抗雌激素、順鉑、卡鉑、干擾素、天冬酰 胺酶、亮丙瑞林、氟他胺、曱地孕酮、絲裂霉素、博萊霉素、阿霉素、 依立替康和紫杉醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗癌劑是諸如他莫昔芬
和ICI 182,780的抗雌激素。
本發(fā)明的化合物可以用表達(dá)外源性ER-a36的重組細(xì)胞來檢測其 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或抑制細(xì)胞增殖的能力。為了制備所述重組細(xì)胞，制備 外源性ER-a36基因并將其嵌入表達(dá)載體中，然后用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 不表達(dá)或低水平表達(dá)內(nèi)源性ER-a36的宿主細(xì)胞，然后選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 宿主細(xì)胞作為用于所述檢測試驗(yàn)的重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞在有本發(fā) 明的化合物或沒有本發(fā)明的化合物的情況下溫育。比較在使用或不用 本發(fā)明的化合物處理的試驗(yàn)中存活的細(xì)胞數(shù)。當(dāng)在用所述測試化合物 處理的試驗(yàn)中存活的細(xì)胞數(shù)低于不用所述測試化合物處理的試驗(yàn)中存 活的細(xì)胞數(shù)時(shí)，所述測試化合物可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或抑制細(xì)胞增殖。
上面所討論的重組細(xì)胞還可用于4企測本發(fā)明的化合物調(diào)控ER-a36 功能的能力。在相同條件下用所述檢測化合物處理表達(dá)外源性ER-a36 的重組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方 法觀察并分析所關(guān)注的ER-a36功能。所述功能包括但不限于諸如絲裂 原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)途徑或Jim NH2端激酶(JNK)途徑的活化 的ER-a36刺激其下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力。
藥物組合物
在本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方式中，式(I)的化合物或其立體異構(gòu)體或前藥，或所述化合物、立體異構(gòu)體或前藥的可藥用鹽可以以包含 可藥用載體、載劑或稀釋劑的藥物組合物的形式來進(jìn)行施用。于是， 式(I)的化合物或其立體異構(gòu)體或前藥、或所述化合物、立體異構(gòu)體或 前藥的可藥用鹽可以以任何傳統(tǒng)劑型分別或一起對受試對象施用，所 述劑型包括口服劑型、經(jīng)口腔劑型、舌下劑型、經(jīng)眼劑型、局部劑型、 腸胃外劑型、經(jīng)直腸劑型、腦池內(nèi)劑型、陰道內(nèi)劑型、腹腔內(nèi)劑型、 膀胱內(nèi)劑型、局域劑型(例如，粉末劑、軟膏劑或滴劑)或經(jīng)鼻劑型。
適用于腸胃外注射的藥物組合物可以包括可藥用無菌水溶液或非 水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于即時(shí)復(fù)水為無菌可注射性 溶液或分散液的無菌粉末。適合的水性或非水性載體、載劑和稀釋劑 包括水、乙醇、多元醇(諸如丙二醇、聚乙二醇、甘油等等)、上述物質(zhì) 的適當(dāng)混合物、植物油(諸如橄欖油)和可注射性有機(jī)酯諸如油酸乙酯。 通過例如使用諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情形中保持必需的顆粒 大小、以及使用表面活性劑可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物還可包含佐劑，諸如防 腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。對所述組合物受微生物污染的預(yù)防 可以由各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯曱酸酯、氯丁醇、苯酚、 山梨酸等等來完成。另外理想的是包含例如糖、氯化鈉等等的等滲劑。 可注射的藥物組合物的延長吸收可受到使用例如單硬脂酸鋁和明膠的 能延緩吸收的試劑的影響。
口服施用的固體劑型可包括膠嚢劑、片劑、粉末劑和顆粒劑。在 這些固體劑型的某些實(shí)施方式中，活性化合物與至少 一種惰性傳統(tǒng)藥
物賦形劑(或載體)諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣，或(a)填料或增量劑，例如， 淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或硅酸；(b)粘合劑，例如，羧曱基纖維素、 藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如， 甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、土豆淀粉或木薯淀粉、海藻 酸、某些復(fù)合硅酸鹽或碳酸鈉；(e)溶液緩凝劑，例如，石蠟；(f)吸收 促進(jìn)劑，例如季銨鹽化合物；(g)潤濕劑，例如，十六醇或甘油單硬脂 酸酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土或膨潤土；和/或(i)潤滑劑，例如，滑 石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉或上述 物質(zhì)的混合物進(jìn)行共混。在膠嚢劑和片劑的情形中，劑型可另外包含緩沖劑。
在某些實(shí)施方式中，固體劑型可與充當(dāng)釋放速率修飾劑的其他賦 形劑一起配制為包含諸如上文詳述的用于立即釋放劑型的那些賦形劑 的緩釋劑型和脈沖釋放劑型，所述其他賦形劑被涂覆于裝置體之上和/ 或包括在裝置體之中。釋放速率修飾劑包括但不限于羥丙基曱基纖維 素、曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素、醋酸纖維素、聚氧 化乙烯、黃原膠、聚曱基丙烯酸銨酯、氫化蓖麻油、巴西棕櫚蠟、石 蠟、鄰苯二曱酸醋酸纖維素、鄰苯二曱酸羥丙基曱基纖維素、曱基丙 烯酸共聚物以及上述物質(zhì)的混合物。緩釋劑型和脈沖釋放劑型可以含 有一種釋放速率修飾賦形劑或釋放速率修飾賦形劑的組合。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可另外包含快速分散或
快速溶解劑型(FDDF),所述FDDF含有下列成分阿斯巴甜、乙?；?胺酸鉀、檸檬酸、交聯(lián)曱羧纖維素鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、二聚抗 壞血酸、丙烯酸乙酯、乙基纖維素、明膠、羥丙基曱基纖維素、硬脂 酸鎂、甘露醇、曱基丙烯酸曱酯、薄荷香料、聚乙二醇、熏硅、二氧 化硅、羧曱基淀粉鈉、硬脂酰富馬酸鈉、山梨醇、木糖醇。本文用于 描述FDDF的術(shù)語分散或溶解取決于所用藥物的溶解度，即當(dāng)所述藥 物不溶時(shí)，可制備快速分散劑型，而當(dāng)所述藥物可溶時(shí)，可制備快速 溶解劑型。
相似類型的固體組合物也可在軟填充或硬填充明膠膠嚢中用作填 料，所述膠嚢使用諸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇和類似物質(zhì) 的輔料。
在某些實(shí)施方式中，固體劑型諸如片劑、糖衣丸劑、膠嚢劑和顆 粒劑可以制成帶包衣和外殼，諸如腸溶衣和其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 熟知的包衣和外殼。所述固體劑型還可包含遮光劑，并且也可含有以 延遲、持續(xù)或受控方式釋放活性化合物的組合物?？刹捎玫陌窠M合 物的實(shí)例是聚合物和蠟。所述活性化合物也可具有包含一種或多種上 述賦形劑C如果合適的話)的微膠嚢化形式。
在某些實(shí)施方式中，用于口服施用的液體劑型包括可藥用乳液劑、 溶液劑、懸浮劑、糖漿劑和酏劑。除活性化合物以外，所述液體劑型 可包含本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，諸如水或其它溶劑、增溶劑和/或乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、苯曱酸千酯、丙二醇、1，3-丁二 醇、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油或芝 麻油)、甘油、四氬糠醇、聚乙二醇或脫水山梨醇脂肪酸酯，或這些物 質(zhì)的混合物，等等。
除這些惰性稀釋劑以外，所述藥物組合物也可包括佐劑，諸如潤 濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、增味劑和增香劑。所述藥物組合物 還可包括懸浮劑，例如，乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚 氧乙烯脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃 芪膠，或上述物質(zhì)的混合物等等。
在某些實(shí)施方式中，還可將本發(fā)明的藥物組合物配置用于獸醫(yī)用 途的治療中，其中本發(fā)明的化合物、或其可獸醫(yī)藥用鹽、或其可獸醫(yī) 藥用溶劑化物或前藥根據(jù)普通獸醫(yī)實(shí)踐來作為適合的可用配方用藥并 且所述獸醫(yī)實(shí)踐者將確定對特定動(dòng)物最適當(dāng)?shù)慕o藥方案和施用途徑。
如果以活性劑的組合來用藥，則它們可以同時(shí)、分開或依次用藥。
式(I)的化合物可以通過遵循現(xiàn)有技術(shù)以及用其它傳統(tǒng)有機(jī)制備方
法來制備(Yu, L丄；Hu, Y.Z. C/ /"a尸/2arm. J 2005, 46>,1029和本文引用 的參考文獻(xiàn)。Nikaido, T.; Ohmoto， T.; Kinoshita, T.; Sankawa， U.; Monache, F. D.; Botta, B.; Tomimori， T.; Miyaichi， Y.; Shirataki， Y.; Yokoe, I.; Komatsu, M. CTzem. P/zarm. 5w//. 1989， 37, 1392和本文引用的 參考文獻(xiàn))。
實(shí)施例
下列實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的 范圍的限制。
實(shí)施例1. ER-a變體在人乳腺癌試樣中的表達(dá) 預(yù)先印跡了人乳腺癌組織的膜購自ProSci公司(Poway, CA)。所述 膜用特異性識(shí)別ER-a36的抗ER-a36抗體和HRP共軛第二抗體進(jìn)行才企
顯像。將同樣的膜剝離用識(shí)別ER-a所有三種亞型——ER-a66、 ER-a46 和ER-a36的抗雌激素受體-a抗體H222 (Novocastra Laboratories Ltd，UK)進(jìn)行檢測。圖1顯示了 ER-a66、 ER-a46和ER-a36沒有在正常乳 腺組織中表達(dá)(道l)但在浸潤性導(dǎo)管癌的一個(gè)試樣(道2)、浸潤性小葉癌 的一個(gè)試樣(道5)和非侵襲性導(dǎo)管癌(道7)中表達(dá)。另外，ER-a36在侵 襲性導(dǎo)管癌(道4)和浸潤性小葉癌的另 一試樣(道6)中表達(dá)。道2和道3 分別來自2個(gè)不同患者的浸潤性導(dǎo)管癌。道5和道6分別來自2個(gè)不 同患者的浸潤性小葉癌。此結(jié)果表明ER-a36在正常乳腺組織中不表達(dá) 但在不表達(dá)ER-a66和ER-a46的ER陰性乳腺癌樣本中表達(dá)。
實(shí)施例2. ER-a36在ER陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中表達(dá) 眾所周知MDA-MB-231細(xì)月包系缺乏ER-a66和ER-a46 (Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Marc Lacroix, Guy Leclercq, Brest Cancer Research and Treatment 83: 249-289 (2004)) 。
MDA-MB-231細(xì)胞來自美國菌種保藏中心(ATCC)。 MDA-MB-231細(xì)胞在37°C, 5% C02氣氛的8孔BIOCOAT室玻片(BD Science Discovery Labware)上的Dulbecco 文良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和 10%胎牛血清中生長12小時(shí)。然后所述細(xì)胞用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS) 沖洗2次，并在室溫用4%低聚曱醛的PBS(pH 7.4)溶液固定30分鐘。 其后，所述細(xì)胞用PBS沖洗，并用0.5% (體積/體積)Triton X-100透化 10分鐘。所述細(xì)胞再用PBS沖洗，并用3%血清的PBS溶液在室溫下 阻斷1小時(shí)。所述室玻片與ER-a36特異性抗體或與結(jié)合到該抗體的免 疫原多肽預(yù)溫育了 30分鐘的相同抗體在室溫下溫育1小時(shí)并用含0.5% Triton X-100的PBS (PBST)沖洗3次，然后與異硫氰酸萸光素(FTIC) 共軛第二抗體溫育。最后，所述玻片用PBST沖洗3次，PBS沖洗1 次，然后覆以抗褪色培養(yǎng)基(Molecular Probes, Eugene， OR)并在Nikon E600顯微鏡下檢測并通過MRC-1024共聚焦成像系統(tǒng)(Bio-Rad)采集圖 像。圖2(上圖)顯示了 MDA-MB-231細(xì)胞被抗ER-ct36抗體陽性染色。 和與所述免疫原多肽預(yù)溫育的相同抗體的溫育沒有顯示任何染色(圖 2,下圖)，表明所述抗體的特異性。
實(shí)施例3.淫羊藿素誘導(dǎo)ER陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的細(xì) 月包死亡將MDA-MB-231細(xì)胞保持在37°C, 5% (302氣氛中的DMEM和 10%胎牛血清中。所述細(xì)胞以每個(gè)60 mm皿中口105個(gè)細(xì)胞的密度點(diǎn) 板。用溶于DMSO中濃度為0、 1 pM、 5 ixM和10 ^M的淫羊藿素處 理MDA-MB-231細(xì)胞。淫羊藿素購自上海友思生物技術(shù)有限公司。處 理后的細(xì)胞在Nikon TS100倒置顯微鏡下檢測并對形態(tài)變化照相。圖3 顯示當(dāng)用10 MM的淫羊藿素處理后，所述細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的特征 并且存活細(xì)胞數(shù)顯著減少。
另夕卜，用濃度為0、 5 |iM、 10 |iM、 20 ^M、 30 ^M、 40 和50 的他莫昔芬、ICI 182,780、木犀草素、淫羊藿素處理MDA-MB-231細(xì) 胞以檢測這些化合物對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響。他莫昔芬和木 犀草素購自Sigma, St. Louis, MO.; ICI 182,780購自Tocris Bioscience, Ellisville, MO。這些化合物溶解于DMSO中。將所述MDA-MB-231細(xì) 胞以每60 mm皿500細(xì)胞進(jìn)行分種并分別與不同化合物溫育10天。在 所述化合物處理下存活的細(xì)胞形成了細(xì)胞群落。對所述細(xì)胞群落用0.5 mL0.02。/。結(jié)晶紫、20%乙醇、0.74%曱醛和80%H20染色10分鐘。在 光學(xué)顯微鏡下對染色的群落計(jì)數(shù)。圖4顯示了經(jīng)5pM淫羊藿素、木犀 草素、他莫昔芬或ICI 182,780處理后MDA-MB-231細(xì)胞群落的數(shù)量 減少。經(jīng)10 pM淫羊藿素或他莫昔芬處理后MDA-MB-231細(xì)胞群落的 數(shù)量進(jìn)一步減少至接近于0。當(dāng)用木犀草素處理時(shí)，在濃度40^M時(shí) MDA-MB-231細(xì)胞群的數(shù)量減至接近于0。然而，當(dāng)用ICI 182,780處 理時(shí)，在濃度50 pM時(shí)所述細(xì)胞群的數(shù)量仍保持在高水平。
實(shí)施例4.淫羊藿素誘導(dǎo)ER陽性乳腺癌MCF7細(xì)胞中的細(xì)胞死亡 MCF7細(xì)胞系是強(qiáng)表達(dá)ER-a66 、 ER-a46和ER-a36的乳腺癌細(xì)胞 系(Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Marc Lacroix, Guy Leclercq, Brest Cancer Research and Treatment (2004) 83， 249-289; Wang等，Pro" Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 9063-9068 (2006))。將來自ATCC的MCF7細(xì)胞保持在37°C, 5% C02 氣氛中的添加了 10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中。對 所述MCF7細(xì)胞用濃度為0-25 iaM的他莫昔芬、ICI 182,780、木犀草 素和淫羊藿素處理10天以;險(xiǎn)測這些化合物對MCF7細(xì)胞生長的影響。所述實(shí)驗(yàn)用與上述實(shí)施例3中圖4的實(shí)驗(yàn)相同的方法進(jìn)行。圖5a顯示 了他莫昔芬、木犀草素和淫羊藿素隨著它們的濃度升高明顯減少了 MCF7細(xì)胞群的數(shù)量。ICI 182,780即使在25 pM下仍僅誘導(dǎo)細(xì)胞群落 的有限減少。
在另一實(shí)驗(yàn)中，分別用淫羊藿素、IC163和Y4處理MCF7細(xì)胞以 比較這些化合物對MCF7細(xì)胞生長的影響。IC 163和Y4購自上海友思 生物技術(shù)有限公司。將所述MCF7細(xì)胞以每個(gè)100-mm皿中l(wèi)x105細(xì)胞 的密度點(diǎn)板并用濃度為0-25 ^M的每個(gè)化合物處理2周。使用血細(xì)胞 計(jì)數(shù)器對存活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對于每個(gè)濃度值對5個(gè)亞的細(xì)胞進(jìn)行 計(jì)數(shù)。圖5b顯示了每個(gè)化合物在濃度為5 ^M及以上時(shí)明顯減少了存 活的MCF7細(xì)胞凄t。
實(shí)施例5.淫羊藿素在過表達(dá)ER-a36的MCF7細(xì)胞和抗他莫昔芬 MCF7細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡
過表達(dá)ER-a36的MCF7細(xì)胞通過用ER-a36表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 MCF細(xì)胞而制得。所述ER-a36表達(dá)載體通過將l.l-kb的ER-a36 cDNA 片段從pBluescript質(zhì)?？寺〉讲溉閯?dòng)物表達(dá)載體pCB6+中來構(gòu)建，如 前所述(Wang等，2005, BBRC， 336:1023-1027)。所構(gòu)建的ER-a36表達(dá) 載體含有巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子。使用FuGene6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemicals)將所述ER-a36表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到MCF7細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將所述細(xì)胞重新點(diǎn)板并用500 jig/mLG418 (Invitrogen) 選取約2周直至出現(xiàn)細(xì)胞群落。然后將所述克隆體匯集并培養(yǎng)以通過 蛋白免疫印跡分析確i^ ER-a36的表達(dá)。
抗他莫昔芬MCF7細(xì)胞通過將MCF7細(xì)胞在含5 ^VI他莫昔芬的 培養(yǎng)基中溫育3個(gè)月而制得。將3個(gè)月后仍存活的MCF7細(xì)胞匯集并 進(jìn)一步培養(yǎng)為抗他莫昔芬MCF7細(xì)胞。蛋白免疫印跡分析表明這些細(xì) 胞高度表達(dá)了 ER-a36(數(shù)據(jù)未示出)。
將所述細(xì)胞系保持在37。C, 5%(302氣氛中的添加了 10%胎牛血清 的DMEM/F12培養(yǎng)基中。將細(xì)胞以每個(gè)100-mm皿中口105細(xì)胞的密 度點(diǎn)板并用濃度O-IO |iM的淫羊藿素處理2周。對2周后的存活細(xì)胞 數(shù)計(jì)數(shù)。對于每個(gè)濃度值對5個(gè)皿的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖6顯示在淫羊藿素為5 jxM時(shí)，所有3種類型細(xì)胞的生長都被明顯的抑制，且在過表 達(dá)ER-a36的MCF7細(xì)胞和抗他莫昔芬MCF7細(xì)胞中的抑制要強(qiáng)于在 MCF7細(xì)胞中的抑制。在10 pM時(shí)，淫羊藿素將所有3種類型的細(xì)胞 數(shù)量減少至接近于0。
實(shí)施例6.正常乳腺上皮細(xì)胞生長不受淫羊藿素影響 正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A來自Karmanos Cancer Institute, Detroit: MI。這些MCF10A細(xì)胞不表達(dá)任何ER同工型，ER-a36、 ER-a46和 ER-a66。將所述MCF10A細(xì)胞保持在37。C， 10%—(302氣氛中的添加了 5%馬血清、L-谷氨酰胺(2 mM)、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 pg/mL)、 氬化可的松(0.5嗎/mL)、胰島素(10嗎/mL)、 EGF(2ng/mL)、霍亂毒素 (0.1嗎/mL)和兩性霉素B(0.5pg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基中。將所述 MCF10A細(xì)胞以每個(gè)100-mm皿中l(wèi)x105細(xì)胞的密度點(diǎn)于分別含0、 20 liM和50 |iM淫羊藿素的板上2周。然后所述細(xì)胞在Nikon TS100倒置 顯微鏡下檢測并對形態(tài)變化照相。圖7顯示了 MCF10A細(xì)胞的形態(tài)在 濃度高達(dá)50 |iM的淫羊藿素處理下沒有改變。
實(shí)施例7.不同試劑對ER-a變體表達(dá)的調(diào)節(jié)
用不同試劑處理MCF7細(xì)胞并通過蛋白免疫印跡分析來分析 ER-a66、 ER-a46和ER-a36的表達(dá)。
用10 (aM的17(3-雌二醇(E2卩)、他莫昔芬或ICI 182，780或血清(20%) 以不同時(shí)間周期處理貧血清MCF7細(xì)胞。用PBS沖洗所處理細(xì)胞并用 裂解緩沖液(50 mM Tris陽HCl pH 8.0, 150 mM NaCl， 0.25 mM EDTApH 8.0， 0.1%SDS， 1% Triton X隱100, 50mMNaF,和來自Sigma的蛋白 酶抑制劑混合物)裂解。將裂解液在SDS凝膠加樣緩沖液(25 mM Tris-Cl pH6.8; 10% SDS; 2%甘油；20%卩-巰基乙醇；0.010/。溴酚藍(lán))中煮沸5 min然后在10% SDS-PAGE凝膠上分離。經(jīng)電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜(Bio Rad Laboratories, Hercules, CA)。用抗雌激素受體-a抗體 H222檢測所述膜。然后將所述膜與HRP共軛第二抗體一起溫育并用 ECL檢測試劑顯像。圖8顯示了 E2(3處理顯著降低了 ER-a66和ER-a46 兩者的表達(dá)但誘導(dǎo)了 ER-a36的表達(dá)。血清處理具有相似效果。然而，他莫昔芬穩(wěn)定了 ER-a66和ER-a46的表達(dá)水平而且還提高了 ER-a36 的表達(dá)水平。ICI 182,780顯著降低了 ER-a66和ER-a46水平，并同時(shí) 提高了 ER-a36的表達(dá)水平。
另外，MCF7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的ICI 182,780、淫羊藿素、IC 163 或Y4處理了 12小時(shí)。用蛋白免疫印跡分析來分析ER-a66、 ER-a46 和ER-a36的表達(dá)，如上所述。圖9顯示了ICI 182,780處理隨著其濃 度增加降低了 ER-a66和ER-a46的表達(dá)但提高了 ER-a36的表達(dá)。然 而，在高濃度下，淫羊藿素明顯降低了所有三種同工型即ER-a66、 ER-a46和ER-a36的表達(dá)水平。IC 163或Y4處理也極大降低了所有3 種ER同工型的表達(dá)。
實(shí)施例8.淫羊藿素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞死亡 H226肺癌細(xì)胞，LnCap細(xì)胞和PC3纟田月包各自以每個(gè)30-mm皿中 lxlO"田胞的密度點(diǎn)板。所迷細(xì)胞用淫羊藿素處理2周。用血細(xì)胞計(jì)數(shù) 器對存活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。淫羊藿素處理分別在O、 1.0 pM、 2.5|iM、 5.0 (iM、 7.5 jiM和10 (iM濃度下測試。對于每個(gè)濃度值對5個(gè)皿的細(xì) 胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖IO顯示了所有細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)都在5 iiM淫羊藿素處 理下減少。在10pM時(shí)，所有細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少。因此，淫 羊藿素也誘導(dǎo)了肺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。
實(shí)施例9.淫羊藿素抑制棵鼠中的ER陽性和ER陰性乳腺癌異種 移植體的生長
施用于動(dòng)物的淫羊藿素制備于玉米油中。為將淫羊藿素制備到玉 米油中，將5mL玉米油置于閃爍管中，并在42。C下加熱30分鐘。將 100 mg淫羊藿素加入預(yù)熱的5 mL玉米油中至最終濃度20 mg/mL。所 述閃爍管用鋁箔包裹并置于37。C下的搖桿上數(shù)小時(shí)。所述淫羊藿素溶 液儲(chǔ)存于4°C以備用于動(dòng)物施用。使用管飼技術(shù)向小鼠施用所述淫羊 度素溶液。我們使用動(dòng)物飼養(yǎng)針頭(Popper; cat No. 9921,尺寸 20GXl.l/2)進(jìn)行管飼。
分析了雌性無胸腺棵鼠(6周齡，品系CDI nu/nu， Charles River Breeding Laboratory)中腫瘤的形成。通過乳^J旨肪墊注射將MCF7細(xì)胞或MDA-MB-231細(xì)月包以每200 [iL基質(zhì)月交(Matrigel)(BD Biosciences) lxl(T細(xì)胞的濃度注射到小鼠中。將每種乳腺癌細(xì)胞注射到一組5只小 鼠中。對于MCF7細(xì)胞，在皮下植入1.7 mg/60天釋放的E2(3丸(60天 中每天能釋放一定量E2P的慢速釋放E2(3丸)5天后進(jìn)行接種，所述E鄰 丸購自Innovative Research of American, Sarasota, FL。用動(dòng)物詞養(yǎng)針頭 通過管飼技術(shù)對腫瘤大小直徑約0.5 cm的動(dòng)物施用淫羊藿素的玉米油 溶液。對于接種了 MCF7細(xì)胞的小鼠，對每只小鼠在15天中隔天喂以 5mg淫羊藿素。對于接種了 MDA-MB-231細(xì)胞的小鼠，對每只小鼠在 30天中隔天喂以5mg淫羊藿素。通過觸診來確定腫瘤消失，并還通過 隔天用游標(biāo)卡尺測量2個(gè)垂直直徑來監(jiān)測并照相記錄腫瘤尺寸。圖11 和圖12分別顯示了在淫羊藿素處理前和處理后MDA-MB-231和MCF7 細(xì)胞異種移植體中腫瘤尺寸減小的圖片。該結(jié)果顯示在淫羊藿素處理 后在兩種乳腺癌細(xì)胞異種移植體中肺瘤尺寸明顯減小。
實(shí)施例10.當(dāng)移植后立即使用淫羊藿素時(shí)淫羊藿素抑制棵鼠中ER 陰性乳腺癌異種移植體的生長
分析了雌性無胸腺棵鼠(6周齡，品系CDI nu/nu, Charles River Breeding Laboratory)中腫瘤的形成。通過乳腺脂肪墊注射將 MDA-MB-231細(xì)胞以每200 (iL基質(zhì)膠(BD Biosciences) 1><107細(xì)胞的濃 度注射到小鼠中。將所述乳腺癌細(xì)胞注射到一組5只小鼠中。注射后 立即用淫羊藿素處理所述小鼠。對每只小鼠在36天中每周2次喂以1 mg淫羊藿素。其后殺死小鼠并從小鼠中解剖出腫瘤組織然后照相并稱 重。圖13顯示了用淫羊藿素處理的MDA-MB-231細(xì)胞異種移植體中 腫瘤尺寸的減小。
實(shí)施例11.淫羊藿素和IC 163抑制棵鼠中人乳腺癌BCAP-37細(xì)胞 異種移植體的生長
用淫羊藿素處理帶乳腺癌異種移植體的棵鼠以檢驗(yàn)其對抑制腫瘤 生長的效果。帶BCAP-37乳腺癌的原始棵鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研 究所提供。從小鼠中取出腫瘤組織并切割為小塊。將數(shù)塊腫瘤組織植 入雌性棵鼠(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)的右前肢腋窩內(nèi)。在移植后，在6天中以7 pg/鼠的劑量每天一次對所述小鼠喂以E鄰溶液以 促進(jìn)接收小鼠中的腫瘤生長。從第7天開始，對所述小鼠喂以3種劑 量的淫羊藿素。高劑量為0.7 mg/鼠/日(約33 mg/kg/曰)。中等劑量為O.35 mg/鼠/日(約16.5 mg/kg/日)。低劑量為0.18 mg/鼠/日(約8.25 mg/kg/日)。 以0.35 mg/鼠/日的劑量使用他莫昔芬作為陽性對照。橄欖油被用作陰 性對照，其中對每只小鼠喂以0.1 mL橄欖油。用與上述實(shí)施例9中所 述相同的方法將淫羊藿素制備為橄欖油溶液。在15天中對所述小鼠每 天給服一次所述不同劑量的淫羊藿素、他莫昔芬或橄欖油。然后殺死 小鼠并從小鼠中解剖出胂瘤組織并稱重。對所述測試進(jìn)行了兩次平行 實(shí)驗(yàn)。對所述兩次平行實(shí)驗(yàn)之一，每種測試化合物和每種劑量使用十 只雌性BALB/c-nu小鼠。對另一平行實(shí)驗(yàn)，每種測試化合物和每種劑 量使用八只雌性BALB/c-nu小鼠。圖14a顯示了用高、中和低劑量淫 羊藿素處理的小鼠與陰性對照相比具有減少的腫瘤重量。圖14b顯示 了在不同劑量下的腫瘤生長抑制速率。肺瘤生長抑制速率是使用下式 計(jì)算的百分比腫瘤生長抑制速率=(對照中的腫瘤平均重量-用淫羊 藿素處理的腫瘤平均重量)/對照中的腫瘤平均重量。用高劑量淫羊藿 素處理的小鼠中的腫瘤重量具有與所述陽性對照相似的肺瘤重量減 少。
在與上述相同的試驗(yàn)中測試了 IC 163對抑制乳腺癌生長的效果。 IC 163以0.7 mg/鼠/日(約35 mg/kg/日)的劑量進(jìn)行測試。他莫昔芬以IC 163劑量的一半作為陽性對照進(jìn)行測試。橄欖油用作陰性對照。
實(shí)施例12.淫羊藿素抑制ICR鼠中小鼠宮頸癌U14細(xì)胞異種移植 體的生長
含宮頸癌U14細(xì)胞系的原始ICR鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 提供。從所述小鼠下腹抽取5 mL腹腔液。將所述液體與生理鹽水以 1:5的比例稀釋。將0.2 mL所述稀釋腹腔液皮下注射到雌性ICR鼠(由 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)的右前肢和胸腔內(nèi)。移植后，將所述 小鼠立即分別用淫羊藿素、他莫昔芬和橄欖油處理。淫羊藿素給以3 種劑量。高劑量為0.7 mg/鼠/日(約33 mg/kg/日)。中等劑量為0.35 mg/ 鼠/日(約16.5 mg/kg/日)。j氐劑量為0.18 mg/鼠/日(約8.25 mg/kg/日)。以0.35mg/鼠/日(約16.5mg/kg/日)的劑量使用他莫昔芬作為陽性對照。橄 欖油被用作陰性對照，其中對每只小鼠喂以0.1 mL橄欖油。用與上述 實(shí)施例9中相同的方法將淫羊藿素制備為橄欖油溶液。在14天期間對 小鼠每天給服一次所述不同劑量的淫羊藿素、他莫昔芬或橄欖油。然 后殺死小鼠并從小鼠中解剖出腫瘤組織并稱重。每種測試化合物和計(jì) 量使用IO只雌性ICR鼠。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。圖15a顯示了用高、中 和低劑量淫羊藿素處理的小鼠與陰性對照相比具有減少的肺瘤重量。 用高劑量淫羊藿素處理的小鼠中的腫瘤重量具有與所述陽性對照相似 的腫瘤重量減少。圖15b顯示了不同劑量下的腫瘤生長抑制速率。使 用與實(shí)施例11中相同的公式來計(jì)算腫瘤生長抑制速率。
實(shí)施例13. IC 163誘導(dǎo)乳腺癌、肺癌和前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡 用IC 163處理MCF7細(xì)胞、PC3前列腺癌細(xì)胞、H226肺癌細(xì)胞和 MCF7/TAM細(xì)胞以測試所述化合物對抑制癌細(xì)胞生長的效果。用與實(shí) 施例8中相同的方法進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示于圖16中。在5^iM時(shí)， 某些細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)開始減少。在10iiM時(shí)，所有測試細(xì)胞系的細(xì)胞 數(shù)都減少并隨著IC 163濃度的增加而繼續(xù)減少。
實(shí)施例14. IC-163對延緩豚鼠中卵白蛋白誘導(dǎo)的哞喘發(fā)作的效果 250-300 g的豚鼠由北京海淀興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場提供。將1 mL 10%卯 白蛋白(Sigma Cat. No. A5253)—次注射到豚鼠腹部。注射后的第15-第 17天，對所述豚鼠通過鼻腔噴霧給以約20秒1%霧化卵白蛋白以誘導(dǎo) 哮喘發(fā)作。測量了根據(jù)卵白蛋白施用后至豚鼠驚厥虛脫的時(shí)間計(jì)算的 哮喘發(fā)作前的潛伏期。如果豚鼠在卵白蛋白施用后150秒內(nèi)沒有驚厥 虛脫，則該豚鼠被取消進(jìn)一步測試的資格。
在注射后的第17天，將合格豚鼠分為3組，高劑量IC-163組 (4/mg/kg/日)、低劑量IC-163組(l/mg/kg/日)和對照組。每組由10只豚 鼠組成。由8只沒有注射任何10%卵白蛋白的正常豚鼠組成的正常組 也進(jìn)行了測試。在6天中每天以每4 mg/kg體重/日(高劑量組)或1 mg/kg 體重/日(低劑量組)經(jīng)肌肉注射對所述豚鼠施用一次IC-163，而正常組 和對照組的豚鼠則用生理鹽水注射。在藥物施用的第4和第6天，用與上述相同的方法對所述豚鼠誘導(dǎo)哮喘發(fā)作。測量哞喘發(fā)作前的潛伏
期。如果潛伏期持續(xù)超過5分鐘，則將該潛伏期記錄為5分鐘。在第6
天，從四組中的豚鼠抽取血液以檢測血液中嗜酸性細(xì)胞百分比、組胺
和IgE的濃度。通過在顯微鏡下對每200個(gè)白細(xì)胞中的嗜酸性細(xì)胞數(shù) 計(jì)數(shù)來測量嗜酸性細(xì)胞百分比。通過雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn))來測量組胺和IgE濃度。
圖17顯示了向豚鼠施用高劑量和低劑量IC-163的第4天和第6 天由卵白蛋白誘導(dǎo)的哮喘發(fā)作前的潛伏期。當(dāng)施用高劑量IC-163時(shí)， 潛伏期與對照組相比在藥物施用第4天延長了 72.9%,第6天延長了 63.5°/。。當(dāng)施用低劑量IC-163時(shí)，潛伏期與對照組相比在第4天延長 了 83.4%而第6天延長了 72.7°/。。所述結(jié)果表明高劑量和低劑量的 IC-163施用能明顯延遲豚鼠中卵白蛋白誘導(dǎo)的嗜喘發(fā)作。
圖18顯示了當(dāng)對豚鼠施用高劑量和低劑量IC-163時(shí)血液中嗜酸性 細(xì)胞的百分比。正常組的嗜酸性細(xì)胞百分比為約5.3。/。而對照組的百分 比則高達(dá)9.9%。當(dāng)IC-163以高劑量和低劑量施用時(shí)，嗜酸性細(xì)胞百分 比分別降低至約8.6%和7.8%。該圖表明高劑量和低劑量的IC-163能 明顯降低受檢豚鼠中嗜酸性細(xì)胞的百分比。
在正常組、對照組、高劑量IC-163組和低劑量IC-163組中對豚鼠 血液中的組胺濃度進(jìn)行了測量。圖19中的結(jié)果顯示，高劑量和低劑量 IC-163施用能明顯降低豚鼠中組胺的血濃度。
還測量了四組豚鼠血液中的IgE濃度，結(jié)果如圖20中所示。所述 結(jié)果顯示了高劑量和低劑量IC-163施用能明顯降低受檢豚鼠中的IgE 濃度。
實(shí)施例15.淫羊藿素抑制人子宮內(nèi)膜癌HeclA細(xì)胞生長 將人子宮內(nèi)膜癌HeclA細(xì)胞(ATCC No.: HTB-112TM>V、 5><103細(xì)胞/ 孔的濃度分種于96孔培養(yǎng)板上并在含高葡萄糖培養(yǎng)基的DMEM (HyClone， SH30022.01B)中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)血清饑餓處理過夜并暴露在不 同濃度的他莫昔芬或淫羊藿素中24小時(shí)。他莫昔芬或淫羊藿素的濃度 分別為0 pM、 0.001 pM、 0.01 pM、 0.1 ^M、 1 |iM、 3 和5 (iM。然 后將所述細(xì)胞與0.5 mg/mL 3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化鎗鹽(MTT)—起在37"C培養(yǎng)4小時(shí)，其中MTT被活細(xì)胞中的活性線 粒體還原酶還原為不溶紫色曱臢。然后從反應(yīng)混合物中除去過量液態(tài) MTT。加入150(iLDMSO以將紫色曱臢溶解為有色溶液。所述有色溶 液的光密度與溶液中的細(xì)胞數(shù)呈線性關(guān)系，從而能準(zhǔn)確定量細(xì)胞。
圖21顯示了所述MTT試驗(yàn)的結(jié)果。光密度隨著HeclA細(xì)胞暴露 在濃度逐漸增高的淫羊藿素中而平滑降低。與此相反，光密度隨著 HeclA細(xì)胞暴露在濃度從0.001 |xM-3 增高的他莫昔芬中而升高。 該圖表明淫羊藿素對HeclA細(xì)胞生長有明顯抑制效果而他莫昔芬在3 ^M濃度以下具有促進(jìn)HeclA細(xì)胞生長的相反效果。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療受試對象中與異常細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向所述受試對象施用治療有效量的包含具有式(I)的結(jié)構(gòu)的獨(dú)立化合物的藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物具有式IA1的結(jié)構(gòu)。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物具有式IA2的結(jié)構(gòu)。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述化合物具有式IA3的結(jié)構(gòu)。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述化合物具有式IA4的結(jié)構(gòu)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述化合物具有式IA5的結(jié)構(gòu)。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述化合物具有式IA6的結(jié)構(gòu)。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述化合物選自下組(i)3,5,7-三羥基_2—(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮，(ii) 3,5,7-三 羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-S同，(iii) 5,7-二 羥基-2-(3,4-二羥基苯基)-4H-色烯-4-S同，(iv) 3,5-二羥基-2-(4-羥基苯 基)-8,8-二曱基-9,10-二氫-4H,8H-吡喃并[2，3-f]色烯-4-酮，(v) 3，5,7-三羥 基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮和(vi) 3,5,7-三羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4H-色烯-4-酮。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物是3,5，7-三羥基-2-(4-曱氧基笨基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4&色烯-4-酮。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 _2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮。
11. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基MH-色烯-4-酮。
12. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-411-色烯-4-酮。
13. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述受試對象是哺乳動(dòng)物。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述施用是口服施用、經(jīng)口腔 施用、舌下施用、經(jīng)眼施用、局部施用、腸胃外施用、經(jīng)直腸施用、 腦池內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、腹腔內(nèi)施用、膀胱內(nèi)施用或經(jīng)鼻施用。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述施用是腸胃外施用。
17. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述疾病選自下組乳腺癌、 宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、白血病、肝癌、肺癌、骨髓瘤、卵巢 癌、前列腺癌、胃癌或子宮癌。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述疾病是乳腺癌。
19. 一種預(yù)防或治療受試對象中與ER-a36相關(guān)的疾病的方法，所 述方法包括向所述受試對象施用治療有效量的包含具有式I的結(jié)構(gòu)的 化合物的藥物組合物。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述化合物具有式IA1的結(jié)構(gòu)。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述化合物具有式IA2的結(jié)構(gòu)。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述化合物具有式IA3的結(jié)構(gòu)。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述化合物具有式IA4的結(jié)構(gòu)。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述化合物具有式IA5的結(jié)構(gòu)。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述化合物具有式IA6的結(jié)構(gòu)。
26. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述受試對象是哺乳動(dòng)物。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
28. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述施用是口服施用、經(jīng)口 腔施用、舌下施用、經(jīng)眼施用、局部施用、腸胃外施用、經(jīng)直腸施用、 腦池內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、腹腔內(nèi)施用、膀胱內(nèi)施用或經(jīng)鼻施用。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述施用是腸胃外施用。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述腸胃外施用是是靜脈內(nèi) 施用、肌內(nèi)施用或者皮下施用、血管內(nèi)施用或輸注。
31. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疾病是骨質(zhì)疏松癥。
32. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述化合物選自下組(i) 3,5，7-三羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮，(ii),5,7-三羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-甲基丁-2-烯基)-4H-色晞-4-酮，(iii) 5,7-二羥基-2-(3，4-二羥基苯基)-4H-色烯-4-酮，(iv) 3,5-二羥基-2-(4-羥基 苯基)-8,8-二甲基-9，10-二氫-4H，8H-吡喃并[2,3-f]色烯-4-酮，(v) 3,5,7-三羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基MH-色烯-4-酮和(vi) 3，5,7-三羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4H-色烯-4-酮。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 一2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4&色烯-4-酮。
34. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 一2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮。
35. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基)-411-色烯-4-酮。
36. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物是3，5，7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4H-色烯-4-酮。
37. —種預(yù)防或治療受試對象中呼吸道病癥的方法，所述方法包括 向所述受試對象施用治療有效量的包含具有式(I)的結(jié)構(gòu)的獨(dú)立化合物 的藥物組合物。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述呼吸道病癥是哮喘。
39. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述化合物選自下組(i) 3,5,7-三羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮，(ii) 3,5,7-三羥基-2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-蟑基)-4H-色烯-4-酮，(iii) 5,7-二羥基-2-(3,4-二羥基苯基)-4H-色烯-4-S同，(iv) 3，5-二羥基-2-(4-羥基 苯基)-8,8-二曱基-9,10-二氫-4H,8H-吡喃并[2,3-f]色烯-4-酮，(v) 3，5,7-三 羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基)-4H-色烯-4-酮和(vi) 3，5,7-三羥基-8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4H-色烯-4-酮。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 -2-(4-曱氧基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4H-色烯-4-酮。
41. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述化合物是3,5，7-三羥基 _2-(4-羥基苯基)-8-(3-曱基丁-2-烯基)-4&色烯-4-酮。
42. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-曱氧基苯基MH-色烯-4-酮。
43. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述化合物是3,5,7-三羥基 -8-(3-羥基-3-曱基丁基)-2-(4-羥基苯基)-4&色烯-4-酮。
全文摘要
在本文某些實(shí)施方式中提供了用于調(diào)控雌激素受體α36的功能、預(yù)防和/或治療與雌激素受體α36相關(guān)的疾病、預(yù)防和/或治療諸如哮喘的呼吸系統(tǒng)疾病、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或抑制細(xì)胞增殖、以及預(yù)防和/或治療諸如癌癥的與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的化合物、藥物組合物和方法。
文檔編號(hào)A01N43/42GK101528038SQ200780039276
公開日2009年9月9日 申請日期2007年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月25日
發(fā)明者坤 孟, 靖 李 申請人:盛諾基醫(yī)藥科技有限公司