專利名稱：分離的髓樣細(xì)胞群及其治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更具體地講，本發(fā)明涉及具有髓樣細(xì)胞特征以及當(dāng)經(jīng)玻璃體腔注射到眼睛時(shí)能夠摻入視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的分離細(xì)胞群。本發(fā)明還涉及通過(guò)給予哺乳動(dòng)物眼部髓樣細(xì)胞以治療眼部變性疾病的方法。
背景技術(shù)：
年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)和糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)是工業(yè)化國(guó)家中視力喪失的最主要的原因，而且這些疾病均由視網(wǎng)膜新血管形成異常所致。由于視網(wǎng)膜由層次分界清晰的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)和血管組分組成，相對(duì)較小的干擾(例如見(jiàn)于血管增生或水腫的千擾)都可導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能喪失。遺傳性視網(wǎng)膜變性(例如色素性視網(wǎng)膜炎(RP))也與血管異常有關(guān)，例如小動(dòng)脈狹窄和血管萎縮。大多數(shù)人類遺傳性視網(wǎng)膜變性特別影響視桿細(xì)胞光感受器，但也伴有視錐細(xì)胞喪失，視
錐細(xì)胞是黃斑(macula)的主要細(xì)胞組分，而黃斑是人類視網(wǎng)膜中負(fù)責(zé)中心精準(zhǔn)視敏度的區(qū)域。最近有報(bào)道披露了視錐細(xì)胞特異性存活因子(Cone-specific survival factor) (Mohand-Said等，1998， iVoc. 7Va//.爿cac/.5W. t/SA 95: 8357-8362)，它可促進(jìn)視網(wǎng)膜變性小鼠模型中視錐細(xì)胞的存活。
遺傳性視網(wǎng)膜變性影響多達(dá)1/3500的個(gè)體，其特征是進(jìn)行性夜盲、；f見(jiàn)野缺損、纟見(jiàn)神經(jīng)萎縮、小動(dòng)脈縮窄、血管通透性改變和常常發(fā)展成完全失明的中心視力喪失(Heckenlively， J. R.主編，1988; i^"m力'sPz'gwe"tosa， Philadelphia: JB Lippincott Co.)。這些疾病的分子遺傳分牙斤已經(jīng)在僅占已知受累個(gè)體相對(duì)較小百分比的IIO多個(gè)不同的基因中鑒定出突變(Humphries等，1992， 5We"ce 256:804-808; Farrar等，2002,五MBOJ. 21:857-864)。這些突變中許多與光轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)器的酶組分和結(jié)構(gòu)組分有關(guān)，這些組分包括4見(jiàn)紫紅質(zhì)、cGMP磷酸二酯酶、rafs外周蛋白和RPE65。盡管觀察到這些結(jié)果，但是仍然沒(méi)有減緩或逆轉(zhuǎn)這些視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)展的有效治療方法。基因療法的最新*是當(dāng)將野生型
轉(zhuǎn)基因遞送到具有特定突變的動(dòng)物的光感受器或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)時(shí)，成功地逆轉(zhuǎn)了小鼠的^fe(Ali等，2000， Ato. 25:306-310)和W(Takahashi等，1999,丄P7ra/. 73:7812-7816)表型以及狗的RPEM表型(Acland等，2001,7Va/. 28:92-95)。
多年來(lái)就已了解到正常成體循環(huán)和骨髓中存在干細(xì)胞群。這些細(xì)胞的不同亞群可沿造血細(xì)胞語(yǔ)系陽(yáng)性(Lin+)或造血細(xì)胞譜系陰性(Lin一)譜系進(jìn)行分化。此外，最新報(bào)道指出，譜系陰性造血干細(xì)胞(HSC)群含有能夠在體外和體內(nèi)形成血管的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)(參見(jiàn)Asahara等，1997， 5Wewce 275:964-7)。這些細(xì)胞可參與正常的出生后血管生成和病理寸生出生后血管生成(postnatal angiogenesis)(參見(jiàn)Lyden等，2001 ， A^.7, 1194-201; Kalka等，2000，尸rac. A^f/. ^caof. 5W. "5^.97:3422-7;及Kocher等，2001， Ato 7:430-6),并分化成多種非內(nèi)皮細(xì)胞類型，包括肝細(xì)胞(參見(jiàn)Lagasse等，2000， Waf. M^/.6:1229-34)、小月M細(xì)胞(參見(jiàn)Priller等，2002， Med 7:1356-61)、心肌細(xì)胞(參見(jiàn)Orlic等，2001,iVa". ^cad 5W. C/.S.A 98:10344-9)和上皮細(xì)胞(參見(jiàn)Lyden等，2001， Ato. MW. 7:1194-1201)。盡管這些細(xì)胞曾被用于若干血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，但是尚不清楚靶向新血管系統(tǒng)的EPC的機(jī)制，也沒(méi)有確定可有效增加有助于特定血管系統(tǒng)的細(xì)胞數(shù)的策略。
目前，得自骨髓的造血干細(xì)胞是常用于治療應(yīng)用的唯一的干細(xì)胞類型。40多年來(lái)，骨髓HSC—直用于移植。目前，正在研究收獲純干細(xì)胞的先進(jìn)方法，以研發(fā)用于治療白血病、淋巴瘤和遺傳性血液疾病的療法。已經(jīng)在有限人數(shù)的患者中對(duì)干細(xì)胞的人體臨床應(yīng)用以治療糖尿病和晚期腎癌進(jìn)行了研究。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供分離髓樣細(xì)胞群，所述細(xì)胞群是通過(guò)從哺乳動(dòng)物骨髓中正向選出表達(dá)CD44、 CDllb和低氧誘導(dǎo)因子la(HIF-la)的細(xì)胞而產(chǎn)生的。當(dāng)給予哺乳動(dòng)物、特別是患有眼部變性疾病的哺乳動(dòng)物眼內(nèi)時(shí)，這些細(xì)胞具有有益的血管營(yíng)養(yǎng)活性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群可以如此分離，即通過(guò)用抗CD44 (透明質(zhì)酸受體)抗體、抗CDllb抗體、抗CD33、 CD14抗體或抗這些抗原組合的抗體處理骨髓細(xì)胞(例如人骨髓細(xì)胞)，根據(jù)具體情況正向選出與一種或多種抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞(例如采用流式細(xì)胞術(shù)或者抗體包被微珠或抗體結(jié)合微珠以分離細(xì)胞)。這類骨髓衍生細(xì)胞本文稱為髓樣骨髓(myeloid-like bone marrow, MLBM)細(xì)胞?；蛘撸捎赏庵苎?例如人
外周血)或臍帶血(例如人臍帶血)中分離本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群。本發(fā)明髓樣細(xì)胞群的大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD44抗原、CD1 lb抗原和低氧誘導(dǎo)因子la(HIF-la)。
7本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物的血管營(yíng)養(yǎng)性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性視網(wǎng)膜 疾病的方法。該方法包括給予哺乳動(dòng)物患病眼分離髓樣細(xì)胞群的細(xì) 胞，優(yōu)選通過(guò)眼內(nèi)注射。優(yōu)選髓樣細(xì)胞群是待治療的哺乳動(dòng)物自體的 (即髓樣細(xì)胞群分離自各待治療哺乳動(dòng)物的骨髓、外周血或臍帶血)。 本發(fā)明的治療方法改善患有眼病的哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜的血管變性和光
感受器神經(jīng)元(photorec印torneuron)變性。所給予的細(xì)胞的量足以延遲 視網(wǎng)膜的血管變性和神經(jīng)變性。髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞在摻入神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 的同時(shí)，有益地?fù)饺胍暰W(wǎng)膜的血管系統(tǒng)，并改善視網(wǎng)膜的視錐細(xì)胞變 性。分離的哺乳動(dòng)物髓樣細(xì)胞群包括當(dāng)經(jīng)玻璃體腔注射到眼睛時(shí)選擇 性耙向活化視網(wǎng)膜星形細(xì)胞并保持穩(wěn)定地?fù)饺胙鄄啃卵芟到y(tǒng)和神 經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞。優(yōu)選哺乳動(dòng)物為人。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在分離髓樣細(xì)胞群中至少約75%的細(xì) 胞表達(dá)CD44,更優(yōu)選至少約90%。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞用治療上有益的基 因轉(zhuǎn)染。例如，該細(xì)胞可用有效編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥或抗血管生成藥的多 核苷酸轉(zhuǎn)染，所述藥物通過(guò)基于細(xì)胞的基因療法形式選擇性靶向新血 管系統(tǒng)并抑制新血管形成而又不影響已建立的血管。在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群包含編碼血管生成抑制肽的基因。髓樣 細(xì)胞群的血管生成抑制細(xì)胞可用于調(diào)節(jié)ARMD、 DR和與血管系統(tǒng)異 常有關(guān)的某些視網(wǎng)膜變性等疾病的血管異常生長(zhǎng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以包含編碼神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)肽的基因。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽轉(zhuǎn)染的髓樣細(xì)胞可用于促進(jìn)涉及視網(wǎng)膜神經(jīng) 變性的眼病(例如青光眼、色素性視網(wǎng)膜炎等)的神經(jīng)元拯救(neuronal rescue》
用本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群治療眼睛的特別優(yōu)勢(shì)是在用髓樣細(xì) 胞群的細(xì)胞經(jīng)玻璃體腔治療的眼中觀察到的血管營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)拯 救效果(rescue effect)。用本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞治療的眼內(nèi)，視 網(wǎng)膜神經(jīng)元和光感受器(特別是視錐細(xì)胞)受到保護(hù)， 一些視功能測(cè)量值可保持不變。
本發(fā)明還提供從骨髓中通過(guò)陰性細(xì)胞標(biāo)記篩選出分離髓樣骨髓
細(xì)胞群的方法。該方法包括使大量骨髓細(xì)胞與對(duì)Ter119、 CD45RB220 和CD3e有特異性的抗體接觸，從大量骨髓細(xì)胞中除去與Terl19、 CD45RB220和CD3e抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞，回收缺失Terl19、 CD45RB220和CD3e表達(dá)細(xì)胞的髓樣骨髓細(xì)胞。利用該方法，回收其 中90。/。以上細(xì)胞表達(dá)CD44的細(xì)胞群。
可通過(guò)本發(fā)明髓樣細(xì)胞群和本發(fā)明方法治療的患病碎見(jiàn)網(wǎng)膜優(yōu)選 包含活化星形細(xì)胞。這可當(dāng)發(fā)生有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)增生時(shí)通過(guò)早期眼部治 療或者利用激光刺激活化星形細(xì)胞局部增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)。
除治療應(yīng)用以外，本發(fā)明的分離髓樣骨髓細(xì)胞群可用作研究眼部 血管發(fā)育生理學(xué)和將特定基因遞送到眼內(nèi)特定部位(例如星形細(xì)胞)的 研究工具。這類應(yīng)用為研究基因功能和可能的治療機(jī)制提供了有價(jià)值 的工具。
附圖簡(jiǎn)述 附圖中


圖1表示發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜的示意圖。(a)初生網(wǎng)(primary plexus) 的發(fā)育。(b)第二期視網(wǎng)膜血管形成。GCL,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL，內(nèi) 網(wǎng)層(inner plexus layer); INL, 內(nèi)才亥層(inner nuclear layer); OPL,夕卜 網(wǎng)層；ONL,外核層；RPE,視網(wǎng)膜色素上皮；ON,視神經(jīng)；P,周 邊(periphery)。圖(c)表示骨髓衍生的Lin+HSC和骨髓衍生的LirTHSC 分離細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)表征。上排非抗體標(biāo)記細(xì)胞的散點(diǎn)分布，其 中Rl限定了陽(yáng)性PE染色的可測(cè)量設(shè)門區(qū)(quantifiable-gated area); R2 表示GFP陽(yáng)性；中排Lin—HSC (C57B/6);下排Lin+HSC (C57B/6) 細(xì)胞，各細(xì)胞系用PE綴合的Sca-l、 c-kit、 Flk-1/KDR、 CD31抗體標(biāo) 記。從Tie-2-GFP小鼠獲取Tie-2數(shù)據(jù)。百分比表示陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞占 總LirTHSC群或Lin+ HSC群的百分比。
9圖2表示Lin— HSC移入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜。(a)注射后4天(P6), 經(jīng)玻璃體腔注射的eGFP+ Lin—HSC細(xì)胞附著在視網(wǎng)膜上并進(jìn)行分化。 (b) LhTHSC (B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用卩-gal抗體染色)自身建立在 血管系統(tǒng)用膠原IV抗體(星號(hào)表示血管系統(tǒng)末端)染色的前頭。(c)大多 數(shù)Un+ HSC細(xì)胞(eGFP+)在注射后4天(P6)無(wú)法分化。(d)注射后4天 (P6)的腸系膜eGFP+鼠EC。 (e)將Lin—HSC (eGFP+)注射到成年小鼠眼 內(nèi)。(f) GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中，低放大倍數(shù)下的eGFP+ Lin— HSC (箭 頭)歸巢至預(yù)先存在的星形細(xì)胞模板并沿該模板分化。(g)較高放大倍 數(shù)下的Lin—細(xì)胞(eGFP)與處于下層的(underlying)星形細(xì)胞(箭頭)之間 的締合。(h)未注射GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?I)注射后4天(P6)， eGFP+ Lin—HSC遷移至更深網(wǎng)層區(qū)并在該區(qū)進(jìn)行分化。左圖拍攝到完整鋪片 視網(wǎng)膜(whole mounted retina)中的Lin— HSC活性；右圖表示Lin—細(xì)胞
(箭頭)在視網(wǎng)膜(上部是玻璃體側(cè)，底部是鞏膜側(cè))中的位置。(j)用
a-CD31-PE和a-GFP-alexa 488抗體進(jìn)行雙標(biāo)記。注射后7天，注入的 LirTHSC(eGFP,紅色)摻入血管系統(tǒng)(CD31)。箭頭表示摻入?yún)^(qū)域。(k) 注射后14天(P17), eGFP+Lin—HSC細(xì)胞形成血管。(l)和(m)心臟內(nèi)注 射羅丹明-葡聚糖表明，初生網(wǎng)(l)和深層網(wǎng)(m)兩者中的血管是完整并
具有功能。
圖3顯示eGFP+ Lin— HSC細(xì)胞歸巢至由激光(a)和機(jī)械(b)兩者引 起成體視網(wǎng)膜損傷(星號(hào)表示損傷部位)而誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)增生(用表 達(dá)GFAP的星形細(xì)胞表示，最左邊的圖像)。最右邊的圖像為較高放大 倍數(shù)，表明Lin—HSC和星形細(xì)胞緊密締合。標(biāo)準(zhǔn)比例尺-20(xM。
圖4顯示Lin— HSC細(xì)胞拯救視網(wǎng)膜變性小鼠的血管系統(tǒng)。(a-d) 注射后27天(P33)用膠原IV染色的視網(wǎng)膜；(a)和(b)，注射Lin+ HSC 細(xì)胞(Balb/c)的視網(wǎng)膜顯示與正常FVB小鼠的血管系統(tǒng)沒(méi)有差異；(c) 和(d)，注射Lin—HSC(Balb/c)的視網(wǎng)膜具有豐富的血管網(wǎng)，與野生型 小鼠相似；(a)和(c),用DAPI染色的整個(gè)視網(wǎng)膜(上部為玻璃體側(cè)，底 部為鞏膜側(cè))的冷凍切片；(b)和(d)， ^L網(wǎng)膜完整鋪片的深網(wǎng)層；(e)柱狀圖表明在注射UiT HSC細(xì)胞的視網(wǎng)膜中所形成的深血管網(wǎng)的血管 供應(yīng)增加(11=6)。通過(guò)計(jì)算每張圖像內(nèi)血管的總長(zhǎng)度，來(lái)定量測(cè)定深層 視網(wǎng)膜血管形成的程度。對(duì)Lin—HSC、 Lin+HSC或?qū)φ找暰W(wǎng)膜血管的 平均總長(zhǎng)度/高倍視野(單位微米)進(jìn)行了比較。(f)注射得自W/W小鼠 的LhTHSC (R，右眼)或Lin+ HSC (L,左眼)細(xì)胞后深血管網(wǎng)長(zhǎng)度的比 較。顯示6只獨(dú)立小鼠的結(jié)果(各種顏色代表各只小鼠)。(g)和(h)當(dāng)注 射到P15眼時(shí)，Lin—HSC細(xì)胞(Balb/c)還拯救W/W血管系統(tǒng)。顯示了 Lin— HSC (G)或Lin+ HSC (H)細(xì)胞注射^f見(jiàn)網(wǎng)膜的中間血管網(wǎng)和深血管 網(wǎng)(注射后1個(gè)月)。
圖5是小鼠視網(wǎng)膜組織的顯微照片(a)視網(wǎng)膜完整鋪片的深層 (W/W小鼠)，eGFP+ LiiT HSC注射后5天(P11)可見(jiàn)(灰色)。(b)和(c) 在P6時(shí)接受Balb/c Lin—細(xì)胞(b)或Un+ HSC細(xì)胞(c)注射的Tie-2-GFP (n^力小鼠P60的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。(b)和(c)左圖中僅可觀察到內(nèi)源內(nèi) 皮細(xì)胞(GFP染色)。(b)和(c)中圖用CD31抗體染色；箭頭表示用CD31 但不是用GFP染色的血管，(b)和(c)右圖顯示用GFP和CD31兩者染 色。(d)注射Lin—HSC (左圖)和對(duì)照視網(wǎng)膜(右圖)的a-SMA染色。
圖6顯示T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的LirT HSC抑制小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的 發(fā)育。(a)在氨基端上具有Igk信號(hào)序列的人TrpRS、 T2-TrpRS和 T2-TrpRS的示意圖。(b)注射T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lin— HSC視網(wǎng)膜體內(nèi) 表達(dá)T2-TrpRS蛋白。(l)在大腸桿菌(五.co")中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS; (2)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS; (3)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組 T2-TrpRS; (4)對(duì)照視網(wǎng)膜；(5)注射Lin—HSC + pSecTag2A (僅載體) 的視網(wǎng)膜；(6)注射LirT HSC + pKLel35 (Igk畫(huà)T2-TrpRS/pSecTag)的視 網(wǎng)膜。(a)內(nèi)源TrpRS。 (b)重組T2-TrpRS。 (c) Lin—HSC注射視網(wǎng)膜的 T2-TrpRS。 (c-f)注射后7天，注射視網(wǎng)膜的代表性初生(淺層)網(wǎng)和次 生(深層)網(wǎng)；(c)和(d)注射空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LirTHSC的眼發(fā)育正常； (e)和(f) T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的LirTHSC注射眼大多數(shù)顯示抑制深層網(wǎng)；(c) 和(e)初生(淺層)網(wǎng)；(d)和①次生(深層)網(wǎng)。(f)中觀察到的血管模糊輪廓是(e)中所示初生網(wǎng)血管的"滲色(bleed-through)"圖像。
圖7顯示編碼帶His6標(biāo)簽的T2-TrpRS的DNA序列，SEQ ID NO:l。
圖8顯示帶His6標(biāo)簽的T2-TrpRS的氨基酸序列，SEQ IDNO:2。 圖9表示用Lin— HSC和用Lin+ HSC (對(duì)照)注射小鼠眼的視網(wǎng)膜
顯微照片和視網(wǎng)膜電位圖(ERG)。
圖IO統(tǒng)計(jì)圖表明用Lin— HSC治療的W/W小鼠眼中間(Int)血管
層和深血管層兩者的神經(jīng)元拯救(y軸)與血管拯救(x軸)之間的相關(guān)性。
圖11統(tǒng)計(jì)圖表明用Lin+ HSC治療的W/W小鼠眼的神經(jīng)元拯救 (y軸)與血管拯救(x軸)之間沒(méi)有相關(guān)性。
圖12柱狀圖是在注射后1個(gè)月(1M)、 2個(gè)月(2M)和6個(gè)月(6M) 時(shí)間點(diǎn)上用Lin—HSC (深色條形柱)治療的rd/W小鼠眼和未治療(淺色 條形柱)小鼠眼的血管長(zhǎng)度(y軸)，單位為任意相對(duì)單位。
圖13包括注射后1個(gè)月(1M)、 2個(gè)月(2M)和6個(gè)月(6M)的ra5/W 小鼠外神經(jīng)層(outer neural layer, ONR)核數(shù)的3個(gè)柱狀圖，證實(shí)了相對(duì) 于用Lin+ HSC治療的對(duì)照眼(淺色條形柱)，用Lin—HSC治療眼(深色 條形柱)的核數(shù)顯著增加。
圖14表示在1個(gè)月(1M)、 2個(gè)月(2M)和6個(gè)月(6M)的時(shí)間點(diǎn)(注 射后)上，右眼(R,用Lin—HSC治療)與左眼(L,用Lin+HSC治療的對(duì) 照眼睛)相比較時(shí)，每只r^W小鼠外神經(jīng)層中的核數(shù)圖；給定圖中每 條直線是將每只小鼠的眼睛進(jìn)行比較。
圖1S表示W(wǎng)〃W/ (C3H/HeJ,左圖)或野生型小鼠(C"BL/6，右 圖)中視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和神經(jīng)細(xì)胞的變化。所顯示的是完整鋪片視網(wǎng)膜 中視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的中間血管網(wǎng)層(上圖)或深血管網(wǎng)層(中圖)(紅色 膠原IV,綠色CD31)以及同一視網(wǎng)膜的切片(紅色DAPI，綠色 CD31，下圖)(P:出生后天數(shù))。(GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，INL:內(nèi)核層， ONL:外核層)。
圖16顯示LirT HSC注射拯救小鼠的變性神經(jīng)細(xì)胞。(A)、
(B) 和(C)，在P30(A)、 P60(B)和P180(C)時(shí)，Lin—HSC注射眼(右圖) 和對(duì)側(cè)對(duì)照細(xì)胞(CD3廠)注射眼(左圖)的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中網(wǎng)層(Int.) 或深網(wǎng)層(deep)以及切片。(D)，在P30 (左，n=10)、 P60 (中，n=10) 和P180(右，11=6)時(shí)，LirTHSC注射視網(wǎng)膜或?qū)φ占?xì)胞(CD3廠)注射視 網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)平均總長(zhǎng)度(+或-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。分別顯示出中 間血管網(wǎng)層(Int.)和深血管網(wǎng)層(deep)的數(shù)據(jù)(Y軸血管系統(tǒng)的相對(duì)長(zhǎng) 度)。(E),在P30(左，n-lO)、 P60(中，n-10)或P180 (右，n-6)時(shí)， 對(duì)照細(xì)胞(CD3廠)或Lin— HSC注射視網(wǎng)膜ONL中細(xì)胞核的平均數(shù)(Y 軸ONL中細(xì)胞核的相對(duì)數(shù))。(F)，在P30(左)、P60 (中)和P180 (右) 時(shí)，LirTHSC或?qū)φ占?xì)胞注射^L網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的長(zhǎng)度(X軸)與ONL中 細(xì)胞核數(shù)(Y軸)的線性相關(guān)性。
圖17表明通過(guò)Lin—HSC注射拯救視網(wǎng)膜功能。采用視網(wǎng)膜電描 記(ERG)記錄測(cè)量Lin—HSC或?qū)φ占?xì)胞(CD31—)注射視網(wǎng)膜的功能。(A) 和(B)，注射后2個(gè)月，代表性拯救和未拯救的^L網(wǎng)膜實(shí)例。圖中顯示 同一動(dòng)物L(fēng)in—HSC注射右眼(A)和CD31—對(duì)照細(xì)胞注射左眼(B)的視網(wǎng) 膜切片(綠色CD31染色的血管系統(tǒng)，紅色DAPI染色的核)。(C)， 同一動(dòng)物的ERG結(jié)果見(jiàn)(A)和(B)。
圖18顯示人骨髓細(xì)胞群可以拯救小鼠的退行性-f見(jiàn)網(wǎng)膜 (A-C)。在另 一個(gè)視網(wǎng)膜變性模型中同樣觀察到這類拯救(D-K)。 A ，用綠色染料標(biāo)記的人LhT HSC (hLiiT HSC)在注射到 C3SnSmn.CB17-iVWc SC7D小鼠玻璃體腔后，可以分化成視網(wǎng)膜血管 細(xì)胞。(B)和(C)，注射后1.5個(gè)月，hLin—HSC注射眼(B)或?qū)?cè)對(duì)照眼
(C) 的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(左圖；上中網(wǎng)層(Int.)，下深網(wǎng)層(deep))和 神經(jīng)細(xì)胞(右圖)。(D)-(K),用Lin—HSC (P6時(shí)注射)拯救W70小鼠。 圖中顯示在P21(D: Lin—HSC, H:對(duì)照細(xì)胞)、P30 (E: LirTHSC, I: 對(duì)照細(xì)胞)、P60(F: Lin—HSC, J:對(duì)照細(xì)胞)和P105 (G: Lin—HSC， K:對(duì)照細(xì)胞)時(shí)的代表性:現(xiàn)網(wǎng)膜(在每一時(shí)間點(diǎn)治療眼和對(duì)照眼來(lái)自同一動(dòng)物)。^L網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(各組照片上為中網(wǎng)層；各組照片中為深網(wǎng) 層)用CDW(綠色)和膠原IV(紅色)染色。各組照片下表示從同一視網(wǎng) 膜上切取的;f黃切片(紅色DAPI，綠色CD31)。
圖19表明用Lin— HSC治療后，晶體蛋白aA在被拯救的外核層 細(xì)胞中上調(diào)，但是用對(duì)照細(xì)胞治療的對(duì)側(cè)眼中沒(méi)有上調(diào)。左照片；拯 救視網(wǎng)膜中的IgG對(duì)照，中照片；拯救視網(wǎng)膜中的晶體蛋白aA,右 照片；未拯救視網(wǎng)膜中的晶體蛋白(xA。
圖20表格包括用本發(fā)明LirTHSC治療后，鼠視網(wǎng)膜中被上調(diào)的 基因。(A)在用鼠Lin— HSC治療的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)增加3倍的基因。 (B)在用鼠LirT HSC治療的小鼠視網(wǎng)膜中上調(diào)的晶體蛋白基因。(C)在 用人Lin— HSC治療的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)增加2倍的基因。(D)在用人 LirT HSC治療的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)上調(diào)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或生長(zhǎng)因子 的基因。
圖21說(shuō)明CD31和整聯(lián)蛋白a6表面抗原在CD133陽(yáng)性(DC133+) 和CD133陰性(CD133—)人LiiT HSC群中的分布。左圖顯示流式細(xì)胞 術(shù)散點(diǎn)圖。中圖和右圖是顯示細(xì)胞群中特定抗體表達(dá)水平的峰圖 (histogram)。 Y軸代表事件次數(shù)，X軸表示信號(hào)強(qiáng)度。偏移向輪廓線 峰圖(對(duì)照)右側(cè)的實(shí)心峰圖表示熒光信號(hào)和抗體表達(dá)增加超出本底水 平。
圖22說(shuō)明在正常含氧水平(常氧(normoxia))下祠養(yǎng)的野生型 C57/B16小鼠在出生后PO天至P30天之間的出生后視網(wǎng)膜發(fā)育。
圖23說(shuō)明在P7和P12之間在高含氧水平(高氧(hyperoxia);含氧 量75°/。)、隨后從P12到P17在常氧下詞養(yǎng)的C57/B16小鼠的氧誘導(dǎo) 的視網(wǎng)膜病模型。
圖24表明氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病(OIR)模型中用Lin—HSC群治療的血 管拯救。
圖25顯示在經(jīng)玻璃體腔注射Lin— HSC后，小鼠外核層(QNL) 中被拯救的光感受器主要為視錐細(xì)胞。野生型小鼠視網(wǎng)膜(上組圖)中
14較小百分比的光感受器為視錐細(xì)胞，如紅色/綠色視錐視蛋白表達(dá)所證
實(shí)(A)，而大多數(shù)的ONL細(xì)胞對(duì)視桿特異性視紫紅質(zhì)呈陽(yáng)性(B)。視網(wǎng) 膜血管系統(tǒng)由于免疫前血清(pre-immune serum)而自身發(fā)出熒光(C), 但是核層對(duì)于用視桿或視錐特異性視蛋白染色完全呈陰性。小鼠 視網(wǎng)膜(下組圖)內(nèi)核層減小，幾乎成完全萎縮的ONL，這兩者對(duì)視錐 視蛋白(D)或視桿視蛋白(圖G)均呈陰性。對(duì)照CD3廠HSC治療眼與 未注射的W/W視網(wǎng)膜相同，無(wú)視錐視蛋白(E)或視桿視蛋白(H)的任何 染色。LirTHSC治療的對(duì)側(cè)眼顯示顯著減少但卻明顯存在的ONL，它 主要由視錐細(xì)胞組成，如視錐紅/綠色視蛋白的陽(yáng)性免疫反應(yīng)性所證實(shí) (F)。還觀察到少量視桿細(xì)胞(I)。
圖26表示用流式細(xì)胞術(shù)表征的譜系陰性和譜系陽(yáng)性干細(xì)胞群的 散點(diǎn)圖(分別為左上圖和左下圖)，顯示表達(dá)CD44抗原的細(xì)胞的百分 比(紅色數(shù)據(jù)點(diǎn))；以及CD31陰性和CD31陽(yáng)性細(xì)胞群的散點(diǎn)圖(分別 為右上圖和右下圖)，顯示表達(dá)CD44抗原的細(xì)胞的百分比(紅色數(shù)據(jù) 點(diǎn))。
圖27表示用流式細(xì)胞術(shù)表征的表達(dá)顯著水平的CD44抗原的譜 系陰性細(xì)胞群(左組圖)和不表達(dá)顯著水平的CD44抗原的骨髓細(xì)胞亞 群(右組圖)的散點(diǎn)圖，說(shuō)明了表達(dá)其它各種細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞的相 對(duì)百分比。
圖28顯微照片顯示經(jīng)玻璃體腔注射本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群的細(xì) 胞的小鼠的視網(wǎng)膜(左圖)與經(jīng)玻璃體腔注射CD44L()細(xì)胞的小鼠的視 網(wǎng)膜的比豐支。
圖29顯微照片顯示注射了 MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞(CD44W)的眼睛 的視網(wǎng)膜和注射了 CD44^Q細(xì)胞的眼睛的視網(wǎng)膜。
圖30柱狀圖表明在氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的視網(wǎng)膜病模型中 MLBM細(xì)胞群對(duì)于改善小鼠視網(wǎng)膜致病性血管生成和促進(jìn)生理上有 益的血管重建(revascularization)的有益效果。上圖對(duì)對(duì)照視網(wǎng)膜(第1 條形柱)、用CD44^細(xì)胞治療的視網(wǎng)膜(中間條形柱)和用MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞治療的視網(wǎng)膜(右條形柱)的視網(wǎng)膜前新血管簇(tuft)面積進(jìn)行
了比較。下圖對(duì)對(duì)照視網(wǎng)膜(第l條形柱)、用CD44^細(xì)胞治療的視網(wǎng) 膜(中間條形柱)和用MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞治療的視網(wǎng)膜(右條形柱)的 血管消失面積進(jìn)行了比較。
圖31顯微照片表明一旦MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞摻入視網(wǎng)膜的血管 系統(tǒng)，則所述細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，如照片下部細(xì)胞的 綠色染色所示。
圖32是表明本發(fā)明的CDllb+ MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞選擇性靶向 視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的顯微照片。
圖33是表明CD44—CDllb—骨髓細(xì)胞未選擇性靶向視網(wǎng)膜血管系 統(tǒng)的顯孩t照片。
圖34顯示TrpRS的T2片段的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:3)及 其T2-TrpRS-GD變異的氨基酸殘基序列(SEQ IDNO:4)。
圖35顯示mini-TrpRS的氨基酸殘基序列(SEQ IDNO:5)。 圖36顯示Tl-TrpRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:6)。 圖37顯示氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病(OIR)模型小鼠的正常視網(wǎng)膜血管發(fā) 育和經(jīng)玻璃體腔移植Lin—骨髓衍生細(xì)胞后的拯救效杲。小鼠出生時(shí)視 網(wǎng)膜很大程度上無(wú)血管，如出生后2天(P2)所示(圖a，視網(wǎng)膜完整鋪 片)，其中血管存在于占據(jù)如圖b所示單一平面的淺層視網(wǎng)膜中。圖b、 圖d和圖f是從旋轉(zhuǎn)90度的w/ace共焦z系列數(shù)據(jù)組3D圖像拍攝的 照片。出生后第一周內(nèi)，淺層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)自視神經(jīng)頭按輻射方式 生長(zhǎng)，到P10時(shí)幾乎達(dá)到周邊(c)。然后在第二周內(nèi)，從淺層分支建立 深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(d)。最后在頭兩層之間形成第三層血管網(wǎng)(third plexus of vessel),在P30前后建立成熟的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(e、 f)。圖g 顯示OIR模型暴露于高氧引起中心血管消失(central vaso-obliteration), 如所本文在P10時(shí)所示。圖h顯示在P12時(shí)，在移至常氧后，中心視 網(wǎng)膜開(kāi)始重建血管，并在血管化(周邊)和無(wú)血管(中心)視網(wǎng)膜之間的界 面形成特有的視網(wǎng)膜前新血管簇。這些簇被同工凝集素強(qiáng)染色。圖I-n顯示在OIR模型中Lin—造血祖細(xì)胞促進(jìn)血管修復(fù)。在P17時(shí)，當(dāng)與溶 々某治療的另側(cè)眼相比時(shí)，在高氧暴露之前經(jīng)玻璃體腔注射LirT細(xì)胞顯 著加快中心視網(wǎng)膜的血管重建。而用溶媒治療的視網(wǎng)膜顯示部分缺乏 淺層血管系統(tǒng)(I)，并完全缺乏深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(k、 m)， Lin—細(xì)胞 治療的另側(cè)眼顯示視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)相對(duì)正常(j),具有所有3個(gè)網(wǎng)層都 存在(k、 m)。圖o顯示在P17時(shí)，比起未注射眼或溶媒注射眼，用 LirT細(xì)胞治療的OIR眼明顯更常常充分地重建血管。通過(guò)心臟灌注熒 光素-葡聚糖(如圖a-f、 i、 j所示)和GS凝集素(圖g、 h、 k-n)對(duì)血管 進(jìn)行了觀測(cè)。圖k-n中的核用DAPI標(biāo)記。
圖38顯示在OIR中Lin—細(xì)胞加快視網(wǎng)膜血管重建，減少視網(wǎng)膜 前新血管簇形成。圖a-d顯示采用計(jì)算機(jī)圖像分析方法計(jì)算在出生后 第17天得自O(shè)IR眼的視網(wǎng)膜完整鋪片中視網(wǎng)膜血管消失以及視網(wǎng)膜 前新血管簇形成(紅色)的面積。圖e顯示在高氧前用Lin-細(xì)胞治療的 視網(wǎng)膜的消失面積減少幾乎是未注射對(duì)照的6倍，與僅用溶媒治療的 眼睛相比減少約5倍。圖f顯示與未注射眼和溶々某治療眼相比，Lin— 細(xì)胞治療顯著減少新血管簇的二維面積。圖g顯示Lin—細(xì)胞移植不僅 在高氧之前給予時(shí)有效減少消失面積，而且在P9-P12的高氧期間以及 剛剛恢復(fù)常氧后也有效減少消失面積。(柱形圖表示平均值士SEM; *p < 0.001)。
圖39顯示骨髓細(xì)胞治療幾乎沒(méi)有或沒(méi)有長(zhǎng)期毒性作用。在接受 LiiT細(xì)胞治療后5或6個(gè)月進(jìn)行評(píng)價(jià)的視網(wǎng)膜具有正常出現(xiàn)的視網(wǎng)膜 血管系統(tǒng)，神經(jīng)視網(wǎng)膜從橫切片看來(lái)在組織上受到保護(hù)(a-f，未注射 與移植后6個(gè)月的Lin—細(xì)胞注射視網(wǎng)膜)。未觀察到腫瘤，神經(jīng)視網(wǎng)膜 中偶見(jiàn)"玫瑰花結(jié)(rosette)"異常，這同樣可能存在對(duì)照非注射眼內(nèi)(g、 h)。
圖40顯示CD44HI細(xì)胞普遍存在于Lin—群中，并有效促進(jìn)OIR模 型的血管修復(fù)。圖a顯示骨髓含有CD44^和CD44^部分，與對(duì)照 CD細(xì)胞相比，LirT群富含CD44m細(xì)胞。插圖顯示是單核細(xì)胞和粒細(xì)胞特有的CD44"細(xì)胞的光散射特性，而CD44^細(xì)胞的光散射特性是 淋巴細(xì)胞特有的。圖b顯示得自在氧暴露之前用CD44^和CD44HI 骨髓細(xì)胞治療的眼睛的代表性P17視網(wǎng)膜。下圖說(shuō)明在P17時(shí)定量測(cè) 定的消失面積和新血管形成面積用來(lái)產(chǎn)生圖c中所示的數(shù)據(jù)。圖c顯 示用CD44H1細(xì)胞治療的眼晴中血管消失和視網(wǎng)膜前新血管形成減少， 功效與用Lin—細(xì)胞治療的眼睛相似。與用溶^(某注射或未注射相比， CD44HI和LirT注射眼中血管消失面積("和視網(wǎng)膜前新血管形成面積 C^)顯著減小(所有情況下p〈l(T5)。與CD^Hi相比，Lin—細(xì)胞治療眼的 消失面積也減少(p-0.03),但是減至更小程度。視網(wǎng)膜前新血管形成 的面積在Lin—和CD44^治療眼之間沒(méi)有顯著不同(p-0.25)。
圖41顯示CD44W亞群表達(dá)骨髓標(biāo)記。圖a中，采用雙色流式細(xì) 胞術(shù)進(jìn)一步表征CD44群。所有細(xì)胞都用抗CD44抗體標(biāo)記，并用所 示不同的抗體共標(biāo)記。對(duì)于CDlla、 CDllb和Ly6GC, CD44^群顯 示呈強(qiáng)標(biāo)記。CD44hi細(xì)胞組分對(duì)于CD14、 F4/80、 cKit和CD115呈 陽(yáng)性。這些抗原的大多數(shù)存在于骨髓譜系細(xì)胞中。CD44LQ細(xì)胞被 Terl 19和CD45RB220強(qiáng)標(biāo)記，它們分別是成紅血細(xì)胞和B細(xì)胞的標(biāo) 記。
圖42顯示CD44W細(xì)胞在視網(wǎng)膜中呈現(xiàn)血管周圍定位(perivascular localization)。采用共焦成像生成一系列z維圖像，然后再以3D表示 出來(lái)。圖a中，顯示了表示CD31標(biāo)記的血管內(nèi)皮和自引入的骨髓細(xì) 胞表達(dá)的GFP的圖像。骨髓細(xì)胞似乎具有假定的血管周圍位置。3D 數(shù)據(jù)表明，觀測(cè)到血管腔和GFP+骨髓細(xì)胞的相對(duì)位置。圖(b)中所列 數(shù)字與圖(a)標(biāo)明的橫切片位置相對(duì)應(yīng)。除了圖b第3號(hào)以外的所有情 況下，在所述腔外都檢測(cè)到GFP信號(hào)，第3號(hào)是通過(guò)具有強(qiáng)熒光的細(xì) 胞體的切片，此處信號(hào)被滲色是顯而易見(jiàn)的。
圖43顯示OIR模型中注射CD44 骨髓細(xì)胞的原位分析。未接受 細(xì)胞治療的對(duì)照視網(wǎng)膜的標(biāo)記顯示，存在內(nèi)源F4/80+血管周圍細(xì)胞 (a-c)。注射的CD44W細(xì)胞靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，具有與內(nèi)源細(xì)胞類似
18的定位、形態(tài)和F4/80表達(dá);f莫式(d-i)。移植的血管周圍骨髓細(xì)^^缺乏 CD44表達(dá)，而未與視網(wǎng)膜血管締合的細(xì)胞保持CD44表達(dá)(j-o)。
圖44表示表達(dá)陣列分析，該分析顯示CD44^群中高表達(dá)的骨髓 相關(guān)基因，而CD44LG細(xì)胞表達(dá)與淋巴細(xì)胞有關(guān)的基因。采用 AFF YMETRIX 陣列對(duì)這兩種骨髓細(xì)胞群之間的基因表達(dá)鐠進(jìn)行了 比較。所示基因在表達(dá)上具有最低5倍的差異。觀察到與CD44Lo細(xì) 胞相比，CD44^群中CD44表達(dá)的水平顯著較高。
圖45表明CD44^細(xì)胞可以分化成具有小膠質(zhì)細(xì)胞特征的細(xì)胞。 圖A和圖B顯示CD44H"主射細(xì)胞表達(dá)CDllb和F4/80,并具有與內(nèi) 源小膠質(zhì)細(xì)胞類似的形態(tài)和血管周圍定位。圖C提供CD44^注射細(xì) 胞血管周圍定位的3d圖像。圖D顯示高放大倍數(shù)視野的CD44^注射 細(xì)胞的形態(tài)。
圖46表明可以通過(guò)負(fù)選擇法分離出CD44^細(xì)胞。圖A顯示使用 對(duì)CD45R/B220、 TER119和CD3e有選擇性的抗體通過(guò)MACS耗盡 小鼠骨髓產(chǎn)生CD44W細(xì)胞超過(guò)90%的細(xì)胞群。圖B顯示陰性部分 (CD44^群)基本上不含CD45R/B220、 TER119和CD3e細(xì)胞。圖C顯 示通過(guò)負(fù)選擇法選出的CD44HI細(xì)胞保持視網(wǎng)膜的尋靶和分化能力。
圖47表明HIF-1表達(dá)在OIR模型中對(duì)介導(dǎo)修復(fù)的骨髓祖細(xì)胞十 分重要。圖a和圖b顯示用得自骨髓特異性HIF-la敲出小鼠的CD44HI 細(xì)胞(a)或得自野生型小鼠的CD44HI細(xì)胞(b)治療的眼睛的代表性GS 凝集素染色的視網(wǎng)膜完整鋪片。圖c和圖d是顯示血管消失(淺色區(qū)) 和新血管簇(深色區(qū))測(cè)量面積的圖a和圖b的視網(wǎng)膜圖像。圖(e)提供 匯編數(shù)據(jù)，顯示用得自HIF-la敲出小鼠的CD44^細(xì)胞治療的眼睛的 修復(fù)活性顯著喪失。*p《0.0003， **p=0.024， n=15,這些值表示平均 值± SEM。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用配對(duì)眼產(chǎn)生。
圖48提供C57BL/6J和BALB/cByJ品系的對(duì)比，顯示在OIR模 型缺血期，CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)可測(cè)量的差異。圖(a)顯示視網(wǎng)膜完整 鋪片，其中兩個(gè)品系顯示在出生后第12天(P12),中心視網(wǎng)膜血管消失的程度大致相同；P17的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)有顯著差異，其中C57BL/6J 視網(wǎng)膜顯示中心視網(wǎng)膜中有豐富的新血管簇，幾乎沒(méi)有血管重建。相 比之下，BALB/cByJ視網(wǎng)膜顯示此時(shí)幾乎沒(méi)有或者沒(méi)有視網(wǎng)膜前新血 管形成，并且血管重建基本完成。圖(b)顯示經(jīng)48小時(shí)缺血過(guò)程后， 與BALB/cByJ視網(wǎng)膜(右)相比，C57BL/6J視網(wǎng)膜(左)含有較少的 CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞。視神經(jīng)頭定位于所有圖像的右下方。圖(c)提供兩 個(gè)品系中隨時(shí)間測(cè)定的CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞，圖中表明C57BL/6J視網(wǎng) 膜在P12 (缺血0小時(shí))回復(fù)到常氧時(shí)具有較少的小膠質(zhì)細(xì)胞，是在Pl4 時(shí)(缺血48小時(shí))BALB/cByJ小鼠視網(wǎng)膜存在的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)的一半 以下。在所有時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于BALB/cByJ與C57BL/6J,p《0.02， n = 8-11 。 圖(d)說(shuō)明在視網(wǎng)膜發(fā)育期間，C57BL/6J中小膠質(zhì)細(xì)胞耗盡誘導(dǎo)預(yù)先 存在的微血管系統(tǒng)顯著喪失。注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體在P5時(shí)導(dǎo)致 CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞顯著喪失，在P8時(shí)導(dǎo)致毛細(xì)血管消失。所示圖像 都位于中心視網(wǎng)膜的相似位置，視神經(jīng)頭位于右下方。圖(e)顯示當(dāng)與 對(duì)照PBS脂質(zhì)體治療的另側(cè)眼相比時(shí)，P2時(shí)給C57BL/6J注射氯膦酸 鹽脂質(zhì)體引起CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞的顯著消耗，并且在P6時(shí)明顯抑制 和破壞視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)；插圖顯示帶標(biāo)記的脂質(zhì)體制劑(紅色)專被 CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)吸收，而不被GS凝集素標(biāo)記的血管細(xì)胞(藍(lán) 色)吸收，也不被任何CDllb—細(xì)胞吸收。
圖49顯示從人骨髓中分離的細(xì)胞的FACS分析數(shù)據(jù)圖，鑒定出 在各細(xì)胞中表達(dá)的多種細(xì)胞標(biāo)記。
圖50顯示從人骨髓中分離的CD44 細(xì)胞的FACS分析數(shù)據(jù)圖。
圖51顯示從人骨髓中分離的細(xì)胞的FACS分析數(shù)據(jù)圖，鑒定出 細(xì)胞標(biāo)記CDlla、 CDllb、 CD33和CD114。
圖52柱狀圖顯示對(duì)用人和d、鼠CD44HI細(xì)胞治療以及PBS對(duì)照治 療的小鼠視網(wǎng)膜的簇面積和消失面積的比較。
圖53顯示從人外周血中分離的細(xì)胞的FACS分析數(shù)據(jù)圖，鑒定 出各種細(xì)胞標(biāo)記。圖54柱狀圖顯示與CD14—細(xì)胞和用PBS處理的細(xì)胞(對(duì)照)相比， 對(duì)用CD44HI細(xì)胞治療的小鼠視網(wǎng)膜的簇面積和消失面積進(jìn)行比較， 所述CD44HI細(xì)胞通過(guò)用CD14和CD33進(jìn)行正選擇而獲得。
圖55顯示從人外周血中分離的細(xì)胞的FACS分析數(shù)據(jù)圖。
圖56柱狀圖顯示與PBS對(duì)照治療相比較時(shí)，對(duì)得自用本發(fā)明各 種細(xì)胞群治療的小鼠視網(wǎng)膜的簇面積和消失面積進(jìn)行比較。
圖57顯示人臍帶血單核細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞。
圖58顯示人臍帶血單核細(xì)胞用抗KDR (VEGFR2)抗體的免疫染色。
圖59顯示人臍帶血單核細(xì)胞用抗PECAM (CD31)抗體的免疫染色。
圖60柱狀圖顯示與僅用PBS治療的視網(wǎng)膜相比，用本發(fā)明的人 臍帶髓樣細(xì)胞治療的小鼠視網(wǎng)膜的簇面積和消失面積。
圖61柱狀圖顯示與僅用PBS治療的視網(wǎng)膜相比，用本發(fā)明的人 臍帶髓樣細(xì)胞治療的小鼠視網(wǎng)膜的簇面積和消失面積。
圖62顯示用eGFP慢病毒表達(dá)(lentiviralexpression)鑒定的新鮮臍 帶血單核細(xì)胞的顯微照片。
圖63上圖顯示FACS數(shù)據(jù)，柱狀圖(下圖)顯示與僅用PBS或 CD14—細(xì)胞治療的視網(wǎng)膜相比，用人臍帶髓樣細(xì)胞治療的小鼠視網(wǎng)膜 的簇面積和消失面積，所述人臍帶髓樣細(xì)胞用CD14進(jìn)行正選擇而分 離出來(lái)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述
骨髓、外周血和臍帶血分別包含表達(dá)CD44抗原(即透明質(zhì)酸受體) 和CDllb (整聯(lián)蛋白aM)的髓樣細(xì)胞亞群?？赏ㄟ^(guò)用抗CD44抗原的
髓細(xì)胞后，從中選出與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞，從而從骨髓中分離 出富含CD44和CD1 lb表達(dá)細(xì)胞的骨髓細(xì)胞髓樣群。然后可通過(guò)本領(lǐng)
21域眾所周知的方法從細(xì)胞中分離出抗體。例如可以應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)， 用結(jié)合微珠或包被在微珠上的抗體然后過(guò)濾選出細(xì)胞，或者通過(guò)本領(lǐng) 域眾所周知的其它分離方法選出細(xì)胞。大部分選出的細(xì)胞為譜系陰
性，并同時(shí)表達(dá)CD44抗原和CDllb抗原，無(wú)論哪一個(gè)抗體均可用于 分離。
除骨髓以外，還可從外周血和從臍帶血分離出表達(dá)CD44和 CDllb的髓樣細(xì)胞群。優(yōu)選髓樣細(xì)胞群從人骨髓、人外周血或人臍帶 血中分離。
骨髓包含干細(xì)胞。通常，干細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞表面上分布的抗原進(jìn) 行鑒定(有關(guān)詳細(xì)論述參見(jiàn)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院科學(xué)政策處(National Institutes of Health, Office of Science Policy)撰寫(xiě)的寺艮告Sfew Ce/Zs: 5We"/折c /Vo^aw awdFi^wre ￡h>ec"<ms (干纟田胞科學(xué)進(jìn)展與未來(lái)方 向)，2001年6月，附錄E: Stem Cell Markers (干細(xì)胞標(biāo)記)，該報(bào)告通 過(guò)引用有關(guān)內(nèi)容結(jié)合到本文中)。大約75%從骨髓分離的譜系陰性造血 千細(xì)胞也呈CD44陽(yáng)性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MLBM細(xì)胞群的 大部分細(xì)胞是譜系陰性造血干細(xì)胞(即CD44tin—HSC)。
本發(fā)明提供改善患有眼病的哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜血管變性和神經(jīng) 元變性的方法。將本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群給予哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜， 優(yōu)選通過(guò)玻璃體腔注射。所給予的細(xì)胞的量足以改善視網(wǎng)膜的血管變 性和/或神經(jīng)元變性。優(yōu)選分離髓樣細(xì)胞群是待治療的哺乳動(dòng)物自體 的。優(yōu)選給予生理上可耐受的介質(zhì)(例如磷酸緩沖鹽溶液(PBS))中的髓 樣細(xì)胞群的細(xì)胞。
一種優(yōu)選的方法包括從待治療的哺乳動(dòng)物骨髓中分離出髓樣細(xì) 胞群，然后以足以改善視網(wǎng)膜血管變性和/或神經(jīng)元變性的量將所述細(xì) 胞給予哺乳動(dòng)物。所述細(xì)胞可從患有眼部變性疾病的哺乳動(dòng)物中分 離，優(yōu)選在眼病早期或者從已知易患眼部變性疾病(即通過(guò)遺傳體質(zhì)) 的健康哺乳動(dòng)物中分離。在后一種情況下，分離髓樣細(xì)胞群可在分離 后保存，然后在后來(lái)發(fā)生眼病的早期進(jìn)行預(yù)防性注射。優(yōu)選患病視網(wǎng)膜包含活化星形細(xì)胞，髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞將耙向該類細(xì)胞。因此，當(dāng) 與神經(jīng)膠質(zhì)增生有關(guān)時(shí)，眼睛的早期治療是有益的?；蛘?，可以在給 予自體髓樣細(xì)胞群之前，用激光刺激視網(wǎng)膜中活化星形細(xì)胞局部增
殖，從而治療^L網(wǎng)膜。
造血干細(xì)胞是能夠發(fā)育成各種血細(xì)胞類型(例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、 粒細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞)的干細(xì)胞。語(yǔ)系表面抗原是一組細(xì)胞表面蛋 白，細(xì)胞表面蛋白是成熟血細(xì)胞語(yǔ)系的標(biāo)記，包括CD2、 CD3、 CDll、 CDlla、 Mac-l (CDllb:CD18)、 CD14、 CD16、 CD19、 CD24、 CD33、 CD36、 CD38、 CD45、 CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER畫(huà)119、 CD56、 CD64、 CD68、 CD86(B7.2)、 CD66b、人白細(xì)胞抗原DR (HLA-DR)和CD235a (血型糖蛋白A)。不表達(dá)高水平的這些抗原的造血干細(xì)胞一般稱為譜 系陰性(Lin—)。人造血干細(xì)胞一般表達(dá)其它表面抗原，例如CD31、 CD34、 CDU7(c-kit)和/或CD133。鼠造血干細(xì)胞一般表達(dá)其它表面抗 原，例如CD34、 CD117 (c-kit)、 Thy-l和/或Sca-l。
本發(fā)明的這些CD44+ CDllb髓樣細(xì)胞能夠摻入發(fā)育中的血管系 統(tǒng)，然后分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
本文和所附權(quán)利要求書(shū)中所使用的表述"成年/成體"當(dāng)涉及骨髓 和骨髓細(xì)胞時(shí)，包括出生后，即從幼年個(gè)體和成年個(gè)體分離的骨髓， 與胚胎相對(duì)應(yīng)。因此，術(shù)語(yǔ)"成年哺乳動(dòng)物"是指幼年(出生后)和完 全成熟的哺乳動(dòng)物，與胚胎或出生前個(gè)體相對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群當(dāng)經(jīng)玻璃體腔注射到哺乳動(dòng)物種類(例 如小鼠或人，所述細(xì)胞從其中分離)的眼內(nèi)時(shí)，選擇性靶向星形細(xì)胞并 摻入視網(wǎng)膜新血管系統(tǒng)。
本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群包括摻入視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，并可用于治 療視網(wǎng)膜新血管和視網(wǎng)膜血管變性疾病以及修復(fù)^L網(wǎng)膜血管損傷的 細(xì)胞。本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群還促進(jìn)視網(wǎng)膜的神經(jīng)元拯救，并促進(jìn)抗凋 亡基因上調(diào)。另外，可以使用本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群治療新生哺乳動(dòng)物 眼的視網(wǎng)膜缺陷，例如患有氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的哺乳動(dòng)物。
研究發(fā)現(xiàn)，不表達(dá)CD44的骨髓細(xì)胞(CD44^細(xì)胞)一般表達(dá)一種 或多種下列細(xì)胞標(biāo)記Terl19、 CD45RB220和CD3e。利用這一事實(shí)， 可通過(guò)包括陰性細(xì)胞標(biāo)記篩選在內(nèi)的方法來(lái)分離本發(fā)明的CD44HI髓 樣細(xì)胞。該方法包括使大量骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞或臍帶細(xì)胞與對(duì) Terl19、 CD45RB220和CD3e有特異性的抗體接觸，從大量骨髓細(xì)胞 中除去與Terl19、 CD45RB220和CD3e抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞，回 收缺失Terl 19、 CD45RB220和CD3e表達(dá)細(xì)胞的髓樣骨髓細(xì)胞。采用 這種方法，可回收其中90。/。以上的細(xì)胞表達(dá)CD44的髓樣細(xì)胞群。
本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物眼病的方法，該方法包括從哺乳動(dòng)物 骨髓中分離出髓樣細(xì)胞群，按足以抑制該病的量經(jīng)玻璃體腔將髓樣細(xì) 胞群的細(xì)胞注射到哺乳動(dòng)物眼內(nèi)?？刹捎帽景l(fā)明的方法治療眼病，例 如新生、幼年或完全成熟的哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜變性疾病、視網(wǎng)膜血管 變性疾病、缺血性視網(wǎng)膜病、血管出血、血管滲漏和脈絡(luò)膜病。這類 疾病的實(shí)例包括年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病 (DR)、擬眼組織胞漿菌病(POHS)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、鐮狀細(xì)胞 性貧血和色素性視網(wǎng)膜炎以及視網(wǎng)膜損傷。
注射到眼睛的髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞數(shù)足以抑制眼病病況。例如，注 射細(xì)胞的量可有效用于修復(fù)眼睛的視網(wǎng)膜損傷，穩(wěn)定視網(wǎng)膜新血管系 統(tǒng)，使視網(wǎng)膜新血管系統(tǒng)成熟，并防止或修復(fù)血管滲漏和血管出血。
本發(fā)明髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞可以用治療上有益的基因轉(zhuǎn)染，例如編 碼抗血管生成蛋白的基因以用于眼科基于細(xì)胞的基因療法，以及編碼 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分的基因以提高神經(jīng)元拯救效果。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以包含在治療上有益的治療視網(wǎng)膜疾病的任何基因。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染細(xì)胞包含有效 編碼抗血管生成肽的基因，所述肽包括蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，例如 TrpRS或其抗血管生成(即血管抑制)片段，例如TrpRS片段，稱為 T2畫(huà)TrpRS (圖34中的SEQ ID NO:3)、T2-TrpRS國(guó)GD (圖34中的SEQ ID
24NO:4)(這兩個(gè)是優(yōu)選的血管抑制肽)，以及mini-TrpRS (圖35中的SEQ IDNO:5)和Tl-TrpRS(圖36中的SEQIDNO:6)。本發(fā)明的編碼抗血管 生成肽的髓樣細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可用于治療包括血管發(fā)育異常在內(nèi) 的視網(wǎng)膜疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病等疾病。優(yōu)選髓樣細(xì)胞群的細(xì) 胞是人細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染細(xì) 胞包含有效編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分(neurotrophic agent)的基因，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成 分例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 蛋白-5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰 島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦衍生神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子等。這類得自髓樣細(xì)胞群的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞可用于在視網(wǎng)膜神經(jīng) 元變性疾病(例如青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎)、在治療視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷 等疾病中促進(jìn)神經(jīng)元拯救。有報(bào)道指出，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的植入用 于治療色素性視網(wǎng)膜炎(參見(jiàn)Kirby等，2001, Mo/77^. 3(2):241-8; Farrar等，2002，五MBO/ow"a/21:857-864)。據(jù)報(bào)道，腦衍生神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子調(diào)節(jié)受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)中與生長(zhǎng)有關(guān)的基因(參見(jiàn)Foumier等， 1997, /iVewrasc/. 47:561-572)。據(jù)報(bào)道，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子延遲色素性視網(wǎng)膜炎的光感受器變性(參見(jiàn)McGee等， 2001,她/ 77^. 4(6):622-9)。
本發(fā)明還提供用于治療眼血管生成疾病的方法，該方法通過(guò)本發(fā) 明的髓樣細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)玻璃體腔注射到眼睛來(lái)給予所述細(xì)胞。 這類髓樣細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括用在治療上有益的基因轉(zhuǎn)染的 MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞，所述基因例如編碼抗血管生成或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)基因 產(chǎn)物的基因。優(yōu)選髓樣細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染細(xì)胞是人細(xì)胞。
優(yōu)選至少約"105個(gè)MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞或髄樣細(xì)胞群的轉(zhuǎn)染 細(xì)胞通過(guò)玻璃體腔注射給予患有視網(wǎng)膜變性疾病的哺乳動(dòng)物眼睛。待 注射的細(xì)胞數(shù)可取決于視網(wǎng)膜變性的嚴(yán)重程度、哺乳動(dòng)物的年齡和對(duì) 治療視網(wǎng)膜疾病領(lǐng)域普通技術(shù)人員十分顯而易見(jiàn)的其它因素?？梢詥蝿┝炕蛞欢〞r(shí)間內(nèi)的多劑量給藥給予髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞，由主治臨床 醫(yī)生決定。
本發(fā)明的髓樣細(xì)胞群可用于治療視網(wǎng)膜損傷和視網(wǎng)膜缺陷，包括 中止或減輕視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)或視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性。人髓樣細(xì)胞群還可
用于產(chǎn)生遺傳上一致的細(xì)胞系即克隆，以用于再生性或修復(fù)性治療禍L 網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，以及用于治療或改善^L網(wǎng)膜神經(jīng)元變性。此外，本發(fā) 明的髓樣細(xì)胞群可用作研究視網(wǎng)膜血管發(fā)育和將基因遞送到選定細(xì) 胞靶標(biāo)(例如星形細(xì)胞)的研究工具。
鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育。
眼血管生成的模型。小鼠眼為研究哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜血管發(fā)育(例 如人視網(wǎng)膜血管發(fā)育)提供了公認(rèn)的模型。在鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育期 間，缺血驅(qū)動(dòng)的視網(wǎng)膜血管發(fā)育成與星形細(xì)胞緊密締合。這些神經(jīng)膠 質(zhì)組分從視盤沿神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層遷移至第三個(gè)三個(gè)月的人胎兒或新生 嚙齒動(dòng)物的視網(wǎng)膜上并放射狀擴(kuò)展。當(dāng)鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育時(shí)，內(nèi) 皮細(xì)胞利用這個(gè)已建立的星形細(xì)胞模板來(lái)確立視網(wǎng)膜血管模式(參見(jiàn) 圖l(a和b))。
圖1 (a和b)表示發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜的示意圖。圖(a) 表示疊合在星形細(xì)胞模板(淺色線條)之上的初生網(wǎng)(圖中左上方的深 色線條)的發(fā)育，(b)表示第二期視網(wǎng)膜血管形成。
圖1中，GCL代表 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL代表內(nèi)網(wǎng)層；INL代表內(nèi)核層；OPL代表外網(wǎng)層； ONL代表外核層；RPE代表視網(wǎng)膜色素上皮；ON代表視神經(jīng)；P代 表周邊。
出生時(shí)，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)實(shí)際上不存在。在出生后第14天(P14)，
視網(wǎng)膜已發(fā)育出與視覺(jué)出現(xiàn)同時(shí)發(fā)生的復(fù)雜的初生(淺)層和次生(深) 層視網(wǎng)膜血管。最初，輻條樣視乳頭周的血管在預(yù)先存在的星形細(xì)胞 網(wǎng)上向周邊呈放射狀生長(zhǎng)，經(jīng)形成毛細(xì)血管網(wǎng)層而逐漸相互連接起 來(lái)。直到PIO，這些血管在神經(jīng)纖維內(nèi)生長(zhǎng)成單層(圖l(a))。在P7-P8 之間，側(cè)枝開(kāi)始從這個(gè)初生網(wǎng)萌發(fā)，并穿透到視網(wǎng)膜直到外網(wǎng)狀層，在此形成次生或深層視網(wǎng)膜網(wǎng)。到P21時(shí)，整個(gè)網(wǎng)進(jìn)行廣泛重塑，并 在內(nèi)核層的內(nèi)表面上形成第三層即中間層網(wǎng)(
圖1 (b))。
出于數(shù)種理由，新生小鼠視網(wǎng)膜血管生成模型可用于研究在眼血 管生成期間HSC的作用。在這個(gè)生理相關(guān)的模型中，在內(nèi)源血管出現(xiàn) 之前，大的星形細(xì)胞模板已經(jīng)存在，這使得在新血管過(guò)程中可對(duì)細(xì)胞 間尋靶的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，已知這種一致且可再現(xiàn)的新生期視網(wǎng) 膜血管過(guò)程是低氧驅(qū)動(dòng)的，就這點(diǎn)而言，與其中已知缺血起作用的許 多視網(wǎng)膜疾病具有相似性。
從骨髓富集內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。
雖然對(duì)HSC制備物中存在的EPC群的細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)進(jìn)行了 廣泛地評(píng)價(jià)，但是仍未清楚地確定唯一鑒定EPC的標(biāo)記。為了富集 EPC,從小鼠骨髓單核細(xì)胞中耗盡造血細(xì)胞譜系標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞(Lin+)， 即B淋巴細(xì)胞(CD45)、 T淋巴細(xì)胞(CD3)、粒細(xì)胞(Ly-6G)、單核細(xì)胞 (CDU)和紅細(xì)胞(TER-119)。使用Sca-l抗原進(jìn)一步富集EPC。在玻璃 體腔注射相同數(shù)目的Lin— Sca-l+細(xì)胞或LirT細(xì)胞后對(duì)所得到的結(jié)果進(jìn) 行比較，在兩組中未發(fā)現(xiàn)差異。實(shí)際上，當(dāng)只注射Lin—Sca-l—細(xì)胞時(shí)， 觀察到摻入發(fā)育中血管的細(xì)胞要多得多。
沖艮據(jù)功能實(shí)驗(yàn)，Lin一HSC群富含EPC。此外，Lin+HSC群在功能 上的作用完全不同于Lin— HSC群。還對(duì)常用來(lái)鑒定EPC每個(gè)組分的 表位(基于之前報(bào)道的體外特征研究)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。雖然這些標(biāo)記無(wú)一 是唯一與Lin—組分有關(guān)的，但是與Lin+HSC組分相比，LiiT HSC中 的所有標(biāo)記都增加約70%至約1800% (圖l(c))。
圖1中，圖(c)表示骨 髓衍生Lin+ HSC和LhTHSC分離細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)表征。圖(c)上排 顯示非抗體標(biāo)記細(xì)胞的造血干細(xì)胞散點(diǎn)分布。Rl限定陽(yáng)性PE染色的 可測(cè)量設(shè)門區(qū)；R2表示GFP-陽(yáng)性。Lin—HSC的散點(diǎn)圖見(jiàn)中排，Lin+ HSC的散點(diǎn)圖見(jiàn)下排。C57B/6細(xì)胞用PE綴合的Sca-l 、 c-kit、 Flk-1/KDR、 CD31的抗體標(biāo)記。從Tie-2-GFP小鼠獲得Tie-2數(shù)據(jù)。散點(diǎn)圖角落的百分比表示陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞點(diǎn)總Lin— HSC群或Lin+ HSC 群的百分比。有趣的是，公認(rèn)的EPC標(biāo)記如Flk-1/KDR、 Tie-2和Sca-1 的表達(dá)較弱，因此，不用于進(jìn)一步分級(jí)分離。
可如下分離LiiT HSC: (a)從成年哺乳動(dòng)物中提取骨髓；(b)從骨 髓中分離出大量單核細(xì)胞；(c)單核細(xì)胞用生物素綴合的譜系組抗體 (biotin-conjugated lineage panel antibodies)標(biāo)記,所述抗體為 一種或多 種i普系表面抗原、優(yōu)選選自以下的語(yǔ)系表面抗原的抗體CD2、 CD3、 CD4、 CDll、 CDlla、 Mac國(guó)l、 CD14、 CD16、 CD19、 CD24、 CD33、 CD36、 CD38、 CD45、 Ly-6G(鼠)、TER畫(huà)119(鼠)、CD45RA、 CD56、 CD64、 CD68、 CD86 (B7.2)、 CD66b、人白細(xì)胞抗原DR (HLA-DR) 和CD235a (血型糖蛋白A); (d)從大量單核細(xì)胞中除去對(duì)所述一種或 多種譜系表面抗原呈陽(yáng)性的單核細(xì)胞；和(e)從中回收譜系陰性造血干 細(xì)胞群。
當(dāng)從成人骨髓中分離LiiT HSC時(shí)，優(yōu)選單核細(xì)胞用生物素綴合 的譜系組抗體標(biāo)記，所述抗體為以下譜系表面抗原的抗體CD2、CD3、 CD4、 CDlla、 Mac-l、 CD14、 CD16、 CD19、 CD33、 CD38、 CD45RA、 CD64、 CD68、 CD86 (B7.2)和CD235a。當(dāng)從成年鼠骨髓分離LhTHSC 時(shí)，優(yōu)選單核細(xì)胞用生物素綴合的譜系組抗體標(biāo)記，所述抗體為以下 譜系表面抗原的抗體CD3、 CDll、 CD45、 Ly-6G和TER-119。
經(jīng)玻璃體腔注射的HSC Lin—細(xì)胞含有靶向星形細(xì)胞并摻入發(fā)育中的 視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的EPC。
為了確定經(jīng)玻璃體腔注射Lin— HSC是否可以靶向視網(wǎng)膜的特定 細(xì)胞類型、利用星形細(xì)胞模板并參與視網(wǎng)膜血管生成，將大約105個(gè) 從成年(GFP或LacZ轉(zhuǎn)基因)小鼠骨髓分離出的本發(fā)明LirT HSC組成 成分(Lin— HSC composition)的細(xì)胞或Lin+ HSC細(xì)胞(對(duì)照，約105個(gè)細(xì) 胞)注射到出生后第2天(P2)的小鼠眼內(nèi)。注射后4天(P6)，衍生自GFP 或LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的本發(fā)明Lin— HSC組成成分的大多數(shù)細(xì)胞黏附到視網(wǎng)膜上，并具有內(nèi)皮細(xì)胞特有的伸長(zhǎng)外觀(圖2 (a))。圖2說(shuō)明Lin一 細(xì)胞移入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜。如圖2中的圖(a)所示，注射后4天(P6), 經(jīng)玻璃體腔注射的eGFP+ Un—HSC附著在視網(wǎng)膜上并進(jìn)行分化。
在視網(wǎng)膜的許多區(qū)域中，GFP表達(dá)細(xì)胞按與處于下層的星形細(xì)胞 一致的模式排列并且類似血管。在內(nèi)源發(fā)育的血管網(wǎng)之前就觀察到這 些熒光細(xì)胞(圖2(b))。相反地，只有少數(shù)Lin+HSC(圖2(c))或成年小 鼠腸系膜內(nèi)皮細(xì)胞(圖2 (d))附著在視網(wǎng)膜表面。為了確定得自注射 Lin— HSC群的細(xì)胞是否也附著到已建立血管的視網(wǎng)膜上，將Lin— HSC 組成成分注射到成熟眼中。有趣的是，沒(méi)有觀察到細(xì)胞附著到視網(wǎng)膜 上或摻入已建立的正常視網(wǎng)膜血管(圖2 (e))。這就表明本發(fā)明的LhT HSC組成成分不會(huì)干擾正常發(fā)育的血管系統(tǒng)，并且不會(huì)在正常發(fā)育的 視網(wǎng)膜中啟動(dòng)異常的血管形成。
為了確定注射的本發(fā)明的Lin— HSC組成成分與視網(wǎng)膜星形細(xì)胞 之間的關(guān)系，使用了表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP，星形細(xì)胞 的標(biāo)記)和啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠。對(duì)注射得 自eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的LirT HSC的這些GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜 進(jìn)行的檢查證實(shí)，注射的eGFP EPC與已存在的星形細(xì)胞共定位(圖2 (f-h),箭頭)。觀察到與處于下層的星形細(xì)胞網(wǎng)一致的eGFP+LhTHSC 過(guò)程(箭頭，圖2(g))。對(duì)這些眼的檢查證實(shí)，注射的標(biāo)記細(xì)胞只附著 在星形細(xì)胞上；在P6小鼠視網(wǎng)膜中，其中視網(wǎng)膜周邊仍沒(méi)有內(nèi)源血 管，觀察到注射細(xì)胞黏附到這些仍未血管化區(qū)域的星形細(xì)胞上。預(yù)料 不到的是，在視網(wǎng)膜的較深層觀察到注射的標(biāo)記細(xì)胞，此處為正常視 網(wǎng)膜血管后續(xù)發(fā)育的確切位置(圖2(1)，箭頭)。
為了確定注射的Lin— HSC是否穩(wěn)定摻入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系 統(tǒng)，在稍后的若干時(shí)間點(diǎn)對(duì)視網(wǎng)膜血管進(jìn)行了檢查。早在P9(注射后 7天)，Lin—HSC便摻入CD31+結(jié)構(gòu)(圖2 (j))。到P16 (注射后14天)， 細(xì)胞已廣泛摻入視網(wǎng)膜血管樣結(jié)構(gòu)(圖2 (k))。當(dāng)在處死動(dòng)物之前經(jīng)血 管內(nèi)注射羅丹明-葡聚糖(以鑒定功能性視網(wǎng)膜血管)時(shí)，大多數(shù)的Lin一HSC與未閉的血管排列在一起(圖2 (l))。觀察到標(biāo)記細(xì)胞分布的兩種 模式(l)在一種模式中，細(xì)胞沿血管散布在未標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞之間；和 (2)另一種模式顯示血管完全由標(biāo)記細(xì)胞組成。注射細(xì)胞還摻入深血管 網(wǎng)的血管中(圖2(m))。雖然以前曾報(bào)道了零星摻入新血管系統(tǒng)的LirT HSC衍生EPC,但是這是第一個(gè)血管網(wǎng)完全由這些細(xì)胞組成的報(bào)道。 這就證實(shí)了經(jīng)玻璃體腔注射的骨髓衍生Lin— HSC群的細(xì)胞，可以有效 地?fù)饺胄纬芍械囊暰W(wǎng)膜血管網(wǎng)的任一層中。
當(dāng)在經(jīng)玻璃體腔注射后長(zhǎng)達(dá)5天或10天進(jìn)行檢查時(shí)，非視網(wǎng)膜 組織(例如腦、肝臟、心臟、肺、骨髓)的組織學(xué)檢查表明不存在任何 GFP陽(yáng)性細(xì)胞。這就表明Lin— HSC組分內(nèi)的細(xì)胞亞群選擇性靶向視 網(wǎng)膜星形細(xì)胞，并穩(wěn)定摻入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。由于這些細(xì)胞 具有內(nèi)皮細(xì)胞的許多特征(與視網(wǎng)膜星形細(xì)胞締合、伸長(zhǎng)的形態(tài)、穩(wěn)定 摻入未閉的血管、不存在于血管外位置)，因此這些細(xì)胞代表了存在于 Lin—HSC群中的EPC。所靶向的星形細(xì)胞與在許多低氧性視網(wǎng)膜病中 觀察到的是同一類型。已經(jīng)清楚了解到，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是在DR和其 它形式的視網(wǎng)膜損傷中所觀察到的新血管簇葉(neovascular fronds of
tufts)的重要組分。在反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生和缺血誘導(dǎo)的新血管形成的 條件下，活化星形細(xì)胞增殖，產(chǎn)生細(xì)胞因子并上調(diào)GFAP，與在許多 哺乳動(dòng)物種類(包括人)的新生期視網(wǎng)膜血管模板形成期間觀察到的類 似。
將Lin—HSC細(xì)胞注射到具有通過(guò)光凝固(圖3 (a))或針尖(圖3 (b)) 損傷的視網(wǎng)膜的成年小鼠成熟眼中，Lin—HSC群將靶向成年小鼠眼的 活化星形細(xì)胞，正如它們?cè)谛律劬λM(jìn)行的一樣。在兩個(gè)模型中， 僅在損傷部位周圍觀察到具有明顯GFAP染色的細(xì)胞群(圖3 (a和b))。 注射的Lin— HSC組成成分的細(xì)胞局限在損傷部位，并保持與GFAP-陽(yáng)性星形細(xì)胞的特異性締合(圖3 (a和b))。在這些部位，還觀察到Lin一 HSC細(xì)胞遷移到視網(wǎng)膜的較深層，水平與在深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)新生 形成期間觀察到的相似。視網(wǎng)膜未損傷部分不包含Lin—HSC細(xì)胞，這與當(dāng)Lin— HSC注射到正常的未損傷成體視網(wǎng)膜時(shí)所觀察到的一致(圖 2(e))。這些數(shù)據(jù)表明，在具有神經(jīng)膠質(zhì)增生的損傷成體視網(wǎng)膜以及正 進(jìn)行血管形成的新生期;f見(jiàn)網(wǎng)膜中，Lin—HSC組成成分可以選擇性耙向 活化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
經(jīng)玻璃體腔注射Lin— HSC可拯救和穩(wěn)定變性的血管系統(tǒng)。
由于經(jīng)玻璃體腔注射的LhT HSC組成成分靶向星形細(xì)胞并摻入 正常視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，因此這些細(xì)胞還可在伴有神經(jīng)膠質(zhì)增生和血管 變性的缺血性或變性性視網(wǎng)膜疾病中穩(wěn)定變性的血管系統(tǒng)。rd/W小鼠 是出生后一個(gè)月顯示光感受器和視網(wǎng)膜血管層嚴(yán)重變性的視網(wǎng)膜變 性模型。在這些小鼠中，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育正常直到P16，屆時(shí)較 深的血管網(wǎng)退化；到P30時(shí)，大多數(shù)小鼠中，深層網(wǎng)和中間層網(wǎng)幾乎 完全變性。
為了確定HSC能否拯救退化中的血管，P6時(shí)，將Lin+ HSC或 Lin—HSC(得自Balb/c小鼠)注射到^/W小鼠玻璃體腔。P33時(shí)，注射 Lin+細(xì)胞后，最深視網(wǎng)膜層的血管幾乎完全不存在(圖4 (a和b))。相 比之下，P33時(shí)，大多數(shù)Lin—HSC注射視網(wǎng)膜具有幾乎正常的視網(wǎng)膜 血管系統(tǒng)，有三層成形良好的平行血管層(圖4 (a和d))。這個(gè)作用的 定量測(cè)定證實(shí)，Lin—注射眼的深血管網(wǎng)層的血管平均長(zhǎng)度比未治 療或Lin+細(xì)胞治療眼的長(zhǎng)幾乎3倍(圖4 (e))。預(yù)料不到的是，注射得 自W/W成年小鼠(FVB/N)骨髓的Lin—HSC組成成分還拯救了 W/n/新 生小鼠變性的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(圖4 (f))。早至出生后2-3周就觀察到 W/W小鼠眼的血管系統(tǒng)變性。 一直到P15才注射LirT HSC,同樣部 分導(dǎo)致使W/W小鼠變性的血管系統(tǒng)穩(wěn)定至少1個(gè)月(圖4 (g和h))。
注射到更幼小的(例如P2) 小鼠的Lin— HSC組成成分也摻入 發(fā)育中的淺層血管系統(tǒng)。Pll時(shí)，觀察到這些細(xì)胞遷移至深水平的血 管網(wǎng)層，并形成與野生型外視網(wǎng)膜血管層所觀察到的模式相同的模式 (圖5 (a))。為了更清楚的描述rd/W小鼠中注射Lin— HSC組成成分的細(xì)胞摻入及穩(wěn)定變性的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的方式，將得自Balb/c小鼠的 LirT HSC組成成分注射到Tie-2-GFP FVB小鼠眼內(nèi)。FVB小鼠具有 W/W基因型，而且因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)融合蛋白Tie-2-GFP,所以所有的內(nèi) 源血管都發(fā)出熒光。
當(dāng)Un— HSC組成成分的未標(biāo)記細(xì)胞注射到新生期Tie-2-GFP FVB 眼中，并隨即4參入發(fā)育中的血管系統(tǒng)時(shí)，可能在內(nèi)源Tie-2-GFP標(biāo)記 血管中存在未標(biāo)記的間隙(gap)，這相當(dāng)于摻入的經(jīng)注射的未標(biāo)記LirT HSC。隨后用另一種血管標(biāo)記(例如CD-31)染色后勾畫(huà)出完整血管， 使得有關(guān)非內(nèi)源內(nèi)皮細(xì)胞是否是血管系統(tǒng)的組成部分得到確定。注射 2個(gè)月后，注射LhTHSC組成成分的眼睛的視網(wǎng)膜中觀察到CD31陽(yáng) 性、Tie-2-GFP陰性的血管(圖5 (b))。有趣的是，大多數(shù)被拯救的血管 含有Tie-2-GFP陽(yáng)性細(xì)胞(圖5 (c))。周細(xì)胞分布(如通過(guò)平滑肌肌動(dòng)蛋 白染色確定)沒(méi)有因Lin—HSC注射而改變，不論是否發(fā)生血管拯救(圖 5(d))。這些數(shù)據(jù)清楚證實(shí)了在遺傳缺陷型小鼠中，經(jīng)玻璃體腔注射的 Lin—HSC細(xì)胞遷移到的視網(wǎng)膜中，參與正常視網(wǎng)膜血管的形成，并穩(wěn) 定內(nèi)源變性的血管系統(tǒng)。
通過(guò)得自Un—HSC的轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制視網(wǎng)膜血管生成。
大多數(shù)視網(wǎng)膜血管疾病都涉及異常血管增生勝于變性。靶向星形 細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以用來(lái)遞送抗血管生成蛋白，抑制血管生成。LhT HSC組成成分的細(xì)胞用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)轉(zhuǎn)染。 T7-TrpRS是TrpRS的43 kD片段，有效抑制視網(wǎng)膜血管生成(圖6 (a))。 在P2時(shí)注射用對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LirTHSC組成成分(無(wú)T2-TrpRS基因) 的眼睛視網(wǎng)膜，在P12時(shí)具有正常的初生視網(wǎng)膜血管網(wǎng)層(圖6 (c))和 次生視網(wǎng)膜血管網(wǎng)層(圖6 (d))。當(dāng)將本發(fā)明的T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lin一 HSC組成成分注射到P2眼內(nèi)、并在10天后進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，初生網(wǎng)明顯 出現(xiàn)異常(圖6 (e))，而且深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的形成幾乎被完全抑制 (圖6 (f))。在這些眼內(nèi)觀察到的少量血管明顯變細(xì)，血管間有4艮大間隙。被分泌T2-TrpRS的LirT HSC抑制的程度詳見(jiàn)表1 。
T2-TrpRS是由LirT HSC組成成分的細(xì)胞在體外產(chǎn)生和分泌的， 將這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射到玻璃體后，觀察到視網(wǎng)膜中T2-TrpRS的30 kD 片段(圖6(b》。準(zhǔn)確地講，只在注射轉(zhuǎn)染的Lin—HSC的視網(wǎng)膜中觀察 到這一 30kD片段，這種相對(duì)于重組或體外合成的蛋白質(zhì)的表觀分子 量的降低可能是T2-TrpRS體內(nèi)加工或降解所引起的。這些數(shù)據(jù)表明 LirTHSC組成成分可用于通過(guò)靶向活化星形細(xì)胞，而將有功能活性的 基因(例如表達(dá)血管抑制分子的基因)遞送到視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。雖然所 觀察到的血管抑制作用大概是由細(xì)胞介導(dǎo)的活性所致，但是這是根本 不可能的，因?yàn)橛孟嗤荰2轉(zhuǎn)染的Lin—HSC組成成分治療的眼睛 具有正常的^f見(jiàn)網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。
表1.分泌T2-TrpRS的Lin—HSC的血管抑制
初生網(wǎng)深層網(wǎng)
抑制正常完全部分正常
T2-TrpRS60%40%33.3%60%6.7%
(15只眼)(9只眼)(6只眼)(5只眼)(9只眼)(1只眼)
對(duì)照0%100%0%38.5%61.5%
(13只眼)(0只眼)(13只眼)(0只眼)(5只眼)(8只眼)
經(jīng)玻璃體腔注射的LhT HSC群定位于視網(wǎng)膜星形細(xì)胞，摻入血 管，并可用于治療多種視網(wǎng)膜疾病。雖然注射的HSC組成成分的大部 分細(xì)胞附著在星形細(xì)胞模板上，但是少部分縱深遷移到視網(wǎng)膜內(nèi)，歸 巢至深層血管網(wǎng)隨后將發(fā)育的區(qū)域。即使在出生后42天以前，在該 區(qū)域也未觀察到GFAP陽(yáng)性星形細(xì)胞，但是這并不排除GFAP陰性神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)存在并提供用于LhTHSC定位的信號(hào)的可能性?，F(xiàn)有 的研究表明，多種疾病與反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生有關(guān)。特別是在DR中， 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其胞外基質(zhì)與病理性血管生成有關(guān)。
由于不論損傷類型，注射的LirT HSC組成成分的細(xì)胞都特異性附著在表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上，因此本發(fā)明的LitTHSC組成成 分可用于靶向視網(wǎng)膜的血管生成前病變(pre-angiogenic lesion)。例如， 在缺血性視網(wǎng)膜病(例如糖尿病)中，新血管形成是對(duì)低氧的響應(yīng)。通 過(guò)Lin— HSC組成成分靶向病理性新血管形成的部位，可使發(fā)育中的新 血管系統(tǒng)穩(wěn)定，防止了新血管系統(tǒng)異常，例如出血或水肺(與DR相關(guān) 的視力喪失的原因)，并且可能減輕最初刺激新血管形成的低氧。異常 血管可能恢復(fù)到正常狀況。此外，可通過(guò)使用轉(zhuǎn)染的LirTHSC組成成 分和激光誘導(dǎo)的星形細(xì)胞活化，將血管抑制蛋白(例如T2-TrpRS)遞送 到病理性血管生成的部位。由于激光凝固通常用于臨床眼科，因此該 方法適用于多種視網(wǎng)膜疾病。雖然在癌癥療法中一直都在研究這類基 于細(xì)胞的方法，但是它們?cè)谘鄄≈械膽?yīng)用更為有利，因?yàn)檠蹆?nèi)注射使 得將大量細(xì)胞直接遞送到患病部位成為可能。
經(jīng)由LiiTHSC的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和血管營(yíng)養(yǎng)性拯救。
按照上述方法，采用MACS從C3H (W/nf)、 FVB 0^^ )小鼠的 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)骨髓中分離出LhTHSC。將得自這些小鼠 的含有EPC的LkT HSC經(jīng)玻璃體腔注射到P6 C3H或FVB小鼠眼內(nèi)。 在注射后不同的時(shí)間點(diǎn)(l個(gè)月、2個(gè)月和6個(gè)月)，收集視網(wǎng)膜。用抗 CD31抗體染色后通過(guò)掃描激光共焦顯微鏡(scanning laser confocal microscope),以及核用DAPI染色后的視網(wǎng)膜組織學(xué)，對(duì)血管系統(tǒng)進(jìn) 行了分析。還采用在不同的時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)視網(wǎng)膜的mRNA進(jìn)行微陣列 基因表達(dá)分析，來(lái)鑒定可能參與該作用的基因。
P21時(shí)，n^YiM、鼠目艮3見(jiàn)網(wǎng)膜神經(jīng)感覺(jué)層(neurosensory retina)和4見(jiàn) 網(wǎng)膜血管系統(tǒng)出現(xiàn)嚴(yán)重變性。P6時(shí)，用LirTHSC治療的rd/W小鼠眼 維持正常視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月；當(dāng)在所有時(shí)間點(diǎn)(l個(gè)月、2個(gè) 月和6個(gè)月)上與對(duì)照相比時(shí)，深層和中間層兩者都有顯著改善(參見(jiàn)
圖12)。此外，我們觀察到，相對(duì)于用Lin+HSC治療作為對(duì)照的眼， 用Lin—HSC治療的視網(wǎng)膜還比較厚(l個(gè)月；1.2倍，2個(gè)月；1.3倍，6個(gè)月；1.4倍)，并且外核層的細(xì)胞數(shù)較多(l個(gè)月；2.2倍，2個(gè)月； 3.7倍，6個(gè)月；5.7倍)。與對(duì)照(未治療或非Lin—治療)W/W視網(wǎng)膜相 比，"被拯救"(例如Lin—HSC)的大規(guī)模基因組分析證實(shí)，編碼sHSP (小熱激蛋白)及與血管和神經(jīng)拯救相關(guān)的特定生長(zhǎng)因子的基因，包括 編碼圖20中的圖A和圖B所列蛋白質(zhì)的基因顯著上調(diào)。
W/W小鼠中，骨髓衍生的LirT HSC群顯著并可再現(xiàn)地引起正常 血管系統(tǒng)的維持，并且顯著地增加光感受器和其它神經(jīng)元細(xì)胞層。這 種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救效果與小熱激蛋白和生長(zhǎng)因子的顯著上調(diào)相關(guān)，并 可供對(duì)目前尚無(wú)法治療的4見(jiàn)網(wǎng)膜變性性疾病的治療方法進(jìn)行深入了
/ W/h/i小鼠視網(wǎng)膜顯示嚴(yán)重的血管變性和神經(jīng)元變性。
文獻(xiàn)中大量記載了小鼠出生后視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元的正常發(fā)育， 它與第三個(gè)三個(gè)月的人胎兒中所觀察到的變化類似(Dorrell等，2002， /"veW. (9; 似/^/mo/. Ws. 5W. 43:3500-3510)。 ra /基因純合的小鼠與人視 網(wǎng)膜變性有許多共同的特征(Frasson等，1999,7Vaf. Med 5:1183-1187)， 由于編碼PR cGMP磷酸二酯酶的基因突變，而出現(xiàn)光感受器(PR)快 速喪失，并伴有嚴(yán)重血管萎縮(Bowes等，1990, A^we 347:677-680)。 為了檢查在視網(wǎng)膜發(fā)育及其后續(xù)變性期間的血管系統(tǒng)，使用了抗膠原 IV (CIV)( —種成熟血管系統(tǒng)的胞外基質(zhì)(ECM)蛋白)和CD31 (PECAM-1)(—種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記)的抗體(
圖15)。 (C3H/HeJ)的 視網(wǎng)膜正常發(fā)育直到大約出生后第8天(P8)，這時(shí)含有光感受器的外 核層(ONL)開(kāi)始變性。ONL快速變性，細(xì)胞經(jīng)凋亡而死亡，使得到P20 時(shí)，只保留了單層核。完整鋪片的視網(wǎng)膜用抗CIV和抗CD31抗體的 雙重染色顯示了 W7/W7小鼠血管變性的詳情與其它研究披露的類似 (Blanks等，1986， /Comp. A^eww/. 254:543-553)。初生牙見(jiàn)網(wǎng)膜血管層 和深層視網(wǎng)膜血管層似乎直到P12時(shí)都發(fā)育正常，之后出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞 快速喪失，正如CD31染色不存在時(shí)所證實(shí)的一樣。CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞直到P12都按正常分布存在，但之后便快速消失。有趣的是，在 所有檢查的時(shí)間點(diǎn)上，CIV陽(yáng)性染色一直保持存在，這就表明血管和 相關(guān)的ECM正常形成，但是P13后，僅基質(zhì)保留，此時(shí)未觀察到CD31 陽(yáng)性細(xì)胞(
圖15，中圖)。中間血管網(wǎng)層同樣在P21后變性，但是進(jìn)程 比在深網(wǎng)層中觀察到的慢(
圖15，上圖)。還對(duì)正常小鼠的視網(wǎng)膜血管 和神經(jīng)細(xì)胞層與小鼠的進(jìn)行了比較(
圖15，右圖)。
/Y /nW小鼠中骨髓衍生細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。
經(jīng)玻璃體腔注射的LiiT HSC摻入內(nèi)源視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的所有三 層血管網(wǎng)中，并且防止血管變性。有趣的是，在外核層中實(shí)際上從未 觀察到注射的細(xì)胞。這些細(xì)胞或摻入正在形成的視網(wǎng)膜血管中，或觀 察到與這些血管緊密相鄰。P6時(shí)，剛好在開(kāi)始變性之前，將鼠Lin— HSC (得自C3H/HeJ)經(jīng)玻璃體腔注射到C3H/HeJ fW〃r^0小鼠眼內(nèi)。P30 時(shí)，對(duì)照細(xì)胞(CD3廠)注射眼顯示出典型的表型，即在每個(gè)所 檢查的視網(wǎng)膜中，觀察到深血管網(wǎng)層和ONL幾乎完全變性。用Lin一 HSC注射的眼維持正常一出現(xiàn)中間血管網(wǎng)層和深血管網(wǎng)層。預(yù)料不到 的是，與對(duì)照細(xì)胞注射眼相比，LiiTHSC注射眼的內(nèi)核層(INL)和ONL 的細(xì)胞明顯多得多(
圖16(A))?？稍谧⑸浜?個(gè)月(
圖16(B))以及長(zhǎng)達(dá) 6個(gè)月(
圖16 (C))時(shí)觀察到Lin— HSC的這種拯救效果。當(dāng)對(duì)拯救眼和 未參》救眼進(jìn)行比較時(shí)，Lin—HSC注射眼中網(wǎng)層的深網(wǎng)層血管系統(tǒng)的差 異，以及含有神經(jīng)元細(xì)胞的INL與ONL的差異，在所測(cè)量的所有時(shí) 間點(diǎn)上都非常顯著(
圖16(B和C))?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量血管系統(tǒng)的總長(zhǎng)度(圖 l6 (D))以及統(tǒng)計(jì)ONL中所觀察到的DAPI陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)目(
圖16 (E)) 來(lái)量化這種作用。對(duì)所有時(shí)間點(diǎn)上的數(shù)據(jù)進(jìn)行了簡(jiǎn)單線性回歸分析。
LirT HSC注射眼中，在P30 (p < 0'024)和P60 (p < 0.034)時(shí)，觀察 到在血管拯救和神經(jīng)元(例如ONL厚度)拯救之間在統(tǒng)計(jì)上有顯著相 關(guān)性(
圖16(F))。 P180時(shí)，當(dāng)將LirTHSC注射視網(wǎng)膜與 照細(xì)胞注射 視網(wǎng)膜相比時(shí)，雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)顯著性(/ < 0.14),但卻保持很高的相關(guān)性(
圖16(F))。相比之下，在任何時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)照細(xì)胞注射視網(wǎng)膜顯示， 血管系統(tǒng)維護(hù)與ONL之間都無(wú)顯著相關(guān)性(
圖16(F))。這些數(shù)據(jù)證實(shí)， 經(jīng)玻璃體腔注射Lin— HSC導(dǎo)致W^//小鼠視網(wǎng)膜中同時(shí)發(fā)生視網(wǎng)膜 血管拯救和神經(jīng)元拯救。在ONL中或者在—見(jiàn)網(wǎng)膜血管內(nèi)或緊鄰一見(jiàn)網(wǎng) 膜血管以外的任何位置都未觀察到注射的細(xì)胞。
Lin—HSC注射的njWY/視網(wǎng)膜的功能拯救。
對(duì)注射對(duì)照細(xì)胞或鼠LirT HSC后2個(gè)月的小鼠進(jìn)行了視網(wǎng)膜電 位圖(ERG)記錄(
圖17)。在ERG記錄后，對(duì)每只眼進(jìn)行了免疫組織化 學(xué)分析和顯微鏡分析，以證實(shí)發(fā)生了血管拯救和神經(jīng)元拯救。經(jīng)治療 的拯救眼和對(duì)照未拯救眼的代表性ERG記錄顯示，拯救眼中，數(shù)字 經(jīng)扣減的信號(hào)(治療眼減去未治療眼)產(chǎn)生了振幅大約8-10微伏的明顯 可檢測(cè)的信號(hào)(
圖17)。顯然，兩類眼的信號(hào)十分異常。然而，從Lin— HSC 治療眼記錄到一致且可檢測(cè)的ERG。在所有情況下，檢測(cè)不到對(duì)照眼 的ERG。雖然在拯救眼中信號(hào)振幅比正常的低得多，但是只要在組織 學(xué)上出現(xiàn)拯救就始終可觀察到信號(hào)，并且大致相當(dāng)于基于基因的其它 拯救研究。總的來(lái)講，這些結(jié)果是Lin—HSC治療眼在某種程度上的功 能拯救的證據(jù)。
拯救的/^/W視網(wǎng)膜細(xì)胞類型主要是視錐細(xì)胞，
用對(duì)視桿視蛋白或視錐視蛋白有特異性的抗體對(duì)拯救視網(wǎng)膜和 未拯救視網(wǎng)膜進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。對(duì)用于ERG記錄的相同眼 (見(jiàn)
圖17)的視桿或視錐視蛋白進(jìn)行了分析。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中， 存在的不超過(guò)約5。/。的光感受器為視錐細(xì)胞(Soucy等，1998， A^wra" 21: 481-493)，用紅/綠色視錐視蛋白(見(jiàn)圖25 (A))或視桿視紫紅質(zhì)(見(jiàn) 圖25(B))所觀察到的免疫組織化學(xué)染色模式，與視錐細(xì)胞的這一百分 比一致。當(dāng)野生型視網(wǎng)膜用免疫前IgG(pre-immunelgG)染色時(shí)，除了 血管自身熒光外，視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺(jué)層中任何位置都未觀察到染色(圖25(C))。出生后2個(gè)月，未注射rd/rd小鼠的視網(wǎng)膜的外核層基本上萎 縮，外核層不顯示與抗紅綠色視錐視蛋白(圖25 (D))或視紫紅質(zhì)(圖25 (G))抗體的任何染色。對(duì)照、CD31—HSC注射眼也沒(méi)有表示視錐視蛋 白(圖25(E)))或視桿視蛋白(圖25(H))存在的陽(yáng)性染色。相比之下，注 射Lin—HSC的對(duì)側(cè)眼在受保護(hù)的外核層中有約3至約8排核；這些細(xì) 胞大多是視錐視蛋白陽(yáng)性(圖25(F))，大約1-3%為視桿視蛋白陽(yáng)性(圖 25(1))。顯然，這與通常在正常小鼠視網(wǎng)膜0見(jiàn)桿細(xì)胞占主導(dǎo))中觀蔡到 的幾乎相反。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，注射Lin—HSC在通常可能變性的長(zhǎng)時(shí)間 內(nèi)保護(hù)視錐細(xì)胞。
人骨髓(hBM)衍生的LiiTHSC同樣拯救變性的視網(wǎng)膜。
由人骨髓分離出的LiiT HSC的作用與鼠Lin— HSC的類似。由人 供體采集骨髓，耗盡Lin+HSC,得到人Lin—HSC (hLiiTHSC)群。這 些細(xì)胞用熒光染料進(jìn)行離體標(biāo)記，并注射到C3SnSmn.CB17-尸HWc SCID小鼠眼內(nèi)。注射的hLin— HSC以注射鼠Lin— HSC時(shí)所觀察到的 相同方式，遷移至并靶向視網(wǎng)膜血管生成部位(
圖18 (A))。除了血管 尋靶外，人Lin—HSC同樣同時(shí)對(duì)W〃W7小鼠血管和神經(jīng)元細(xì)胞層提 供加強(qiáng)的拯救效果(
圖18 (B和C))。這個(gè)觀察結(jié)果證實(shí)，人骨髓中存 在靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)并且可以防止視網(wǎng)膜變性的細(xì)胞。
LiiT HSC在/v/M/W/M小鼠中具有血管營(yíng)養(yǎng)作用和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。
雖然小鼠是視網(wǎng)膜變性中使用最普遍和表征最充分的模 型(Chang等，2002， Ww'o"42:517-525)，但是變性卻非常迅速， 在這一方面不同于該人類疾病中所觀察到的通常較慢的時(shí)程。在該品 系中，光感受器細(xì)胞變性大約在P8時(shí)開(kāi)始，此時(shí)視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)還 在放射狀擴(kuò)展(
圖15)。深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的后續(xù)變性甚至在中網(wǎng)層 仍在形成時(shí)發(fā)生，因此，W7/W7小鼠視網(wǎng)膜從未完全發(fā)育，與患有該 病的大多數(shù)人不同。采用變性時(shí)程較慢并與人視網(wǎng)膜變性性疾病更相像的W川小鼠模型來(lái)研究Lin— HSC介導(dǎo)的血管拯救。小鼠中， 光感受器細(xì)胞變性大約在P21時(shí)開(kāi)始，隨后不久開(kāi)始血管變性。
由于正常視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺(jué)層發(fā)育主要到P21時(shí)才完成，在視網(wǎng)膜 已經(jīng)完成分化后才觀察到變性開(kāi)始，這樣比起W7/W/小鼠模型，與 人視網(wǎng)膜變性更為相似。將得自W70小鼠的Lin—HSC或?qū)φ占?xì)胞在 P6時(shí)注射到眼內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在P21時(shí)， Lin—HSC和對(duì)照細(xì)胞注射眼兩者的視網(wǎng)膜似乎均正常，具有完全發(fā)育 的所有血管層和正常發(fā)育的INL和ONL (圖l8 (D和H))。大致在P21 時(shí)，視網(wǎng)膜變性便開(kāi)始，并隨年齡發(fā)展。到P30時(shí)，對(duì)照細(xì)胞注射視 網(wǎng)膜顯示嚴(yán)重的血管變性和神經(jīng)元變性(
圖18 (I))，而LhT HSC注射 視網(wǎng)膜維持幾乎正常的血管層和光感受器細(xì)胞(
圖18 (E))。拯救眼和未 拯救眼之間的差異在隨后的時(shí)間點(diǎn)更為明顯(對(duì)
圖18 (F和G)與
圖18 (J和K)進(jìn)行比較)。在對(duì)照治療眼中，通過(guò)CD31和膠原IV的免疫組 織化學(xué)染色，十分清楚地觀察到血管變性的發(fā)展(
圖18(I-K))。對(duì)照治 療眼對(duì)于CD31幾乎完全呈陰性，而膠原IV陽(yáng)性血管"軌跡(track)" 保留得很明顯，這就表明發(fā)生了血管消退，而不是不完全血管形成。 相比之下，Lin— HSC治療眼同時(shí)具有CD31和膠原IV陽(yáng)性血管，這 似乎與正常的野生型眼非常相似(比較
圖18 (F和I))。
Lin— HSC治療后小鼠視網(wǎng)膜的基因表達(dá)分析。
使用大規(guī)?；蚪M(微陣列分析)對(duì)拯救和未拯救視網(wǎng)膜進(jìn)行了分 析以鑒定推定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救介質(zhì)。將Lin— HSC治療的W7/W7小 鼠視網(wǎng)膜中的基因表達(dá)與未注射視網(wǎng)膜和注射對(duì)照細(xì)胞(CD31—)的視 網(wǎng)膜進(jìn)行了比較。這些比較各按一式三份進(jìn)行。在所有三個(gè)一式三份 的比較中，基因的表達(dá)水平必需比本底水平高至少2倍，才被—見(jiàn)為存 在。與對(duì)照細(xì)胞注射和未注射W/W小鼠視網(wǎng)膜相比，Lin— HSC保護(hù) 的一見(jiàn)網(wǎng)膜中上調(diào)3倍的基因見(jiàn)圖20中的圖A和圖B。將標(biāo)準(zhǔn)差除以 各cRNA復(fù)制物的平均表達(dá)水平，計(jì)算出已表達(dá)基因的變異系數(shù)(COV)水平。此外，通過(guò)使平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)相互關(guān)聯(lián)，計(jì)算出表達(dá)水平與噪聲方差(noise variance)之間的相關(guān)性。得到了各基因的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)差之間的相關(guān)性，可供確定本底水平和可靠的表達(dá)水平閾值之用。總之，數(shù)據(jù)很好地落入可接受的極限值內(nèi)(Tu等，2002,尸roc. iVw/.^c"d C/SJ 99:14031-14036)。下面分別論述的基因的表達(dá)水平超出這些臨界表達(dá)水平。還測(cè)定了所述基因的配對(duì)"t-檢驗(yàn)"值。在所有情況下，p值都是理想的(接近或低于0.05)，這表明復(fù)制物之間存在相似性，并且不同檢驗(yàn)組之間可能存在顯著差異。多種顯著上調(diào)的基因，包括MAD和Ying Yang-l (YY-1) (Austen等，1997， Cwm 7b; .M/craWc /. /www"o/. 224: 123-130),編碼具有涉及保護(hù)細(xì)胞免于凋亡的功能的蛋白質(zhì)。與已知參與保護(hù)細(xì)胞免于應(yīng)激的熱激蛋白有序列同源性和類似功能的多種晶體蛋白基因，通過(guò)Lin—HSC治療也被上調(diào)。根據(jù)免疫組織化學(xué)分析，a-晶體蛋白的表達(dá)局限于ONL (
圖19)。
圖19顯示晶體蛋白aA在Lin—HSC治療后經(jīng)拯救的外核層細(xì)胞中上調(diào)，但在對(duì)照細(xì)胞治療的對(duì)側(cè)眼中卻未上調(diào)。左圖顯示拯救;魄網(wǎng)膜中的IgG染色(對(duì)照)。中圖顯示拯救視網(wǎng)膜中的晶體蛋白aA。右圖顯示未拯救視網(wǎng)膜中的晶體蛋白aA。
將得自用人Lin— HSC拯救的W7/^/小鼠視網(wǎng)膜的信使RNA與人特異性AffymetrixU133A微陣列芯片雜交。進(jìn)行嚴(yán)格性分析后，發(fā)現(xiàn)其mRNA表達(dá)是人類特有的多個(gè)基因超出本底，并且與鼠LirT HSC拯救視網(wǎng)膜和人對(duì)照細(xì)胞注射未拯救視網(wǎng)膜相比，這些基因在人LirTHSC拯救視網(wǎng)膜中顯著較高(圖20中的圖C)。由微陣列生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CD6 (—種在原始和最新分化的CD34+造血干細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞黏著分子)和干擾素a13 (由造血干細(xì)胞表達(dá)的另一種基因)兩者都是有效的評(píng)價(jià)方案。此外，根據(jù)人Lin— HSC拯救的小鼠視網(wǎng)膜樣品，若干生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)超過(guò)本底(圖20中的圖D)。
采用i普系定型的造血細(xì)月包(lineage畫(huà)committed hematopoietic cell)標(biāo)記對(duì)含有EPC的骨髓衍生Lin— HSC群進(jìn)行負(fù)選擇。雖然通過(guò)常用的細(xì)胞表面標(biāo)記無(wú)法表征可用作EPC的骨髓衍生的LirT HSC亞群，但是這些細(xì)胞在發(fā)育中或受損視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中的作用方式完全不同于Lin+或成體內(nèi)皮細(xì)胞群所觀察到的作用方式。這些細(xì)胞選擇性革巴向視網(wǎng)膜血管生成的部位，并參與未閉血管的形成。
遺傳性視網(wǎng)膜變性性疾病常常伴有視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)喪失。這類疾病的有效治療需要恢復(fù)功能以及維持復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。雖然若干最新研究對(duì)基于細(xì)胞遞送營(yíng)養(yǎng)因子或干細(xì)胞本身的用法進(jìn)行了探索，但這兩種的某種組合可以是必需的。例如，使用生長(zhǎng)因子療法治療視網(wǎng)膜變性疾病導(dǎo)致血管不受控制的過(guò)度生長(zhǎng)，從而引起了正常視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。使用神經(jīng)或視網(wǎng)膜千細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病可能重建神經(jīng)元功能，但是同樣需要功能性血管系統(tǒng)來(lái)維持視網(wǎng)膜功能的完整性。將Lin— HSC群的細(xì)胞摻入小鼠視網(wǎng)膜血管穩(wěn)定了變性的血管系統(tǒng)而又不破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。當(dāng)給P15時(shí)的r^W小鼠注射該細(xì)胞時(shí)，同樣觀察到這種拯救效果。由于小鼠的血管變性自P16開(kāi)始，對(duì)于有效的LhT HSC治療，這一觀察延伸至治療窗。在Lin—HSC細(xì)胞注射眼內(nèi)，視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光感受器受到保護(hù)，視功能得到維持。
當(dāng)經(jīng)玻璃體腔給患有視網(wǎng)膜變性疾病的小鼠注射時(shí)，成體骨髓衍生LirTHSC發(fā)揮重要的血管營(yíng)養(yǎng)作用和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。這種拯救效果在治療后持續(xù)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，并且當(dāng)LirT HSC在完全視網(wǎng)膜變性(小鼠出生后直到16天，該小鼠通常在出生后30天出現(xiàn)完全視網(wǎng)膜變性)之前注射時(shí)是最有效的。在兩個(gè)視網(wǎng)膜變性'J、鼠模型中觀察到這種拯救，而且引人注目的是，接受者是患有視網(wǎng)膜變性的免疫缺陷型嚙齒動(dòng)物(例如SCID小鼠)，或者當(dāng)供體為患有視網(wǎng)膜變性的小鼠時(shí)，用成人骨髓衍生HSC也可實(shí)現(xiàn)這種拯救。雖然若干最新報(bào)道披露了在用野生型基因在基于病毒的基因拯救后，患視網(wǎng)膜變性的小鼠或狗出現(xiàn)部分表型拯救(Ali等2000, iVw 25:306-310; Takahashi等，1999, /Wra/. 73:7812-7816; Acland等，2001, Ato. 28:92-95)，但是本發(fā)明仍是第 一例通過(guò)血管拯救實(shí)現(xiàn)基于普通細(xì)胞的治療效果。因此，
這類治療具有100個(gè)以上已知相關(guān)突變的一組疾病(例如色素性-觀網(wǎng)膜炎)的方法的潛在應(yīng)用，比研發(fā)治療每個(gè)已知突變的獨(dú)立基因療法更為實(shí)際。
尚不清楚神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救效果確切的分子基礎(chǔ)，但是只觀察到同時(shí)存在的血管穩(wěn)定/拯救。注射干細(xì)胞的存在本身并不足以產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救，而且外核層中完全不存在干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元排除了注射細(xì)胞轉(zhuǎn)化成光感受器的可能性。通過(guò)微陣列基因表達(dá)分析所獲得的數(shù)據(jù)證實(shí)，已知具有抗凋亡作用的基因顯著上調(diào)。由于一見(jiàn)網(wǎng)膜變性中觀察到的大多數(shù)神經(jīng)元死亡是因細(xì)胞凋亡引起的，因此這類保護(hù)可能在延長(zhǎng)光感受器以及在這些疾病中對(duì)視功能十分關(guān)鍵的其它神經(jīng)元的
壽命方面具有重大的治療益處。C-myc是通過(guò)上調(diào)各種下游細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子來(lái)參與細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子。W/W小鼠中的C-myc表達(dá)比野生型增加4.5倍，這表明可能參與W7/hl 小鼠中觀察到的光感受器變性。已知在Lin— HSC保護(hù)的視網(wǎng)膜中大幅上調(diào)Madl和YY-1這2個(gè)基因(圖20中的圖A)抑制c-myc的活性，因此抑制c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究表明，Madl的過(guò)量表達(dá)抑制Fas誘導(dǎo)的胱天蛋白酶-8 (凋亡途徑的另一個(gè)關(guān)鍵組分)的活化。這兩種分子的上調(diào)通過(guò)防止引發(fā)
小鼠中通常導(dǎo)致變性的細(xì)胞凋亡，在視網(wǎng)膜不受血管變性和神經(jīng)變性的保護(hù)中起作用。
在LhT HSC保護(hù)的視網(wǎng)膜中大幅上調(diào)的另一組基因包括晶體蛋白家族成員(圖20中的圖B)。與熱激蛋白和其它應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)類似，晶體蛋白可以被視網(wǎng)膜應(yīng)激激活，并提供針對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。晶體蛋白aA異常低的表達(dá)與視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良大鼠模型中光感受器的喪失有關(guān)，ra!/W小鼠視網(wǎng)膜的最新蛋白組學(xué)分析證實(shí)，在響應(yīng)視網(wǎng)膜變性時(shí)誘導(dǎo)晶體蛋白上調(diào)。根據(jù)我們的EPC拯救的r必W小鼠禍L網(wǎng)膜的微陣列數(shù)據(jù)，晶體蛋白上調(diào)似乎在EPC介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)中起關(guān)鍵作用。
42基因例如c-myc、 Madl、 Yx-l和晶體蛋白很可能是神經(jīng)元拯救的下游介質(zhì)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分可以調(diào)節(jié)抗凋亡基因表達(dá)，雖然我們用小鼠干細(xì)胞拯救視網(wǎng)膜的微陣列分析無(wú)法證明引起已知神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平增加。另一方面，用人特異性芯片分析人骨髓衍生干細(xì)胞介導(dǎo)的拯救則表明，多個(gè)生長(zhǎng)因子基因的表達(dá)低但顯著地增加。
上調(diào)的基因包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的若干個(gè)成員和otoferlin。 otoferlin基因的突變與由聽(tīng)神經(jīng)病致聾的遺傳疾病有關(guān)。很可能通過(guò)注射LirTHSC引起的otoferlin產(chǎn)生也是預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)病的原因之一。過(guò)去以來(lái)一直認(rèn)為，在患視網(wǎng)膜變性的患者和動(dòng)物中所觀察到的血管變化是因?yàn)楣飧惺芷魉劳龆^發(fā)的代謝需求降低。本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，至少對(duì)于患遺傳性視網(wǎng)膜變性的小鼠，保護(hù)正常血管系統(tǒng)同樣可有助于維持外核層的組分。最新的文獻(xiàn)報(bào)道支持組織特異性血管系統(tǒng)具有超出預(yù)期單純提供血管"營(yíng)養(yǎng)物，，以外的營(yíng)養(yǎng)作用的觀點(diǎn)。例如，在面臨肝損傷時(shí)對(duì)肝細(xì)胞再生和維持十分關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子VEGFR1活化之后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟內(nèi)皮細(xì)胞(LeCouter等，2003,5Wewe 299:890-893)。
據(jù)報(bào)道，血管內(nèi)皮細(xì)胞與鄰近的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間類似的標(biāo)志性相互作用遠(yuǎn)在功能性血管形成之前就參與了肝臟器官發(fā)生?；家暰W(wǎng)膜變性個(gè)體中的內(nèi)源視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)可能不促進(jìn)如此顯著的拯救，但是如果該血管系統(tǒng)得到衍生自骨髓造血干細(xì)胞群的內(nèi)皮祖細(xì)胞的支持，則它們可使血管系統(tǒng)更能抵抗變性，同時(shí)有助于視網(wǎng)膜神經(jīng)元以及血管存活。在患視網(wǎng)膜變性的人中，延緩?fù)耆暰W(wǎng)膜變性的發(fā)生可額外提供數(shù)年的視力。用LhTHSC治療的動(dòng)物的ERG得到明顯保護(hù)，這可能足以支持視力。
在臨床上普遍發(fā)現(xiàn)，可能基本喪失光感受器和其它神經(jīng)元而仍然保存功能性視力。在某一點(diǎn)上，臨界閾值交叉，視力喪失。因?yàn)閹缀跛腥祟愡z傳性-f見(jiàn)網(wǎng)膜變性都是早期但緩慢發(fā)作的，因此可以鑒定出患視網(wǎng)膜變性的個(gè)體，并且可以通過(guò)玻璃體腔移植本發(fā)明的自體骨髓干細(xì)胞來(lái)治療，以延緩視網(wǎng)膜變性和伴發(fā)的視力喪失。為了促進(jìn)本發(fā)
明干細(xì)胞的尋靶和摻入，需要活化星形細(xì)胞的存在(Otani等，2002,A^A M^/, 8: 1004-1010);當(dāng)存在相關(guān)神經(jīng)月交質(zhì)增生時(shí)可通過(guò)早期治療，或者可通過(guò)用激光刺激活化星形細(xì)胞局部增生來(lái)實(shí)現(xiàn)。任選在眼內(nèi)注射之前，干細(xì)胞離體用一種或多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)染，這可用來(lái)提高拯救效果。該方法可應(yīng)用于治療其它視神經(jīng)元變性性疾病，例如青光眼，其中存在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性。
得自成體骨髓的Lin— HSC群含有EPC群，該EPC群可通過(guò)靶向反應(yīng)性星形細(xì)胞并摻入已建立的模板來(lái)促進(jìn)血管生成而不會(huì)破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。Lin—HSC還在患有視網(wǎng)膜變性眼中提供長(zhǎng)期神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救效果。此外，經(jīng)遺傳修飾的含有EPC的自體Lin— HSC組成成分可被移植到缺血或血管化異常眼內(nèi)，并可以穩(wěn)定地?fù)饺胄卵芎蜕窠?jīng)元層中，并在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)局部連續(xù)遞送治療分子。這類按生理上有益的劑量局部遞送表達(dá)藥物的基因代表了用于治療目前尚不能治療的眼病的新模式。
例如，正常小鼠視網(wǎng)膜中的光感受器主要是視桿細(xì)胞，但用本發(fā)明LhTHSC拯救之后觀察到的外核層主要含視錐細(xì)胞。我們認(rèn)為，由于原發(fā)性視桿細(xì)胞特異性缺陷而產(chǎn)生了大多數(shù)人類遺傳性視網(wǎng)膜變性，視錐細(xì)胞喪失是繼視桿細(xì)胞功能障礙而發(fā)生的，這可能與由視桿細(xì)胞表達(dá)的某些營(yíng)養(yǎng)因子的喪失有關(guān)。
實(shí)施例
實(shí)施例l.細(xì)胞分離和富集；鼠Lin—HSCA群和B群的制備。
通用方法。所有體內(nèi)評(píng)價(jià)均遵照NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)進(jìn)4亍，所有評(píng)Y介方法都經(jīng)過(guò)斯克里普斯研究學(xué)院(The Scripps Research Institute)(TSRI， La Jolla， CA)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(Animal Care and UseCommittee)批準(zhǔn)。從B6.129S7-Gtrosa26、 Tie-2GFP、 ACTbEGFP、FVB/NJ (W/^/小鼠)或Balb/cBYJ成年小鼠(The Jackson Laboratory,ME)提取骨髓細(xì)胞。
然后采用HISTOPAQUE⑧水溶性聚蔗糖梯度(Sigma, St. Louis,MO),通過(guò)密度梯度分離，分離出單核細(xì)胞，用生物素綴合的譜系組抗體(CD45、 CD3、 Ly-6G、 CDll、 TER-119， Pharmingen， SanDiego，CA)標(biāo)記用于小鼠的Un—篩選。利用磁分離裝置(AUTOMACSTM分選儀，Miltenyi Biotech， Aubum， CA)，從LirTHSC中分離并除去語(yǔ)系陽(yáng)性(Lin+)細(xì)胞。使用下列抗體PE綴合的Sca-l 、 c-kit、 KDR和CD31(Pharmingen， San Diego， CA)，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ)對(duì)所得的含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的LirT HSC群進(jìn)行進(jìn)一步表征。Tie-2-GFP骨髓細(xì)胞用于表征Tie-2。
為了收獲成年小鼠內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)手術(shù)從ACTbEGFP小鼠摘取腸系膜組織，并置于膠原酶(Worthington， Lakewood， NJ)中以消化組織，隨后用451im濾器過(guò)濾。收集濾出液后，與內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego， CA)—起將育。通過(guò)觀察形態(tài)上的鵝卵石外觀、用CD31mAb (Pharmingen)染色并檢查MATRIGEl/M基質(zhì)(Beckton Dickinson,Franklin Lakes, NJ)培養(yǎng)物中形成的管樣結(jié)構(gòu)，以證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞特征。
鼠LiiT HSC A群。通過(guò)上述通用方法，從ACTbEGFP小鼠中提取骨髓細(xì)胞。通過(guò)FACS流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)Lin—HSC細(xì)胞的CD31、c-kit、Sca-l 、 Flk-l和Tie-2細(xì)胞表面抗原標(biāo)記進(jìn)行表征。結(jié)果見(jiàn)
圖1 (c)。約81%的LhT HSC具有CD31標(biāo)記，約70.5%的LirT HSC具有c-kit標(biāo)記，約4%的Lin— HSC具有Sca-l標(biāo)記，約2.2%的LhT HSC具有Flk-l標(biāo)記，約0.91%的Lin—HSC細(xì)胞具有Tie-2標(biāo)記。相比之下，從這些骨髓細(xì)胞分離出的Lin+ HSC具有顯著不同的細(xì)胞標(biāo)記語(yǔ)(即CD31: 37.4%; c-kit: 20%; Sca-l: 2.8%; Flk國(guó)0.05%)。
鼠LhT HSCB群。通過(guò)上述通用方法，乂人Balb/C、 ACTbEGFP和C3H小鼠提取骨髓細(xì)胞。分析了 Lin— HSC細(xì)胞存在的細(xì)胞表面標(biāo)記(Sca-l、 Flk-1/KDR、 c-kit (CD117)、 CD34、 CD31和各種整耳關(guān)蛋白
45ocl、 (x2、 ct3、 a4、 ot5、 a6、 aL、 aM av、 ax、 aIIb、卩,、卩2、卩3、 p4、 p
和卩7)。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2. Lin- HSC B群的表征
細(xì)胞標(biāo)記LhTHSC
al0.10
a217.57
a30.22
a489.39
a582.47
a677.70
aL62.69
aM35.84
aX3.98
aV33.64
allb0.25
PI86.26
(3249.07
(3345.70
P40.68
P59.44
P711.25
CD3151.76
CD3455.83
Flk-l/KDR2.95
c-kit (CD 117)74.42
Sca-17.54
實(shí)施例2.鼠模型中經(jīng)玻璃體腔給予細(xì)胞。
用微小刀片(fine blade)在小鼠眼瞼上切割出眼瞼裂隙露出P2至P6時(shí)目艮球。然后，用33號(hào)(Hamilton， Reno, NV)帶針注射器，將本發(fā)明的譜系陰性HSC A群(約0.5 pl至約1 pl細(xì)胞培養(yǎng)基中約105細(xì)胞)注射到玻璃體腔內(nèi)。
實(shí)施例3. EPC轉(zhuǎn)染。按照生產(chǎn)商的方案，用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche,Indianapolis,IN),鼠Un— HSC (A群)用編碼TrpRS的T2片段還附加了 His6標(biāo)簽的DNA (SEQ ID NO:l,圖7)轉(zhuǎn)染。將Lin— HSC細(xì)胞(約106個(gè)細(xì)胞/ml)懸浮于含有干細(xì)胞因子(PeproTech， Rocky Hill, NJ)的QPTI-MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。然后加入DNA (約1昭)和FuGENE試劑(約3 (il)混合物，將混合物在大約37。C下孵育約18小時(shí)。孵育后，洗滌并收集細(xì)胞。該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率約為17%，通過(guò)FACS分析得到證實(shí)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)了 T2-TrpRS的產(chǎn)生。加有His6標(biāo)簽的T2-TrpRS的氨基酸序列見(jiàn)圖8中的SEQIDNO:2。
實(shí)施例4.免疫組織化學(xué)和共焦分析.
在不同時(shí)間點(diǎn)收獲小鼠視網(wǎng)膜，并制備完整鋪片或冷凍切片。對(duì)于完整鋪片，視網(wǎng)膜用4%低聚曱醛固定，并在環(huán)境溫度下，在50%胎牛血清(FBS)和20%正常山羊血清中封閉1小時(shí)。對(duì)視網(wǎng)膜用第一抗體處理，并用第二抗體檢測(cè)。所用第一抗體為以下抗體抗膠原IV(Chemicon， Temecula， CA)、抗卩-gal (Promega, Madison, WI)、抗GFAP (Dako Cytomation， Carpenteria， CA)、抗a畫(huà)平滑月幾肌動(dòng)蛋白(a-SMA, Dako Cytomation)。所用第二抗體與Alexa 488或594熒光標(biāo)記(Molecular Probes, Eugene, OR)綴合。用MRC 1024共焦顯《效4竟(Bio國(guó)Rad， Hercules, CA)拍攝照片。用LASERSHARP⑧軟件(Bio-Rad)制成三維圖像，以檢查完整鋪片視網(wǎng)膜中三層不同的血管發(fā)育層。利用通過(guò)共焦顯微鏡法分辨出來(lái)的增強(qiáng)型GFP (eGFP)小鼠與GFAP/wtGFP小鼠之間GFP像素強(qiáng)度(pixel intensity)的差異，來(lái)制成三維圖像。
實(shí)施例5.小鼠體內(nèi)視網(wǎng)膜血管生成定量測(cè)定法。
對(duì)于T2-TrpRS分析，由小鼠視網(wǎng)膜三維圖像重建初生網(wǎng)和深層網(wǎng)。初生網(wǎng)被分成兩類正常發(fā)育或停止血管進(jìn)程。才艮據(jù)包括下列標(biāo)準(zhǔn)在內(nèi)的血管抑制百分比解釋深層血管發(fā)育抑制的類別完全抑制的深層網(wǎng)形成被標(biāo)為"完全，，，正常血管發(fā)育(包括小于25%抑制)被標(biāo)為"正常"，其余的被標(biāo)為"部分"。對(duì)于ra^WZ小鼠拯救數(shù)據(jù)，用10x透鏡拍攝每張完整視網(wǎng)膜鋪片內(nèi)較深網(wǎng)層的4個(gè)獨(dú)立區(qū)域。計(jì)算每張照片血管系統(tǒng)的總長(zhǎng)度，匯總后進(jìn)行組間比較。為了獲得正確的信息，將Lin—HSC注射到一只眼中，將Lin+HSC注射到同一只小鼠的另一只眼中。非注射對(duì)照視網(wǎng)膜取自同窩小鼠。
實(shí)施例6.成體視網(wǎng)膜損傷鼠模型。
采用二極管激光(150mW, l秒鐘，50mm)或用27號(hào)針機(jī)械刺穿小鼠視網(wǎng)膜，來(lái)產(chǎn)生激光模型和瘢痕模型。損傷后5天，采用玻璃體腔方法注射細(xì)胞。5天后摘取小鼠眼睛。
實(shí)施例7.視網(wǎng)膜再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救。
成年鼠骨髓衍生的語(yǔ)系陰性造血干細(xì)胞(Lin— HSC)在視網(wǎng)膜變性小鼠模型中具有血管營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救效果。給10日齡小鼠的右眼玻璃體腔注射約0.5微升(含有約105個(gè)本發(fā)明的Lin—HSC), 2個(gè)月后，對(duì)視網(wǎng)膜存在的血管系統(tǒng)和神經(jīng)元層核的統(tǒng)計(jì)數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。給同 一小鼠的左眼注射大致相同數(shù)量的Lin+ HSC作為對(duì)照，并進(jìn)行了同樣的評(píng)價(jià)。如圖9所示，在Lin—HSC治療眼中，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)看起來(lái)幾乎正常，內(nèi)核層幾乎正常，外核層(ONL)具有約3層至約4層的核。相比之下，對(duì)側(cè)Lin+HSC治療眼具有明顯萎縮的視網(wǎng)膜血管中間層，完全萎縮的視網(wǎng)膜血管外層；內(nèi)核層明顯萎縮，外核層完全消失。這在3號(hào)小鼠和5號(hào)小鼠中得到充分說(shuō)明。1號(hào)小鼠中沒(méi)有拯救效果，對(duì)于約15°/。的注射小鼠也沒(méi)有拯救效果。
當(dāng)用視網(wǎng)膜電位圖(ERG)對(duì)視功能進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，在觀察到血管拯救和神經(jīng)元拯救的同時(shí)，也觀察到陽(yáng)性ERG的恢復(fù)(3和5號(hào)小鼠)。當(dāng)無(wú)血管拯救或神經(jīng)元拯救(l號(hào)小鼠)時(shí)，也未觀察到陽(yáng)性ERG。通過(guò)圖IO中所示的回歸分析圖，說(shuō)明了由本發(fā)明Lin—HSC引起的W/W小鼠眼血管營(yíng)養(yǎng)性拯救和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救之間的這種關(guān)聯(lián)性。對(duì)于中間層血管系統(tǒng)類型(f0.45)以及對(duì)于深層血管系統(tǒng)(rK).67)，都觀察到神經(jīng)元恢復(fù)(y軸)和血管恢復(fù)(x軸)之間的關(guān):f關(guān)性。
圖11顯示由Lin+HSC引起的血管拯救和神經(jīng)元拯救之間不存在任何統(tǒng)計(jì)顯著相關(guān)性。對(duì)血管拯救進(jìn)行了定量測(cè)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)
圖12。注射后1個(gè)月(1M)、 2個(gè)月(2M)和6個(gè)月(6M)小鼠的數(shù)據(jù)見(jiàn)
圖12,數(shù)據(jù)表明特別在注射后1個(gè)月和2個(gè)月，相對(duì)于同一小鼠未治療眼的血管長(zhǎng)度(淺色條形柱)，本發(fā)明LirT HSC治療眼的血管長(zhǎng)度(黑色條形柱)顯著加長(zhǎng)。注射Lin—HSC或Lin+HSC后約2個(gè)月，通過(guò)統(tǒng)計(jì)內(nèi)核層和外核層的細(xì)胞核，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救效果進(jìn)行了定量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)
圖13和
圖14。
實(shí)施例8.人Lin— HSC群。
通過(guò)上述通用方法，從健康成人志愿者中提取骨髓細(xì)胞。然后采用HISTOPAQUE⑧水溶性聚蔗糖梯度(Sigma， St. Louis, MO)，通過(guò)密度梯度分離，分離出單核細(xì)胞。為了從人骨髓單核細(xì)胞分離出Lin一HSC群，連同磁分離系統(tǒng)(AUTOMACSTM分選儀，Miltenyi Biotech，Auburn， CA)—起使用了下列生物素綴合的譜系組抗體CD2、 CD3、CD4、 CDlla、 Mac-l、 CD14、 CD16、 CD19、 CD33、 CD38、 CD45RA、CD64、 CD68、 CD86、 CD235a (Pharmingen)。
根據(jù)CD133表達(dá)，將人Lin—HSC群進(jìn)一步分成兩個(gè)亞群。細(xì)胞用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記，并分成CD133陽(yáng)性亞群和CD133陰性亞群。
實(shí)施例9.視網(wǎng)膜變性鼠模型中經(jīng)玻璃體腔給予人和鼠細(xì)胞。
C3H/HeJ、 C3SnSmn.CB17-PWWcSC/Z)和小鼠品系用作3見(jiàn)網(wǎng)膜變性才莫型。C3H/HeJ和C3SnSmn.CB17-尸rWc SOD小鼠(The JacksonLaboratory, Maine)是視網(wǎng)膜變性1 (W7)突變的純合體，這是引起早期發(fā)生嚴(yán)重視網(wǎng)膜變性的一種突變。該突變位于編碼視桿細(xì)胞光感受器cGMP磷酸二酯酶(3亞基的7We幼基因外顯子7上。 一向在患有常染色體隱性色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的人類患者中發(fā)現(xiàn)該基因的突變。C3SnSmn.CB17-尸rWc SC/D小鼠也是重癥聯(lián)合免疫缺陷自發(fā)性突變(/VWc SC/j9)的純合體，并用于人細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。WM小鼠的視網(wǎng)膜變性是由尸&幼基因的外顯子13突變引起的。這也是臨床上有關(guān)的視網(wǎng)膜變性比n/7//^的更晚發(fā)作并較輕微的RP模型。所有評(píng)價(jià)都遵照NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南進(jìn)行，所有方法都經(jīng)過(guò)斯克里普斯研究學(xué)院動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。
用微小刀片在小鼠眼瞼上切割出眼瞼裂隙露出P2至P6時(shí)的眼球。然后用33號(hào)(Hamilton, Reno， NV)帶針注射器，將譜系陰性HSC細(xì)胞的鼠A群或人C群(約0.5 pl至約1 pl細(xì)胞培養(yǎng)基中的約105個(gè)細(xì)胞)注射到小鼠眼玻璃體腔。為了觀測(cè)注射的人細(xì)胞，細(xì)胞在注射前用染料(細(xì)胞示蹤物綠色CMFDA， Molecular Probes)標(biāo)記。
在不同時(shí)間點(diǎn)收獲視網(wǎng)膜，并用4。/。低聚甲醛(PFA)和甲醇固定后，在室溫下，在50。/。FBS/20。/。NGS中封閉1小時(shí)。為了使視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)染色，依次將視網(wǎng)膜與抗CD31抗體(Pharmingen)和抗膠原IV抗體(Chemicon)及Alexa 488或594綴合的第二抗體(MolecularProbes， Eugene, Oregon)—起孵育。將具有4個(gè)放射狀松馳切口的視網(wǎng)膜鋪平，以得到完整鋪制片。應(yīng)用Radiance MP2100共焦顯孩M竟和LASERSHARP⑧軟件(Biorad, Hercules, California),獲得視網(wǎng)膜血管中網(wǎng)層或深網(wǎng)層中血管系統(tǒng)的圖像(參見(jiàn)Dorrell等，2002 /wveWQp似/^/mo/. 5W. 43:3500-3510)。至于血管系統(tǒng)的定量測(cè)定，從血管中間層或血管深層的中部隨機(jī)選擇4個(gè)獨(dú)立視野(900 pm x 900Hm)，并應(yīng)用LASERPIX⑧分析軟件(Biorad)測(cè)量出血管系統(tǒng)的總長(zhǎng)度。同 一 網(wǎng)層的這4個(gè)視野的血管總長(zhǎng)度被用作進(jìn)一 步分析。
將平鋪的視網(wǎng)膜重新包埋用于恒冷箱切片。將視網(wǎng)膜置于4%
50PFA過(guò)夜后，與20%蔗糖一起孵育。將視網(wǎng)膜在最佳切片溫度化合物 (OCT: Tissue-Tek; Sakura FineTech, Torrance, CA)中包埋。將恒冷箱切 片(IO (jm)在含有核染料DAPI (Sigma-Aldrich， St. Louis, Missouri)的 PBS中重新水化。用共焦顯微鏡，在包含視神經(jīng)頭和整個(gè)周邊視網(wǎng)膜 的單一切片內(nèi)的3個(gè)不同區(qū)域(寬280 pm，無(wú)偏取樣)內(nèi)，拍攝DAPI 標(biāo)記的核照片。統(tǒng)計(jì)位于一個(gè)切片上3個(gè)獨(dú)立^f見(jiàn)野內(nèi)ONL的核數(shù)， 匯總用于分析。進(jìn)行了簡(jiǎn)單線性回歸分析，以研究深層網(wǎng)血管系統(tǒng)長(zhǎng) 度與ONL細(xì)胞核數(shù)之間的關(guān)系。
避光適應(yīng)過(guò)夜后，通過(guò)腹膜內(nèi)注射15 pg/gm氯胺酮和7 pg/gm賽 拉。秦，將小鼠麻醉。瞳孔放大(1%硫酸阿托品)后，用金環(huán)角膜電極連 同口部參比電極和尾接地電極，從各眼角膜表面記錄視網(wǎng)膜電位圖 (ERG)。用附在高反射性全視野彎面(highly reflective Ganzfeld dome) 外的Grass光刺激器(Photic Stimulator) (PS33 Plus, Grass Instruments, Quincy， MA)產(chǎn)生刺激。記錄強(qiáng)度高達(dá)光刺激器最大允許(0.668 cd-s/m2) 范圍內(nèi)的短波長(zhǎng)(Wratten 47A;人max = 470 nm)閃光時(shí)的視桿細(xì)胞反 應(yīng)。將反應(yīng)信號(hào)》文大(CP511 AC放大器，Grass Instruments),進(jìn)行數(shù) 字化處理(PCI-1200， National Instruments, Austin, TX)，并進(jìn)4亍了計(jì) 算機(jī)分析。在用ERG記錄治療和未治療眼時(shí)，每只小鼠都用作其自 身的內(nèi)部對(duì)照。對(duì)于最弱信號(hào)，對(duì)多達(dá)100次掃描取平均值。得自未 治療眼的平均反應(yīng)數(shù)值減去治療眼的反應(yīng)數(shù)值，用信號(hào)的這個(gè)差異表 明功能拯救。
采用微陣列分析評(píng)價(jià)了 Lin—HSC靶向的視網(wǎng)膜基因表達(dá)。給P6 rd/W小鼠注射Lin—或CD31— HSC。注射后40天，在無(wú)RNA酶培養(yǎng) 基中解剖出這些小鼠的視網(wǎng)膜(在注射后這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng) 和光感受器層的拯救顯而易見(jiàn))。通過(guò)完整鋪片對(duì)各視網(wǎng)膜的一個(gè)象限 進(jìn)行了分析，以確保已達(dá)到正常HSC尋靶以及血管系統(tǒng)和神經(jīng)保護(hù)。 用TRIzol (Life Technologies, Rockville， MD)、苯酚/氯仿RNA分離 方案，對(duì)得自成功注射的視網(wǎng)膜的RNA進(jìn)行純化。將RNA與Affymetrix Mu74Av2芯片雜交，應(yīng)用 GENESPRING 軟件 (SiliconGenetics, Redwood City, CA)，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行了分析。將純 的人或小鼠HSC注射到P6小鼠玻璃體腔。在P45時(shí)，解剖出視網(wǎng)膜， 并合并成以下部分用于RNA純化，并與人特異性U133A Affymetrix 芯片雜交l)注射人HSC的被拯救的小鼠視網(wǎng)膜，2)注射人HSC的 未拯救的小鼠視網(wǎng)膜，和3)注射小鼠HSC的被拯救的小鼠視網(wǎng)膜。 應(yīng)用GENESPRING⑧軟件鑒定表達(dá)超出本底和人HSC拯救的視網(wǎng)膜 中表達(dá)較高的基因。然后對(duì)這些基因的每一種分別進(jìn)行了探針對(duì)表達(dá) 語(yǔ)(probe-pair expression profile)的分析，并與采用dChip的正常人模型 U133A微陣列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較，以確定人的種特異性雜交，并消除因 跨種雜交所致的假陽(yáng)性。
圖21表示流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，對(duì)本發(fā)明CD133陽(yáng)性(CD133+)和 CD133陰性(CD133—)人LirT HSC群中的CD31和整聯(lián)蛋白a6表面抗 原表達(dá)進(jìn)行了比較。左圖表示流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖。中圖和右圖是表示 在細(xì)胞群中表達(dá)的特異性抗體水平的峰圖。Y軸代表事件次數(shù)，X軸 表示信號(hào)強(qiáng)度。輪廓峰圖為同種型IgG對(duì)照抗體，表示非特異性本底 染色水平。實(shí)心峰圖表示細(xì)胞群中的特異性抗體表達(dá)水平。偏移到輪 廓(對(duì)照)峰圖右側(cè)的實(shí)心峰圖代表熒光信號(hào)增強(qiáng)，抗體表達(dá)超出本底 水平。兩個(gè)細(xì)胞群之間實(shí)心峰圖的峰位置的比較代表細(xì)胞中蛋白質(zhì)表 達(dá)的差異。例如，CD31在本發(fā)明CD133+和CD133—細(xì)月包兩者中的表 達(dá)均超出本底；然而，比起在CD133—群中，在CD133+細(xì)胞群中有較 多細(xì)胞表達(dá)較低水平的CD31。從這一數(shù)據(jù)明顯看出CD31表達(dá)在兩 個(gè)群之間不同，a6整聯(lián)蛋白表達(dá)主要限于Lin-群的細(xì)胞，因此可以用 作具有血管營(yíng)養(yǎng)性拯救功能和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性拯救功能的細(xì)胞的標(biāo)記。
當(dāng)將CD133陽(yáng)性和CD133陰性Lin—HSC亞群經(jīng)玻璃體腔注射到 新生SCID小鼠眼內(nèi)時(shí)，對(duì)于同時(shí)表達(dá)CD31和整聯(lián)蛋白a6表面抗原 的CD133陰性亞群，觀察到摻入發(fā)育中的血管系統(tǒng)的最大程度(參見(jiàn) 圖21下)。不表達(dá)CD31或整聯(lián)蛋白a6的CD133陽(yáng)性亞群(圖21上)似乎靶向周邊缺血驅(qū)動(dòng)的新血管形成的部位，但不是當(dāng)注射到正在進(jìn) 行血管生成的眼睛時(shí)。
用對(duì)視桿或視錐視蛋白有特異性的抗體，對(duì)拯救和未拯救的視網(wǎng)
膜進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。對(duì)用于
圖17中所示ERG記錄的相同眼 的視桿或視錐視蛋白進(jìn)行了分析。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中，存在的5% 以下的光感受器為視錐細(xì)胞(Soucy等，1998， A/ewrow 21:481-493)，用 紅/綠色視錐視蛋白或視桿視紫紅質(zhì)觀察到的免疫組織化學(xué)染色模式 (分別如圖25(A)和圖25(B)所示)，與一見(jiàn)錐細(xì)胞的這一百分比一致。對(duì) 視桿視紫紅質(zhì)有特異性的抗體(rho4D2)由英屬哥倫比亞大學(xué) (University of British Columbia)的Robert Molday博士提供，按照前述 方法使用(Hicks等，1986，五少e 42:55-71)。對(duì)視錐紅/綠色視 蛋白有特異性的兔抗體購(gòu)自Chemicon (AB5405),按照生產(chǎn)商的說(shuō)明 書(shū)使用。
實(shí)施例10.氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性鼠模型中經(jīng)玻璃體腔給予鼠細(xì)胞。
在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性(OIR)模型中，在出生后P7天至P12天之 間將新生野生型C57B16小鼠暴露于高氧(含氧量75%)。圖22說(shuō)明 C57B16小鼠出生后自P0到P30血管發(fā)育正常。P0時(shí)，可在^f見(jiàn)盤周 圍觀察到剛萌發(fā)的淺層血管。接著幾天內(nèi)，初生淺網(wǎng)層伸展到周邊， 出生后第10天(P10)時(shí)達(dá)到遠(yuǎn)周邊。在P7和P12期間，次生(深層)網(wǎng) 層發(fā)育。到P17時(shí)，存在廣泛的淺層和深層血管網(wǎng)(圖22插圖)。在隨 后的幾天內(nèi)，隨同第三層(中間層)血管的發(fā)育發(fā)生重建，直到大致在 P21時(shí)達(dá)到成熟結(jié)構(gòu)。
相比之下，在本文所述的OIR模型中，在P7-P12時(shí)暴露于含氧 量75°/。后，事件的正常順序被嚴(yán)重?cái)_亂(圖23)。 P3時(shí)，將本發(fā)明的成 年鼠Lin— HSC群經(jīng)玻璃體腔注射到隨后患OIR的小鼠眼內(nèi)，另 一只 眼注射PBS或CD31陰性細(xì)胞作為對(duì)照。圖24說(shuō)明LirTHSC群可以 在發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)逆轉(zhuǎn)高氧水平的變性作用。P17時(shí)，在治療
53眼內(nèi)觀察到完全發(fā)育的淺層和深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，而對(duì)照眼顯示大
量無(wú)血管的區(qū)域?qū)嶋H上無(wú)深層血管(圖24)。在OIR模型中觀察了大約 IOO只鼠眼。比起用CD31—細(xì)胞治療的對(duì)照眼(12%)和用PBS治療的 對(duì)照眼(3%)，用Lin—HSC群治療的眼中觀察到58°/。的正常血管形成。
實(shí)施例11.通過(guò)CD44篩選從鼠骨髓中分離出髓樣骨髓細(xì)胞。
從成年小鼠(The Jackson Laboratory, ME)中提取骨髓細(xì)胞。全部 骨髓用鼠CD44抗體處理，采用流式細(xì)胞術(shù)從骨髓中分離出CD44表 達(dá)細(xì)胞。將細(xì)胞與抗體分離開(kāi)來(lái)，在緩沖液中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯臃蛛x出 不顯著表達(dá)CD44的細(xì)胞群(CD44L。BM)。
實(shí)施例12.通過(guò)CD44篩選從鼠骨髓分離出髓樣骨髓細(xì)胞。
如實(shí)施例中11所述，采用抗CD1 lb抗體替代抗CD44抗體，正 向選出骨髓細(xì)胞。分離出為CD44^和CDllb+的髓樣骨髓細(xì)胞群，其 具有與實(shí)施例11中用CD44分離出的CD44^群類似的活性特征。同 樣分離出CD44LQCDllb—群，發(fā)現(xiàn)它是無(wú)活性的。
實(shí)施例13. MLBM細(xì)胞群的表征。
盡管不清楚在這種情況下CD44的作用，但是有可能的是，在細(xì) 胞注射到眼內(nèi)后，該受體在富含透明質(zhì)酸的玻璃體中介導(dǎo)細(xì)胞存活、 細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞分化。未分級(jí)分離的小鼠骨髓中存在獨(dú)特的 CD44HI (即MLBM)和CD44L()細(xì)胞群。MLBM細(xì)胞群占用于前述實(shí)施 例的Lin—群的76%,而分別只占得自CD44表達(dá)骨髓的Lin+和 CD317CD34—/CDllb—細(xì)胞群的約37%和40/。(圖26)。因此，在這3個(gè) 群觀察到的CD44表達(dá)與血管營(yíng)養(yǎng)活性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性之間存在顯著 的相關(guān)性，即Lin—細(xì)胞最有效，而CD317CD347CDllbT細(xì)胞始終是有 效性最低。使用一組語(yǔ)系特異性抗體，測(cè)定出大多數(shù)CD44HI細(xì)胞具 有較強(qiáng)的骨髓特征(圖27)。同樣，幾乎所有CD44HI骨髓細(xì)胞也都是 CDllb+(圖27)。實(shí)施例12中用CDllb抗體正向選出的MLBM (CD44HI CDllb+) 得到的活性結(jié)果與血管尋靶實(shí)驗(yàn)中用CD44抗體篩選分離出的MLBM 所得到的結(jié)果類似。
實(shí)施例12中MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞表面抗原特征與實(shí)施例12中 分離出的CD44LO CD1 lb+細(xì)胞的表面抗原特征見(jiàn)下表3。表3中，加 號(hào)(+)越多表明抗原表達(dá)相對(duì)越高。減號(hào)(-)表示未檢測(cè)到表達(dá)。
表3
抗原 CD44HI/CDllb+ CD44LO/CDllb-
CDlla ^
CD31 + ++
CD34 + -
++ -
KDR + -
Sca-1 + +
c-Kit + -
CD115 + -
CD45R/B220 + ++
TER119 - +++
Ly6G&C(GR曙l) +++ -
Ly6G +++ -
實(shí)施例14. MLBM細(xì)胞群的血管營(yíng)養(yǎng)作用和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。
在血管尋靶及血管和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用方面，實(shí)施例11的MLBM細(xì) 胞群保留了 LhT細(xì)胞的性質(zhì)，而CD44L()BM細(xì)胞幾乎沒(méi)有活性或者無(wú) 活性。通過(guò)將GFP+ MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞注射到出生后7天(P7)小鼠 的玻璃體腔，并在P14時(shí)對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行分析，證實(shí)了血管尋靶活性。 血管用GS同工凝集素標(biāo)記后，觀察到GFP+細(xì)胞靶向—見(jiàn)網(wǎng)膜血管系統(tǒng)， 呈現(xiàn)血管周圍定位，并無(wú)摻入的證據(jù)。當(dāng)使用MLBM時(shí)，這些事件 非常普遍，CD44L。BM治療眼中則很少發(fā)生或不發(fā)生(圖28)。
用上述用于LiiT HSC的^見(jiàn)網(wǎng)膜變性小鼠才莫型，對(duì)實(shí)施例11中 MLBM細(xì)胞群的血管和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。n^/W/小鼠顯示
55出視網(wǎng)膜變性疾病特有的特征，包括光感受器死亡和深層視網(wǎng)膜血管
系統(tǒng)萎縮。如上所述，LhTHSC骨髓細(xì)胞保護(hù)深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和 部分拯救光感受器。本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群同樣執(zhí)行相同的功能(圖 29)。
氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病模型與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病有共同的特征。當(dāng)用 MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞治療眼睛時(shí)，與這一模型有關(guān)的病理顯著減輕。 MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞在這個(gè)模型中的作用與使用上述Lin— HSC所觀 察到的相同。用MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞治療的眼睛顯示，用來(lái)量化這 個(gè)模型病理程度的兩個(gè)參數(shù)顯著降低血管消失面積和新血管簇面 積。相比之下，比起溶媒對(duì)照治療眼，CD44tGBM細(xì)胞治療眼未顯示 出改善(圖30)。
除了靶向3見(jiàn)網(wǎng)膜血管系統(tǒng)以外，MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞分化成巨噬 細(xì)胞樣(F4/80+)細(xì)胞，穿透視網(wǎng)膜，并占據(jù)與視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)緊 密相對(duì)的位置。這個(gè)定位有利于觀察到的MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞的血 管和光感受器拯救效果。此外， 一旦位于RPE附近，MLBM細(xì)胞群 的細(xì)胞便產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),正如注射衍生自VEGF-GFP 小鼠的MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞所證實(shí)的一樣，其中綠色熒光蛋白(GFP) 在VEGF基因活化時(shí)進(jìn)行表達(dá)(圖31)。因此，MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞似 乎處于VEGF "活化"狀態(tài)。引入的來(lái)自MLBM細(xì)胞群的細(xì)胞似乎募 集相同類型的內(nèi)源細(xì)胞，因?yàn)樵赗PE區(qū)都同時(shí)觀察到GFP+ (引入的) 和GFP-(內(nèi)源的)細(xì)胞。在野生型小鼠的正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育期間，在 W7/W7小鼠拯救的視網(wǎng)膜中以及在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病模型中都觀察 到這種定位。
同樣的血管尋靶結(jié)果還存在于實(shí)施例12的MLBM細(xì)胞群。圖32 顯示，當(dāng)在P2注射時(shí)，直到P20時(shí)實(shí)施例12的CD44HI CD1 lb+細(xì)胞(綠 色)，以類似于實(shí)施例11的CD44hi群的方式，特異性靶向血管系統(tǒng)(紅 色)。圖33顯示實(shí)施例12的CD44Lo CD1 ltT沒(méi)有特異性靶向血管系統(tǒng)。
本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群為眼病提供多方面的有效治療。該細(xì)胞容易從自體骨髓中分離，因此使常在基于細(xì)胞療法中觀察到的可能的
免疫原性最小化。此外，本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群可以用將功能基因 遞送到視網(wǎng)膜的有用基因轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例15.骨髓細(xì)胞亞群的進(jìn)一步表征。
如前述實(shí)施例中所述，所有實(shí)驗(yàn)均遵照MH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用 指南進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)方法都獲得TSRI動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。 按照上述方案，在C57B16小鼠中誘導(dǎo)OIR。出生后第7天，將幼鼠 及母鼠從室內(nèi)空氣中轉(zhuǎn)移到含氧量75%的環(huán)境中5天，之后回復(fù)到室 內(nèi)空氣中。采用FDA批準(zhǔn)的含氧量分析儀(AX-300, Teledyne Analytical Instruments, CA, USA),監(jiān)測(cè)含氧水平。在這些條件下， 在高氧期間，在中心視網(wǎng)膜形成了大量血管發(fā)育不全的區(qū)域，在回復(fù) 到常氧后，出現(xiàn)異常視網(wǎng)膜前新血管形成，在P17前后達(dá)到最高，最 終消退(圖37中的圖g-i，圖2中的圖a和圖c)。
細(xì)胞制備物基本如下進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞提取從actGFP小鼠 股骨和脛骨收獲骨髓細(xì)胞，并用兩種不同的方法處理。在第一種方法 中，用FICO/LITELM (Atlanta Biologicals， Norcross， Georgia)通過(guò) 密度梯度，并且用生物素綴合的譜系抗體(CD45R/B220、 CD3e、 Ly-6G/C、 CDllb、 TER119， Pharmingen, San Diego， CA)標(biāo)記，來(lái) 分離單核細(xì)胞。之后與鏈霉抗生物素或抗生物素^f茲珠一起孵育，并采 用MACS細(xì)胞分選系統(tǒng)(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)進(jìn)行分選以獲 得LirTHSC群。在第二種方法中，將全部骨髓與針對(duì)CD44的抗體一 起孵育，所述抗體與熒光標(biāo)記綴合。然后應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分選法 (Fluorescence activated cell sorting, FACS)分離出CD44HI細(xì)胞(即其中 大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD44的MLBM細(xì)胞群)和CD44LQ細(xì)胞(即其中少數(shù) 細(xì)胞表達(dá)CD44的細(xì)胞群)。
骨髓細(xì)胞表征采用以下兩種方法，對(duì)通過(guò)上述方法獲得的細(xì)胞 亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析(l)雙色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合抗各種語(yǔ)系和祖細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體，表面標(biāo)記包括CDlla、 CDllb、 Ly6G/C、 CD43、 F4/80、 CD14、 cKit、 CD34、 a6整聯(lián)蛋白和CD115 (所有均得自 Pharmingen ， San Diego ， CA); (2)采用本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法用 AFFYMETRIX Mu430芯片(Affymetrix, Santa Clam， CA)對(duì)基因表 達(dá)進(jìn)行分析。用GENESPRING⑧軟件(Agilent Technologies, Palo Alto, C A)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行了分析。
玻璃體腔注射P2-P7 (高氧前)小鼠中，輕輕解剖切割出眼瞼裂 隙，暴露出眼球。用哈密頓注射器(Hamilton syringe)和33號(hào)針 (Hamilton, Reno， Nevada),將0.5 pl溶媒(含有0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS)中的約1.5x 105至2.5x 105個(gè)骨髓衍生細(xì)胞注射到每只動(dòng) 物一只眼的玻璃體內(nèi)。在對(duì)側(cè)對(duì)照眼中僅注射大約相同數(shù)量的對(duì)照細(xì) 胞或溶々某，在某些情況下，完全不進(jìn)行注射以觀察疾病的天然進(jìn)程。 在分組實(shí)驗(yàn)中，在P9和P12之間的較大齡期進(jìn)行細(xì)胞移植。
視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的染色在P17時(shí)收獲視網(wǎng)膜用于血管系統(tǒng)成像、 注射細(xì)胞定位和表征。在某些情況下，在解剖視網(wǎng)膜以觀測(cè)未閉的血 管之前，將動(dòng)物麻醉，將熒光素標(biāo)記的高分子量葡聚糖(FITCDextran， Sigma)注射到心臟內(nèi)。在其它情況下，釆用使血管和GFP表達(dá)細(xì)胞染 色的免疫組織學(xué)技術(shù)。將視網(wǎng)膜在4。/。全氟乙酸(PFA)和曱醇中固定， 接著在室溫下，在20。/。FBS/20。/。NGS中封閉1小時(shí)。隨后與ALEXA 594綴合的同工凝集素GS-IB4孵育過(guò)夜以鑒定血管(Molecular Probes, Eugene, Oregon)。將具有放射狀松馳切口的視網(wǎng)膜鋪平，以獲得完整 鋪制片，或者在OCT中包埋，并進(jìn)行冷凍切片，得到在鋪片前用DAPI 復(fù)染的視網(wǎng)膜的橫切片。
為了表征移植的細(xì)胞，采用免疫組織學(xué)技術(shù)鑒定分組眼中的下列 細(xì)月包標(biāo)i己F4/80 (Caltag， Burlingame， CA)、 CD44、 CD31 (Pharmingen, San Diego ， CA)和NG2 (Chemicon， Temecula， CA)。所有一見(jiàn)網(wǎng)膜用 凝集素、抗GFP和上述標(biāo)記之一進(jìn)行三重染色。
成像和圖像分析用RADIANCE 2100MP激光掃描共焦顯微鏡(Biorad, Hercules, CA)獲得視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的圖像。如下進(jìn)行血管消 失和新血管形成的定量測(cè)定通過(guò)在GS凝集素染色視網(wǎng)膜的中心視 網(wǎng)膜上仔細(xì)勾畫(huà)出無(wú)血管區(qū)帶的輪廓，來(lái)測(cè)量血管消失的面積，用 PHOTOSHOP (Adobe)或VOLOCITY⑧軟件(Improvision， Lexington MA)計(jì)算出總面積。同樣，通過(guò)采用在視網(wǎng)膜前平面聚焦的共焦圖像， 根據(jù)像素強(qiáng)度選出血管簇(簇標(biāo)記比正常血管系統(tǒng)的更亮)，計(jì)算出視 網(wǎng)膜前新血管("簇")形成面積。然后將所選區(qū)域匯總得到新血管形 成的總面積。應(yīng)用T-檢驗(yàn)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。
收集z系列的共焦圖像，應(yīng)用VOLOCITY⑧軟件將其換算成以體 積表示，從而產(chǎn)生視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和血管周圍骨髓細(xì)胞的三維圖像。 然后可觀察橫切片的視網(wǎng)膜血管，并確定移植的骨髓細(xì)胞相對(duì)于血管 腔的位置。
視網(wǎng)膜血管發(fā)育和氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病小鼠模型。出生后在正常含 氧量條件生長(zhǎng)的小鼠的正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育見(jiàn)圖37中的圖a-f。在出 生后2天(P2)，僅觀察到萌發(fā)的淺層血管占據(jù)了視盤周圍單一平面(圖 37中的圖a和圖b)。在接下來(lái)的一周進(jìn)程中，初生淺網(wǎng)層延伸到周邊， P12前后達(dá)到遠(yuǎn)周邊(圖37中的圖c)。在P7-P12之間，次生(深層)網(wǎng) 層發(fā)育(圖37中的圖d)。第1個(gè)月末時(shí)，隨著第三層(中間層)血管的 發(fā)育，在完全血管化視網(wǎng)膜中發(fā)生重建(圖37中的圖e),達(dá)到成熟結(jié) 構(gòu)(圖37中的圖f)。
相比之下，在OIR模型中，自P7到P12暴露于含氧量75。/。中嚴(yán) 重?cái)_亂了事件正常順序已在中心視網(wǎng)膜形成的淺層血管網(wǎng)發(fā)生明顯 消退(尤其沿動(dòng)脈)(圖37中的圖g(P10)和圖h、圖i(P17))，深層網(wǎng)的 發(fā)育被嚴(yán)重延遲(圖37中的圖k和圖m， P17時(shí)的視網(wǎng)膜橫切片)。僅 僅在P12回復(fù)到正常含氧量條件后，才再次按異常方式開(kāi)始血管生長(zhǎng)。 實(shí)際上，對(duì)于嚴(yán)重血管發(fā)育不全的視網(wǎng)膜，這些現(xiàn)成為相對(duì)低氧的條 件。P17時(shí)，可以在周邊鑒定出一些深層血管，但是，在中周邊內(nèi)， 在血管發(fā)育不全的中心視網(wǎng)膜與較多血管化的周邊之間的邊界上，可觀察到與血管內(nèi)染料滲漏有關(guān)的異常視網(wǎng)膜前新血管簇(圖37中的圖 h)。接下來(lái)幾天內(nèi)，在無(wú)血管區(qū)，淺層和深層血管慢慢發(fā)育，但是新 血管簇延伸到視網(wǎng)膜內(nèi)界膜(ILM)以外進(jìn)入玻璃體，通常持續(xù)直到P21 或甚至更晚。到P25-P30時(shí)，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)已經(jīng)重建，并與此時(shí)的 正常血管系統(tǒng)相像。
高氧前注射造血祖細(xì)胞在氧誘導(dǎo)的血管消失后促進(jìn)視網(wǎng)膜的血管修 復(fù)。在P2-P7時(shí)注射本發(fā)明的LiiTHSC顯著改變^見(jiàn)網(wǎng)膜血管系統(tǒng)在暴 露于高含氧量后恢復(fù)的能力(圖37中的圖j、
圖1、圖n、圖o;和圖 38中的圖b、圖d、圖e、圖f、圖g)。僅注射溶媒不會(huì)誘導(dǎo)這類變化。 在50%以上情況下，在P17時(shí)，Lin—HSC注射眼中觀察到完全發(fā)育的 淺層和深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，而對(duì)側(cè)溶媒注射眼顯示大量無(wú)血管區(qū)， 并且?guī)缀鯖](méi)有深層血管(圖37中的
圖1、圖n，與圖h、圖i、圖k、圖 m和與圖o進(jìn)行比較)。在某些情況下，尤其當(dāng)對(duì)側(cè)對(duì)照眼損傷非常嚴(yán) 重時(shí)，直到P17, LiiT細(xì)胞注射眼中都未完全恢復(fù)，但是在大多數(shù)情 況下明顯好轉(zhuǎn)。在同一動(dòng)物兩側(cè)眼之間的這種比較為L(zhǎng)irTHSC的功效 提供了進(jìn)一步的支持，有效平衡了大多數(shù)的其它遺傳和環(huán)境因素。
在這一模型中，血管消失一直是未得到正確評(píng)價(jià)的特征，因?yàn)榇?多數(shù)研究只分析了連續(xù)視網(wǎng)膜切片中視網(wǎng)膜前新血管簇的形成。可以 采用共焦顯微鏡法和數(shù)字圖像分析，對(duì)同一視網(wǎng)膜的血管消失和血管 簇形成進(jìn)行評(píng)價(jià)(參見(jiàn)例如圖38中的圖a-d)。 P17被選為分析的主要 時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)檠艽匦纬沙３Ｔ诖藭r(shí)最大，而對(duì)照眼中仍存在顯著的 血管消失。采用新的聯(lián)合分析方法，鑒定出了治療眼和對(duì)照眼之間的 明顯差異。與只接受溶J(某眼或未注射眼相比，Lin—治療^L網(wǎng)膜中，在 P17時(shí)測(cè)定的血管消失顯著降低(消失面積減少超過(guò)75%)(圖38中的 圖e)。在這一方面，溶媒注射與未注射之間未觀察到顯著差異。同樣， 比起溶媒注射眼，LirT細(xì)胞治療眼新血管簇面積減少約70%，比起未 注射對(duì)照，減少超過(guò)80%(圖38中的圖f)。因此，LirTHSC治療眼對(duì)小鼠OIR模型的兩個(gè)主要血管損傷和修復(fù)參數(shù)具有重要作用，即降低 新血管簇形成的同時(shí)，力口快"生理性，，內(nèi)層視網(wǎng)膜血管重建。
當(dāng)在高氧期間以及回復(fù)到常氧下進(jìn)行治療時(shí)，也觀察到修復(fù)加 速，但是效果減弱。至此所述實(shí)驗(yàn)涉及在暴露于高氧之前P2-P7曰之 間進(jìn)行的注射。為了確定如果稍后在高氧周期和在回復(fù)到常氧下注 射，注射LirT細(xì)胞是否也能夠影響血管修復(fù)，為此在P9、 P11或P12 時(shí)進(jìn)行了注射，并在隨后不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果見(jiàn) 圖38中的圖g，結(jié)果證實(shí)，即使在高氧期間和在P12時(shí)給予，注射 LirTHSC也有效地加快血管修復(fù)和減少消失面積。然而，這種作用似 乎有些減弱，這就表明在高氧暴露之前進(jìn)行治療，可達(dá)到最大功效。
用Lin—造血祖細(xì)胞治療后，長(zhǎng)期的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能得到充分保 護(hù)。還研究了用Lin—HSC治療的長(zhǎng)期效果和可能的副作用。為此，按 照已建立的模型，從3-6月齡、經(jīng)過(guò)Lin—細(xì)胞注射和暴露于高氧的小 鼠中取12個(gè)視網(wǎng)膜(圖39)。所有情況下，都未觀察到腫瘤，且神經(jīng)視 網(wǎng)膜組織看起來(lái)完好。唯一值得注意的異常是在視網(wǎng)膜內(nèi)偶爾形成 "玫瑰花結(jié)"，這一發(fā)現(xiàn)同樣存在于對(duì)照眼中(圖39中的圖g和圖h)。 LhTHSC注射眼的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)具有正常外觀，未發(fā)現(xiàn)與非注射對(duì) 照視網(wǎng)膜有明顯差異(圖39中的圖a-f)。
還研究了移植細(xì)胞的長(zhǎng)期保持。只在小百分比的眼睛(10%)中觀 察到GFP+細(xì)胞，這表明大多數(shù)注射細(xì)胞數(shù)月后不再存活。如果存在， 則存活細(xì)胞常常位于緊鄰視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的位置。在移植后17天至6 個(gè)月進(jìn)行的視網(wǎng)膜電描記記錄測(cè)量的視網(wǎng)膜功能顯示，LirTHSC移植 眼與齡期匹配的正常非OIR對(duì)照之間無(wú)區(qū)別。為了研究移植細(xì)胞可能 離開(kāi)眼睛并全身擴(kuò)散的可能性，注射后大致7-10天，對(duì)15只小鼠的 脾和/或肝臟存在的GFP+細(xì)胞進(jìn)行了分析。未觀察到眼外的GFP+細(xì)胞。
JiHi活性細(xì)胞類型Lin—群富含CD44肌細(xì)胞。為了更好地理解 在這些過(guò)程中具有活性的機(jī)制并且簡(jiǎn)化細(xì)胞篩選方法，對(duì)鑒定可用來(lái) 從骨髓中分離活性HSC的單一標(biāo)記進(jìn)行了嘗試。根據(jù)例如參與細(xì)胞遷
61移和分化等特征，集合了一大組候選骨髓祖細(xì)胞標(biāo)記。采用流式細(xì)胞
術(shù)，篩選出這些標(biāo)記，將它們?cè)诨钚訪irT細(xì)胞中的表達(dá)與之前在多個(gè) 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中顯示出無(wú)活性的對(duì)照BM細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行了比較。證實(shí) CD44在以下這兩個(gè)群中進(jìn)行差異表達(dá)比起對(duì)照BM細(xì)胞群(4%), (30441_11細(xì)胞存在顯著較高比例的Lin—細(xì)胞(76%)(圖40中的圖a)。如 上所述，CD44是透明質(zhì)酸的細(xì)胞表面受體，研究表明參與調(diào)節(jié)一般 認(rèn)為在介導(dǎo)包括存活、遷移和分化在內(nèi)的拯救效果中是十分重要的若 干細(xì)胞功能。在活性細(xì)胞群中非常普遍而在對(duì)照細(xì)胞則相當(dāng)罕見(jiàn)且活 性P爭(zhēng)低的CD44^細(xì)胞的這種分布，表明CD44實(shí)際上是有效的活性標(biāo)
志o
例如，CD44^細(xì)胞在OIR模型中促進(jìn)血管修復(fù)，而CD44^細(xì)胞 卻不能。CD44HI細(xì)胞在OIR模型有促進(jìn)血管修復(fù)能力的功效已得到證 實(shí)。采用Lin—細(xì)胞注射中所述的相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，證實(shí)了 CD44^細(xì)胞在 該模型中促進(jìn)視網(wǎng)膜血管修復(fù)的功效與用Lin—細(xì)胞所觀察到的類似 (圖40中的圖b、圖c)。相比之下，CD44L0細(xì)胞對(duì)修復(fù)沒(méi)有積極作用。 值得指出的是，觀察到CD44^治療動(dòng)物的視網(wǎng)膜內(nèi)常常幾乎沒(méi)有或 沒(méi)有注射細(xì)胞，這就表明這些細(xì)胞在玻璃體內(nèi)存活和/或遷移到視網(wǎng)膜 中的能力降低。尚未得知CD44H1細(xì)胞是唯一的活性骨髓亞群還是具 有該活性的不同亞群之一。
CD44HI細(xì)胞表達(dá)提示骨髓來(lái)源的基因和標(biāo)記。通過(guò)大規(guī)模表達(dá) 分析，并依次通過(guò)Lin—和祖細(xì)胞特異性標(biāo)記的抗體標(biāo)記法及流式細(xì)胞 術(shù)，對(duì)CD44^群進(jìn)行了進(jìn)一步表征(圖41和圖44)。兩種方法都顯示 CD44H1細(xì)胞具有提示骨髓來(lái)源的表達(dá)譜。在這些細(xì)胞中觀察到 CDlla、 CDllb和Ly6G/C在蛋白質(zhì)水平上的強(qiáng)表達(dá)，而通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)檢測(cè)到F4/80、 CD14、 cKit和CD115的強(qiáng)度較弱的陽(yáng)性標(biāo)記。在 表達(dá)分析中，與CD44^細(xì)胞相比，包括CD204、 CD114、 CD33和 CD115在內(nèi)的若干骨髓特異性基因高表達(dá)(圖44)。相比之下，在蛋白 質(zhì)水平上，CD44^群具有顯著表達(dá)的Terl19和CD45R B220，它們分別為成紅細(xì)胞/紅細(xì)胞和B細(xì)胞的標(biāo)記。在表達(dá)陣列中，與包括 CD 19 、 CD79a和CD22在內(nèi)的CD44 細(xì)胞相比，與淋巴細(xì)胞有關(guān)的 多個(gè)基因在CD44^中高表達(dá)(圖44)。因此，在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上 的分析鑒定出活性CD44^群主要是骨髓來(lái)源的，而無(wú)活性CD44^細(xì) 胞主要為淋巴來(lái)源的。
移植細(xì)胞原位分析一分化的證據(jù)已對(duì)得自骨髓的活性細(xì)胞群進(jìn) 行了更明確地界定后，對(duì)這些細(xì)胞在引入眼睛后的命運(yùn)進(jìn)行了研究。 為此，用各種標(biāo)記通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)得自O(shè)IR模型的CD44^注射 視網(wǎng)膜進(jìn)行了分析。絕大多數(shù)引入的細(xì)胞選擇性靶向視網(wǎng)膜血管系 統(tǒng)，并呈現(xiàn)血管周圍定位，常常形成與主血管緊密締合的伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)(圖 42中的圖a)。采用抗CD31抗體和抗NG2抗體，在表達(dá)GFP的血管 周圍骨髓細(xì)胞上未檢測(cè)到這些標(biāo)記，這就表明，這些細(xì)胞沒(méi)有分別分 化成內(nèi)皮細(xì)胞或周細(xì)胞。此外，移植細(xì)胞似乎沒(méi)有形成血管腔的任何 部分(圖42中的圖b)，從而證實(shí)這些細(xì)胞不可能分化成內(nèi)皮細(xì)胞。相 比之下，在CD44H"臺(tái)療眼中，巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記F4/80標(biāo)記 許多但非全部的血管周圍GFP+細(xì)胞(圖43中的圖d-I)。這些引入的 F4/80+細(xì)胞的外觀與同樣是用F4/80標(biāo)記的內(nèi)源血管周圍細(xì)胞非常相 似(圖43中的圖a-c)，這就表明在OIR模型中，移植細(xì)胞具有與天然 細(xì)胞相似的特性。
細(xì)胞療法潛在的優(yōu)勢(shì)之一(特別是與常規(guī)藥物治療相比)是細(xì)胞響 應(yīng)局部信號(hào)(local cue)并在變化的環(huán)境下進(jìn)行修飾的潛力。在P17 (注 射后IO天)時(shí)，觀察到已靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)并占據(jù)血管周圍位置的 移植細(xì)胞下調(diào)CD44到無(wú)法檢測(cè)的水平(圖43中的圖j-o)。然而未與血 管系統(tǒng)締合的細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)CD44。因此，通過(guò)FACS根據(jù)CD44高 表達(dá)最初選出的植入細(xì)胞亞群在體內(nèi)下調(diào)該受體，這與細(xì)胞在視網(wǎng)膜 中的定位有關(guān)。這就表明引入的細(xì)胞實(shí)際上正在眼環(huán)境內(nèi)進(jìn)行選擇性 變化(分化)。
上面的詳細(xì)結(jié)果表明，基于細(xì)胞的療法可以用來(lái)治療ROP和其它缺血性視網(wǎng)膜病。在小鼠模型中觀察到的結(jié)果表明該方法有效減輕 與高氧暴露有關(guān)的血管病理，并且?guī)缀鯚o(wú)毒性或沒(méi)有毒性。與單因素 治療相反，采用細(xì)胞療法的優(yōu)勢(shì)可能在于細(xì)胞適應(yīng)和響應(yīng)變化的環(huán)境 的能力。從單因素治療發(fā)展到結(jié)合藥物和介入，以選出并遞送可以指 揮和指引復(fù)雜反應(yīng)順序而同時(shí)與宿主組織相互作用的精致可適應(yīng)細(xì) 胞，是一個(gè)令人振奮的新構(gòu)思。在這個(gè)方面，本發(fā)明在缺血性視網(wǎng)膜
病/血管病變的治療方法中提供"范式轉(zhuǎn)變(paradigm shift)"，也就是 說(shuō)強(qiáng)調(diào)治愈和穩(wěn)定，而不是抑制和消失。
靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的本發(fā)明的分離髓樣細(xì)胞群，可以用來(lái)遞送 血管抑制藥，并在視網(wǎng)膜變性模型中具有血管營(yíng)養(yǎng)作用和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作 用。在本研究中，MLBM細(xì)胞群的特定亞群在加快OIR修復(fù)中十分 有效。有趣的是，活性細(xì)胞表達(dá)提示它們是骨髓來(lái)源的標(biāo)記，并可能 在移植后進(jìn)行分化和修飾。
心臟病學(xué)領(lǐng)域已在應(yīng)用細(xì)胞療法促進(jìn)血管形成方面充當(dāng)先鋒，其 目的在于抵償梗塞的動(dòng)脈。有充分的證據(jù)證明，某些骨髓細(xì)胞在改善 灌注和心臟功能方面是有效的。然而尚不清楚的是，哪一種細(xì)胞類型 負(fù)責(zé)所觀察到的效果。研究骨髓衍生內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)潛在作用的多 項(xiàng)研究推斷這些細(xì)胞存在于新血管或側(cè)支血管，但是在某些這類研究 中報(bào)道了少數(shù)摻入細(xì)胞，這引起了對(duì)它們的重要性的爭(zhēng)議。另外，含 有十分少量的干細(xì)胞和/或EPC的異源骨髓群，例如單核細(xì)胞或未分 級(jí)細(xì)胞，同樣可能顯著促進(jìn)側(cè)支血管發(fā)育，這表明直接摻入血管以外 的其它機(jī)制發(fā)生了作用。雖然無(wú)意受理論的束縛，但是有可能通過(guò)這 些細(xì)胞分泌的因子起使宿主血管系統(tǒng)條件最佳化的作用，從而這些細(xì) 胞發(fā)揮支持和旁分泌作用。研究表明，多個(gè)骨髓亞群是血管生成因子 的來(lái)源，而且已知單核細(xì)胞分泌各種這類因子。因此，存在這樣的可 能性，即骨髓細(xì)胞以旁分泌方式起作用，在側(cè)支血管形成時(shí)補(bǔ)充EPC 的作用，并與宿主免疫系統(tǒng)相互作用。
雖然尚不清楚在該系統(tǒng)中運(yùn)行的確切機(jī)制，但是就理解功能性骨
64髓細(xì)胞的性質(zhì)而言，已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步。對(duì)于鑒定如本發(fā)明細(xì)胞 所提供的骨髓內(nèi)的活性骨髓群，可就有關(guān)機(jī)制提出一些啟示。髓樣細(xì) 胞，特別是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，建立了通過(guò)分泌血管生成生長(zhǎng)因子 來(lái)影響血管生長(zhǎng)的能力。此外，巨噬細(xì)胞顯示比其它細(xì)胞類型更耐受 低氧，并通過(guò)分泌血管生成因子響應(yīng)低氧條件。因此，將骨髓祖細(xì)胞 引入缺血視網(wǎng)膜，可提供可以經(jīng)得起低氧條件并可以旁分泌方式促進(jìn)
血管修復(fù)的細(xì)胞。在OIR視網(wǎng)膜中，宿主衍生的F4/80+血管周圍細(xì)胞 的存在表明這類細(xì)胞在該過(guò)程中具有作用，或許是通過(guò)直接移植到眼 內(nèi)遞送大量同樣的細(xì)胞(或其祖細(xì)胞)，加強(qiáng)了這一作用。這個(gè)設(shè)想突 出了如本研究所觀察的似是而非的結(jié)果，即注射本發(fā)明的細(xì)胞群促進(jìn) 視網(wǎng)膜的血管重建而抑制視網(wǎng)膜前新血管形成。雖然尚未完全了解其 基礎(chǔ)，但是很有可能是"生理性"血管重建加速可降低視網(wǎng)膜所經(jīng)歷 的低氧，使得缺血刺激的新血管簇在同 一程度上無(wú)法形成。
髓樣細(xì)胞支持血管生長(zhǎng)的設(shè)想可能與有關(guān)rdl和rdlO視網(wǎng)膜變性 小鼠模型的一些早期研究有關(guān)。注射骨髓祖細(xì)胞可能通過(guò)分泌的因子 起維持深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的作用，并防止在這些模型中所觀察到的 血管變性。研究還證實(shí)， 一些巨噬細(xì)胞分泌的血管生成因子(例如bFGF) 也具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。因此，在rd小鼠中注射本發(fā)明的細(xì)胞群時(shí)觀察 到的光感受器死亡減少可能是通過(guò)旁分泌機(jī)制介導(dǎo)的，其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子通過(guò)移植的骨髓衍生髓樣細(xì)胞產(chǎn)生。為了支持這個(gè)機(jī)制，本研究 表明本發(fā)明分離的MLBM細(xì)胞群能夠有效地拯救rd模型的血管和神 經(jīng)元，其功效與注射分離MLBM細(xì)胞觀察到的相似。
在用于ROP臨床治療時(shí)，在高危早產(chǎn)兒出生時(shí)收獲胎臍帶血細(xì) 胞，然后分選出富含介導(dǎo)拯救效果的特定亞群的細(xì)胞，然后將這些自 體祖細(xì)胞注射到嬰兒眼內(nèi)。
使用細(xì)胞療法現(xiàn)時(shí)最主要的限制之一是在許多情況下尚不清楚 其作用的確切分子機(jī)制的事實(shí)，實(shí)際上，這些機(jī)制在模型之間可以不 相同。然而，這實(shí)際上可能是基于細(xì)胞療法的最大優(yōu)勢(shì)，也就是說(shuō)以不同的方式用大量組成成分對(duì)變化的條件和信號(hào)作出反應(yīng)的能力。這 不僅僅在不同實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和攻擊之間屬實(shí)，而且在一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)在時(shí)間上 也如此。換句話說(shuō)，這類細(xì)胞可能在一時(shí)間點(diǎn)上分泌某些因子，而在 其它時(shí)間點(diǎn)上分泌不同的因子，最終，如果需要它們消退，則可完全 停止起作用。這是現(xiàn)有基于化學(xué)的藥物療法無(wú)法做到的，而且根據(jù)的 是細(xì)胞從根本上利用和響應(yīng)反饋的事實(shí)。在本研究中觀察到的移植細(xì) 胞內(nèi)細(xì)胞標(biāo)記的體內(nèi)修飾支持這個(gè)觀點(diǎn)。
實(shí)施例16. MLBM細(xì)胞分化成具有小膠質(zhì)細(xì)胞特征的細(xì)胞。
在注射CD44HI細(xì)胞后對(duì)^L網(wǎng)膜的分析表明，骨髓細(xì)胞CD44^群 注射到眼睛后分化成d、膠質(zhì)細(xì)胞。d、膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的定居骨髓 群(resident myeloid population),表達(dá)特有的標(biāo)記，包才舌CDllb和 F4/80。這些細(xì)胞還可通其分支形態(tài)并且呈現(xiàn)血管周圍定位來(lái)加以區(qū) 分。在注射到眼睛后的不同時(shí)間，對(duì)CD44^細(xì)胞的定位、形態(tài)和表 面標(biāo)記表達(dá)進(jìn)行了分析。觀察到注射的CD44H1 GFP+細(xì)胞具有所述的 內(nèi)源視網(wǎng)膜小月嫌細(xì)胞的所有特征(圖45)。圖45中的圖A和圖B顯 示，注射的CD44W細(xì)胞表達(dá)CDllb和F4/80,具有與內(nèi)源小膠質(zhì)細(xì)胞 相似的形態(tài)和血管周圍定位。圖C提供表明注射的CD44^細(xì)胞定位 于血管周圍區(qū)的3D成像分析。圖D顯示高放大倍數(shù)視野下觀察的注 射CD44^細(xì)胞的形態(tài)。
實(shí)施例17.通過(guò)負(fù)選擇法分離MLBM細(xì)胞。
為了實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用，需要注射無(wú)表面結(jié)合的篩選成分(例如抗 體和/或磁珠)的細(xì)胞。達(dá)到這個(gè)目的的一種方法是利用負(fù)選擇策略來(lái) 分離CD44^細(xì)胞。通過(guò)本文所述的CD44^和CD44^細(xì)胞群表面標(biāo) 記表達(dá)譜的表征，發(fā)現(xiàn)了 CD44LQ細(xì)胞具有高表達(dá)的Terl19和 CD45RB220，它們分別為類紅細(xì)胞(erythroid cell)和B細(xì)胞的標(biāo)記?？?這些標(biāo)記的抗體，加上T細(xì)胞標(biāo)記CD3e，有效地標(biāo)記CD44^群，供通過(guò)磁分離或FACS分離將其除去，留下"未觸及的(untouched)" CD44^細(xì)胞作為產(chǎn)物。用該策略通過(guò)FACS分離的細(xì)胞具有典型的本 發(fā)明MLBM細(xì)胞群的功能特征(圖46)。
圖46中的圖A顯示使用對(duì)CD45R/B220、 TER119和CD3e有選 擇性的抗體通過(guò)MACS耗盡小鼠骨髓產(chǎn)生CD44^細(xì)胞為90%以上的 細(xì)胞群。圖B顯示陰性部分(CD44^群)基本上不含CD45R/B220、 TER119和CD3e細(xì)胞。圖C顯示負(fù)選擇法選出的CD44HI細(xì)胞保留視 網(wǎng)膜尋靶和分化能力。
實(shí)施例18.低氧誘導(dǎo)因子la (HIF-la)表達(dá)對(duì)于低氧誘導(dǎo)的血管損傷 的修復(fù)十分重要。
HIF-1 a是經(jīng)深入研究的細(xì)胞對(duì)低氧條件反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑和血管生 成基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑，它調(diào)節(jié)在血管修復(fù)中具有潛在作用的多個(gè)基因的 轉(zhuǎn)錄，包括VEGF、 IGF、 TGF-a和其它基因。C57BL/6J小鼠中HIF-la 轉(zhuǎn)錄因子的定向缺失通過(guò)雜交形成由溶菌酶M啟動(dòng)子(lysMcre)驅(qū)動(dòng) 的cre表達(dá)本底而產(chǎn)生，這允許該因子在骨髓譜系中的特定缺失。我 們按照本文所述方法，從這些小鼠的骨髓分離出CD44^骨髓祖細(xì)胞， 并且當(dāng)在P7時(shí)移植時(shí)，與得自野生型小鼠的CD44HI細(xì)胞相比較，對(duì) 它們?cè)贠IR模型中促進(jìn)血管修復(fù)的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。重要的是，在表 面標(biāo)記表達(dá)或光散射特性方面，發(fā)現(xiàn)從骨髓特有HIF-la敲出品系和 野生型品系分離的CD44"細(xì)胞之間沒(méi)有差異。然而，HIF-la缺陷型 細(xì)胞不能促進(jìn)修復(fù)，而野生型細(xì)胞明顯加快血管修復(fù)(圖47)。該發(fā)現(xiàn) 進(jìn)一步表明，髓樣細(xì)胞組成介導(dǎo)血管修復(fù)的活性細(xì)胞群，因?yàn)樵谠撉?除品系中HIF-la基因表達(dá)被抑制是骨髓i普系細(xì)胞特有的。預(yù)期所有 其它骨髓衍生細(xì)胞均保留正?；钚?。
實(shí)施例19.小膠質(zhì)細(xì)胞參與視網(wǎng)膜血管重建。
視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在歷史上一直被視作響應(yīng)炎癥和感染的免疫活性細(xì)胞，它吞噬正常發(fā)育重建或變性疾病期間所產(chǎn)生的碎片。小膠 質(zhì)細(xì)胞在促進(jìn)視網(wǎng)膜血管形成中的作用 一直沒(méi)有清楚地描述過(guò)。本研 究證實(shí)表達(dá)骨髓祖細(xì)胞表面標(biāo)記的成體骨髓衍生細(xì)胞可以分化成小 膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)血管系統(tǒng)在低氧損傷后加快恢復(fù)。這個(gè)過(guò)程是
HIF-1 a依賴性的并且描述了骨髓祖細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管生成中的新作用。 移植的骨髓衍生骨髓祖細(xì)胞在OIR模型中分化成小膠質(zhì)細(xì)胞并 促進(jìn)中心視網(wǎng)膜血管重建和修復(fù)，根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在正常 發(fā)育期間促進(jìn)和維持視網(wǎng)膜血管形成中起重要作用是顯而易見(jiàn)的。對(duì) 于OIR小鼠模型，C57BL/6J小鼠是最普遍使用的品系，因?yàn)樗煽?地提供顯著的血管消失和視網(wǎng)膜前血管簇形成。相比之下，BALB/cByJ 品系在相同條件下不形成可評(píng)價(jià)程度的視網(wǎng)膜前血管簇，而且在回復(fù) 到常氧之后，在高氧期間觀察到的中心血管消失非常迅速地重建血管 (圖48中的圖a)。由于這些差異的^f艮本原因不明，因此對(duì)這兩個(gè)品系 在視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中的差異進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)與C57BL/6J小 鼠相比，在48小時(shí)缺血/缺氧期間，BALB/cByJ小鼠中血管消失的中 心視網(wǎng)膜內(nèi)保持有較大量的小膠質(zhì)細(xì)胞(圖48中的圖b、圖c)。這個(gè) 結(jié)果表明BALB/cByJ品系通過(guò)在修復(fù)期內(nèi)源視網(wǎng)膜小月M細(xì)胞的存 在增加而受部分保護(hù)免于視網(wǎng)膜病。雖然不希望受理論的束縛，但是 骨髓衍生的骨髓祖細(xì)胞移植到C57BL/6J小鼠可替代和/或增強(qiáng)這個(gè)品 系中存在的較少的內(nèi)源小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，導(dǎo)致修復(fù)作用與未注射 BALB/cByJ小鼠中觀察到的類似。
為了進(jìn)一步研究OIR模型中參與血管修復(fù)的機(jī)制，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞 在正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育中的作用進(jìn)行了研究。這通過(guò)用荷載氯膦酸鹽 的脂質(zhì)體操縱小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述脂質(zhì)體被吞噬細(xì)胞(例如巨噬 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)選擇性吸收并誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞凋亡。采用標(biāo)記的脂質(zhì) 體來(lái)證實(shí)這些實(shí)驗(yàn)中小膠質(zhì)細(xì)胞攝取的特異性，注射后4天，唯獨(dú)發(fā) 現(xiàn)所述脂質(zhì)體共定位于CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)(圖48中的圖e插圖)。 血管細(xì)胞或其它CDllb—細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物質(zhì)。在P5時(shí)經(jīng)玻璃體腔注射荷載氯膦酸鹽的脂質(zhì)體，在P8進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，所述脂質(zhì)體引起小
膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著減少，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。觀察到在解 剖方面與氯膦酸鹽介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞死亡面積相關(guān)的大量毛細(xì)血管
消失，這就表明小膠質(zhì)細(xì)胞是新血管發(fā)育和/或維持所必需的(圖48中 的圖d)。
同樣，在P2時(shí)注射荷載氯膦酸鹽的脂質(zhì)體，當(dāng)在P6與接受對(duì)照 荷載PBS的脂質(zhì)體的另側(cè)目M目比時(shí)，引起血管化視網(wǎng)膜面積減少28% (n二6)(圖48中的圖e)。由于血管網(wǎng)層密度的明顯差異，所以還比較了 血管總面積，用氯膦酸鹽脂質(zhì)體治療的總面積減少41%。這些結(jié)果表 明小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于未成熟血管維持以及在視網(wǎng)膜發(fā)育期間新血管的 生長(zhǎng)都十分重要。
實(shí)施例20.人MLBM CD44HI細(xì)胞。
涉及小鼠髓樣骨髓細(xì)胞群的發(fā)現(xiàn)還可延伸到人細(xì)胞。 從人骨髓中分離出髓樣細(xì)胞群。分離細(xì)胞是CD44m表達(dá)細(xì)胞并 且還表達(dá)CDlla、 CDllb、 CDllc、 CD14、 CD33和CD46 (圖49和 圖51)。就流式細(xì)胞術(shù)的光散射而言，人CD44^細(xì)胞具有類似于小鼠 CD44HI細(xì)胞的物理性質(zhì)(圖50)。例如，細(xì)胞皆同時(shí)表達(dá)CD44和 CDllb。人CD44^群不同于小鼠的是CD44^細(xì)胞的組分似乎為淋巴 細(xì)胞，而在小鼠骨髓中，CD44HI細(xì)胞全部是骨髓細(xì)胞。為了獲得盡可 能與之前研究的小鼠細(xì)胞十分相似的人細(xì)胞群，從耗盡淋巴細(xì)胞的人 骨髓中分離出CD44HJ群。這些人骨髓細(xì)胞有效減輕小鼠OIR模型的 血管病理(圖52)。
然后，解決了活性細(xì)胞是否存在于外周血的問(wèn)題。首先，采用抗 CD14抗體從外周血中分離出單核細(xì)胞。從中選出這些細(xì)胞是因?yàn)榈?自骨髓的CD44HI細(xì)胞含有單核細(xì)胞作為主要組分。采用抗CD33抗體 從外周血選出髓樣細(xì)胞。在紅細(xì)胞(rbc)溶解后，對(duì)人外周血中與CD44 共表達(dá)的抗原進(jìn)行了分析(圖53)。對(duì)于CD14是正選擇的，以及對(duì)于CD33也是正選擇的CD44m細(xì)胞群均在小鼠OIR模型中具有功效(圖
54) 。這些細(xì)胞還表達(dá)CDllb。
根據(jù)細(xì)胞獨(dú)特的物理性質(zhì)采用細(xì)胞篩選方法。流式細(xì)胞術(shù)能夠測(cè) 量細(xì)胞大小和細(xì)胞粒度，可被用作篩選特殊細(xì)胞群的方法。在這種情 況下，在紅細(xì)胞用氧化銨溶解后，僅用光散射而無(wú)需使用任何選擇劑 (即抗體)便可選出單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。類似于CD44HI細(xì)胞的細(xì)胞群(它 含有單核細(xì)胞和粒細(xì)胞作為主要組分)可按這種方式從外周血產(chǎn)生(圖
55) 。發(fā)現(xiàn)在小鼠OIR模型中，這些細(xì)胞減少血管消失和新血管形成。 同樣發(fā)現(xiàn)單獨(dú)分離的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞在OIR模型中具有功效(圖
56) 。
實(shí)施例21. CD14+人臍帶血細(xì)胞。
人臍帶血是造血集落形成細(xì)胞(hematopoietic colony-forming cell) 或干細(xì)胞(HCFC或HSC)的豐富來(lái)源。若干臨床研究證實(shí)了得自臍帶 和胎盤的血液含有足夠量的干細(xì)胞以重建經(jīng)輻射燒蝕的骨髓。
起源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)在缺血組織的新血管形成中以及 在損傷血管的再內(nèi)皮化(re-endothelialization)中發(fā)揮作用。
我們發(fā)現(xiàn)人臍帶血造血祖細(xì)胞包含能夠在缺血和/或變性部位摻 入視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群，并且有助于拯救功能性血 管。大部分細(xì)胞表達(dá)CD44，約97。/。的細(xì)胞表達(dá)CDllb。已將體外增 殖的細(xì)胞和它們的內(nèi)皮子代注射到經(jīng)歷氧誘導(dǎo)缺血的免疫缺陷型 SCID小鼠玻璃體腔。應(yīng)用菲可(Ficoll)密度離心法獲得人臍帶血單核 細(xì)胞。將未經(jīng)篩選的人臍帶血的單核細(xì)胞接種到纖連蛋白包被的培養(yǎng) 物中。
4天后在體外形成具有內(nèi)皮細(xì)胞(EC)形態(tài)的集落。內(nèi)皮祖細(xì)胞集 落呈多層扁平的薄細(xì)胞，從中央圓形細(xì)胞團(tuán)輻射出來(lái)。
第7天，在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的EPC呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞集落形態(tài)， 由具有扁平紡錘樣形態(tài)的薄細(xì)胞組成，從圓形/多角形細(xì)胞團(tuán)輻射出來(lái)。伸長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形成分散的集落或密實(shí)堆集的細(xì)胞束。第13天， 培養(yǎng)的EPC同樣分化成EC (圖57)。
為了證實(shí)內(nèi)皮特征，用針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體2 (VEGFR2)和CD31的抗體進(jìn)行了間接免疫染色。核用4'-6-二脒基-2-苯基吲咪-2HCl染色(圖58、圖59)。
將新鮮得到的置于培養(yǎng)物中7天的分化的臍帶血或人臍帶血細(xì)胞 注射到OIR模型小鼠的玻璃體腔。注射新鮮臍帶血單核(CBMN)細(xì)胞 或置于培養(yǎng)物中7天的分化細(xì)胞后，對(duì)血管消失面積(黃色)和新血管 簇形成面積進(jìn)行了分析，并將血管拯救與注射PBS的血管拯救進(jìn)行了 比較(圖60和圖61)。新鮮CBMN細(xì)胞用eGFP慢病毒表達(dá)進(jìn)行了鑒 定(圖62)。
在人臍帶血單核細(xì)胞中鑒定出表達(dá)CD14的單核細(xì)胞群。將通過(guò) MACS分離的新鮮CD14陽(yáng)性細(xì)胞(純度98%)注射到OIR模型小鼠的 玻璃體腔。我們對(duì)血管消失面積和簇形成面積進(jìn)行了分析。如圖63 所示，與PBS注射相比，注射細(xì)胞明顯誘導(dǎo)血管杏S救。
在不偏離本發(fā)明新特征的精神和范圍的情況下，可以對(duì)上述實(shí)施 方案進(jìn)行多種變動(dòng)和修改。對(duì)于本文所說(shuō)明的具體實(shí)施方案，不得或 不應(yīng)當(dāng)推斷出有任何限制。
7權(quán)利要求
1.一種分離髓樣細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含大多數(shù)表達(dá)CD44抗原、CD11b抗原和低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群通過(guò)包括以下 步驟的方法產(chǎn)生從哺乳動(dòng)物中分離出骨髓，從骨髓中正向選出與選 自抗CD44抗體、抗CD1 lb抗體及其組合的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求1的分離髓樣骨髓細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞還表達(dá) CD204、 CD114、 CD33和CD115。
4. 權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群，其中在所述細(xì)胞群中至少約 75%的細(xì)胞表達(dá)CD44。
5. 權(quán)利要求1的分離髓樣骨髓細(xì)胞群，其中在所述細(xì)胞群中至少 約卯％的細(xì)胞表達(dá)CD44。
6. 權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是鼠細(xì)胞。
7. 權(quán)利要求6的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群基本上不含 TER-119表達(dá)細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求1的分離髓樣骨髓細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
9. 一種在低氧視網(wǎng)膜組織中重建和穩(wěn)定功能性血管系統(tǒng)的方法， 該方法包括使低IU見(jiàn)網(wǎng)膜組織與有效量的權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞 群的細(xì)胞接觸。
10. —種在抑制異常視網(wǎng)膜前血管形成的同時(shí)促進(jìn)低氧視網(wǎng)膜組 織的生理性視網(wǎng)膜內(nèi)血管形成的方法，該方法包括使低氧視網(wǎng)膜組織 與有效量的權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群的細(xì)胞接觸。
11. —種在低氧視網(wǎng)膜組織中促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞形成的方法，該方 法包括使低氧視網(wǎng)膜組織與有效量的權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群的 細(xì)胞，接觸。
12. —種分離的轉(zhuǎn)染髓樣細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含大多數(shù)表達(dá) CD44抗原、CDllb抗原和低氧誘導(dǎo)因子la(HIF-la)的細(xì)胞，所述細(xì)胞被有效編碼抗血管生成肽的基因轉(zhuǎn)染。
13. 權(quán)利要求12的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群通過(guò)包括以 下步驟的方法產(chǎn)生從哺乳動(dòng)物中分離出骨髓，從骨髓中正向選出與 選自抗CD44抗體、抗CD1 lb抗體、抗CD33抗體及其組合的抗體發(fā) 生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求12的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞還表達(dá) CD204、 CD114、 CD33和CD115。
15. 權(quán)利要求12的分離髓樣細(xì)胞群，其中在所述細(xì)胞群中至少約 75%的細(xì)胞表達(dá)CD44。
16. 權(quán)利要求12的分離髓樣骨髓細(xì)胞群，其中在所述細(xì)胞群中至 少約90%的細(xì)胞表達(dá)CD44。
17. —種分離的轉(zhuǎn)染髓樣細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含大多數(shù)表達(dá) CD44抗原、CDllb抗原和低氧誘導(dǎo)因子la(HIF-la)的細(xì)胞，所述細(xì) 胞被有效編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分的基因轉(zhuǎn)染
18. 權(quán)利要求17的分離的轉(zhuǎn)染髓樣細(xì)胞群，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成 分選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 蛋白-5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰 島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和腦衍生神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子。
19. 權(quán)利要求17的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群通過(guò)包括以 下步驟的方法產(chǎn)生從哺乳動(dòng)物中分離出骨髓，從骨髓中正向選出與 選自抗CD44抗體、抗CD1 lb抗體及其組合的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì) 胞。
20. 權(quán)利要求17的分離髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞還表達(dá) CD204、 CD114、 CD33和CD115。
21. 權(quán)利要求17的分離髓樣細(xì)胞群，其中在所述細(xì)胞群中至少約 75。/。的細(xì)胞表達(dá)CD44。
22. 權(quán)利要求17的分離髓樣細(xì)胞群，其中在所述細(xì)胞群中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)CD44。
23. 權(quán)利要求l的髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞還表達(dá)CD14。
24. 權(quán)利要求l的髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是人骨髓細(xì)胞。
25. 權(quán)利要求1的髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)月包是人外周血細(xì)胞。
26. 權(quán)利要求1的髓樣細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是人臍帶血細(xì)胞。
27. —種制備權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群的方法，該方法包括 從骨髓中正向選出與選自抗CD44抗原的抗體、抗CDllb抗體、抗 CD33抗體及其組合的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
28. —種制備權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群的方法，該方法包括 從人外周血中正向選出與選自抗CD44抗原的抗體、抗CD 11 b抗體、 抗CD33抗體及其組合的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
29. —種制備權(quán)利要求1的分離髓樣細(xì)胞群的方法，該方法包括 從人臍帶血中正向選出與選自抗CD44抗原的抗體、抗CD lib抗體、 抗CD33抗體及其組合的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離髓樣細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含大部分為譜系陰性并且同時(shí)表達(dá)CD44抗原、CD11b抗原和低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的細(xì)胞。這些細(xì)胞當(dāng)經(jīng)眼內(nèi)給予哺乳動(dòng)物眼睛時(shí)，特別是給予患有眼部變性疾病的哺乳動(dòng)物時(shí)，具有有益的血管營(yíng)養(yǎng)活性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。通過(guò)用抗CD44(透明質(zhì)酸受體)、抗CD11b、CD14、CD33或抗其組合的抗體處理骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞或臍帶細(xì)胞來(lái)分離出髓樣細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞術(shù)從中正向選出表達(dá)CD44和/或CD11b的細(xì)胞。本發(fā)明的分離髓樣骨髓細(xì)胞可以用編碼治療上有益的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)染，以將該基因遞送到視網(wǎng)膜。
文檔編號(hào)A01N63/00GK101594781SQ200780050008
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月16日
發(fā)明者M·R·里特, M·弗里蘭德, S·K·莫爾諾, V·馬徹蒂 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院