專利名稱：新型選擇性標記基因的制作方法
專利說明新型選擇性標記基因
背景技術：
選擇性標記是一種可以檢測的遺傳性狀或能夠被鑒定和追蹤的DNA區(qū)段(segment)。標記基因通常充當另一基因(有時稱為靶基因)的標志(flag)。標記基因通常與用于轉(zhuǎn)化靶細胞的靶基因一起使用。以可遺傳的方式接納靶基因的靶細胞能夠通過選擇也表達標記基因的細胞來鑒定。標記基因與靶基因足夠接近，因而所述兩個基因(標記基因和靶基因)在遺傳上連鎖并且通常一起遺傳。目前選擇性標記的標準是“pat”基因，其編碼稱為膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶。
谷氨酰胺合成酶(“GS”)在許多植物中是植物細胞發(fā)育和生活的關鍵酶。GS將谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺。GS還參與氨同化和氮代謝。GS參與了在大多數(shù)植物中用于解毒由硝酸還原釋放的氨的途徑中。因此，GS的強力抑制劑對于植物細胞的毒性非常大。分解或修飾植物內(nèi)的除草劑能夠?qū)е驴剐浴?br> 基于植物中因抑制GS而產(chǎn)生的毒性作用，開發(fā)了一類特殊的除草劑。雙丙氨酰膦(Bialaphos)和膦絲菌素是兩個這樣的作用于GS的抑制劑并且擁有出色的除草性質(zhì)。這兩種除草劑是非選擇性的；它們抑制土壤上存在的全部不同種類植物的生長，因此引起對它們的整體破壞。
雙丙氨酰膦也是一種廣譜除草劑。雙丙氨酰膦由膦絲菌素(PPT或PTC；2-氨基-4-甲基膦基丁酸)、L-谷氨酸類似物和兩個L-丙氨酸殘基組成。因此PPT和雙丙氨酰膦之間的結構差異在于PPT缺少兩個丙氨酸氨基酸。通過胞內(nèi)肽酶將雙丙氨酰膦的L-丙氨酸殘基去除的情況下，則釋放PPT。PPT是GS的有利抑制劑。在植物中通過PPT對GS的抑制引起氨的迅速積累和植物細胞的死亡。
雙丙氨酰膦最初被披露具有抗生素特性，這使得它能夠用作殺蟲劑或殺真菌劑。美國專利第3,832,394號涉及培養(yǎng)吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，和從它的培養(yǎng)基回收雙丙氨酰膦。然而，其它菌株，例如綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，也產(chǎn)生這種化合物。其它含有PPT模塊(moiety)的三肽抗生素也已知存在于自然界中，例如磷丙氨菌素(phosalacin)。PPT也是通過化學合成獲得的并且進行商業(yè)銷售。
產(chǎn)雙丙氨酰膦的吸水鏈霉菌和綠色產(chǎn)生鏈霉菌受到具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的保護而不受PPT毒性影響。Plant Physiol，April 2001，Vol.125，pp.1585-1590(“Expression of bar in the Plastid Genome Confers HerbicideResistance，”Lutz等)。產(chǎn)生這些抗生素的鏈霉菌屬菌種(Streptomyces species)本身會受到破壞，如果它們不具有針對這些抗生素的自我防御機制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種自我防御機制在多種情況下包含能夠抑制抗生素作用的酶。
膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶由bar(雙丙氨酰膦抗性；Thompson等，1987)或pat(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶；Strauch等，1988)基因編碼，并且通過乙?；疨PT的游離氨基來解毒PPT。由這兩種基因編碼的酶功能上相同并且在氨基酸水平顯示85％同一性(Wohlleben等，1988；Wehrmann等，1996)。已經(jīng)通過自核基因在胞質(zhì)中表達嵌合的bar或pat基因獲得了PPT抗性作物。已經(jīng)通過在煙草(煙草栽培種Petit Havana(Nicotiana tabacum cv Petit Havana))、馬鈴薯、歐洲油菜(Brassica napus)、甘藍(Brassica oleracea)(De Block等，1987；De Block等，1989)、玉米(Spencer等，1990)和稻(Cao等，1992)中直接選擇PPT抗性獲得了除草劑抗性品系。
在天藍色鏈霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)中鑒定了與hrdDσ因子基因相鄰的一個基因(bar)。預測的bar產(chǎn)物與產(chǎn)生雙丙氨酰膦的綠色產(chǎn)色鏈霉菌和吸水鏈霉菌的pat和bar基因的產(chǎn)物分別顯示了32.2％和30.4％的同一性。當處于高拷貝數(shù)載體上克隆入天藍色鏈霉菌中時，天藍色鏈霉菌bar基因賦予對雙丙氨酰膦的抗性。Bedford等，Gene，1991 Jul 31；104(1)39-45，“Characterization of a gene conferring bialaphos resistance in StreptomycescoelicolorA3(2).”。在其它微生物中異源表達這種基因，或?qū)⑦@種基因轉(zhuǎn)化入植物，迄今為止尚無報導。
除草劑抗性性狀的用途參見DE 3642 829A和美國專利第5,879,903號(以及5,637,489；5,276,268；和5,273,894)，其中pat基因分離自綠色產(chǎn)色鏈霉菌。WO 87/05629和美國專利第5,648,477號(以及5,646,024和5,561,236)涉及使用來自吸水鏈霉菌的bar基因用于保護植物細胞和植物免于谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如PPT)的用途和植物中除草劑抗性的開發(fā)。將編碼對除草劑BASTA(Hoechst膦絲菌素)或Herbiace(Meiji Seika雙丙氨酰膦)的抗性的基因通過農(nóng)桿菌感染導入煙草(煙草栽培種Petit Havan SR1)、馬鈴薯(馬鈴薯栽培種Benolima(Solanum tuberosum cv Benolima))和番茄(番茄(Lycopersicum esculentum))植物中，并且賦予了除草劑抗性。


發(fā)明內(nèi)容
主題的發(fā)明涉及在此稱為DSM-2的新基因。這種基因是在天藍色鏈霉菌(A3)中鑒定的。DSM-2蛋白與PAT和BAR的關系較遠。主題的發(fā)明還提供按植物優(yōu)化的編碼DSM-2蛋白的基因。DSM-2可以用作轉(zhuǎn)基因性狀以在微生物、植物細胞和植物中賦予對除草分子和抗菌分子、草銨膦(glufosinate)、膦絲菌素和/或雙丙氨酰膦的耐受。
轉(zhuǎn)化入擬南芥(Arabidopsis)允許以高比例回收草銨膦。一旦導入，DSM-2基因能夠提供有效的選擇(significant selection)和整株植物抗性。
主題的基因僅作為用于生物技術工程的選擇性標記就具有高固有價值。在一些優(yōu)選的實施方案中，主題的基因可以用作標記用于選擇培養(yǎng)物中成功轉(zhuǎn)化的細胞，和溫室及田地中成功轉(zhuǎn)化的整株植物。這種基因和相似的同源物可以代替pat和/或bar使用。
在細菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中使用這種基因作為選擇性標記能夠增加對所有植物的轉(zhuǎn)化的效率。使用DSM-2作為單一的選擇標記消除了克隆過程中對額外的藥用抗生素標記(例如氨芐青霉素抗性)的需求。
根據(jù)主題的發(fā)明還可能有多種其它用途。DSM-2可用作轉(zhuǎn)基因性狀以賦予植物對除草劑草銨膦和雙丙氨酰膦的耐受。
這種基因也可以連同經(jīng)修飾的農(nóng)桿菌屬菌株(Agrobacterium strain)用作一種新型植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎。用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生并且納入了非藥用抗生素抗性標記基因的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的新菌株或其它的微生物菌株也可以按照主題的發(fā)明產(chǎn)生。通過免去片段純化遠離藥用抗生素抗性元件來改進克隆和轉(zhuǎn)化的方法及效率也可能是一個好處。
除了除草劑耐受作物(HTC)性狀，使用除草劑用于控制雜草的方法也在主題的發(fā)明的范圍之內(nèi)，其中對于該除草劑已通過主題的基因在轉(zhuǎn)基因作物中產(chǎn)生了耐受。主題的HTC性狀的組合在與其它HTC性狀(包括但不限于草甘膦耐受和2，4-D耐受)組合時也是有益的，特別是用于控制新近獲得除草劑(例如草甘膦)抗性或?qū)Τ輨?例如草甘膦)固有耐受的物種。另外，當將草甘膦耐受作物(其在全世界變得越來越流行)與另外的草甘膦耐受作物輪種時，控制草甘膦抗性的自生作物(volunteer)可能是困難的。因此，使用疊加的或單獨轉(zhuǎn)化入作物的這些轉(zhuǎn)基因性狀可以提供一種對其它HTC自生作物進行控制的工具。
附圖簡述


圖1顯示通過由DSM2介導的N-乙?；共蒌@膦失活。
序列簡述 SEQ ID NO1是天然DSM-2序列。
SEQ ID NO2是天然蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO3是Hemicot DSM-2(v2)序列。
SEQ ID NO4是重建的(Rebuilt)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO5是Pat PTU引物(MAS123)。
SEQ ID NO6是Pat PTU引物(Per 5-4)。
SEQ ID NO7是Pat編碼區(qū)引物 SEQ ID NO8是Pat編碼區(qū)引物 SEQ ID NO9是DSM-2(v2)編碼區(qū)引物 SEQ ID NO10是DSM-2(v2)編碼區(qū)引物 發(fā)明詳述 主題的發(fā)明涉及在此稱作DSM-2的新基因。這種基因是在天藍色鏈霉菌(A3)中鑒定的。DSM-2蛋白與PAT和BAR的關系較遠(分別具有30和28％氨基酸同一性)。主題的發(fā)明還提供按植物優(yōu)化的編碼DSM-2蛋白的基因，例如具有hemicot偏好(hemicot bias)。DSM-2可以用作轉(zhuǎn)基因性狀以在植物和植物細胞中賦予對除草劑草銨膦、膦絲菌素和/或雙丙氨酰膦的耐受。
主題的基因僅作為用于生物技術工程的選擇性標記就具有高固有價值。然而，按照主題的發(fā)明還可以有多種其它用途。
DSM-2可以用作轉(zhuǎn)基因性狀以賦予植物對除草劑草銨膦、膦絲菌素和/或雙丙氨酰膦的耐受。
在一些優(yōu)選的實施方案中，(與除草劑耐受作物-HTC不同(separatefrom)或在除草劑耐受作物-HTC之外)，作為選擇性標記用于在培養(yǎng)物、溫室和田地中選擇成功轉(zhuǎn)化的細胞和整株植物。這種基因和相似的同源物可以代替pat和/或bar使用。此處例舉的一個實施方案是在NT-1煙草細胞中使用DSM-2作為選擇性標記。主題的基因也可以在其它植物系統(tǒng)例如玉米(corn)和稻中用作選擇性標記。
在細菌系統(tǒng)中使用這種基因作為選擇性標記能夠增加對所有植物的轉(zhuǎn)化的效率。使用DSM-2作為單一的選擇標記消除了克隆過程中對額外的藥用抗生素標記(例如氨芐青霉素抗性)的需求。
實驗證明了大腸桿菌細胞系BL21-Star(DE3)(Invitrogen目錄號#C6010-03)在含有濃度為100μg/ml的草銨膦銨(Basta)的基本培養(yǎng)基上受到抑制。DSM-2在BL21 Star細胞系中的表達補足了在含有400μg/ml草銨膦的基本培養(yǎng)基上的抗性。這些實驗說明DSM-2的表達可以用作非藥用抗生素選擇性標記在受草銨膦抑制的細菌中用于克隆應用。
進一步的實驗證實植物啟動子擬南芥(Arabidopsis thaliana)PolyUbiquitin 10(At Ubi10)和病毒啟動子木薯葉脈花葉病毒(Cassava VeinMosaic Virus(CsVMV))在大腸桿菌菌株BL21-Star(DE3)中有功能。兩種啟動子均表達充足的DSM-2蛋白以提供對含200μg/ml草銨膦的基本培養(yǎng)基的抗性。這些植物啟動子可以用于在大腸桿菌中驅(qū)動DSM-2作為非藥用抗性選擇性標記的表達。單一植物啟動子在細菌和植物二者中的功能性消除了針對每個物種需要單獨的選擇性標記的需求。
這種基因也可以連同經(jīng)修飾的農(nóng)桿菌屬菌株用作新型植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎。使用非藥用抗生素抗性標記基因用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的熒光假單胞菌新菌株或其它的微生物菌株也可以按照主題的發(fā)明產(chǎn)生。通過免去片段純化、遠離藥用抗生素抗性元件來改進克隆和轉(zhuǎn)化的方法及效率也可能是一個好處。
除了HTC性狀，使用除草劑用于控制雜草的方法也在主題的發(fā)明的范圍之內(nèi)，其中對于該除草劑已通過主題的基因在轉(zhuǎn)基因作物中產(chǎn)生了耐受。主題的HTC性狀的組合在與其它HTC性狀(包括但不限于草甘膦耐受和2，4-D耐受)組合時也是有益的，特別是用于控制新近獲得除草劑(例如草甘膦)抗性或?qū)Τ輨?例如草甘膦)固有耐受的物種。另外，當將草甘膦耐受作物(其在全世界變得越來越流行)與另外的草甘膦耐受作物輪種時，控制草甘膦抗性的自生作物(volunteer)可能是困難的。因此，使用疊加的或單獨轉(zhuǎn)化入作物的這些轉(zhuǎn)基因性狀可以提供一種對其它HTC自生作物進行控制的工具。
主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)(和來源分離株(source isolate))。本發(fā)明提供功能性蛋白質(zhì)?！肮δ苄曰钚浴?或“活性的”)在此是指用于主題的發(fā)明的用途的蛋白質(zhì)/酶具有降解或減少除草劑活性的能力(單獨或與其它蛋白質(zhì)組合)。產(chǎn)生主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)的植物將優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的所述蛋白質(zhì)，從而當用除草劑處理該植物時，蛋白質(zhì)表達的水平足以使植物完全或部分地抗所述除草劑(除非另行指定，否則按照典型的比率(rate)；例如，典型施用率(applicationrate)可以在公知的除草劑手冊(Weed Science Society of America，EighthEdition，2002)中找到)或?qū)λ龀輨┠褪?。所述除草劑可以按照一般將會殺死目標植物的頻率，按照普通田間使用頻率和濃度施用。(由于主題的發(fā)明，水平和/或濃度可以任選地高于先前使用的那些。)優(yōu)選地，主題的發(fā)明的植物細胞和植物受到針對由除草劑處理引起的生長抑制或損傷的保護。如本文所討論的，優(yōu)選地使主題的發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和植物細胞對除草劑有抗性或耐受，意味著所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和植物細胞能夠在有效量的本文所討論的一種或多種除草劑存在下生長。主題的發(fā)明的優(yōu)選的蛋白質(zhì)具有代謝一種或多種芳氧基鏈烷酸酯/鹽(aryloxyalkanoate)化合物的催化活性。無法簡單地討論術語“抗性”，也不能使用動詞“耐受”或形容詞“耐受的”。工業(yè)上花費了無法計數(shù)的時間來爭論除草劑耐受作物(HTC)與除草劑抗性作物(HRC)。HTC是工業(yè)上優(yōu)選的術語。然而，官方的Weed Science Society of America對抗性的定義是“在曝露于一般為野生型致死劑量的除草劑之后，植物能夠存活并繁殖的遺傳性能力。在植物中，抗性可以是天然存在的或是通過如遺傳工程或?qū)M織培養(yǎng)或誘變產(chǎn)生的變體進行選擇等技術來誘導的?！庇糜诒疚某橇碛姓f明，除草劑“抗性”是可遺傳的，并且使得植物能夠在用針對給定植物的除草劑進行的典型有效除草處理(如主題的公開提交時通用的除草劑手冊版本所建議的)存在下生長。如本領域技術人員所公認的，即使因曝露于除草劑而有的某種程度的植物損傷是表觀的，植物仍然可以被認為是“抗性的”。如本文所使用，術語“耐受”比術語“抗性”更寬，并且包括如本文所定義的“抗性”，以及特定植物改進的經(jīng)受住不同程度除草劑誘導的損傷的能力，所述不同程度的損傷是在相同除草劑劑量下在相同基因型的野生型植物中產(chǎn)生的。
將功能性活性轉(zhuǎn)給植物或細菌系統(tǒng)可以包括核酸序列，其編碼主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述核酸序列整合在蛋白質(zhì)表達載體中，所述蛋白質(zhì)表達載體適合于該載體將存在于其中的宿主。獲得編碼具有功能性活性的蛋白質(zhì)的核酸序列的一種方法是，如本文所公開的，利用從蛋白質(zhì)的氨基酸序列推定的信息，從產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的細菌菌種分離天然的遺傳物質(zhì)?？梢詫⑻烊恍蛄嗅槍υ谥参镏械谋磉_進行優(yōu)化，例如，如下文將更詳細討論的。也可以基于蛋白質(zhì)序列設計優(yōu)化的多核苷酸。
表征這些蛋白質(zhì)種類和編碼它們的多核苷酸的一種方法是如下限定多核苷酸，通過所述多核苷酸在指定條件范圍內(nèi)與示例核苷酸序列(其補體和/或源自任一鏈的一個或多個探針)雜交的能力，和/或通過所述多核苷酸藉由使用源自示例序列的引物進行的PCR來擴增的能力。
有多種方法用于獲得按照主題的發(fā)明使用的蛋白質(zhì)。例如，可以使用本文公開的蛋白質(zhì)的抗體從蛋白質(zhì)的混合物鑒定和分離其它的蛋白質(zhì)。具體而言，抗體可以針對蛋白質(zhì)中最保守或與其它相關蛋白相比差別最大的部分來產(chǎn)生。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)或免疫印跡將這些抗體用于特異性地鑒定具有特征活性的等效蛋白質(zhì)。針對本文公開的蛋白質(zhì)或針對等效蛋白質(zhì)或針對這些蛋白質(zhì)的片段的抗體可以使用標準流程容易地制備。這些抗體是主題的發(fā)明的一個方面。主題的發(fā)明的抗體包括單克隆和多克隆抗體，優(yōu)選是響應于示例的或建議的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的。
得益于主題的公開，主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)和基因可以從多種來源獲得，包括例如多種微生物，例如重組的和/或野生型細菌。
細菌分離株的突變體可以通過本領域公知的流程制備。例如，不產(chǎn)芽孢的(asporogenous)突變體能夠通過對分離株進行甲基磺酸乙酯(EMS)誘變來獲得。突變體可以使用紫外線和亞硝基胍通過本領域公知的流程來制備。
“來自”或“獲得自”本文涉及或建議的任何分離株的蛋白質(zhì)是指所述蛋白質(zhì)(或類似蛋白質(zhì))可以從主題的分離株或一些其它來源獲得，例如另一細菌菌株或植物?！霸醋浴币灿羞@種含義，并且包括例如能夠從給定的為了在植物中表達而修飾的細菌類型獲得的蛋白質(zhì)。本領域技術人員將容易地認識到，假設披露了細菌基因和蛋白質(zhì)，就能夠工程改造植物使其產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)?？贵w制備物、核酸探針(例如DNA、RNA或PNA)等可以使用本文公開的多核苷酸和/或氨基酸制備，并且用于從其它(天然)來源篩選和回收其它相關基因。
可以使用標準分子生物學技術來克隆并測序本文描述的蛋白質(zhì)和基因。額外的信息可以在Sambrook等，1989中找到，將其通過引用并入本文。
多核苷酸和探針。主題的發(fā)明還提供編碼按照主題的發(fā)明使用的蛋白質(zhì)的核酸。主題的發(fā)明還提供鑒定和表征基因的方法，所述基因編碼具有期望的除草劑活性的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，主題的發(fā)明提供獨特的核苷酸序列，其可用作雜交探針和/或用于PCR技術的引物。引物產(chǎn)生的特征性基因片段可以在感興趣的特定基因的鑒定、表征和/或分離中使用。主題的發(fā)明的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)不同于先前描述的蛋白質(zhì)。
主題的發(fā)明的多核苷酸可以用于形成在期望的宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或肽的完整“基因”。例如，如本領域技術人員將輕易認識到的，在感興趣的宿主中可以適當?shù)貙⒅黝}的多核苷酸置于啟動子的調(diào)控下，如本領域中容易知曉的?；虮磉_和/或時間/組織特異性表達的水平能夠大大影響本發(fā)明的應用。通常，更高的降解基因蛋白質(zhì)表達水平將導致更快和更完整的底物降解(在這種情況下，底物是目標除草劑)。啟動子以高水平表達靶基因?qū)⑹抢硐氲?，除非高表達對植物健康有因此產(chǎn)生的負面影響。通常，人們會希望DSM-2基因在全部組織中組成型表達來對全部生長階段的植物進行完全保護。但是，人們可以代替地使用營養(yǎng)型表達的抗性基因；這將允許在耕種中使用目標除草劑用于雜草控制并且隨后將通過在開花階段中施用來控制目標作物的有性生殖。
如本領域技術人員所知，DNA通常以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。若DNA在某植物中復制(例如)，則產(chǎn)生額外的DNA互補鏈?！熬幋a鏈”在本領域中通常用于指與反義鏈結合的鏈。mRNA從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄。“有義”或“編碼”鏈具有可以作為可讀框(ORF)閱讀的一系列密碼子(一個密碼子是三個核苷酸，其能夠被讀作指定特定氨基酸的一個三個殘基的單元)，以形成感興趣的蛋白質(zhì)或肽。為了在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，DNA鏈通常轉(zhuǎn)錄成mRNA的互補鏈，其作為蛋白質(zhì)的模板使用。因此，主題的發(fā)明包括隨附的序列表中所示的示例多核苷酸和/或包括互補鏈的等效物的用途。將功能上與示例DNA分子等效的RNA和PNA(肽核酸)包括在主題的發(fā)明中。
在主題的發(fā)明的一個實施方案中，可以將細菌分離株培養(yǎng)在導致微生物高繁殖的條件下。在處理微生物以提供單鏈基因組核酸之后，可以將DNA與主題的發(fā)明的引物接觸并且進行PCR擴增。感興趣的基因的特征性片段將通過所述方法得到擴增，由此鑒定感興趣的基因的存在。
主題的發(fā)明另外的方面包括使用本文公開的方法和核苷酸序列鑒定的基因和分離株。由此鑒定的基因能夠編碼主題的發(fā)明的除草劑抗性蛋白質(zhì)。
例如，按照主題的發(fā)明使用的蛋白質(zhì)和基因可以通過使用寡核苷酸探針鑒定和獲得。這些探針是可檢測的核苷酸序列，其能夠依靠適當?shù)臉擞泚頇z測或可以使其成為固有發(fā)熒光的，如國際申請第WO 93/16094號中所述。探針(和主題的發(fā)明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U；用于RNA分子)，主題的發(fā)明的合成探針(和多核苷酸)也可以具有肌苷(一種能夠與全部四種堿基配對的中性堿基；在合成探針中有時用來代替全部四種堿基的混合物)和/或其它合成(非天然)堿基。因此，在本文提及合成的、簡并寡核苷酸，并且統(tǒng)稱使用“N”或“n”的情況下，“N”或“n”可以是G、A、T、C或肌苷。本文使用的多義密碼(ambiguity code)符合主題的申請?zhí)峤粫r的標準IUPAC命名規(guī)定(例如，R是指A或G，Y是指C或T等)。
如本領域所公知的，如果探針分子與核酸樣品雜交，那么能夠合理地假設所述探針和樣品具有實質(zhì)上的(substantial)同源性/相似性/同一性。優(yōu)選地，首先進行多核苷酸的雜交，其后在低、中或高嚴緊性條件下通過本領域公知的技術洗滌，例如，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)DNA Probes，StocktonPress，New York，NY，pp.169-170中所述。例如，如該文獻中所述，低嚴緊性條件可以通過首先用2xSSC(標準檸檬酸鹽水(Standard Saline Citrate))/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate))在室溫洗滌15分鐘來實現(xiàn)。通常進行兩次洗滌。然后可以通過降低鹽濃度和/或提高溫度來實現(xiàn)較高的嚴緊性。例如，上述洗滌之后可以進行兩次洗滌，每次在室溫使用0.1xSSC/0.1％SDS進行15分鐘，然后再進行多次洗滌，每次在55℃用0.1xSSC/0.1％SDS進行30分鐘。這些溫度可以用于本文所述的其它雜交和洗滌方案，并且如本領域技術人員將會知道的(例如，SSPE可以用作鹽代替SSC)。2xSSC/0.1％SDS可以通過向445ml水加入50ml的20xSSC和5ml的10％SDS來制備。20xSSC可以通過混合NaCl(175.3g/0.150M)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015M)和水，用10N NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.0，然后將體積調(diào)節(jié)至1升來制備。10％SDS可以通過將10g SDS溶解到50ml高壓滅菌水中，然后稀釋到100ml來制備。
探針的檢測提供了一種以已知方式測定雜交是否得到保持的手段。這樣的探針分析提供了一種鑒定主題的發(fā)明的基因的快速方法。用作本發(fā)明的探針的核苷酸區(qū)段可以使用DNA合成儀和標準流程來合成。這些核苷酸序列也可以用作PCR引物來擴增主題的發(fā)明的基因。
分子的雜交特征可以用于鑒定主題的發(fā)明的多核苷酸。因此主題的發(fā)明包括與本文示例的多核苷酸雜交的多核苷酸(和/或它們的補體，優(yōu)選它們的完整補體)。也就是說，例如，一種定義基因(和它編碼的蛋白質(zhì))的方法是通過它與已知的或具體示例的基因雜交的能力(在任何本文具體公開的條件下)。
如用于本文，用于雜交的“嚴緊”條件是指實現(xiàn)與目前的申請人所采用的條件所實現(xiàn)的雜交特異性程度相同或大約相同的條件。具體而言，可以通過標準方法將Southern印跡上固定化的DNA與32P-標記的基因特異性探針雜交(參見，例如，Maniatis等1982)。概括而言，雜交和后續(xù)的洗滌可以在允許對靶序列進行檢測的條件下進行。對于雙鏈DNA基因探針，雜交可以在低于DNA雜合體解鏈溫度(Tm)20-25℃的溫度下在6xSSPE、5xDenhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中過夜進行。解鏈溫度通過以下公式描述(Beltz等1983) Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/以堿基對計算的雙鏈體長度 洗滌通常如下進行 (1)在1xSSPE、0.1％SDS中在室溫進行兩次各15分鐘(低嚴緊性洗滌)。
(2)在0.2xSSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃進行一次15分鐘(中嚴緊性洗滌)。
對于寡核苷酸探針，雜交可以在6xSSPE、5xDenhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在低于雜合體解鏈溫度10-20°的溫度過夜進行。寡核苷酸探針的Tm可以通過以下公式?jīng)Q定 Tm(℃)＝2(T/A堿基對數(shù)目)+4(G/C堿基對數(shù)目) (Suggs等，1981)。
洗滌通?？梢匀缦逻M行 (1)在1xSSPE、0.1％SDS中在室溫進行兩次各15分鐘(低嚴緊性洗滌)。
(2)在1xSSPE、0.1％SDS中在雜交溫度進行一次15分鐘(中嚴緊性洗滌)。
概括而言，可以改變鹽和/或溫度來改變嚴緊性。對于長度＞70左右的標記DNA片段，可以使用以下條件 低1或2xSSPE，室溫 低1或2xSSPE，42℃ 中0.2x或1xSSPE，65℃ 高0.1xSSPE，65℃ 雙鏈體的形成和穩(wěn)定性依賴于雜合體兩條鏈之間實質(zhì)上的互補性，并且，如上所述，可以容許某種程度的錯配。因此，主題的發(fā)明的探針序列包括對所述序列的突變(一個和多個兩種)、缺失、插入，和它們的組合，其中所述突變、插入和缺失允許與感興趣的靶多核苷酸形成穩(wěn)定雜合體。突變、插入和缺失可以在給定的多核苷酸序列中以多種方式產(chǎn)生，并且這些方法是本領域普通技術人員已知的。其它方法可能在未來逐漸為人所知。
PCR技術。聚合酶鏈式反應(PCR)是一種重復性、酶促、引物引導的核酸序列合成。這種方法是公知的，并且是本領域技術人員普遍使用的(參見Mullis，美國專利第4,683,195、4,683,202和4,800,159號；Saiki等，1985)。PCR基于對感興趣的DNA片段的酶促擴增，所述DNA片段由兩個寡核苷酸引物在側翼包圍(flanked)，所述引物與靶序列的兩個相對序列雜交。優(yōu)選地所述引物的方向為3′端彼此相對。模板熱變性、將引物與它們的互補序列退火和使用DNA聚合酶延伸退火的引物的重復循環(huán)導致由PCR引物5′端限定的區(qū)段的擴增。每個引物的延伸產(chǎn)物可以充當模板用于另一引物，所以每個循環(huán)基本上使前一循環(huán)中產(chǎn)生的DNA片段的量翻倍。這導致特定靶片段以指數(shù)積累，在數(shù)小時中高達幾百萬倍。通過使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶例如Taq聚合酶(其分離自嗜熱細菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus))，可以使擴增過程完全自動化?？梢允褂玫钠渌甘潜绢I域技術人員已知的。
示例性的DNA序列，或它的區(qū)段，可以用作引物用于PCR擴增。在PCR擴增的進行中，可以容許引物和模板之間某種程度的錯配。因此，對示例引物的突變、缺失和插入(特別是向5′端添加核苷酸)落入主題的發(fā)明的范圍之內(nèi)?？梢酝ㄟ^本領域普通技術人員已知的方法在給定的引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失。
基因和蛋白質(zhì)的修飾。主題的基因和蛋白質(zhì)可以與其它基因和蛋白質(zhì)融合以產(chǎn)生嵌合的或融合的蛋白質(zhì)。根據(jù)主題的發(fā)明有用的基因和蛋白質(zhì)不僅包括具體示例的全長序列，還包括這些序列的部分、區(qū)段(segment)和/或片段(包括連續(xù)的片段和相較于全長分子的中部和/或末端缺失)，它們的變體、突變體、嵌合體和融合物。主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有經(jīng)取代的氨基酸，只要它們保留了期望的功能性活性?！白凅w”基因具有編碼與示例蛋白質(zhì)具有等效或相似活性的相同蛋白質(zhì)或等效蛋白質(zhì)的核苷酸序列。術語“變體蛋白質(zhì)”和“等效蛋白質(zhì)”是指這樣的蛋白質(zhì)，其與示例蛋白質(zhì)具有相同或基本上相同的針對目標底物的生物學/功能性活性和等效序列。如用于本文，提及的“等效”序列是指具有氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列，所述取代、缺失、添加或插入使活性改進或?qū)钚詻]有程度顯著的負面影響。保有活性的片段也包括在這個定義中。與示例蛋白質(zhì)的相應片段保留相同或相似功能或活性的片段或其他等效物也在主題的發(fā)明的范圍內(nèi)。以氨基酸取代或添加為例的變化可以出于多種目的來進行，例如增加(或減少)蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性(在實質(zhì)上/本質(zhì)上未減少該蛋白質(zhì)的功能性活性)，去除或添加限制位點，等等?；虻淖儺惪梢允褂美缰圃禳c突變的標準技術容易地構建。
此外，美國專利第5,605,793號，例如，描述了通過在隨機或聚焦片段化(focused fragmentation)之后使用DNA再裝配來生成額外的分子多樣性的方法。這可以稱作基因“改組”，其通常包括混合兩種或多種不同DNA分子的(期望大小的)片段，然后是重復的變性循環(huán)。這能夠改進由初始基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。結果是具有改進的活性、改變的底物特異性、增加的酶穩(wěn)定性、改變的立體特異性(stereospecificity)或其它特征的嵌合蛋白。
“改組”可以在獲得和檢驗了感興趣的蛋白質(zhì)的原子3D(三維)坐標和晶體結構之后設計并指定目標(target)。由此，“聚焦改組”可以定向于某些對于修飾而言理想的蛋白質(zhì)區(qū)段，例如表面暴露的區(qū)段，并且優(yōu)選不是參與蛋白質(zhì)折疊和關鍵3D結構完整性的內(nèi)部區(qū)段。
可以使用變體基因來產(chǎn)生變體蛋白；重組宿主能夠用于產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。使用“基因改組”和其它技術，能夠構建等效基因和蛋白質(zhì)，其包含具有本文示例的任何序列的某些連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的某些區(qū)段。這樣的技術可以進行調(diào)整以獲得等效的/功能上有活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169和170個對應于任何示例的或建議的序列中(相同大小的)區(qū)段的連續(xù)氨基酸殘基。編碼這些區(qū)段的多核苷酸，特別是對于感興趣的區(qū)域，也包括在主題的發(fā)明中，并且能夠用作探針和/或引物，特別是用于保守區(qū)域。
全長基因的片段可以按照標準流程使用可以通過商業(yè)途徑獲得的核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶制備。例如，酶如Bal31或定點誘變可以用于系統(tǒng)性地從這些基因的末端切割核苷酸。同樣，編碼活性片段的基因可以使用多種限制酶來獲得。可以使用蛋白酶來直接獲得這些蛋白質(zhì)的活性片段。
如本文所公開的，能夠被截短并且仍然保留功能性活性的蛋白質(zhì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。“截短的蛋白質(zhì)”是指可以將蛋白質(zhì)的一部分切下，同時剩余的截短的蛋白質(zhì)在切割之后保留并且展現(xiàn)期望的活性。切割可以通過多種蛋白酶來實現(xiàn)。另外，有效切割的蛋白質(zhì)可以使用分子生物學技術來產(chǎn)生，其中通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化或本領域技術人員可用的其它技術將編碼所述蛋白質(zhì)的DNA堿基去除。截短之后，可以將所述蛋白質(zhì)在異源系統(tǒng)例如大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)、酵母等中表達，并且再如本文所述置于昆蟲測定法中來測定活性。本領域公知能夠成功地產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)，如此它們保留功能性活性，同時小于完整的全長序列。例如，B.t蛋白可以以階段的(核心蛋白)形式使用(參見，例如，

等(1989)，和Adang等(1985))。如本文所使用，術語“蛋白質(zhì)”可以包括功能上有活性的截短物(truncation)。
在一些情況下，特別是對于在植物中的表達，使用表達截短的蛋白質(zhì)的截短的基因可能是有利的。優(yōu)選的截短的基因?qū)⑼ǔ＞幋a全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。
主題的發(fā)明的某些蛋白質(zhì)已經(jīng)在本發(fā)明具體示例。由于這些蛋白進食對主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)的示例，應該很容易明白主題的發(fā)明包含具有與示例蛋白質(zhì)相同或相似的活性的變體或等效蛋白質(zhì)(和編碼其等效物的核苷酸序列)。等效蛋白質(zhì)將于示例蛋白質(zhì)具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性將通常是至少60％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，并且可以是至少95％。主題的發(fā)明的優(yōu)選的蛋白質(zhì)也可以按照更具體的同一性和/或相似性范圍來限定。例如，如與本文示例的或建議的序列相比，同一性和/或相似性可以是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。以上所列的任何數(shù)字可以用于限定上限和下限。
除非另有指定，如用于本文，兩個核酸的百分比序列同一性和/或相似性的測定使用Karlin和Altschul，1990的算法，如Karlin和Altschul 1993中進行修改。這樣的算法被納入了Altschul等，1990的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸檢索使用NBLAST程序進行，得分(score)＝100，字長(wordlength)＝12。缺口BLAST(Gapped BLAST)可以如Altschul等，1997中所述來使用。當應用BLAST和缺口BLAST程序時，使用各程序(NBLAST和XBLAST)的缺省參數(shù)。參見NCBI/NIH網(wǎng)站。為了獲得缺口比對來用于比較的目的，采用缺省參數(shù)使用了Vector NTI Suite 8(InforMax，Inc.，NorthBethesda，MD，U.S.A.)的AlignX功能。這些為15的缺口產(chǎn)生罰分(Gapopening penalty)，6.66的缺口延伸罰分(Gap extension penalty)和8的缺口分隔罰分范圍(Gap separation penalty range)。
也可以改變蛋白質(zhì)的多種性質(zhì)和三維特性而不負面影響蛋白質(zhì)的活性/功能性。不負面影響分子的活性和/或三維構型的保守氨基酸取代是可以容忍/進行。氨基酸可以歸為以下類別非極性、不帶電的極性、堿性和酸性。將一種類別的一個氨基酸用同種類型的另一氨基酸替代的保守取代屬于主題的發(fā)明的范圍，只要所述取代不會不利于化合物的生物學活性。表2提供的是屬于各個類別的氨基酸的實例列表。

在一些情況下，也可以進行非保守取代。然而，優(yōu)選的取代不顯著減損蛋白質(zhì)的功能性/生物學活性。
如本文所使用，提及“分離的”多核苷酸和/或“純化的”蛋白質(zhì)是指這些分子處于這樣一種狀態(tài)時，所述狀態(tài)不同于將在自然界中找到的所述分子的狀態(tài)。因此，提及“分離的”和/或“純化的”強調(diào)如本文所述的“人工”參與。例如，導入植物進行表達的主題的發(fā)明的細菌“基因”是“分離的多核苷酸”。同樣，源自細菌蛋白并且由植物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是“分離的蛋白質(zhì)”。
由于遺傳密碼的簡并性/冗余性，多種不同的DNA序列能夠編碼本文公開的氨基酸序列。創(chuàng)建編碼相同的或基本上相同的蛋白質(zhì)的可選DNA序列完全在本領域經(jīng)過訓練的人員的技術之內(nèi)。這些變體DNA序列屬于主題的發(fā)明的范圍。這還將在下文題為“優(yōu)化用于在植物中表達的序列”的部分中更詳細地討論。
優(yōu)化用于在植物中表達的序列。為了獲得異源基因在植物中的高表達，通常優(yōu)選重新改造所述基因，從而使它們在植物細胞(的胞質(zhì))中更有效地表達。玉米是一個這樣的植物，其中可能優(yōu)選在轉(zhuǎn)化之前重新設計異源基因以增加其在所述的植物中的表達水平。因此，在編碼細菌蛋白的基因的設計中的額外步驟是為了最佳表達而重新改造異源基因，其使用與目標植物序列(無論是雙子葉植物或單子葉植物物種)排列更接近的密碼子偏倚。在本文其它地方所討論的任何更具體的植物類型中也可以為了表達而優(yōu)化序列。
轉(zhuǎn)基因宿主?？梢詫⒅黝}的發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)的基因?qū)牒芏喾N微生物或植物宿主。主題的發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因植物細胞和轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的植物(和植物細胞)是玉米、擬南芥(Arabidopsis)、煙草、大豆、棉花、油菜、稻、小麥、草皮草和牧草(turf and pasture grasses)等等。轉(zhuǎn)基因植物的其它類型也可以根據(jù)主題的發(fā)明制備，例如水果、蔬菜、觀賞植物和樹。更概括地，雙子葉植物和/或單子葉植物可以在主題的發(fā)明的多種方面中使用。
因此，主題的發(fā)明可以進行修改以適用于維管和非維管植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，針葉樹(conifer)，苔蘚植物(bryophyte)，藻類，真菌和細菌。動物細胞和動物細胞培養(yǎng)物也是一種可能。
在優(yōu)選的實施方案中，基因表達直接或間接地導致感興趣的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)產(chǎn)生(和保持)。以這種方式能夠使植物成為除草劑抗性的。這樣的宿主可以稱作轉(zhuǎn)基因的、重組的、轉(zhuǎn)化的和/或轉(zhuǎn)染的宿主和/或細胞。在本發(fā)明的一些方面中(例如，在克隆和制備感興趣的基因時)，得益于主題的發(fā)明的內(nèi)容，可以按照標準技術產(chǎn)生并使用微生物(優(yōu)選細菌)細胞。
用主題的發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染的植物細胞可以再生成整株植物。主題的發(fā)明包括細胞培養(yǎng)物，包括組織細胞培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物和平板培養(yǎng)物。由主題的發(fā)明的植物產(chǎn)生和/或用于生成主題的發(fā)明的植物的種子也包括在主題的發(fā)明的范圍內(nèi)。其它植物組織和部分也包括在主題的發(fā)明中。主題的發(fā)明同樣包括產(chǎn)生包含主題的發(fā)明的多核苷酸的植物或細胞的方法。一種產(chǎn)生這樣的植物的優(yōu)選方法是通過栽培主題的發(fā)明的種子。
插入基因以形成轉(zhuǎn)基因宿主。主題的發(fā)明的一個方面是用表達主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)的主題的發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染植物、植物細胞和其它宿主細胞。以這種方式轉(zhuǎn)化的植物能夠產(chǎn)生對作用模式不同的多種除草劑的抗性。
許多種方法可以用于在允許穩(wěn)定保持和表達基因的條件下將編碼期望的蛋白質(zhì)的基因?qū)肽繕怂拗?。這些方法是本領域技術人員公知的，并且在例如美國專利第5,135,867號中描述。
包含DSM-2多核苷酸的載體包括在主題的發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，大量包含大腸桿菌中的復制系統(tǒng)和允許對轉(zhuǎn)化細胞進行選擇的標記的克隆載體可用于制備外源基因向高等植物的插入。例如，所述載體包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以將編碼蛋白質(zhì)的序列插入載體中合適的限制位點處。將所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。將所述大腸桿菌細胞培養(yǎng)在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后收獲并裂解。通過從基因組DNA中純化來回收質(zhì)粒。通常進行序列分析、限制酶分析、電泳和其它生物化學-分子生物學方法作為分析的方法。在每種操作之后，可以對使用的DNA序列進行限制酶消化并且與接下來的DNA序列連接。可以將每種質(zhì)粒序列克隆入相同的或其它的質(zhì)粒中。依賴于將期望的基因插入植物的方法，其它的DNA序列可能是必要的。如果，例如，使用Ti或Ri質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化植物細胞，那么至少Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的右邊界，但通常為右邊界和左邊界，必需作為待插入的基因的側翼區(qū)域加入。已經(jīng)深入研究了使用T-DNA用于轉(zhuǎn)化植物細胞，并且在EP 120 516；Hoekema(1985)；Fraley等(1986)；和An等(1985)中描述。
大量技術可用于將DNA插入植物宿主細胞。那些技術包括使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑以T-DNA轉(zhuǎn)化，融合，注射，生物彈射(微粒轟擊)，碳化硅晶須(silicon carbide whisker)，氣溶膠發(fā)射(aerosol beaming)，PEG或電穿孔以及其它可能的方法。如果使用農(nóng)桿菌(Agrobacteria)用于轉(zhuǎn)化，那么必需將待插入的DNA克隆入特殊的質(zhì)粒，即克隆入中間載體(intermediate vector)或二元載體(binary vector)。中間載體可以依靠與T-DNA中序列同源的序列通過同源重組整合入Ti或Ri質(zhì)粒。Ti或Ri質(zhì)粒還包含T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的vir區(qū)。中間載體本身無法在農(nóng)桿菌中復制?？梢詫⒅虚g載體依靠輔助質(zhì)粒(接合)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌。二元載體本身能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌二者中復制。它們包含由左右T-DNA邊界區(qū)框住的選擇標記基因和接頭或多聚接頭?？梢詫⑺鼈冎苯愚D(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌(Holsters，1978)。用作宿主細胞的農(nóng)桿菌包含攜帶vir區(qū)域的質(zhì)粒。vir區(qū)域是將T-DNA轉(zhuǎn)入植物細胞所必需的?？梢院蓄~外的T-DNA。將如此轉(zhuǎn)化的細菌用于轉(zhuǎn)化植物細胞?？梢詫⒅参锿庵搀w有利地與根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)來將DNA轉(zhuǎn)入植物細胞。然后可以在合適的培養(yǎng)基中從感染的植物材料(例如，葉片，莖段，根，還有原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細胞)再生整株植物，所述培養(yǎng)基可以含有抗生素或殺生物劑用于選擇。然后可以測試如此獲得的植物中插入的DNA的存在。在注射和電穿孔的情況下對質(zhì)粒沒有特殊要求。可以使用普通質(zhì)粒，諸如，例如，pUC衍生物。
以常規(guī)方法使轉(zhuǎn)化的細胞在植物內(nèi)生長。它們能夠形成生殖細胞，并且將轉(zhuǎn)化的性狀傳給子代植物。這樣的植物可以以普通方式培養(yǎng)，并且與具有相同的轉(zhuǎn)化的遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。所得雜交個體具有相應的表型特性。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，編碼細菌蛋白的基因是從插入植物基因組中的轉(zhuǎn)錄單位表達的。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄單位是能夠穩(wěn)定整合入植物基因組并且使得對表達編碼蛋白質(zhì)的mRNA的轉(zhuǎn)化植物品系能夠進行選擇的重組載體。
一旦已經(jīng)將插入DNA整合入基因組，就相對穩(wěn)定(并且不會再次出來)。它通常含有賦予轉(zhuǎn)化的植物細胞對殺生物劑或抗生素的抗性的選擇標記，所述抗生素例如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或氯霉素等。植物選擇性標記通常也能提供對多種除草劑的抗性，所述除草劑如草銨膦、(PAT)、草甘膦(EPSPS)、咪草煙(imazethyapyr)(AHAS)以及許多其它除草劑。因此單獨采用的標記物應該允許選擇轉(zhuǎn)化的細胞而非不含插入DNA的細胞。感興趣的基因優(yōu)選在植物細胞中通過組成型或誘導型啟動子表達。一旦表達，mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，其中在蛋白質(zhì)中納入了感興趣的氨基酸。在植物中表達的編碼蛋白質(zhì)的基因可以在組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子的調(diào)控下。
存在幾種技術用于將外源重組載體導入植物細胞和用于獲得穩(wěn)定保有并表達導入的基因的植物。這些技術包括將涂覆在微粒上的遺傳材料直接導入細胞(Cornell的美國專利第4,945,050號和DowElanco(現(xiàn)為DowAgroSciences，LLC)的美國專利第5,141,131號)。此外，植物可以使用農(nóng)桿菌技術轉(zhuǎn)化，參見University of Toledo的美國專利第5,177,010號；Texas A&M的美國專利第5,104,310號；歐洲專利申請0131624B1；Schilperoot的歐洲專利申請120516、159418B1和176,112；Schilperoot的美國專利第5,149,645、5,469,976、5,464,763和4,940,838和4,693,976號；歐洲專利申請116718、290799、320500，均屬于Max Planck；歐洲專利申請604662及627752，和美國專利第5,591,616號，屬于Japan Tobacco；歐洲專利申請0267159及0292435，和美國專利第5,231,019號，全部屬于Ciba Geigy，現(xiàn)為Syngenta；美國專利第5,463,174和4,762,785號，均屬于Calgene；和美國專利第5,004,863和5,159,135號，均屬于Agracetus。其它轉(zhuǎn)化技術包括晶須(whiskers)技術。參見美國專利第5,302,523和5,464,765號，均屬于Zeneca，現(xiàn)為Syngenta。其它直接的DNA遞送轉(zhuǎn)化技術包括氣溶膠發(fā)射技術。參見美國專利第6,809,232號。電穿孔技術也已經(jīng)用于轉(zhuǎn)化植物。參見Boyce ThompsonInstitute的WO 87/06614；美國專利第5,472,869和5,384,253號，均屬于Dekalb；和WO 92/09696和WO 93/21335，均屬于Plant Genetic Systems。此外，病毒載體也可以用于產(chǎn)生表達感興趣的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。例如，單子葉植物可以使用屬于Mycogen Plant Science和Ciba-Geigy(現(xiàn)為Syngenta)的美國專利第5,569,597號，以及屬于現(xiàn)為Large Scale Biology的Biosource的美國專利第5,589,367和5,316,931號中描述的方法用病毒載體來轉(zhuǎn)化。
如先前提及的，將DNA構建體導入植物宿主的方式不是本發(fā)明的關鍵?？梢圆捎萌魏翁峁┯行мD(zhuǎn)化的方法。例如，在本文描述了多種用于植物細胞轉(zhuǎn)化的方法，并且包括使用Ti或Ri質(zhì)粒等進行農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化。在許多情況下，用于轉(zhuǎn)化的構建體在一側或兩側的邊界上為T-DNA邊界將是理想的，更具體而言為右邊界。這在構建體使用根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化模式時尤其有用，盡管T-DNA邊界可能在其它轉(zhuǎn)化模式中也有用。在使用農(nóng)桿菌進行植物細胞轉(zhuǎn)化的情況下，可以使用載體，可以將所述載體導入宿主用于與宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri質(zhì)粒的同源重組。載體的導入可以藉由電穿孔、三親雜交和本領域技術人員已知的用于轉(zhuǎn)化革蘭氏陰性細菌的其它技術來進行。將載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌宿主的方式不是本發(fā)明的關鍵。含有用于重組的T-DNA的Ti或Ri質(zhì)粒可以是能夠或不能引起菌癭(gall)形成的，并且不是所述發(fā)明的關鍵，只要vir基因存在于所述的宿主中。
在一些將農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化的情況下，T-DNA邊界內(nèi)的表達構建體將被插入廣譜載體例如pRK2或其衍生物中，如Ditta等(1980)和EPO 0 120 515中所述。在表達構建體和T-DNA內(nèi)將包括一個或多個如本文所述的標記物，其允許對轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌和轉(zhuǎn)化的植物細胞的選擇。采用的特定標記物不是本發(fā)明的關鍵，優(yōu)選的標記物依賴于使用的宿主和構建。
對于使用農(nóng)桿菌的植物細胞轉(zhuǎn)化，可以將外植體與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌組合并且一起溫育足夠的時間以允許其轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化之后，通過用合適的抗生素選擇來殺死農(nóng)桿菌，并且將植物細胞用適合的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。一旦形成愈傷組織，可以按照植物組織培養(yǎng)和植物再生領域中公知的方法通過采用適合的植物激素來促進芽形成。然而，愈傷組織中間階段不一定是必需的。在芽形成之后，可以將所述的植物細胞轉(zhuǎn)移至促進根形成的培養(yǎng)基，由此完成植物再生。然后可以將植物培育成種子，并且可以使用所述種子來建立未來的世代。不考慮轉(zhuǎn)化技術，優(yōu)選將編碼細菌蛋白的基因并入基因轉(zhuǎn)移載體，所述載體通過在載體中包括植物啟動子調(diào)節(jié)元件，以及3′非翻譯轉(zhuǎn)錄終止區(qū)例如Nos等而適合于在植物細胞中表達所述基因。
除了用于轉(zhuǎn)化植物的眾多技術，與外源基因接觸的組織的類型也可以不同。這樣的組織將包括但不限于胚發(fā)生組織，I、II和III型愈傷組織，下胚軸，分生組織，根組織，用于在韌皮部中表達的組織等等。幾乎所有植物組織均可使用本發(fā)明描述的適合技術在去分化過程中轉(zhuǎn)化。
除了選擇性標記，可能期望使用報道基因。在一些情況下，報道基因可以與或不與選擇性標記一起使用。報道基因是通常不存在于受體生物或組織中的基因，并且通常編碼導致某些表型變化或酶特性的蛋白質(zhì)。這樣的基因的實例在Weising等，1988中提供。優(yōu)選的報道基因包括大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，來自大腸桿菌Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，來自生物發(fā)光的水母維多利亞水母(Aequorea Victoria)的綠色熒光蛋白，和來自螢火蟲北美螢火蟲(Photinus pyralis))的螢光素酶基因。然后在所述基因?qū)肓耸荏w細胞之后，可以在合適的時間進行用于檢測報道基因表達的測定。優(yōu)選的這樣的測定需要使用如Jefferson等，(1987)所述的編碼大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因以鑒定轉(zhuǎn)化的細胞。
除了植物啟動子調(diào)節(jié)元件，在植物細胞中可以有效地使用來自多種來源的啟動子調(diào)節(jié)元件以表達外源基因。例如，可以使用細菌來源的啟動子調(diào)節(jié)元件，例如章魚堿合酶啟動子、胭脂氨酸合成酶啟動子、甘露氨酸合酶啟動子；病毒來源的啟動子，例如花椰菜花葉病毒(35S和19S)，35T(其是重新改造的35S啟動子，參見美國專利第6,166,302號，特別是實施例7E)等。植物啟動子調(diào)節(jié)元件包括但不限于核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)啟動子，β-菜豆蛋白啟動子，ADH啟動子，熱激啟動子和組織特異性啟動子。其它元件例如基質(zhì)附著區(qū)、支架附著區(qū)、內(nèi)含子、增強子、聚腺苷酸化序列等可以存在并且由此可以改進轉(zhuǎn)錄效率或DNA整合。這樣的元件對于DNA功能可能是必需的或可能不是，盡管它們通過影響轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性等來提供更好的DNA表達或功能。這樣的元件可以按照期望包括在DNA中以獲得轉(zhuǎn)化DNA在植物中的最佳性能。典型的元件包括但不限于Adh-內(nèi)含子1、Adh-內(nèi)含子6、苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白前導序列、滲透蛋白UTR序列、玉米條紋毒病病毒外殼蛋白前導序列、以及其它本領域技術人員可用的元件。也可以使用組成型啟動子調(diào)節(jié)元件，由此在全部細胞類型中和全部時間指導連續(xù)的基因表達(例如，肌動蛋白、泛素、CaMV 35S等)。組織特異性的啟動子調(diào)節(jié)元件負責在特定細胞或組織類型中，例如葉或種子中的基因表達(例如，玉米醇溶蛋白、油質(zhì)蛋白、油菜籽蛋白、ACP、球蛋白等)，并且這些也可以使用。
啟動子調(diào)節(jié)元件也可以是在植物發(fā)育的某個階段中是活性的(或無活性的)以及在植物組織和器官中是活性的。這樣的實例包括但不限于花粉特異性、胚特異性、玉米須特異性(corn-silk-specific)、棉花纖維特異性、根特異性、種子胚乳特異性或營養(yǎng)階段特異性的啟動子調(diào)節(jié)元件等。在某些情況下，使用誘導型啟動子調(diào)節(jié)元件可能是理想的，所述誘導型啟動子調(diào)節(jié)元件負責基因響應于特定信號表達，例如物理刺激物(熱激基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代謝物、化學藥物(四環(huán)素應答型)和應激。可以使用其它在植物中發(fā)揮功能的理想的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。多種植物特異性基因轉(zhuǎn)移載體是本領域已知的。
基于植物RNA病毒的系統(tǒng)也可以用于表達細菌蛋白。在這樣的操作中，可以將編碼蛋白質(zhì)的基因插入將感染感興趣的宿主植物的合適植物病毒的外殼啟動子區(qū)。然后可以表達所述蛋白質(zhì)，由此為植物提供免于除草劑損害的保護。基于植物RNA病毒的系統(tǒng)在Mycogen Plant Sciences，Inc.的美國專利第5,500,360號和Biosource(現(xiàn)為Large Scale Biology)的美國專利第5,316,931和5,589,367號中描述。
選擇劑。除了草銨膦和雙丙氨酰膦，能夠按照主題的發(fā)明使用的選擇劑包括全部合成的和天然的類似物，所述類似物可以通過由主題的發(fā)明的DSM-2基因介導的乙酰轉(zhuǎn)移酶機制失活。參見例如
圖1。
除非具體說明或暗示，如本文使用的術語“一個(a)”、“一種(an)”和“所述(the)”表示“至少一個”。
將本文涉及的或引用的全部專利、專利申請、臨時申請和公開文獻通過引用以不與本說明書的清楚教導相沖突的程度整體并入。
以下是說明實踐本發(fā)明的流程的實施例。這些實施例不應理解為限制。全部百分比均按重量計，且全部溶劑混合物比例均按體積計，除非另有注釋。
實施例1.用于鑒定在植物中賦予草銨膦抗性的基因的方法 作為一種鑒定在植物中(in planta)擁有除草劑降解活性的基因的方法，可以在目前的公共數(shù)據(jù)庫例如NCBI(National Center for BiotechnologyInformation(國家生物技術信息中心))中挖掘。為了開始所述過程，必須具有已經(jīng)鑒定的編碼具有期望特征的蛋白質(zhì)(即，膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的功能性基因序列。然后使用這種蛋白質(zhì)序列作為BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)(Altschul等，1997)算法的輸入信息以針對保存的可用NCBI蛋白質(zhì)序列進行比較。使用缺省設定，這種搜索返回了超過100個不同水平的同源蛋白質(zhì)序列。這些在氨基酸水平從高度相同(85-98％)到非常低同一性(23-32％)。傳統(tǒng)上會預期只有具有高同源性的序列保有與輸入序列相似的特性。在這種情況下，只選擇≤50％同源性的所得序列。如本文所示例的，克隆并重組表達只有30％氨基酸保守性的同源物(相對于來自吸水鏈霉菌的pat)可以用于將轉(zhuǎn)化的植物細胞培養(yǎng)物從未轉(zhuǎn)化的中選出。
DSM-2是作為與pat僅有30％氨基酸同一性且與bar僅有28％氨基酸同一性的同源物從NCBI數(shù)據(jù)庫(參見ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站；登錄號AAA26705)中鑒定的。百分比同一性是通過首先將數(shù)據(jù)庫中保存的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)，然后使用VectorNTI軟件包中的ClustalW進行多重序列比對來測定的。
實施例2.優(yōu)化用于在植物和細菌中表達的序列 2.1-背景 為了獲得異源基因在植物中更高水平的表達，可以優(yōu)選重新改造所述基因的蛋白質(zhì)編碼序列從而使它們在植物細胞中更有效地表達。玉米是一個這樣的植物，其中可以優(yōu)選在轉(zhuǎn)化之前重新設計異源蛋白質(zhì)編碼區(qū)以增加植物中基因的表達水平和編碼的蛋白質(zhì)水平。因此，在編碼細菌蛋白的基因的設計中一個額外的步驟是為了最優(yōu)表達而重新改造異源基因。參見例如Kawabe等(2003)，“Patterns of Codon Usage Bias in Three Dicot and FourMonocot Plant Species，”Genes Genet.Syst.，pp.343-352；和Ikemura等(1993)，“Plant Molecular Biology Labfax”，Croy，ed.，Bios Scientific Publishers Ltd.，p.3748)，和本文引用的所有相關的參考文獻。
例如，為了在玉米中的表達而重新改造細菌蛋白的一個理由是由于天然基因的非最優(yōu)G+C含量。例如，許多天然細菌基因非常低的G+C含量(并且因此傾向于高A+T含量)導致生成模仿或復制已知高度富含A+T的植物基因調(diào)控序列的序列。在導入植物的基因的DNA內(nèi)一些富含A+T的序列(例如，通常存在于基因啟動子中的TATA框區(qū))的存在可能導致基因的異常轉(zhuǎn)錄。另一方面，位于轉(zhuǎn)錄的mRNA中的其它調(diào)節(jié)序列的存在(例如，聚腺苷酸化信號序列(AAUAAA)，或前mRNA剪接中涉及的與核內(nèi)小RNA互補的序列)可能導致RNA不穩(wěn)定。因此，在用于玉米表達的編碼細菌蛋白的基因(更優(yōu)選地稱作按植物優(yōu)化的基因)的設計中一個目的，是生成具有較高G+C含量的DNA序列，并且優(yōu)選接近編碼代謝酶的玉米基因的G+C含量。在編碼細菌蛋白的按植物優(yōu)化的基因的設計中的另一個目的是生成其中序列修飾不阻礙翻譯的DNA序列。
表3列舉了玉米中的G+C含量如何的高。對于表3中的數(shù)據(jù)，基因編碼區(qū)提取自GenBank(Release 71)條目，且堿基組成是使用MacVectorTM程序(Accelerys，San Diego，California)計算的。在所述計算中忽略內(nèi)含子序列。

a圓括號中給出類別中的基因數(shù)。
b圓括號中給出標準差。
c在平均值計算中忽略組合的組的平均值(Combined groups meanignored in mean calculation)。
由于遺傳密碼的冗余性和簡并性給予的可塑性(即，一些氨基酸由多于一個密碼子指定)，不同生物或生物類別中的基因組進化導致了有差別的冗余密碼子使用。這種“密碼子偏倚”(codon bias)反映在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的平均堿基組成中。例如，具有相對低G+C含量的生物在冗余密碼子的第三個位置利用具有A或T的密碼子，而那些具有較高G+C含量的生物利用在第三個位置具有G或C的密碼子。認為mRNA內(nèi)“少數(shù)”密碼子(“minor”codons)的存在可能降低了mRNA的絕對翻譯率，特別是當對應于少數(shù)密碼子的氨酰tRNA的相對豐度較低時。這種情況的延伸是單獨的少數(shù)密碼子的翻譯率的降低將至少是多重少數(shù)密碼子的加和。因此，少數(shù)密碼子相對含量高的mRNA將相應地具有低翻譯率。這種比率將由后續(xù)的編碼蛋白的低水平來反映。
在對用于在玉米(玉米，或其它植物，例如棉花、大豆、小麥、蕓苔屬(Brassica)/油菜、稻；或更概括地油料作物，單子葉植物，雙子葉植物和hemicot/植物，一般而言)中表達的編碼細菌蛋白的基因的工程改造中，已經(jīng)測定了植物的密碼子偏倚。玉米的密碼子偏倚是植物用來編碼它的蛋白質(zhì)的統(tǒng)計學密碼子分布，而優(yōu)選的密碼子選擇示于表4。在測定偏倚之后，測定感興趣的基因中密碼子的百分比頻率。應該測定植物優(yōu)選的主要密碼子，以及當存在多種選擇時優(yōu)選密碼子的第二、第三和第四種選擇。然后可以設計新的DNA序列，其編碼細菌蛋白的氨基酸序列，但是新的DNA序列因使用植物(第一優(yōu)選、第二優(yōu)選、第三優(yōu)選或第四優(yōu)選的)密碼子進行的取代而不同于天然細菌DNA序列(編碼所述蛋白的)，以指定蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)每個位置的氨基酸。然后分析所述新序列可能因修飾產(chǎn)生的限制酶位點。對鑒定的位點進一步修飾，通過用優(yōu)選密碼子的第一、第二、第三或第四種選擇來代替所述密碼子。序列中可能影響感興趣的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它位點是外顯子內(nèi)含子連接(exonintron junctions)(5′或3′)，多聚A添加信號，或RNA聚合酶終止信號。進一步分析并修飾所述序列以降低TA或GC雙聯(lián)體(doublet)的頻率。除了雙聯(lián)體，具有多于約四個相同殘基的G或C序列區(qū)組(block)能夠影響序列的轉(zhuǎn)錄。因此，也通過將第一或第二種選擇的密碼子等用選擇的次優(yōu)選密碼子代替來修飾這些區(qū)組。


優(yōu)選編碼細菌蛋白的按植物優(yōu)化的基因含有約63％的首選密碼子，約22％至約37％的第二選擇密碼子，和約15％至約0％的第三或第四選擇密碼子，其中總百分比是100％。最優(yōu)選的是按植物優(yōu)化的基因含有約63％的首選密碼子，至少約22％的第二選擇密碼子，約7.5％的第三選擇密碼子，和約7.5％的第四選擇密碼子，其中總百分比為100％。上文描述的方法使得本領域技術人員能夠修飾對于特定植物是外源的基因，從而使所述基因在植物中進行最優(yōu)表達。所述方法在PCT申請WO 97/13402中進一步闡述。
因此，為了設計編碼細菌蛋白的按植物優(yōu)化的基因，利用從密碼子偏倚表確立的冗余遺傳編碼設計編碼所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的DNA序列，所述密碼子偏倚表匯編自特定的一種或多種植物的基因序列。所得DNA序列具有較高的密碼子多樣性程度，理想的堿基組成，可以含有按策略安排的限制酶識別位點，并且缺乏可能干擾基因轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)物mRNA翻譯的序列。由此，合成的基因在功能上等同于主題的發(fā)明的蛋白質(zhì)/基因，可以使用所述合成基因轉(zhuǎn)化宿主，包括植物。關于合成基因產(chǎn)生的其它指導可以在例如美國專利第5,380,831號中找到。
2.2.DSM-2植物重建分析。
對天然DSM-2編碼區(qū)(SEQ ID NO1)的DNA序列513個堿基對(bp)的廣泛分析揭示了被認為對最優(yōu)植物表達有害的幾個序列基序的存在，以及非最優(yōu)的密碼子組成。由SEQ ID NO1編碼的蛋白質(zhì)作為SEQ ID NO2呈現(xiàn)。為了改進單子葉植物以及雙子葉植物中重組蛋白的產(chǎn)生，開發(fā)了一種“按植物優(yōu)化的”DNA序列DSM-2 v2(SEQ ID NO3)，其編碼與SEQ ID NO2所公開的天然序列相同的蛋白質(zhì)。相反，編碼區(qū)的天然的和按植物優(yōu)化的DNA序列僅78.3％相同。表5顯示了天然的(A和D欄)和按植物優(yōu)化的序列(B和E欄)的密碼子組成，并且允許與理論的按植物優(yōu)化的序列(C和F欄)進行比較。


從表5的檢查清楚了天然的和按植物優(yōu)化的編碼區(qū)，盡管編碼相同的蛋白質(zhì)，但是彼此本質(zhì)上不同。按植物優(yōu)化的版本(v1)精密地(closely)模仿了編碼DSM-2蛋白質(zhì)的理論的按植物優(yōu)化編碼區(qū)的密碼子組成。
實施例3.克隆轉(zhuǎn)化載體 3.1-構建含有DSM-2 (v2)的二元質(zhì)粒 將編碼序列(DASPICO45)的DSM-2 (v2)密碼子優(yōu)化基因用限制酶BbsI(New England Biolabs，Inc.，Beverly MA，目錄號R0539s)和SacI(New EnglandBiolabs，Inc.，目錄號R0156s)切割。將所得片段連接入pDAB773中相應的限制位點NcoI(New England Biolabs，目錄號R0193s)和SacI處。藉由限制酶消化鑒定了陽性菌落。所得克隆含有Rb7MAR v3//At Ubi10啟動子v2//感興趣的基因//Atu Orf 13’UTR v3。將含有DSM-2 (v2)作為感興趣的基因的質(zhì)粒標記為pDAB3774。
將Rb7MAR v3//AtUbi10啟動子v2//感興趣的基因//Atu Orf13’UTRv3表達盒作為AgeI(New England Biolabs，Inc.，目錄號R0552s)限制片段克隆至二元載體pDAB3736中。將這種表達盒克隆到所述二元質(zhì)粒的左手和右手邊界之間。藉由限制酶消化和測序反應鑒定了陽性菌落。將含有Rb7 MAR v3//AtUbi10啟動子v2//DSM-2v2//Atu Orf13’UTR v3的構建體標記為pDAB3778。
通過從pDAB3736去除GateWay attR目的表達盒(destination cassette)完成了含有Rb7MAR v3//AtUbi10啟動子v2//PAT v3//Atu Orf1 3’UTR v3表達盒的對照構建體。將pDAB3736用PacI(New England Biolabs，Inc.，目錄號R0547s)限制酶消化。PacI在pDAB3736中GateWay attR目的表達盒的兩側。將用PacI消化的質(zhì)粒自連接并且轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen，Carlsbad CA，目錄號C4040-10)。藉由限制酶消化和測序反應鑒定了陽性菌落。將所得構建體標記為pDAB3779。
3.2-克隆額外的轉(zhuǎn)化構建體 為轉(zhuǎn)化至適合的植物物種中創(chuàng)建的全部其它構建體是使用如本文先前所述的相似流程和其它標準分子克隆方法(Maniatis等，1982)建立的。表6列出了全部具有適合的啟動子和限定的特征的轉(zhuǎn)化構建體，以及轉(zhuǎn)化的作物。

實施例4.使用帶有原核和真核啟動子的DSM-2(V)互補敏感大腸桿菌(BL-21) 4.1-構建含DSM-2 (v2)的大腸桿菌表達質(zhì)粒 將DSM-2 (v2)密碼子優(yōu)化的序列用限制酶BbsI和SacI消化。將所得片段克隆入pDAB779中相應的NcoI和SacI限制位點處。pDAB779是pET28a(+)表達載體(Novagen，Madison WI，目錄號69864-3)。藉由限制酶消化鑒定了含有DSM-2 (v2)基因編碼序列的陽性菌落。將所述DSM-2//pET28a(+)構建體標記為pDAB4412。
將表達質(zhì)粒pET(空載體對照)和pDAB4412使用標準方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌T7表達菌株BL21-Star(DE3)(Invitrogen，Carlsbad CA，目錄號C6010-03)。表達培養(yǎng)物以10-200個新鮮轉(zhuǎn)化的菌落在含有50μg/ml抗生素和75μMIPTG(異丙基-α-D-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl-α-D-thiogalatopyranoside))的250mL LB培養(yǎng)基中起始。將培養(yǎng)物在28℃以180-200rpm培養(yǎng)24小時。通過在250ml Nalgene瓶中在4℃以3,400xg離心10分鐘來回收細胞。將沉淀重懸在4-4.5mL Butterfield’s磷酸溶液中(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA；0.3mM磷酸鉀pH 7.2)。將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至50mL聚丙烯螺旋蓋離心管，所述離心管含有1mL 0.1mm直徑的玻璃珠(Biospec，Bartlesville，OK，目錄號1107901)。將細胞-玻璃珠混合物在冰上冷卻，然后通過在～20的輸出以Branson Sonifier 250(Danbury CT)使用2mm探針(probe)以兩次45秒的猝發(fā)脈沖(burst)通過超聲處理來裂解細胞，在兩次猝發(fā)脈沖之間是完全冷卻的。將裂解物轉(zhuǎn)移至2mL Eppendorf管并且在16,000xg離心5分鐘。收集上清液并且測量蛋白質(zhì)濃度。將Bio-Rad Protein Dye Assay Reagent(Bio-Rad蛋白質(zhì)染料測定試劑)用H2O以1∶5稀釋，并且將1mL加入10μL以1∶10稀釋的每種樣品中，和濃度為5、10、15、20和25μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)中。在Shimadzu UV160U分光光度計(Kyoto，JP)中以595nm波長測量光密度的分光光度計上讀取樣品。相對于BSA標準曲線計算每種樣品中所含蛋白質(zhì)的量，并且用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至3-6mg/mL之間。將裂解物在SDS蛋白質(zhì)凝膠上運行以使表達的蛋白質(zhì)顯影。
4.2-評估普通克隆菌株對BASTA的敏感性 將選擇的大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌細胞系接種到含有漸增(incrementallyincreasing)濃度的草銨膦(BASTA)的基本培養(yǎng)基上。最初使細胞系；BL21-Star(DE3)，Top10，DH5α，根癌農(nóng)桿菌C58和根癌農(nóng)桿菌LBA4404在復合培養(yǎng)基上長起來。將大腸桿菌在LB中培養(yǎng)，并且將根癌農(nóng)桿菌菌株在YEP中培養(yǎng)。將5微升的細胞培養(yǎng)物接種并均勻分散到含有不同濃度草銨膦的基本培養(yǎng)基平板上。所述濃度由0μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml和4000μg/ml的BASTA組成。此外，將細菌菌株接種到復合培養(yǎng)基的平板上作為對照——將根癌農(nóng)桿菌菌株接種到YEP瓊脂平板上，并且將大腸桿菌菌株接種到LB瓊脂平板上。將含有大腸桿菌菌株的平板在37℃溫育24小時。將含有根癌農(nóng)桿菌菌株的平板在25℃溫育48小時。在分配的溫育時間之后，觀察平板的細菌生長。表7示例了不同的菌株在含有草銨膦的基本培養(yǎng)基上生長的能力。僅一種菌株BL21-Star(DE3)細胞系本質(zhì)上受到草銨膦的抑制。

將大腸桿菌在37C培養(yǎng)24小時。將農(nóng)桿菌在25C培養(yǎng)48小時。+++＝大量菌苔生長//++＝少量菌苔生長//+＝斑塊狀菌苔生長//--＝無生長 4.3-重組表達DSM-2(v2)以補足大腸桿菌BL21-Star(DE3)的細胞生長 構建了含PAT(v3)的pET28a(+)表達質(zhì)粒作為陽性對照。將PAT(v3)作為NcoI-SacI片段克隆至pDAB779的相應限制位點中。藉由限制酶消化驗證了含PAT(v3)基因片段的陽性克隆。將此構建體標記為pDAB4434。
將質(zhì)粒pDAB4434、pDAB4412和空pET載體(對照)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-Star(DE3)細菌細胞中。表達培養(yǎng)物以10-200個新鮮轉(zhuǎn)化的菌落在含有50μg/ml抗生素和75μM IPTG(異丙基-α-D-硫代半乳吡喃糖苷)的250mLLB培養(yǎng)基中起始。將所述培養(yǎng)物在28℃以180-200rpm培養(yǎng)24小時。將5微升的所述培養(yǎng)物接種至復合培養(yǎng)基對照和含有漸增濃度的草銨膦和20μM IPTG的基本培養(yǎng)基上。將所述培養(yǎng)物均勻地分散到平板上并且在28℃溫育2小時。在分配的溫育時間之后，觀察平板的細菌生長。這些結果在表8中示例。

將大腸桿菌在含20uM IPTG的培養(yǎng)基上在28C培養(yǎng)24小時。--＝無生長//+++＝分開的菌落生長(distinct colony growth)。
4.4-使用植物啟動子在大腸桿菌BL21-Star(DE3)細胞中驅(qū)動DSM-2的重組表達 測定在病毒啟動子CsVMV或植物啟動子AtUbi10下表達DSM-2(v2)和PAT基因編碼序列的質(zhì)粒構建體對含草銨膦基本培養(yǎng)基的補足。將質(zhì)粒3778(Rb7MARv3//AtUbi10啟動子//DSM-2(v2)//Atu Orf1 3’UTR)、3779(Rb7MARv3//AtUbi10啟動子//PAT//Atu Orf1 3’UTR)、3264(CsVMV啟動子//DSM-2//Atu Orf 243’UTR)、3037(CsVMV啟動子//PAT//Atu Orf 25/263’UTR)和770(含CsVMV啟動子//GUS v3//Atu Orf24 3’UTR的對照質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21-Star(DE3)并且在復合培養(yǎng)基上生長起來。將5微升的所述培養(yǎng)物鋪板在含有漸增濃度草銨膦的基本培養(yǎng)基上并且在37℃溫育48小時。結果在表9中示例。這些數(shù)據(jù)表明植物和病毒啟動子在細菌細胞內(nèi)具有中等水平的功能性并且可以用于驅(qū)動選擇性標記的表達。

將大腸桿菌在37C培養(yǎng)48小時。++++＝大量菌苔生長；+++＝菌苔生長；++＝大量分開的菌落；+＝分散的菌落生長 實施例5.為生物化學表征進行的DSM-2純化和用于Western分析的抗體產(chǎn)生 5.1-重組表達 將在質(zhì)粒pDAB4412中含密碼子優(yōu)化的DSM-2 (v2)基因的大腸桿菌BL-21(DE3)Star細胞(購自Invitrogen，Carlsbad，CA)用于接種補充有50μg/ml卡那霉素的3ml LB培養(yǎng)基，在37℃過夜用于種子制備。將大約2ml的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至2.8L帶擋板的Erlenmeyer燒瓶中1L含有卡那霉素(50μg/ml)的新鮮LB中。將培養(yǎng)物于37℃在搖床(New Brunswick Scientific，Model Innova 44)上以250RPM溫育大約6小時以獲得接近0.8-1.0的OD600。向培養(yǎng)物中加入最終為75μM的異丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)并且基序在18℃溫育進行過夜誘導。通過于4℃在8,000RPM離心15分鐘收獲細胞，并且將細胞糊貯藏在-80℃或立即進行純化。
將來自1L培養(yǎng)物的濕重大約5g的大腸桿菌細胞解凍并且重懸在300ml含有20mM Tris-HCl，pH 8.0和0.3ml蛋白酶抑制劑混合物(ProteaseInhibitor Cocktail)(Sigma，目錄號P8465)的提取緩沖液中，并且在冰上通過超聲處理進行15分鐘的破壞。將裂解物在4℃以24,000RPM離心20分鐘，并且使上清液經(jīng)過0.8μm和0.45μm膜過濾。全部后續(xù)的蛋白質(zhì)分離使用Pharmacia AKTA Explorer 100進行并且在4℃進行操作。將濾出液以10ml/min應用于用20mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液平衡的QXL Sepharose FastFlow柱(Pharmacia HiPrep 16/10，20ml bed size)。用這種緩沖液洗滌該柱直到洗脫液OD280回到基線，用0.5L 0-0.4M線性梯度的NaCl以5ml/min的流速洗脫蛋白質(zhì)，同時收集了5ml級分。匯集含有如通過SDS-PAGE測定具有明顯的20kDa條帶(預測的DSM-2分子量是19.3kDa)的DSM-2的級分，其也對應于草銨膦轉(zhuǎn)化活性。將樣品用4倍體積的20mM Tris-HCl，pH 7.5緩沖液稀釋，所述緩沖液含有5mM DTT、0.5％Triton X-100、5％甘油，并且再次以4ml/min應用于Mono Q柱(Pharmacia 10/100GL，8ml柱床大小(bed size))。用相同緩沖液中的0.1-0.3M NaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。匯集含DSM-2的主峰，并且添加固體硫酸銨至最終1.0M，并且應用于在20mMTris-HCl，pH 7.5中1.0M硫酸銨中平衡的Phenyl Fast Flow柱(PharmaciaHiTrap，5ml柱床大小)。將該柱用平衡緩沖液以4ml/min洗滌直到洗脫液的OD280回到基線，然后在50min(3ml/min)內(nèi)通過20mM Tris-HCl，pH 7.5中1.0M-0的硫酸銨線性梯度將蛋白質(zhì)洗脫，并且收集了3ml級分。匯集在75mS/cm處洗脫的含有DSM-2的主峰級分，并使用MWCO 10kDa膜離心過濾裝置(Millipore)濃縮成大約3mg/ml。然后將樣品以1ml/min的流速應用于含有PBS緩沖液的Superdex 75凝膠過濾住(Pharmacia XK 16/60，110ml柱床大小)。匯集了含有純DSM-2的峰級分并且貯藏于-80℃。通過Bradford測定法或總氨基酸分析使用牛血清白蛋白作為標準品測定了蛋白質(zhì)濃度?；陟⒔z菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)測定法的標準流程測量了純化的DSM-2的活性。(Wehrmann等1996) 5.2-抗體產(chǎn)生 抗DSM-2的兔多克隆抗體使用Invitrogen Antibody Services提供的兔多克隆抗體-標準方案(South San Francisco，CA，目錄號M0300)來制備。由大腸桿菌表達且純化的DSM-2(參見前節(jié))提供作為免疫原。簡言之，為兩只新西蘭兔皮下(SQ)注射用0.25mg匙孔血藍蛋白和弗氏不完全佐劑(IFA)乳化的1mg DSM-2蛋白。使兔休息2周，再用0.5mg在IFA中乳化的DSM-2蛋白進行三次皮下推注，兩次之間為3周的休息期。最終推注之后兩周，從每只兔收集了血清，并且在直接ELISA上測試了效價(數(shù)據(jù)未顯示)。對針對特定抗體得出更好效價的2號兔進行了兩次額外的推注和末端放血(terminalbleed)。
5.3-Western印跡分析 將大約100mg的愈傷組織置入含有3個不銹鋼BB珠的2mL微量離心管中。加入250μL提取緩沖液(含有0.1％Triton X-100、10mM DTT和5μL/mL蛋白酶抑制劑混合物的磷酸鹽緩沖鹽水)，并且將所述試管扣緊在Geno/Grinder(Model 2000-115，Certiprep，Metuchen，NJ)中，并且用1x為500rpm的設定振蕩6分鐘。將試管在10,000xg離心十分鐘并且將含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液用移液管吸入單獨的試管并且在冰上貯藏。如上所述二次提取沉淀，并且將上清液與前一級分匯集并且測定。
將來自植物樣品的提取蛋白質(zhì)在Laemmli緩沖液中變性并且在95℃溫育10分鐘。將變性的蛋白質(zhì)在Novex 8-16％ Tris-甘氨酸預制凝膠(Invitrogen目錄號EC60452BOX)上按照制造商的方案分離，其后使用標準方案轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。
全部Western印跡溫育步驟均在室溫下進行1小時。首先將印跡在含有4％牛奶的PBS(PBSM)中封閉，然后在用PBSM稀釋了5000倍的DSM-2特異性兔多克隆抗體(參見前段)中溫育。在三次在含有0.05％Tween-20的PBS(PBST)中進行的每次5分鐘洗滌之后，在所述印跡上溫育山羊抗兔抗體/辣根過氧化物酶綴合物。使用化學發(fā)光底物(Pierce Biotechnology，Rockford，IL目錄號32106)并且曝光于X射線膠片使受檢測的蛋白質(zhì)顯影。
實施例6.向擬南芥中的轉(zhuǎn)化和選擇 6.1-擬南芥生長條件。
將野生型擬南芥種子懸浮在0.1％瓊脂糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶液中。將懸浮的種子在4℃貯藏2天以完成休眠需求并且確保同步的種子萌發(fā)(分層現(xiàn)象(stratification))。
將Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)用五塊蛭石覆蓋，并且用霍格蘭溶液從下方灌注(sub-irrigated)直到濕潤。使土壤混合物進行24小時的排水。將分層的種子播種在蛭石上，并且用保濕蓋(humidity dome)(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋7天。
使種子萌發(fā)并且在Conviron(CMP4030和CMP3244型，ControlledEnvironments Limited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中在長光照條件(16小時光照/8小時黑暗)下以120-150μmol/m2sec的光強度在恒溫(22℃)恒濕(40-50％)下培養(yǎng)植物。最初用霍格蘭溶液澆灌植物，然后用去離子水以保持土壤潮而不濕(moist but not wet)。
6.2-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 含紅霉素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)的LB+瓊脂平板含有劃線接種的DH5α菌落，使用所述平板提供菌落來接種4ml小量制備培養(yǎng)物(液體LB+紅霉素)。將所述培養(yǎng)物在37℃伴隨恒定的攪拌溫育過夜。按照制造商的說明書進行Qiagen(Valencia，CA)Spin Mini Preps，用于純化質(zhì)粒DNA。
電感受態(tài)的根癌農(nóng)桿菌(菌株Z707s、EHA101s和LBA4404s)細胞是使用來自Weigel和Glazebrook(2002)的方案制備的。使用修改自Weigel和Glazebrook(2002)的電穿孔方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞。將50μl感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞在冰上解凍并且向所述細胞添加10-25ng期望的質(zhì)粒。將DNA和細胞混合物加入預冷的電穿孔槽(2mm)。使用Eppendorf電穿孔儀2510用以下條件進行轉(zhuǎn)化，電壓2.4kV，脈沖長度5毫秒。
電穿孔之后，向槽中加入1ml YEP培養(yǎng)液(每升10g酵母提取物，10g細菌用蛋白胨(Bacto-peptone)，5g NaCl)，并且將細胞-YEP懸浮液轉(zhuǎn)移至15ml培養(yǎng)管。將細胞在28℃水浴中伴隨恒定的攪拌溫育4小時。溫育之后，將培養(yǎng)物鋪板在含紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)(250mg/L)的YEP+瓊脂上。將平板在28℃溫育2-4天。
選擇菌落并且劃線接種至新鮮的含紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的YEP+瓊脂平板上，并且在28℃溫育1-3天。選擇菌落用于PCR分析以通過使用載體特異性引物驗證基因插入物的存在。按照制造商的說明書進行Qiagen Spin Mini Preps用于從選擇的農(nóng)桿菌菌落純化質(zhì)粒DNA，除了以下例外將15ml過夜小量制備培養(yǎng)物(液體YEP+紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L))和鏈霉素(250mg/L))的4ml等分試樣用于DNA純化。使用Qiagen Spin Mini Prep DNA的代替方式是在100℃將懸浮在10μl水中的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細胞裂解5分鐘。將來自農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中使用的二元載體的質(zhì)粒DNA包括作為對照。以0.5x濃度按照制造商的說明書使用Takara Mirus Bio Inc.(Madison，Wisconsin)的Taq DNA聚合酶完成PCR反應。PCR反應在MJ Research Peltier熱循環(huán)儀上進行，程序設定為以下條件1)94℃3分鐘；29個循環(huán)的2)94℃45秒，3)55℃30秒，4)72℃1分鐘；然后是1個循環(huán)的72℃10分鐘。循環(huán)過后將反應保持在4℃。通過1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增并且通過溴化乙錠染色來顯影。選擇PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒對照相同的菌落。
6.3-擬南芥轉(zhuǎn)化。
使用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。使用選擇的菌落接種一份或多份15-30ml的YEP培養(yǎng)液的預培養(yǎng)基，其含有紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)。將培養(yǎng)物在28℃伴隨220rpm的恒定攪拌溫育過夜。使用每份預培養(yǎng)物接種兩個500ml含有紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的YEP培養(yǎng)液的培養(yǎng)基，并且將培養(yǎng)物伴隨恒定攪拌在28℃溫育過夜。然后將細胞在室溫以大約8700xg離心(pellet)10分鐘，并且棄去所得上清液。將細胞沉淀輕柔地重懸在500ml浸潤培養(yǎng)基(infiltration media)中，所述培養(yǎng)基含1/2x Murashige和Skoog鹽/Gamborg’sB5維生素，10％(w/v)蔗糖，0.044μM芐氨基嘌呤(10μl/L的DMSO中的1mg/ml貯液)和300μl/L Silwet L-77。將大約1個月大小的植物在培養(yǎng)基中浸漬15秒，確保浸沒最新的花序。將植物側躺平放并且蓋住(透明或不透明)24小時，然后用水洗滌，再直立起來。使植物在22℃生長，光周期為16小時光照/8小時黑暗。浸漬之后大約4周，收獲種子。
6.4-選擇轉(zhuǎn)化的植物 使新鮮收獲的T1種子[DSM-2 (v2)基因]在室溫干燥7天。將T1種子播種在26.5x51-cm萌發(fā)托盤(T.O.Plastics Inc.，Clearwater，MN)上，每個接受200mg分層T1種子的等分試樣(～10,000個種子)，所述種子之前已經(jīng)懸浮在40ml的0.1％瓊脂糖溶液中并且在4℃貯藏了2天以完成休眠要求并確保同步的種子萌發(fā)。
將Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)用五塊蛭石覆蓋，并且用霍格蘭溶液從下方灌注(sub-irrigated)直到濕潤，然后允許重力排水。將各40ml的分層種子等分試樣用移液管均勻播種在蛭石上并且用保濕蓋(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋4-5天。在使用2，4-D出土后噴霧(postemergence spray)進行初始轉(zhuǎn)化體選擇(選擇共轉(zhuǎn)化的AAD-12基因；參見USSN 60/731,044)之前1天將圓蓋去除。
種植之后7天(7DAP)并且第二次為11DAP，用2，4-D除草劑(456g ae/L2，4-D Amine 4，Dow AgroSciences LLC，Indianapolis，IN)的0.016％溶液以10ml/托盤(703L/ha)的噴霧體積使用DeVilbiss壓縮空氣噴頭對T1植物(分別為子葉和2-4葉階段)噴霧，以遞送每次施用50g ae/ha 2，4-D DMA的有效率。在最后一次噴霧之后4-7天鑒定出存活株(生長活躍的植物)，并且單獨移植入準備有盆栽培養(yǎng)基(Metro Mix 360)的3英寸盆中。將移植的植物用保濕蓋覆蓋3-4天并且在到溫室之前置于22℃培養(yǎng)箱(growth chamber)中或直接移入溫室。其后將圓蓋去除，并且將植物在溫室(22±5℃，50±30％RH，14小時光照10小時黑暗，最低500μE/m2s1自然光+補充光)中培養(yǎng)至少1天，然后測試DSM-2 (v2)提供草銨膦除草劑抗性的能力。
然后為T1植物隨機指定不同的草銨膦比率。對于擬南芥，140g ai/ha草銨膦是區(qū)別敏感植物與具有有意義抗性水平的植物的有效劑量。還應用了提高的比率以測定抗性的相對水平(280、560或1120g ai/ha)。表10顯示與芳氧基鏈烷酸酯/鹽除草劑抗性基因(AAD-12 v1)進行的比較；參見USSN60/731,044。
全部草銨膦除草劑施用均通過軌道噴霧器(track sprayer)以187L/ha噴霧體積來施用。商業(yè)的LibertyTM制劑(200g ai/L，Bayer Crop Science，ResearchTriangle Park，NC)。對于展現(xiàn)出草銨膦耐受的T1植物在T2代中進一步進行評估。
6.5-轉(zhuǎn)化植物的選擇結果 首先使用DSM-2 (v2)(按植物優(yōu)化的基因)進行了擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用2，4-D DMA選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子的背景中選擇出T1轉(zhuǎn)化體。篩選了超過100,000個T1種子，并且鑒定了2602，4-D抗性植物(AAD-12基因)，等于轉(zhuǎn)化/選出率為0.26％，稍高于使用AAD-12+2，4-D進行選擇時構建體的選出率范圍。接著將以上選擇的T1植物移植到單獨的盆中并且用不同比率的商用草銨膦除草劑進行噴霧。表10比較了DSM-2 (v2)和對照基因為擬南芥T1轉(zhuǎn)化體賦予草銨膦抗性的響應(response)。響應按照％可見損傷2WAT來表現(xiàn)。將數(shù)據(jù)表示為展現(xiàn)非常小的損傷或無損傷的個體(＜20％)、展現(xiàn)中度損傷的個體(20-40％)或展現(xiàn)重度損傷的個體(＞40％)的柱狀圖。由于每個T1是獨立的轉(zhuǎn)化事件(event)，可以預見在給定的比率內(nèi)單獨的T1響應的顯著變化。顯示了每個處理的算數(shù)平均值和標準差。未轉(zhuǎn)化-野生型擬南芥充當草銨膦敏感型對照。DSM-2 (v2)基因為單獨的T1擬南芥植物賦予了除草劑抗性。在給定的處理中，植物響應的水平差異很大，并且可能歸因于每株植物代表獨立的轉(zhuǎn)化事件這個事實。值得注意的是，在140g ai/ha草銨膦以上，存在不受影響的個體，而一些個體則受到嚴重影響。按照比率的整體種群損傷均值示于表10，僅為說明用DSM-2 (v2)轉(zhuǎn)化的植物與野生型或用AAD-12+PAT轉(zhuǎn)化的對照之間的顯著差異。許多DSM-2(v2)個體在1,120g ai/ha草銨膦存活，損傷非常小或無損傷。

6.6-DSM-2 (v2)作為選擇性標記。
如上所述用轉(zhuǎn)化的擬南芥分析了在使用草銨膦作為選擇劑時使用DSM-2 (v2)作為選擇性標記的能力。將大約100顆含有DSM-2 (v2)的T1代擬南芥種子(100-150顆種子)或2mg含有PAT的純合T5植物加入(spike into)大約10,000顆野生型(敏感型)種子。每托盤植物在以下處理時間接受兩次280gai/ha草銨膦的施用時機7DAP和11DAP。處理用DeVilbiss噴頭如前文所述施用。播種來自每種的另外2mg T1代擬南芥種子并且不進行噴霧以作為比較計數(shù)。在17DAP鑒定出植物是抗性的或敏感性的。處理和未處理之間的計數(shù)在表11中表現(xiàn)相似。這些結果說明DSM-2 (v2)能夠有效地用作種群的另一種選擇性標記。
表11.播種種子的質(zhì)量和在280g ai/ha草銨膦處理之后存活的植物數(shù)的計數(shù) 處種植的WT 種植的PAT 種植的DSM-2在草銨膦噴霧之后 理的質(zhì)量 的質(zhì)量 (v2)的質(zhì)量 的存活植物數(shù) 1 200mg 0mg0mg0 2 0mg 2mg0mg154 3 200mg2mg0mg121 4 0mg 0mg2mg117 5 200mg0mg2mg121 6.7-分子分析 6.7.1-從組織收獲的DNA的分離和定量為Xμl 將新鮮組織置于試管中并且在4℃冷凍干燥2天。組織完全干燥之后，將鎢珠(Heavy Shot)置于試管中，并且使用Kelco珠研磨器(bead mill)對樣品進行1分鐘的干磨。然后是標準DNeasy DNA分離流程(Qiagen，DNeasy69109)。然后將提取的DNA的等分試樣用Pico Green(Molecular ProbesP7589)染色并且在熒光計(Wavelength 485/530-BioTek)上讀數(shù)，使用已知的標準品來獲得以ng/μl為單位的濃度。
6.7.2-侵入測定分析Xμl(Invader assay analysis Xμl) 將DNA樣品稀釋到0.7ng/μl，然后通過在熱循環(huán)儀中以95℃溫育10分鐘來變性。然后按照Third Wave Technologies發(fā)布的96孔模式流程制備侵入測定反應混合物。將7.5μl制備的反應混合物分裝入96孔平板的每個孔中，然后加入7.5μl對照和0.7ng/μl經(jīng)稀釋變性的未知樣品的等分試樣。每個孔用15μl礦物油(Sigma)覆蓋。然后將平板在63℃溫育1小時并且在熒光儀(Biotek)上讀數(shù)。用靶探針(FAM染料波長560/620)相對于背景的％信號除以相對于背景的內(nèi)部對照探針(RED染料波長485/530)的％信號進行的計算將算出比值。然后使用所述比值決定事件的接合性(event′s zygosity)。
6.8-遺傳率 將多種T1事件自花授粉產(chǎn)生T2種子。通過向100個隨機的T2同胞種(sibling)施用草銨膦(200g ai/ha)對這些種子進行子代測試。將每個單獨的T2植物移植到3英寸見方的盆中，然后進行噴霧施用(以187 L/ha的施用率，用軌道噴霧器)。63％的T1家族(T2植物)分離成孟德爾遺傳對顯性遺傳的單一基因座所預期的3抗性1敏感性模型，如通過X方分析所測定的(P＞0.05)。
對接合性的侵入是對來自每個作為單一基因座分離的品系的16株隨機選擇的植物進行的。從純合侵入測定的T2個體收集種子(T3種子)。對來自4個純合侵入測定的T2家族中的各25個T3同胞種如前文所述進行子代測試。全部被預測為純合的(非分離型種群)T2家族均為非分離型。這些數(shù)據(jù)證明DSM-2 (v2)穩(wěn)定整合并以孟德爾方式遺傳了至少三代。
實施例7.使用HERBIACE對玉米的晶須介導轉(zhuǎn)化 7.1-克隆DSM-2 (v2) 將DSM-2 (v2)基因從DASPICO45載體作為Bbs1/Sac1片段切下。將其定向連接至以類似方法切割的pDAB3812載體中，所述載體含有ZmUbi1單子葉植物啟動子。使用T4DNA連接酶將所述兩個片段連接起來，并且轉(zhuǎn)化至DH5α細胞中。使用Qiagen’s QIASpin小量制備試劑盒對所得菌落進行小量制備，并且消化菌落以檢查方向。將最終的構建體命名為pDAB3250，其含有ZmUbi1/DSM-2 (v2)/ZmPer5。如上構建了含有PAT基因的相同的對照載體。將此構建體命名為pDAB3251。
7.2-愈傷組織/懸浮液起始。
為了獲得未成熟的胚用于愈傷組織培養(yǎng)起始，進行在溫室培養(yǎng)的Hi-II親本A和B(Armstrong等1991)之間的F1雜交。當胚大小為1.0-1.2mm時(大約在授粉后9-10天)，收獲穗(ear)并且通過用

皂擦洗、浸入70％乙醇2-3分鐘、再浸入20％商用漂白劑(0.1％次氯酸鈉)30分鐘來進行表面滅菌。
在無菌蒸餾水中清洗穗，并且將未成熟的合子胚無菌地切下并且在15Ag10培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(Chu等，1975)，1.0mg/L 2，4-D，20g/L蔗糖，100mg/L酪蛋白水解物(酶促消化)，25mM L-脯氨酸，10mg/L AgNO3，2.5g/LGelrite，pH 5.8)上培養(yǎng)2-3周，其中盾片(scutellum)朝著培養(yǎng)基之外的方向(facing away from the medium)。將顯示正確形態(tài)的組織(Welter等，1995)以兩周的間隔選擇性地轉(zhuǎn)移至新鮮的15Ag10培養(yǎng)基上，持續(xù)約6周，然后以兩周的間隔轉(zhuǎn)移至4培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，1.0mg/L 2，4-D，20g/L蔗糖，100mg/L酪蛋白水解物(酶促消化)，6mM L-脯氨酸，2.5g/L Gelrite，pH 5.8)，持續(xù)大約2個月。
為了起始胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)，將源自單一胚的大約3ml收集細胞體積(PCV)的愈傷組織加入大約30ml H9CP+液體培養(yǎng)基(MS基礎鹽混合物(Murashige and Skoog，1962)，修改的MS維生素，含1/10(10-fold less)的煙酸和5倍的鹽酸硫胺素，2.0mg/L 2，4-D，2.0mg/L α-萘乙酸(NAA)，30g/L蔗糖，200mg/L酪蛋白水解物(酸消化)，100mg/L肌醇，6mM L-脯氨酸，5％v/v椰子汁(coconut water)(傳代培養(yǎng)之前即刻添加)，pH 6.0)。將懸浮培養(yǎng)在溫控振蕩裝置中以125rpm于28℃在黑暗條件下保持在125mlErlenmeyer燒瓶中。細胞系通常在起始后2-3個約開始建立。在建立過程中，通過每3.5天使用寬孔移液管將3ml PCV的細胞和7ml經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基加入20ml新鮮的H9CP+液體培養(yǎng)基對懸浮液進行傳代培養(yǎng)。一旦組織開始成倍生長，按比例增加懸浮液并且保持在500ml燒瓶中，其中將12ml PCV的細胞和28ml經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至80ml H9CP+培養(yǎng)基中。一旦懸浮液完全建立，將它們冷藏保存?zhèn)溆谩?br> 7.3-懸浮液的冷藏保存和融化 傳代培養(yǎng)2天之后，將4ml PCV的懸浮細胞和4ml經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基加入8ml冷凍保護劑(溶于不含椰子汁的H9CP+培養(yǎng)基，1M甘油，1M DMSO，2M蔗糖，過濾除菌)，并且使其在125ml燒瓶中于4℃以125rpm振蕩1小時。1小時之后，向冷的5.0ml Corning冷凍管加入4.5ml。一旦裝入，將單獨的小管在速度受控的冰箱中于4℃保持15分鐘，然后使其以-0.5℃/分鐘的速度冷凍直至達到-40℃的最終溫度。在達到最終溫度之后，將小管轉(zhuǎn)移至充滿液氮蒸汽的Cryoplus 4貯藏單元(Forma Scientific)內(nèi)擱架中的盒子里。
為了解凍，將小管從貯藏單元中移出并置于閉合的干冰容器中，然后投入保持在40-45℃的水浴直至“沸騰”消退。解凍之后，將內(nèi)容物倒在有蓋的100×25mm培養(yǎng)皿中一疊～8張無菌的70mm Whatman濾紙(No.4)上。允許幾分鐘使液體吸入濾紙，然后將含有細胞的頂部濾紙轉(zhuǎn)移至GN6培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，2.5g/L Gelrite，pH 5.8)上，保持1周。1周之后，僅將具有有希望的形態(tài)的組織從濾紙上移下直接移到新鮮的GN6培養(yǎng)基上。每7-14天對這種組織進行傳代培養(yǎng)，直到1-3克可用于懸浮，懸浮在125ml Erlenmeyer燒瓶中大約30mL H9CP+培養(yǎng)基中起始。每3.5天將3ml PCV傳代培養(yǎng)至新鮮的H9CP+培養(yǎng)基中直到獲得總共12mlPCV，進行傳代培養(yǎng)的點如前文所述。
在轉(zhuǎn)化之前大約24小時，將12ml PCV之前冷凍保藏的胚發(fā)生玉米懸浮細胞加上28ml經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基在500ml Erlenmeyer燒瓶中80ml GN6液體培養(yǎng)基(不含Gelrite的GN6培養(yǎng)基)中傳代培養(yǎng)，并且置于28℃、125rpm的搖床上。使用相同的細胞系將此重復2次，由此將總共36ml PCV分配在3個燒瓶中。在24小時之后，去除GN6液體培養(yǎng)基，并且用每瓶72ml GN6S/M滲透培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，45.5g/L山梨糖醇，45.5g/L甘露醇，100mg/L肌醇，pH 6.0)代替以使細胞的質(zhì)壁分離(plasmolyze)。將燒瓶置于黑暗中的搖床上30-35分鐘，并且在這段時間期間通過向～405mg預先高壓滅菌的碳化硅晶須(Advanced Composite Materials，Inc.)添加適當體積的GN6S/M液體培養(yǎng)基來制備50mg/ml碳化硅晶須的懸浮液。
在GN6S/M中的溫育之后，將每個燒瓶的內(nèi)容物匯集在250ml離心瓶中。一旦全部細胞沉降在底部，將幾乎～14ml的GN6S/M液排出，并且收集在無菌的1-L燒瓶中備用。將預濕的晶須懸浮液以最高速渦旋振蕩60秒，再將8.1ml加入瓶中，向所述瓶中加入170μg DNA作為最后一步。將瓶子立即置于改良的Red Devil 5400商用涂料混合器中并且攪拌10秒。攪拌之后，將細胞、培養(yǎng)基、晶須和DNA的混合物與125ml新鮮GN6液體培養(yǎng)基一起加入1-L燒瓶的內(nèi)容物以減少滲壓劑(osmoticant)。使細胞在搖床上恢復2小時，然后在Whatman#4濾紙(5.5cm)上進行過濾，使用與房屋真空管道(house vacuum line)連接的玻璃細胞收集裝置。
在用真空抽吸的同時將大約6mL分散的懸浮液用移液管吸至濾紙的表面上。將濾紙置于60×20mm GN6培養(yǎng)基的平板上。將平板在暗盒中于28℃培養(yǎng)1周。
1周之后，將20張濾紙轉(zhuǎn)移至60×20mm平板中的GN6(1Herbiace)，將20張濾紙轉(zhuǎn)移至60×20mm平板中的GN6(2Herbiace)，并且將20張濾紙轉(zhuǎn)移至60×20mm平板中的GN6(4Herbiace)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L2，4-D，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，1、2或4mg/L雙丙氨酰膦(來自Herbiace)和，2.5g/L Gelrite，pH 5.8)。將平板置于盒中并且再培養(yǎng)額外的一周。
額外的一周之后，再次將全部濾紙轉(zhuǎn)移至相同濃度的GN6+Herbiace培養(yǎng)基(1H、2H和/或4H)。將平板置于盒中并且再培養(yǎng)額外的一周。
轉(zhuǎn)化之后三周，通過將平板上1/2的細胞刮下放入含有1、2或4mg/L來自Herbiace的雙丙氨酰膦的3.0mL融化的GN6瓊脂糖培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，7g/L Sea Plaque瓊脂糖，pH 5.8，在121℃高壓滅菌僅10分鐘)，將組織包埋。將組織打碎(break up)并且將3mL瓊脂糖和組織根據(jù)細胞最初在其上進行培養(yǎng)的濃度均勻地倒在100×15mm的GN6平板(1H、2H或4H)表面上。用每個平板上的另外1/2的細胞重復此過程。一旦包埋，將平板單獨地用

或Parafilm

密封，然后在暗盒中于28℃培養(yǎng)約4周。
7.4-用于植物再生的方案。
推定得到轉(zhuǎn)化的分離株通常最先在轉(zhuǎn)化之后5-8周可見。將任何潛在的分離株從包埋平板中移出，并且轉(zhuǎn)移至60×20mm平板中相同濃度的新鮮選擇培養(yǎng)基。如果在大約2周之后，明顯有持續(xù)不變的生長，那么認為該事件為抗性的。然后將抗性事件的亞組進行分子分析。
通過將愈傷組織轉(zhuǎn)移至基于細胞分裂素的誘導培養(yǎng)基28(1H)來起始再生，所述培養(yǎng)基含有(MS鹽和維生素，30.0g/L蔗糖，5mg/L BAP，0.25mg/L2，4-D，1mg/L雙丙氨酰膦，2.5g/L Gelrite；pH 5.7)。使細胞在低光照(13μEm-2s-1)條件下生長一周，然后在高光照(40μEm-2s-1)條件下再生長一周，之后轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基36(1H)，其與28(1H)相同，除了它缺乏植物生長調(diào)節(jié)劑。將小(3-5cm)植株移出并且置于含有非選擇性SHGA培養(yǎng)基(Schenk andHildebrandt basal salts and vitamins(基礎鹽和維生素)，1972；1g/L肌醇，10g/L蔗糖，2.0g/L Gelrite，pH 5.8)的150×25-mm培養(yǎng)管中。一旦小植株發(fā)育了足夠的根和莖系統(tǒng)，將它們移植到溫室的土壤中。
7.5-分子分析玉米材料和方法 7.5.1-從組織收獲的DNA的分離和定量。
將新鮮組織置于試管中并且在4℃冷凍干燥2天。組織完全干燥之后，將鎢珠(Valenite)置于試管中，并且使用Kelco珠研磨器(bead mill)對樣品進行1分鐘的干磨。然后是標準DNeasy DNA分離流程(Qiagen，DNeasy 69109)。然后將提取的DNA的等分試樣用Pico Green(Molecular Probes P7589)染色并且在熒光計(BioTek)上讀數(shù)，使用已知的標準品來獲得以ng/μl為單位的濃度。
7.5.2-PAT侵入測定分析。
將DNA樣品稀釋到20ng/μl，然后通過在熱循環(huán)儀中以95℃溫育10分鐘來變性。然后使用提供的寡聚混合物和MgCl2(Third Wave Technologies)來制備信號探針混合物。將7.5μl的等分試樣置于侵入測定平板的每個空中，接著是對照、標準品和20ng/μl稀釋的未知樣品的7.5μl等分試樣。每個孔用15μl礦物油(Sigma)覆蓋。然后將平板在63℃溫育1小時并且在熒光儀(Biotek)上讀數(shù)。用靶探針相對于背景的％信號除以相對于背景的內(nèi)部對照探針的％信號進行的計算將算出比值。開發(fā)并使用Southern印跡分析驗證的已知拷貝標準品的比值被用來鑒定未知事件的估計拷貝。
7.5.3-對PAT的聚合酶鏈式反應 將總共100ng的總DNA用作模板。將20mM的每種引物與Takara ExTaq PCR聚合酶試劑盒(Mirus TAKRR001A)一起使用。用于PATPTU的引物是(正向MAS123-GAACAGTTAGACATGGTCTAAAGG)(SEQ ID NO5)和(反向Per5-4-GCTGCAACACTGATAAATGCCAACTGG)(SEQ ID NO6)。將PCR反應在9700Geneamp熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)中進行，通過使樣品經(jīng)歷94℃3分鐘，和35個循環(huán)的94℃30秒、62℃30秒和72℃3分15秒，接著是72℃10分鐘。用于編碼區(qū)PCR PAT的引物是(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQ ID NO7)和(反向-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQ ID NO8)。將PCR反應在9700Geneamp熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)中進行，通過使樣品經(jīng)歷94℃3分鐘，和35個循環(huán)的94℃30秒、65℃30秒和72℃1分45秒，接著是72℃10分鐘。用于DSM-2的編碼區(qū)PCR的引物是(正向-ATGCCTGGAACTGCTGAGGTC)(SEQ ID NO9)和(反向-TGAGCGATGCCAGCATAAGCT)(SEQ ID NO10)。將PCR反應在9700Geneamp熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)中進行，通過使樣品經(jīng)歷94℃3分鐘，和35個循環(huán)的94℃30秒、65℃30秒和72℃45秒，接著是72℃10分鐘。通過用EtBr染色的1％瓊脂糖凝膠上的電泳來分析PCR產(chǎn)物。
75.4-Southern印跡分析。
用獲得自Qiagen DNeasy試劑盒的總DNA進行了Southern印跡分析。對總共5μg的總基因組DNA用NcoI和SwaI進行過夜消化以獲得整合數(shù)據(jù)。將用限制酶SspI進行的5μg消化用于獲得PTU數(shù)據(jù)。在分析了SspI消化數(shù)據(jù)之后，使用限制酶MfeI來消化全部剩余的樣品，因為MfeI在酶中似乎是更好的選擇。在過夜消化之后，將～100ng的等分試樣在1％凝膠上運行以確保完全消化。在這種確認之后，將樣品在大的0.85％瓊脂糖凝膠上以40伏過夜運行。然后將所述凝膠在0.2M NaOH、0.6M NaCl中變性30分鐘。然后將凝膠在pH 7.5的0.5M Tris HCl、1.5M NaCl中中和30分鐘。然后設置一個含有20xSSC的凝膠裝置以獲得凝膠向尼龍膜(Millipore INYC00010)的過夜重力轉(zhuǎn)移。在過夜轉(zhuǎn)移之后，再藉由交聯(lián)儀(Stratagene UV交聯(lián)儀1800)在120,000微焦耳對所述膜施以UV光。然后將膜在0.1％SDS、0.1SSC中洗滌45分鐘。45分鐘洗滌之后，將膜在80℃烘烤3小時，再于雜交之前貯藏在4℃。使用質(zhì)粒DNA使用編碼區(qū)PCR制備雜交模板片段。將產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上運行，再切下，然后使用Qiagen(28706)凝膠提取方法進行凝膠提取。然后將膜在60℃在Perfect Hyb緩沖液(Sigma H7033)中進行預雜交步驟1小時。使用Prime it RmT dCTP-標記反應(Stratagene 300392)來開發(fā)基于p32的探針(Perkin Elmer)。使用Probe Quant.G50柱(Amersham27-5335-01)提純所述探針。使用每毫升雜交緩沖液兩百萬計數(shù)CPM來過夜雜交Southern印跡。過夜雜交之后，再將印跡在0.1％SDS、0.1SSC中在65℃洗滌兩次各20分鐘。然后將印跡過夜曝光于膠片，在-80℃溫育。
7.6-結果 用前文描述的2種構建體(PAT和DSM-2)各自進行了三個晶須介導的玉米轉(zhuǎn)化。從這些全部實驗，回收了230個分離株。在含有1和2mg/L雙丙氨酰膦(來自Herbiace)的培養(yǎng)基上，PAT和DSM-2之間的事件回收率非常相似，然后，在含有4mg/L雙丙氨酰膦的培養(yǎng)基上，PAT的事件回收率高于DSM-2。
表.實施例7.6-1
藉由Southern印跡分析對用1或2Herbiace選擇的48個DSM-2事件進行拷貝數(shù)分析和完整植物轉(zhuǎn)化單元(PTU)的存在性(分析)。全部48個事件含有至少一個拷貝的DSM-2基因。將得自較低拷貝事件(3個或更少)的結果的亞組示于下文。
表.實施例7.6-2
分別藉由侵入測定法和PCR對用1、2或4Herbiace選擇的48個PAT事件進行拷貝數(shù)評估和完整植物轉(zhuǎn)化單元(PTU)的存在性(分析)。全部48個事件含有至少一個拷貝的PAT基因。將得自較低拷貝事件(3個或更少)的結果的亞組示于下文。
表.實施例7.6-3 從前文列出的15個含DSM-2的事件各自再生了大約6-10株T0植物，并且從7個含PAT的事件再生了大約7-8株植物，用于評估對Liberty的耐受。
用Western印跡實驗分析了來自31個不同事件的愈傷組織樣品以及未經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織(陰性對照)。除了陰性對照之外的所有樣品都具有一條相對于標記的相對分子量為20kDa的條帶。這與預測的19.7kDa的蛋白質(zhì)大小相符。此外，該條帶還與標準品具有相同的大小，所述標準品即純化自大腸桿菌的純化的DSM-2蛋白。使用凝膠上0.7μg/mL的標準品并且為其給出5(+++++)的假定得分，對來自不同事件的條帶進行了相對評級，并且在下表中列出。
表.實施例7.6-4 7.6.1-T0玉米中的葉涂敷直接比較 用向下流的草銨膦除草劑(a rundown of glufosinate herbicide)涂敷T0DSM-2(v2)植物。測試了來自15個T0事件中每一個的同胞種，并且每株單獨植物的4片葉在大約V8階段接受了向下流的草銨膦。將流下處理(rundowntreatment)隨機化成各種比率，使得在單獨葉片上的處理位置產(chǎn)生變化。對于玉米，0.25％v/v草銨膦是分辨敏感植物和具有有意義的抗性水平的植物的最低有效劑量。還施用了升高的比率以測定抗性的相對水平(0.5％、1.0％和2.0％v/v)。使用棉花棒(cotton tipped applicator)將草銨膦處理施用到大約直徑2.5cm的處理區(qū)中。
表11比較了DSM-2 (v2)和對照基因?qū)τ跒橛衩譚0轉(zhuǎn)化體賦予草銨膦抗性的響應。響應按照％可見損傷2WAT來表現(xiàn)。將數(shù)據(jù)表示為展現(xiàn)非常小的損傷或無損傷的個體(＜20％)、展現(xiàn)中度損傷的個體(20-40％)或展現(xiàn)重度損傷的個體(＞40％)的柱狀圖。由于每個T0是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可以預見在給定的比率內(nèi)單獨的T0響應的顯著變化。顯示了每個處理的算數(shù)平均值和標準差。未轉(zhuǎn)化的野生型玉米充當草銨膦敏感型對照。DSM-2 (v2)基因為單獨的T0玉米植物賦予了除草劑抗性。在給定的處理中，植物響應的水平差異很大，并且可能歸因于每株植物代表獨立的轉(zhuǎn)化事件這個事實。值得注意的是，在高達2％v/v的草銨膦，DSM-2 (v2)整體表現(xiàn)得優(yōu)于用PAT轉(zhuǎn)化的植物。按照比率的整體種群損傷均值示于表11，僅為說明用DSM-2 (v2)轉(zhuǎn)化的植物與野生型或用PAT轉(zhuǎn)化的對照之間的顯著差異。

7.6.2-T2玉米中高草銨膦耐受的確認 將來自T1DSM-2 (v2)x5XH751雜交的種子種植在含有Metro Mix培養(yǎng)基的4英寸盆中，并且在2葉階段在設定為187L/ha的軌道噴霧器中以560g ai/ha草銨膦噴霧以去除無效株(nulls)。在7DAT時，將無效株去除并且在軌道噴霧器中如上所述按以下比率對抗性植物進行噴霧0、560、1120、2240和4480g ai/ha草銨膦。在3和14DAT時對植物進行評級，并且與5XH751x Hi II對照植物比較。下面的表實施例7.6.2-1顯示存在個別DSM-2(v2)植物，其被提供高達2240g ai/ha草銨膦而損傷低于20％。DSM-2 (v2)還提供了與PAT轉(zhuǎn)化的對照類似的對4480g ai/ha草銨膦的耐受。
表.實施例7.6.2-1.T2玉米對出土后(14DAT)施用的一系列草銨膦比率的響應
7.6.3-玉米中DSM-2(v2)遺傳率 將來自T1DSM-2 (v2)x5XH751雜交的種子種植在含有Metro Mix培養(yǎng)基的3英寸盆中，并且在2葉階段在設定為187L/ha的軌道噴霧器中以0、280、560、1120、2240和4480g ai/ha草銨膦噴霧。在3和14DAT時對植物進行評級，并且與5XH751x HiII對照植物比較。用0-100％的可見損傷如前進行植物的評級。為了決定每個種群的分離(segregation)，選擇了1120g ai/ha及更高的比率。對抗性和敏感性植物進行計數(shù)，并且測定了全部T1家族作為單一基因座、顯性孟德爾性狀(1R:1S)分離，如通過X方分析所測定的。將存活的植物自交以產(chǎn)生T2代。當與商用雜交種(hybrid)互交時，DSM-2 (v2)在多個物種中可以作為強力的草銨膦抗性基因遺傳。
還對五個DSM-2 (v2)T2家族進行了子代測試。將種子如上所述種植在3英尺盆中。在3葉階段，如前文所述將全部植物在軌道噴霧器中用560g ai/ha草銨膦噴霧。7DAT之后，對抗性和敏感性植物進行計數(shù)。所測試五個品系中的四個作為單一基因座、顯性孟德爾性狀(3R:1S)分離，如通過X方分析所測定的。
7.6.4-疊加DSM-2 (v2)以增加除草劑譜 進行了T1植物與BE1146RR的雜交?？梢詫SM-2 (v2)-轉(zhuǎn)化的植物方便地培育成其它含有額外的感興趣的性狀的玉米品系。將一種含有草甘膦耐受性狀CP4的近交系(BE1146RR)與含有DSM-2 (v2)的T1植物雜交?？梢酝ㄟ^以等于或超過通常為致死性除草劑比率的比率依次施用草銨膦和草甘膦或施用用罐混合的草銨膦和草甘膦(例如可以用280、560、1120g ae/ha，或更多的，兩種除草劑來對植物進行噴霧)，來測試后續(xù)世代的植物兩種除草劑耐受性狀的效力。這將鑒定在組合施用或相繼施用中使用兩種除草劑用于除草劑抗性管控的能力。
實施例8.藉由抗體從轉(zhuǎn)化的植物檢測蛋白質(zhì) 8.1-多克隆抗體制備 將5毫克純化的DSM-2(參見前節(jié))遞送至Invitrogen Custom AntibodyServices(South San Francisco，CA)用于兔多克隆抗體制備。兔在12周期間接受了4次注射，每次注射包含懸浮在1mL不完全弗氏佐劑中的0.5mg所述純化蛋白。在直接ELISA和Western印跡實驗二者中測試了血清以確認特異性和親和力。
8.2-從愈傷組織提取DSM-2 將使用單孔打孔器得到的4片玉米(Hi-II)葉盤(leaf discs)放入微量離心管中，所述管中含有2顆不銹鋼珠(4.5mm；Daisy Co.，目錄號145462-000)和500μL植物提取緩沖液(PBS，含0.1％Triton X-100和5μL/mL蛋白酶抑制劑混合物(Sigma Cat # P9599))。將離心管固定在Geno/Grinder(Model2000-115，Certiprep，Metuchen，NJ)中并且用1x的500rpm設定振蕩6分鐘。將離心管在5000xg離心10分鐘并且在Western印跡實驗中測定了含有可溶性蛋白的上清液以檢測DSM-2的存在。
8.3-Western印跡分析 向葉提取物摻入不同濃度的純化DSM-2，并且與Laemmli樣品緩沖液一起在95℃溫育10分鐘，然后在8-16％Tris-甘氨酸預制凝膠中進行電泳分離。其后將蛋白質(zhì)使用標準方案電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。在PBS中4％的脫脂奶中封閉之后，用抗DSM-2抗血清繼之以山羊抗兔/HRP綴合物來檢測DSM-2蛋白。將檢出的蛋白質(zhì)通過化學發(fā)光底物ECL Western分析試劑(Amersham Cat.#RPN 21058)來顯影。
8.4-結果 使用在大腸桿菌細胞中表達并且從大腸桿菌細胞中純化的蛋白質(zhì)生成了DSM-2的多克隆抗體。在4次注射之后，抗血清具有比直接ELISA中觀察到的更高的抗DSM-2抗體效價。在100,000倍稀釋后，所述血清仍提供了背景之上六倍的信號。
在(對野生型玉米(Hi-II)葉基(leaf matrix)中DSM-2的)Western印跡分析中，所述血清能夠檢測到大約22kDa的主條帶，其與基于DSM-2 (v2)基因的預測分子量相當。當向提取物以最低測試濃度5ng/mL摻入時，仍能檢測到同一條帶。在高DSM-2濃度還觀察到了次要條帶，認為這些條帶是靶蛋白的聚合體，因為在較低濃度沒有觀察到。觀察到了分子量與預測分子量相當?shù)膯我恢鳁l帶。(在此凝膠上運行的泳道是分子量標記、和含有濃度分別為0.005、0.05、0.5和5μg/mL的DSM-2蛋白的葉提取物。)此外，多克隆抗體不與任何玉米葉蛋白交叉反應，因為幾乎觀察不到背景信號。
使用Western印跡分析測定了自轉(zhuǎn)化的煙草愈傷組織表達的DSM-2。在不同的事件中觀察到了與標準(大約22kDa)具有相當?shù)拇笮〉臋z出條帶，說明DSM-2在轉(zhuǎn)基因煙草組織中得到了表達。
實施例9.煙草(細胞培養(yǎng)物)轉(zhuǎn)化 在轉(zhuǎn)化之前4天，通過向NT-1B培養(yǎng)基加入2ml的NT-1培養(yǎng)物或1ml壓緊的細胞，將每7天傳代培養(yǎng)一次的1周齡NT-1煙草懸浮液傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基。將傳代培養(yǎng)的懸浮液保持在黑暗中25+1℃下125rpm的搖床上。
表.實施例9-1 NT-1培養(yǎng)基配方 試劑 每升 使用含有感興趣的二元載體的根癌農(nóng)桿菌[菌株LBA4404]的50％甘油儲液，通過向含有50-100mg/L壯觀霉素的30ml YEP液(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl、0-10g/L蔗糖)中加入20、100或500μl來起始液態(tài)過夜培養(yǎng)。將所述細菌培養(yǎng)物在150-250rpm的溫育搖床中在28℃黑暗條件下溫育指導OD600為1.5±0.2。這大約需要18-20小時。
對于測試的每種載體，將20-70mL 4天時間的懸浮細胞轉(zhuǎn)移至無菌容器(vessel)中，向其中添加500-1750μl的適當OD的農(nóng)桿菌懸浮液。為了確保獲得均勻的混合物，將細胞用10ml寬孔移液管上下吹吸5次。然后將均勻的懸浮液吸入重復移液器的25ml桶中，并且將250μl所述懸浮液分配至24孔平板的每個孔中，持續(xù)分配直到懸浮液耗盡。將多孔平板用Parafilm包裹，并且在黑暗中于25±1℃不搖動地共培養(yǎng)3天。
共培養(yǎng)之后，用1mL移液管頭將全部多余的液體從每個孔中移出，并且將剩余的細胞重懸在1ml NTC液(NT-1B培養(yǎng)基，含500mg/L羧芐青霉素，在高壓滅菌之后添加)中。將單獨的孔中的內(nèi)容物使用一次性移液器分散到100×25mm選擇平板的整個表面上。選擇培養(yǎng)基由用8g/l TC瓊脂固化的NTC培養(yǎng)基組成，補充有在高壓滅菌后添加的7.5-15mg/L雙丙氨酰膦或工業(yè)級草銨膦(glufosinate ammonium)。將全部選擇平板(不包裹)保持在28℃黑暗中。
推定的轉(zhuǎn)化體作為小簇愈傷組織出現(xiàn)在死亡的、未轉(zhuǎn)化細胞的背景上。在轉(zhuǎn)化之后大約2-6周將愈傷組織分離。將每個愈傷組織分離體轉(zhuǎn)移至它自己的60×20mm平板，所述平板含有相同的選擇培養(yǎng)基，并且允許其在進行分析之前生長大約2周。
9.1-結果 完成了將DSM-2 (v2)與PAT進行比較的并排實驗(side-by-sideexperiment)。在該研究中，100％的PAT選擇平板在10mg/L雙丙氨酰膦培養(yǎng)基上產(chǎn)生了至少一個PCR陽性分離體，而79％的DSM-2 (v2)選擇平板產(chǎn)生了至少一個PCR陽性分離體。藉由編碼區(qū)PCR測定了全部事件中DSM-2 (v2)或PAT基因的存在，并且發(fā)現(xiàn)均為陽性。
表.實施例9-2 對DSM-2 (v2)選擇的事件的小亞組進行了Western印跡，并且如以下數(shù)據(jù)中所示鑒定了三個陽性事件。在第二個實驗中，在7.5、10、12.5或15mg/L雙丙氨酰膦或工業(yè)級草銨膦之上對用DSM-2 (v2)處理的煙草進行了選擇。下表中列出了通過編碼區(qū)PCR確認之后的轉(zhuǎn)化頻率(產(chǎn)生至少一個愈傷組織的選擇平板的％)。
表.實施例9-3 實施例10.其它作物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 受到主題內(nèi)容的啟發(fā)，可以按照主題的發(fā)明使用本領域已知的技術轉(zhuǎn)化其它作物。對于農(nóng)桿菌介導的黑麥轉(zhuǎn)化，參見，例如，Popelka and Altpeter(2003)。對于農(nóng)桿菌介導的大豆轉(zhuǎn)化，參見，例如，Hinchee等，1988。對于農(nóng)桿菌介導的高粱轉(zhuǎn)化，參見，例如，Zhao等，2000。對于農(nóng)桿菌介導的大麥轉(zhuǎn)化，參見，例如，Tingay等，1997。對于農(nóng)桿菌介導的小麥轉(zhuǎn)化，參見，例如，Cheng等，1997。對于農(nóng)桿菌介導的稻轉(zhuǎn)化，參見，例如，Hiei等，1997。
這些植物和其它植物的拉丁名在下文給出。應該清楚這些及其它(非農(nóng)桿菌)轉(zhuǎn)化技術可以用于將DSM-2 (v1)，例如，轉(zhuǎn)化至這些植物和其它植物中，所述植物包括但不限于玉米(禾本科(Gramineae)玉米(Zea mays))、小麥(早熟禾亞科(Pooideae)小麥屬物種(Triticum spp.))、稻(禾本科稻屬物種(Oryzaspp.)和菰屬物種(Zizania spp.))、大麥(早熟禾亞科大麥屬物種(Hordeumspp.))、棉花(昂天蓮屬雙子葉植物綱昂天蓮(Abroma Dicotyledoneae Abromaaugusta)和錦葵科(Malvaceae)棉屬物種(Gossypium spp.))、大豆(大豆(Soya)豆科(Leguminosae)大豆(Glycine max))、糖甜菜(sugar beet)(藜科(Chenopodiaceae)甜菜(Beta vulgaris altissima))、甘蔗(桄榔(Arenga pinnata))、番茄(茄科(Solanaceae)番茄(Lycopersicon esculentum)和番茄屬其它物種、Physalis ixocarpa、黃水茄(Solanum incanum)和茄屬其它物種、和樹番茄(Cyphomandra betacea))、馬鈴薯、甘薯、黑麥(早熟禾亞科黑麥屬物種(Secalespp.))、胡椒(pepper)(茄科辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum sinense和Capsicum frutescens)、萵苣(菊科(Compositae)萵苣(Lactuca sativa)、Lactucaperennis和Lactuca pulchella)、甘藍、芹菜(傘形科(Umbelliferae)旱芹(Apiumgraveolens))、茄(茄科茄(Solanum melongena))、高粱(全部高粱屬物種(Sorghumspecies))、苜蓿(豆科紫苜蓿(Medicago sativum))、胡蘿卜(傘形科胡蘿卜(Daucus carota sativa))、菜豆(beans)(豆科菜豆屬物種(Phaseolus spp.)和其它的屬)、燕麥(燕麥(Avena Sativa)和Avena Strigosa)、豌豆(豆科豌豆屬(Pisum)、豇豆屬(Vigna)和Tetragonolobus spp.)、向日葵(菊科向日葵(Helianthusannuus))、西葫蘆(雙子葉植物綱南瓜屬物種(Cucurbita spp.))、黃瓜(雙子葉植物綱屬)、煙草(茄科煙草屬物種(Nicotiana spp.))、擬南芥(十字花科(Cruciferae)擬南芥(Arabidopsis thaliana))、草皮草(黑麥草屬(Lolium)、剪股穎屬(Agrostis)和其它科)和三葉草(豆科)。這樣的植物，含DSM-2 (v2)基因，例如，包括在主題的發(fā)明中?？梢酝ㄟ^選擇性地施用草銨膦來改進對于因使用DSM-2 (v2)轉(zhuǎn)化而導致被賦予草銨膦或雙丙氨酰膦抗性的植物的植被控制。
DSM-2 (v2)具有增加能夠用DSM-2滅活的除草劑(例如草銨膦、雙丙氨酰膦和/或膦絲菌素)用于在多種落葉和常綠木材種植系統(tǒng)中季節(jié)性使用(in-season use)的可應用性的潛力。草銨膦或雙丙氨酰膦抗性木材物種將增加過度使用這些除草劑的靈活性而沒有造成損傷的顧慮。這些物種將包括，但不限于榿木(alder)、梣樹(ash)、楊樹(aspen)、山毛櫸(beech)、樺木(birch)、櫻桃樹(cherry)、桉樹(eucalyptys)、山核桃(hickory)、槭樹(maple)、橡樹(oak)、松樹(pine)和楊樹(poplar)。在觀賞性物種中使用草銨膦或雙丙氨酰膦抗性用于選擇控制也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實例可以包括，但不限于，薔薇(roses)、衛(wèi)矛(Euonymus)、矮牽牛(petunia)、秋海棠(begonia)和萬壽菊(marigolds)。
實施例11.在任意作物中與草甘膦耐受性狀疊加的DSM-2(V2) 在北美種植的棉花、油菜和大豆田中的大多數(shù)含有草甘膦耐受(GT)性狀，且GT玉米的采用也在增加。其它GT作物(例如，小麥、稻、糖甜菜和草皮草)已經(jīng)在開發(fā)中，但是迄今尚未投入商用。許多其它草甘膦抗性物種處在實驗到開發(fā)階段(例如，苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜(beet)、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、番茄和煙草；林業(yè)物種如楊樹和楓香樹(sweetgum)；和園藝物種如萬壽菊、矮牽牛和秋海棠；isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005，在萬維網(wǎng)上)。GTC’s是關于由這種系統(tǒng)提供的受控雜草的絕對廣度和便利性和成本效率的一種有價值的手段。然而，草甘膦的利用作為現(xiàn)行標準基礎處理是對草甘膦抗性雜草的選擇。另外，草甘膦對其先天效率較低的雜草遷移(shift)為實施僅含草甘膦的化學工程的田地中的優(yōu)勢種類。通過將DSM-2 (v2)與GT性狀通過常規(guī)育種或通過結合為新轉(zhuǎn)化事件來疊加，可以改進雜草控制效率、靈活性和管控雜草遷移(shift)和除草劑抗性的發(fā)展。在任何單子葉作物或雙子葉作用物種中，可以預見關于改進的雜草控制選擇的多種模式，其中將DSM-2 (v2)和GT性狀疊加 a)可以按標準出土后施用率(420-2160g ae/ha，優(yōu)選560-840g ae/ha)施用草甘膦，用于大多數(shù)草和闊葉雜草物種的控制。對于草甘膦抗性闊葉雜草如小白酒草(Conyza canadensis)或先天難以用草甘膦控制的雜草(例如，鴨跖草屬物種(Commelina spp)、番薯屬物種(Ipomoea spp)等)的控制，可以相繼地、用罐混合地或作為與草甘膦的預混合物施用280-2240g ae/ha(優(yōu)選350-1700g ae/ha)草銨膦以提供有效控制。
b)目前，GTC’s中的草甘膦施用率通常在每次施用時560-2240g ae/ha的范圍。草甘膦對草類物種比對闊葉雜草物種遠為有效。DSM-2 (v2)+GT的疊加性狀將允許草有效性草甘膦比率(105-840g ae/ha，更優(yōu)選210-420gae/ha)。然后可以相繼地、用罐混合地或作為與草有效比率的草甘膦的預混合物施用草銨膦(按照280-2240g ae/ha，更優(yōu)選地350-1700g ae/ha)以提供必要的闊葉雜草控制。
本領域技術人員將認識到，可以通過用DSM-2 (v2)轉(zhuǎn)化植物而使其它除草劑(例如雙丙氨酰膦)能夠作用。具體的比率可以通過CPR(Crop ProtectionReference)書或相似編著中匯編的除草劑標簽、線上(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的標簽或任何商用的或?qū)W術的作物保護指南例如Crop Protection Guide fromAgriliance(2003)來確定。每種通過DSM-2 (v2)而能夠在HTC中使用的除草劑，無論是單獨使用、用罐混合使用、或相繼使用，均認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例12.在任意作物中與AHAS性狀疊加的DSM-2 (v2) 咪唑啉酮除草劑耐受(AHAS，等)目前存在于多種在北美終止的作物中，包括但不限于，玉米、稻和小麥。其它咪唑啉酮耐受作物(例如，棉花和糖甜菜)已經(jīng)處于開發(fā)中，但是至今尚未投入商用。許多咪唑啉酮除草劑(例如，咪草啶酸、咪草煙、滅草喹和甲咪唑煙酸)目前選擇性地用于多種常規(guī)作物。通過咪唑啉酮耐受性狀如AHAS等已經(jīng)使得咪草煙、咪草啶酸和非選擇性滅草煙的使用成為可能。目前的商用咪唑啉酮耐受HTC具有非轉(zhuǎn)基因的優(yōu)勢。這種化學種類還具有顯著的土壤參與活性，因此能夠提供延長到施用時間之外的雜草控制，不像基于草甘膦或草銨膦的系統(tǒng)。然而，受咪唑啉酮除草劑控制的雜草譜不像草甘膦那么寬(Agriliance，2003)。另外，許多雜草已經(jīng)發(fā)展出對咪唑啉酮除草劑所具有的作用模式(抑制乙酰乳酸合酶，ALS)的抗性(Heap，2004)。通過將DSM-2 (v2)與咪唑啉酮耐受性狀通過常規(guī)育種或通過結合為新轉(zhuǎn)化事件來疊加，可以改進雜草控制效率、靈活性和管控雜草遷移和除草劑抗性的發(fā)展。在任何單子葉作物或雙子葉作用物種中，可以預見關于改進的雜草控制選擇的多種模式，其中將DSM-2 (v2)和咪唑啉酮耐受性狀疊加 a)可以按標準出土后施用率(35-280g ae/ha，優(yōu)選70-140g ae/ha)施用咪草煙，用于多種草和闊葉雜草物種的控制。
i)ALS-抑制劑抗性闊葉雜草如野莧(Amaranthus rudis)、三裂葉豚草(Amaranthus rudis)、藜(Chenopodium album)(等等，Heap，2004)可以通過用罐混合280-2240g ae/ha，更優(yōu)選350-1700g ae/ha草銨膦來控制。
ii)對咪唑啉酮除草劑先天更耐受的闊葉物種如番薯屬物種也可以通過用罐混合280-2240g ae/ha，更優(yōu)選350-1700g ae/ha草銨膦來控制。
雜草控制領域的技術人員將認識到，通過DSM-2 (v2)轉(zhuǎn)化并且通過常規(guī)育種或遺傳工程與任何咪唑啉酮耐受性狀疊加，使單獨或多重組合的多種商用咪唑啉酮除草劑和基于草銨膦的除草劑中的任一種的使用成為可能。代表這些化學物質(zhì)的其它除草劑的具體比率可以通過CPR(Crop ProtectionReference)書或相似編著中匯編的除草劑標簽、線上(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的標簽或任何商用的或?qū)W術的作物保護指南例如Crop Protection Guide from Agriliance(2003)來確定。每種通過DSM-2 (v2)而能夠在HTC中使用的可選除草劑，無論是單獨使用、用罐混合使用、或相繼使用，均認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例13.稻中的DSM-2 (v2) 13.1-培養(yǎng)基描述 將采用的培養(yǎng)基用1M KOH調(diào)節(jié)至pH 5.8并且用2.5g/l Phytagel(Sigma)固化。將胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)在含有40ml半固體培養(yǎng)基的100×20mm培養(yǎng)皿中。將細胞懸浮液保持在含有35ml液體培養(yǎng)基的125-ml錐形瓶中，并且以125rpm旋轉(zhuǎn)。胚發(fā)生培養(yǎng)物的誘導和保持在黑暗中以25-26℃進行(Zhang等1996)。
胚發(fā)生愈傷組織的誘導和保持在NB基礎培養(yǎng)基上如先前所述(Li等1993)進行，但是改為含有500mg/l谷氨酰胺。懸浮培養(yǎng)在SZ液體培養(yǎng)基(Zhang等1998)中起始并保持，所述培養(yǎng)基包含30g/l蔗糖代替麥芽糖。滲透培養(yǎng)基(NBO)由甘露醇和山梨糖醇各添加了0.256M的NB培養(yǎng)基組成。在補充有8mg/l雙丙氨酰膦的NB培養(yǎng)基上選擇除草劑抗性愈傷組織，進行9周，每3周傳代培養(yǎng)一次。
13.2-組織培養(yǎng)發(fā)育 將水稻(Oryza sativa L.japonica)Taipei 309栽培種的成熟干燥種子如Zhang等1996中所述進行了滅菌。通過在NB培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)無菌的成熟稻種子誘導了胚發(fā)生組織。將直徑大約1mm的原始愈傷組織(primarycallus)從盾片移下并用于起始SZ液體培養(yǎng)基中的細胞懸浮液培養(yǎng)(cellsuspension)。然后將懸浮液如Zhang 1995中所述保持。在前一次傳代培養(yǎng)之后3-5天，將懸浮液衍生的胚發(fā)生組織從液體培養(yǎng)物中移出并且置于NBO滲透培養(yǎng)基上以在培養(yǎng)皿中形成寬約2.5cm的圓，并且在轟擊之前培養(yǎng)4小時。轟擊之后16-20小時，將組織從NBO培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至NBH8 herbiace選擇培養(yǎng)基上，確保受轟擊的表面朝上，并且在黑暗中溫育3周。將新形成的愈傷組織于新鮮NBH8培養(yǎng)基每3周傳代培養(yǎng)兩次。
13.3-微粒轟擊 全部轟擊用Biolistic PDS-1000/HeTM系統(tǒng)(Bio-Rad，Laboratories，Inc.)進行。將3毫克1.0微米直徑的金粒用100％乙醇洗滌一次，用無菌蒸餾水洗滌2此，并且重懸在硅化的Eppendorf管中的50μl水中。向金懸浮液加入5微克質(zhì)粒DNA、20μl亞精胺(0.1M)和50μl氯化鈣(2.5M)。將混合物在室溫溫育10分鐘，以10000rpm進行10s使沉淀形成，在60μl冷100％乙醇中重懸，并且將8-9μl分配至每個大載體(macrocarrier)上。如Zhang等(1996)所述在1100psi和27in的Hg真空(at 1100psi and 27 in of Hg vacuum)對組織樣品進行了轟擊。
實施例14.在任意作物中與AAD-1(V3)疊加的DSM-2(V2) 草銨膦像草甘膦一樣是相對無選擇性、廣譜的草類和闊葉類除草劑。草銨膦的作用模式與草甘膦不同。其作用更快，導致受處理的葉在除草劑施用24-48小時之后干燥且“灼傷”。這對于快速雜草控制的表象是有利的。然而，這也限制了草銨膦向目標植物分生組織區(qū)的易位，導致雜草控制較差，如通過在多種物種中對兩種化合物的相對雜草控制性能評級所證明的(Agriliance，2003)。
通過將AAD-1 (v2)(參見USSN 11/587,893；WO 2005/107437)與草銨膦耐受性狀通過常規(guī)育種或通過結合為新轉(zhuǎn)化事件來疊加，可以改進雜草控制效率、靈活性和管控雜草遷移(shift)和除草劑抗性的發(fā)展。如在前文實施例中提到的，通過用AAD-1 (v3)轉(zhuǎn)化作物，能夠在單子葉作物中選擇性地施用AOPP除草劑，單子葉作物將具有更高的苯氧基生長素安全性限度，而苯氧基生長素能夠選擇性地在雙子葉作物中施用。在任何單子葉作物或雙子葉作用物種中，可以預見關于改進的雜草控制選擇的多種模式，其中將AAD-1 (v3)和草銨膦耐受性狀疊加 a)可以按標準出土后施用率(200-1700g ae/ha，優(yōu)選350-500g ae/ha)施用草銨膦，用于多種草和闊葉雜草物種的控制。至今，尚未確認草銨膦抗性雜草；然而，草銨膦比草甘膦具有更多先天對其更耐受的雜草。
i)先天耐受的草類雜草物種(例如稗屬物種(Echinochloa spp)或高粱屬物種)可以通過用罐混合10-200g ae/ha(優(yōu)選20-100g ae/ha)喹禾靈來控制。
ii)先天耐受的闊葉雜草物種(例如，絲路薊(Cirsium arvensis)和Apocynumcannabinum)可通過用罐混合280-2240g ae/ha，更優(yōu)選560-2240g ae/ha，2，4-D來控制，用于有效控制這些難以控制的多年生物種并改進對一年生闊葉雜草物種的控制力度(robustness)。
b)例如，草銨膦(200-500g ae/ha)+2，4-D(280-1120g ae/ha)+喹禾靈(10-100g ae/ha)的三重組合能夠提供更強的、重疊的雜草控制譜。此外，重疊的譜提供用于管控或延遲(delay)除草劑抗性雜草的其它機制。
實施例15.在任意作物中與AAD-12(V2)疊加的DSM-2(V2) 草銨膦，像草甘膦一樣，是相對無選擇性的、廣譜的草類和闊葉類除草劑。草銨膦的作用模式與草甘膦不同。其作用更快，導致受處理的葉在除草劑施用24-48小時之后干燥且“灼傷”。這對于快速雜草控制的表象是有利的。然而，這也限制了草銨膦向目標植物分生組織區(qū)的易位，導致雜草控制較差，如通過在多種物種中對兩種化合物的相對雜草控制性能評級所證明的(Agriliance，2003)。
通過將AAD-12 (v1)與草銨膦耐受性狀通過常規(guī)育種或通過結合為新轉(zhuǎn)化事件來疊加，可以改進雜草控制效率、靈活性和管控雜草遷移(shift)和除草劑抗性的發(fā)展。在任何單子葉作物或雙子葉作用物種中，可以預見關于改進的雜草控制選擇的多種模式，其中將AAD-12 (v1)和草銨膦耐受性狀疊加 a)可以按標準出土后施用率(200-1700g ae/ha，優(yōu)選350-500g ae/ha)施用草銨膦，用于多種草和闊葉雜草物種的控制。至今，尚未確認草銨膦抗性雜草；然而，草銨膦比草甘膦具有更多先天對其更耐受的雜草。
i)先天耐受的闊葉雜草物種(例如，絲路薊、Apocynum cannabinum和小白酒草)可通過用罐混合280-2240g ae/ha，更優(yōu)選560-2240g ae/ha，2，4-D來控制，用于有效控制這些難以控制的多年生物種并改進對一年生闊葉雜草物種的控制力度。定草酯(triclopyr)和氟草煙在雜草控制方案中將是值得考慮的可取成分。對于定草酯，使用率將通常在70-1120g ae/ha的范圍，更通常為140-420g ae/ha。對于氟草煙，使用率將通常在35-560g ae/ha的范圍，更通需為70-280ae/ha。
b)例如，草銨膦(200-500g ae/ha)+/-2，4-D(280-1120g ae/ha)+/-定草酯或氟草煙(按照上文列出的比率)將提供更強力的、重疊的雜草控制譜。此外，重疊的譜提供用于管控或延遲除草劑抗性雜草的其它機制。
實施例16.在任意作物中與昆蟲抗性(IR)或其它輸入性狀疊加的DSM-2(V2) 由轉(zhuǎn)基因性狀提供的作物中的昆蟲抗性流行于北美和全球的玉米和棉花生產(chǎn)中。組合了IR和HT性狀的商業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)由多家種子公司開發(fā)。這些包括Bt IR性狀(例如在lifesci.sussex.ac.uk，2006網(wǎng)站上列出的Bt毒素)和任何或所有上文所述的HTC性狀。因此，這種貢獻(offering)帶來的價值包括通過遺傳手段在一種貢獻中控制多種害蟲問題的能力。如果雜草控制和昆蟲控制獨立于彼此完成，這種貢獻的便利將受到限制。單獨的DSM-2 (v2)或與一種或多種另外的HTC性狀疊加的DSM-2 (v2)可以通過常規(guī)育種或結合作為一個新的轉(zhuǎn)化事件來與一種或多種另外的輸入性狀(例如，昆蟲抗性、真菌抗性或應激耐受，等)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005)疊加。益處包括上文實施例11-15中所述的便利性和靈活性，以及在由DSM-2 (v2)和相關的除草劑耐受性提供的改進的雜草控制之外，管控蟲害和/或其它農(nóng)藝應激的能力。因此，主題的發(fā)明可以用于提供改進作物質(zhì)量的完整農(nóng)藝套裝(agronomic package)，其具有靈活并有費用效益地控制多種農(nóng)藝問題的能力。
組合的IR和HT性狀在大多數(shù)農(nóng)藝和園藝/觀賞作物和林木中具有應用。DSM-2 (v2)及其相配的除草劑耐受性與由多種Bt或非Bt IR基因中的任一提供的昆蟲抗性的組合能夠應用于(但不限于)實施例10中所列的作物物種。雜草控制領域的技術人員將認識到將DSM-2與相應的HT性狀或IR性狀疊加能夠通過例如常規(guī)育種或遺傳工程來完成。
實施例17.其它基因組合 本發(fā)明還包括產(chǎn)生與一種或多種其它除草劑抗性基因“疊加”在一起的一種或多種本發(fā)明的酶的植物，所述其它除草劑抗性基因包括但不限于，草甘膦-、ALS-(咪唑啉酮、氯磺隆(chlorsulfuron))、芳氧基鏈烷酸酯/鹽-、HPPD-，PPO-和草銨膦-抗性基因，從而提供與更寬且更強力的雜草控制相符的除草劑耐受植物和除草劑抗性管控選擇。本發(fā)明進一步包括利用本文示例的基因和蛋白質(zhì)的同源物的方法和組合物。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供對雙丙氨酰膦、膦絲菌素或草銨膦及一種或多種商業(yè)上可以獲得的除草劑(例如，草甘膦、草銨膦、百草枯(paraquat)、ALS-抑制劑(例如，氯磺隆、咪唑啉酮、三唑并嘧啶磺苯胺(triazolopyrimidinesulfonanilides)等)、HPPD抑制劑(例如，甲基磺草酮(mesotrione)、異噁氟草酮(isoxaflutole)等)、2，4-D、氟草煙(fluroxypyr)、綠草定(tricoplyr)、麥草畏(dicamba)、溴苯腈(bromoxynil)、芳氧苯氧丙酸酯(aryloxyphenoxypropionates)等等)耐受的單子葉植物和雙子葉植物。也公開了包含負責這種除草劑耐受性的核苷酸序列的載體，還包含使用這樣的耐受植物和除草劑的組合用于雜草控制和防止雜草種群遷移的方法。本發(fā)明使按照新方式使用新的除草劑組合成為可能。另外，本發(fā)明提供防止雜草菌株的發(fā)展并且對該雜草菌株進行控制的新方法，所述雜草菌株對一種或多種除草劑例如草甘膦是抗性的。本發(fā)明使得除草劑和作物的新組合的新用途稱為可能，包括在種植植物種子之前即刻對將要進行種植的區(qū)域進行種植前施用，所述植物在其它情況下對除草劑(例如草銨膦)將是敏感的。
為了本領域公知的有關草銨膦耐受的額外機制，所述DSM-2基因可以與一種或多種pat/bar基因疊加。
對于編碼HPPD(羥基-苯基丙酮酸雙加氧酶)的基因在植物中的使用，參見美國專利第6,268,549和7,297,541號。這種“疊加的”植物可以與草銨膦抗性的其它基因組合，且這種疊加的植物(和多種其它植物和本發(fā)明的疊加的植物)可以用于防止草甘膦抗性的發(fā)展。
編碼具有草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)活性的基因也可以與本發(fā)明的DSM-2基因一起使用(疊加)。參見，例如Castle等(2004)，“Discovery ofDirected Evolution of a Glyphosate Tolerance Gene，”Science Vol.34，pp.115l-1154；和WO 2002/36782。
主題的DSM-2基因也可以與分別在WO 2005/107437、WO 2007/053482和USSN 60/928,303中的AAD-1和AAD-12和AAD-13基因疊加，并且如其中所述，在一些優(yōu)選的實施方案中，可以用于與草甘膦抗性競爭。
序列表
<110>陶氏益農(nóng)公司(Dow AgroSciences LLC)
Lira，Justin M.
Wright，Terry R.
Robinson，Andrew
Russell，Sean M.
Merlo，Donald J.
Webb，Steven Robert
Arnold，Nicole
Smith，Kelley
<120>新型選擇性標記基因
<130>DAS-136XC1
<140>60/873,602
<141>2006-12-07
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>516
<212>DNA
<213>天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3
<400>1
atgccgggaa ctgccgaggt ccaggtcaga ccgggagtcg aggaggatct caagccactc 60
accgacctct acaaccacta cgtacgtgag acgcccatca cgttcgacac cgagccgttc 120
actccggagg agcgccgacc gtggctgctc tcccaccctg aagacggccc gtaccgcctg 180
agggttgcca cggacgcgga gtcacaggag atcctggggt acgccacatc cagcccctac 240
cgcgcgaagc ccgcctacgc gacctcggtg gagaccaccg tctacgtcgc cccgggggcc 300
ggcggccgcg gcatcggctc gctcctctac gcgtccctct tcgacgccct ggccgccgag 360
gacctgcacc gcgcctacgc gggcatcgcc cagcccaacg aggcctccgc ccggctgcac 420
gcgcgcttcg gtttccggca cgtgggcacg taccgcgagg tgggccgcaa gttcggccgg 480
tactgggacg tggcctggta cgagagaccg ctctag516
<210>2
<211>171
<212>PRT
<213>天藍色鏈霉菌A3
<400>2
Met Pro Gly Thr Ala Glu Val Gln Val Arg Pro Gly Val Glu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Lys Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Asn His Tyr Val Arg Glu Thr Pro
20 25 30
Ile Thr Phe Asp Thr Glu Pro Phe Thr Pro Glu Glu Arg Arg Pro Trp
35 40 45
Leu Leu Ser His Pro Glu Asp Gly Pro Tyr Arg Leu Arg Val Ala Thr
50 55 60
Asp Ala Glu Ser Gln Glu Ile Leu Gly Tyr Ala Thr Ser Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Arg Ala Lys Pro Ala Tyr Ala Thr Ser Val Glu Thr Thr Val Tyr Val
85 90 95
Ala Pro Gly Ala Gly Gly Arg Gly Ile Gly Ser Leu Leu Tyr Ala Ser
100 105 110
Leu Phe Asp Ala Leu Ala Ala Glu Asp Leu His Arg Ala Tyr Ala Gly
115 120 125
Ile Ala Gln Pro Asn Glu Ala Ser Ala Arg Leu His Ala Arg Phe Gly
130 135 140
Phe Arg His Val Gly Thr Tyr Arg Glu Val Gly Arg Lys Phe Gly Arg
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Tyr Trp Asp Val Ala Trp Tyr Glu Arg Pro Leu
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<223>反向PTU引物″Per5-4″
<400>6
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>正向編碼區(qū)引物
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<223>針對DSM-2的編碼區(qū)PCR正向引物
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>針對DSM-2的編碼區(qū)PCR反向引物
<400>10
tgagcgatgc cagcataagc t 2權利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物細胞，其包含編碼具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC的條件下與編碼SEQID NO2的核酸探針的完整補體雜交。
2.權利要求1的細胞，其中所述探針包含選自下組的序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO3。
3.權利要求1的細胞，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
4.一種載體，其包含在植物細胞中可操作的啟動子，和與所述啟動子可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，并且其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC的條件下與編碼SEQID NO2氨基酸序列的核酸探針的完整補體雜交。
5.一種選擇權利要求1的植物細胞的方法，其中所述方法包括為多個植物細胞提供權利要求4的載體，并且將所述的多個植物細胞培養(yǎng)在允許表達所述多核苷酸的細胞生長同時殺死或抑制不包含所述載體的細胞的生長的除草劑濃度中，其中所述除草劑包含膦絲菌素。
6.權利要求5的方法，其中所述除草劑選自下組雙丙氨酰膦和草銨膦。
7.權利要求5的方法，其中所述方法進一步包括鑒定并再生轉(zhuǎn)化的植物細胞。
8.包含多個權利要求1的細胞的植物。
9.權利要求8的植物的種子。
10.權利要求1的植物細胞，其中所述細胞進一步包含昆蟲抗性基因，所述基因源自選自下組的生物蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)和致病桿菌屬(Xenorhabdus)。
11.權利要求1的植物細胞，其中所述細胞進一步包含第二除草劑抗性基因。
12.權利要求8的植物，其中所述植物產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。
13.權利要求12的植物，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO2。
14.一種使用膦絲菌素抗性基因作為植物細胞中抗性標記的方法，所述方法包括以下步驟用權利要求4的載體對多個植物細胞進行轉(zhuǎn)化，將所述細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將所述細胞曝露于膦絲菌素，和測定細胞是否為膦絲菌素抗性的。
15.一種用于生成膦絲菌素抗性植物細胞、植物和它們的繁殖體(propagate)的方法，其中所述方法包括用權利要求4的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，和將轉(zhuǎn)化的植物細胞再生成產(chǎn)生繁殖體的植物。
16.一種用于產(chǎn)生膦絲菌素抗性植物的方法，其中所述方法包括將權利要求4的載體并入植物的基因組，和選擇膦絲菌素抗性。
17.一種用于產(chǎn)生對谷氨酰胺合成酶抑制劑的除草劑活性耐受的植物細胞的方法，所述抑制劑包括膦絲菌素或具有膦絲菌素模塊的化合物，其中所述方法包括將重組DNA并入起始植物細胞的核基因組的步驟，所述重組DNA包含
a)由所述起始植物細胞的聚合酶所識別的啟動子，和
b)包含來自產(chǎn)生所述谷氨酰胺合成酶抑制劑的天藍色鏈霉菌A3微生物的DNA片段的編碼區(qū)，其中所述DNA片段編碼對所述谷氨酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
18.一種用于產(chǎn)生對谷氨酰胺合成酶抑制劑的除草劑活性耐受的植物的方法，所述抑制劑包括膦絲菌素或具有膦絲菌素模塊的化合物，所述方法包括步驟a)產(chǎn)生權利要求1的植物細胞，和b)從所述細胞再生植物，所述植物在其核基因組中包含所述多核苷酸。
19.一種通過消滅雜草來保護田地中成組的栽培植物的方法，其中所述植物在它們的細胞的基因組中并入了權利要求4的載體，其中所述雜草是通過施用包含谷氨酰胺合成酶抑制劑作為活性成分的除草劑來消滅的。
20.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細胞的純培養(yǎng)物的方法，所述細胞在它們的核基因組中并入了外源DNA，所述方法包括步驟
i)用外源DNA轉(zhuǎn)化植物細胞培養(yǎng)物中的起始植物細胞，所述外源DNA包含
a)由所述起始植物細胞的聚合酶所識別的啟動子，和
b)包含來自產(chǎn)生谷氨酰胺合成酶抑制劑的天藍色鏈霉菌A3微生物的DNA片段的編碼區(qū)，所述抑制劑包括膦絲菌素或具有膦絲菌素模塊的化合物，其中所述DNA片段編碼對所述谷氨酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；和
ii)通過向植物細胞培養(yǎng)物以足以殺死未轉(zhuǎn)化的植物細胞的濃度施用所述谷氨酰胺合成酶抑制劑來選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞。
21.一種產(chǎn)生具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的合成蛋白的方法，其中所述方法包括修飾包含SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生變體蛋白，和測定所述變體蛋白的所述活性。
22.權利要求21的方法，其中所述方法包括修飾選自由SEQ ID NO1和SEQ ID NO3組成的組的多核苷酸以創(chuàng)建多個修飾的多核苷酸，并且在基因改組方法中使用所述修飾的多核苷酸。
23.權利要求21的方法，其中所述方法包括通過易錯PCR修飾選自由SEQ ID NO1和SEQ ID NO3組成的組的多核苷酸。
24.權利要求21的方法，其中所述方法包括修飾編碼所述氨基酸序列中的至少一個的至少一種核苷酸序列。
25.一種除鏈霉菌屬之外的細菌細胞，其中所述細胞包含權利要求4的載體。
26.一種選擇包含權利要求4的載體的植物細胞的方法，其中所述方法包括
a)為多個植物細胞提供所述載體；和
b)將所述多個細胞培養(yǎng)在允許表達所述多核苷酸的細胞生長同時殺死或抑制缺乏所述載體的細胞的生長的除草劑濃度中，其中所述除草劑包含膦絲菌素。
27.權利要求26的方法，其中所述表達盒存在于低拷貝數(shù)二元載體中。
28.權利要求26的方法，其中所述除草劑選自下組雙丙氨酰膦和草銨膦。
29.權利要求26的方法，其中所述方法在選自下組的表達系統(tǒng)中使用細菌表達系統(tǒng)，植物細胞培養(yǎng)物表達系統(tǒng)，藻類表達系統(tǒng)，動物細胞表達系統(tǒng)，病毒表達系統(tǒng)，真菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)。
30.權利要求29的方法，其中所述表達系統(tǒng)是熒光假單胞菌表達系統(tǒng)。
31.權利要求1的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述細胞進一步包含選自下組的除草劑抗性基因AAD-1和AAD-12。
32.權利要求19的方法，其中所述植物進一步包含草甘膦抗性基因，并且所述方法進一步包括對所述田地施用草甘膦。
33.權利要求19的方法，其中所述植物進一步包含咪唑啉酮抗性基因，并且所述方法進一步包括對所述田地施用咪唑啉酮除草劑。
34.權利要求19的方法，其中所述植物進一步包含選自由AAD-1和AAD-12組成的組的除草劑抗性基因，并且所述方法進一步包括對所述田地施用2，4-D。
35.權利要求19的方法，其中所述植物進一步包含AAD-1除草劑抗性基因，并且所述方法進一步包括對所述田地施用芳氧苯氧丙酸酯/鹽除草劑。
36.權利要求19的方法，其中所述植物進一步包含AAD-12除草劑抗性基因，并且所述方法進一步包括對所述田地施用吡啶氧乙酸鹽(pyridyloxyacetate)除草劑。
37.一種選擇或區(qū)別含有DSM-2基因的單獨植物或成組作物類植物與不含所述基因的相同物種的植物的群體的方法。
38.權利要求37的方法，包括對植物的集合施用草銨膦或雙丙氨膦。
39.權利要求37的方法，其中所述方法在溫室、培養(yǎng)箱或田地中實施。
40.一種控制田地中至少一種雜草的方法，所述方法包括在所述田地中種植至少一種權利要求12的轉(zhuǎn)基因植物的種子，所述植物包含
異源多核苷酸，其編碼賦予對谷氨酰胺合成酶抑制性除草劑的抗性的酶，和
第二異源多核苷酸，其編碼賦予對至少一種其它除草劑的抗性的酶；
所述方法進一步包括向所述田地的至少一部分施用選自下組的第一除草劑草銨膦、膦絲菌素和雙丙氨酰膦；和向所述田地的所述至少一部分施用所述至少一種其它除草劑。
41.權利要求40的方法，其中所述除草劑是相繼或同時施用的。
42.權利要求40的方法，其中所述第一除草劑是谷氨酰胺合成酶抑制性除草劑。
43.權利要求40的方法，其中所述至少一種其它除草劑選自下組2，4-D、刈草胺(acetochlor)、三氟羧草醚(acifluorfen)、禾草滅(alloxydim)、磺氨磺隆(amidosulfuron)、氯氨吡啶酸(aminopyralid)、莠去津(atrazine)、氟丁酰草胺(beflubutamid)、雙嘧苯甲酸(bispyribac)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、唑草胺(cafenstrole)、氟酮唑草(carfentrazone)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、綠麥隆(chlorotoluron)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、烯草酮(clethodim)、炔草酯(clodinafop)、異噁草酮(clomazone)、環(huán)己烯草酮(cloproxydim)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯酯磺草胺(cloransulam)、草凈津(cyanazine)、環(huán)丙磺隆(cyclosulfamuron)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop)、香草隆(daimuron)、麥草畏(dicamba)、氯甲草(diclofop)、2，4-滴丙酸(dichlorprop)、唑嘧磺胺(diclosulam)、吡氟草胺(diflufenican)、二甲吩草胺(dimethenamid)、敵草快(diquat)、氟硫草定(dithiopyr)、敵草隆(diuron)、丁氟消草(ethalfluralin)、噁唑禾草靈(fenoxaprop)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、雙氟磺草胺(florasulam)、吡氟禾草靈(fluazifop)、氟酮磺隆(flucarbazone)、氟噻草胺(flufenacet)、氟苯啶草(flufenican)、氟噠嗪草酯(flufenpyr)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟草煙、達草氟(fluthiacet)、氟磺胺草醚(fomesafen)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、草銨膦、草甘膦、氟硝磺酰胺(halosafen)、吡氯磺隆(halosulfuron)、氟吡禾靈(haloxyfop)、咪草酯(imazamethabenz)、咪草啶酸(imazamox)、甲咪唑煙酸(imazapic)、滅草煙(imazapyr)、滅草喹(imazaquin)、咪草煙(imazethapyr)、啶咪磺隆(imazosulfuron)、碘磺隆(iodosulfuron)、碘苯腈(ioxynil)、異噁酰草胺(isoxaben)、異噁氟草酮(isoxaflutole)、乳氟禾草靈(lactofen)、利谷隆(linuron)、MCPA、2甲4氯丙酸(mecoprop)、苯噻酰草胺(mefenacet)、氟磺酰草胺(mefluidide)、甲基二磺隆(mesosulfuron)、甲基磺草酮(mesotrione)、噁唑酰草胺(metamifop)、吡草胺(metazachlor)、唑草磺胺(metosulam)、嗪草酮(metribuzin)、MSMA、敵草胺(napropamide)、煙嘧磺隆(nicosulfuron)、達草滅(norflurazon)、黃草消(oryzalin)、噁草靈(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、百草枯(paraquat)、克草猛(pebulate)、胺硝草(pendimethalin)、五氟磺草胺(penoxsulam)、氨氯吡啶酸(picloram)、氟吡酰草胺(picolinafen)、pinoxaden、氟嘧磺隆(primisulfuron)、環(huán)苯草酮(profoxydim)、敵稗(propanil)、氟唑草酯(pyraflufen)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron)、嘧苯草肟(pyribenzoxim)、肟啶草(pyriminobac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、pyroxasulfone、pyroxsulam、二氯喹啉酸(quinclorac)、氯甲喹啉酸(quinmerac)、喹禾靈(quizalofop)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、saflufenacil、稀禾定(sethoxydim)、西瑪津(simazine)、磺草酮(sulcotrione)、磺胺草唑(sulfentrazone)、嘧磺隆(sulfometuron)、tefuryltrione、tembotrione、吡喃草酮(tepraloxydim)、特草定(terbacil)、噻草啶(thiazopyr)、賽二唑素(thidiazuron)、thiencarbazone、噻磺隆(thifensulfuron)、禾草丹(thiobencarb)、topramezone、肟草酮(tralkoxydim)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、定草酯(triclopyr)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、氟樂靈(trifluralin)、氟胺磺隆(triflusulfuron)、和三氟甲磺隆(tritosulfuron)。
44.一種檢測植物是否包含權利要求8的多核苷酸的方法，其中所述方法包括從所述植物收集樣品和測定所述樣品中所述多核苷酸的存在。
45.權利要求44的方法，其中所述方法包括測定所述樣品中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的存在。
46.權利要求44的方法，其中所述方法包括使用PCR引物或探針來檢測所述多核苷酸的存在。
47.權利要求44的方法，其中所述方法包括使用抗體來檢測所述蛋白質(zhì)的存在。
48.權利要求8的植物，其中所述植物進一步包含昆蟲抗性基因，該基因源自選自下組的生物蘇云金芽孢桿菌、光桿狀菌屬和致病桿菌屬。
49.權利要求8的植物，其中所述植物進一步包含選自下組的農(nóng)藝性狀真菌抗性、應激耐受、增加的產(chǎn)率、改進的油分布譜(profile)、改進的纖維質(zhì)量、病毒抗性、延遲的成熟、冷耐受、和鹽耐受。
50.一種控制田地中至少一種雜草的方法，所述方法包括使至少一種權利要求8的植物生長在所述田地中，并且向所述田地的至少一部分施用谷氨酰胺合成酶抑制性除草劑。
51.權利要求50的方法，進一步包括除草劑草銨膦、雙丙氨酰膦和膦絲菌素。
52.權利要求50的方法，其中所述植物對選自下組的除草劑有抗性草甘膦、草銨膦、2，4-D、喹禾靈、咪草煙、氯磺隆(chlorsulfuron)、麥草畏、甲基磺草酮、異噁氟草酮和氟丙嘧草酯。
53.權利要求24的方法，其中所述植物是單子葉植物。
54.權利要求53的方法，其中所述單子葉植物選自下組玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、甘蔗、溫季和涼季草皮草、燕麥、高粱和牧草。
55.權利要求24的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
56.權利要求37的方法，其中所述DSM-2基因作為選擇性標記發(fā)揮功能，并且所述方法在溫室、培養(yǎng)箱或田地中實施。
57.權利要求12的植物，其中所述多核苷酸具有用于增加在植物中的表達的密碼子應用選擇。
58.一種轉(zhuǎn)基因大豆植物，其包含編碼具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC條件下與編碼SEQID NO2的核酸探針的完整補體雜交。
59.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，其包含編碼具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC條件下與編碼SEQID NO2的核酸探針的完整補體雜交。
60.一種使用多核苷酸產(chǎn)生權利要求58或59的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述多核苷酸具有用于增加在植物中的表達的密碼子應用選擇。
61.一種使用蛋白質(zhì)向植物輸送除草劑耐受的方法，其中所述方法包括將多核苷酸整合入作物類植物，其中所述多核苷酸編碼所述蛋白質(zhì)，并且所述蛋白質(zhì)具有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC條件下與編碼SEQ ID NO2的核酸探針的完整補體雜交，并且其中所述多核苷酸的表達和所述蛋白質(zhì)的產(chǎn)生使所述植物對膦絲菌素除草劑耐受。
全文摘要
本發(fā)明涉及在本文稱作DSM-2的新基因。這種基因是在天藍色鏈霉菌A3中鑒定的。DSM-2蛋白與PAT和BAR的關系較遠。主題的發(fā)明還提供按植物優(yōu)化的編碼DSM-2蛋白的基因。DSM-2可以用作轉(zhuǎn)基因性狀以在植物和植物細胞中賦予對除草劑草銨膦和雙丙氨酰膦的耐受。主題的基因的一種優(yōu)選用途是作為選擇性標記。在細菌系統(tǒng)中使用這種基因作為選擇性標記能夠增加植物轉(zhuǎn)化的效率。使用DSM-2作為單一的選擇標記消除了在克隆過程中對額外的藥用抗生素標記(例如氨芐青霉素抗性)的需求。按照主題的發(fā)明還可以有多種其它用途。
文檔編號A01H1/00GK101600790SQ200780051075
公開日2009年12月9日 申請日期2007年12月7日 優(yōu)先權日2006年12月7日
發(fā)明者賈斯廷·M·利拉, 特里·R·賴特, 肖恩·M·拉塞爾, 唐納德·J·默洛, 史蒂文·R·韋伯, 妮科爾·L·阿諾德, 安德魯·E·魯賓遜, 凱利·A·史密斯 申請人:陶氏益農(nóng)公司