專利名稱：：涉及三萜合成的酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及編碼三萜合成中涉及的酶的分離多核苷酸。具體地講，本發(fā)明涉及編碼新的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、新的甲基轉移酶、和新的葡糖基轉移酶家族1的分離多核苷酸。這些分離自黑燕麥的新酶稱為AsSCPLl(絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶)、AsMTl(甲基轉移酶)和AsGT2(葡糖基轉移酶)。編碼負責多種谷物中三萜合成的酶的基因鑒定將允許它們的操縱。三萜合成操縱將引起三萜皂苷水平或結構的改變。皂苷產量的提高將引起植物抗害蟲能力的提高。來源于具有高三萜水平的植物的食物被認為具有降低膽固醇的效應，然而三萜水平降低據(jù)信會使得食物具有更好的風味。因此，具有改變的三萜水平的轉基因植物可對害蟲產生抗性，而用三萜水平或結構發(fā)生改變的種子制備的食物將具有提高的營養(yǎng)價值或更好的風味。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列當與SEQIDN0:2比較時，基于ClustalV比對方法具有至少95%的序列同一性；或編碼甲基轉移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列當與SEQIDNO:4比較時，基于ClustalV比對方法具有至少95%的序列同一性；或編碼葡糖基轉移酶的核苷酸序列，所述酶的氨基酸序列當與SEQIDNO:6比較時，基于ClustalV比對方法具有至少95%的序列同一性；或包含(a)、(b)或(c)的全長互補序列的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明分離多核苷酸的載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA構建體，該構建體包含編碼三萜途徑的第一種酶的本發(fā)明的多核苷酸的至少一部分，所述部分可操作地連接至少一種調控序列上。7在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA構建體，該構建體包含編碼三萜途徑的第一種酶的本發(fā)明的多核苷酸的至少一部分，所述部分可操作地連接至少一種調控序列上，還包含至少第二多核苷酸的至少一部分，所述第二多核苷酸編碼調節(jié)三萜途徑至少第二種酶的表達的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的重組DNA構建體的分離宿主細胞。該宿主細胞可以是酵母細胞、細菌細胞、或植物細胞。本發(fā)明也包括包括植物和植物部分的組合物，所述組合物包含本發(fā)明的分離多肽或多核苷酸。本發(fā)明也包括轉化過的植物，所述植物來源于高等植物和種子或谷物的轉化過的宿主細胞，它們來源于此類轉化過的植物。此類轉基因植物包括那些具有水平改變的P_香樹素衍生的三萜、或具有改性三萜的植物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明重組體的轉基因植物，其中調節(jié)序列是異源啟動子，其中轉基因植物當與野生型植物的三萜水平相比時具有改變的三萜水平。本發(fā)明也涉及改變植物細胞中多肽表達水平的方法，所述方法包括用來自至少一部分本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸片段轉化植物組織，其中所述多核苷酸能夠改變天然絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶；將所述植物組織再生到轉基因植物中；并評估當與具有對應的天然絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的野生型表達水平的植物比較時，所述轉基因植物的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達水平改變。本發(fā)明也涉及產生對至少一種真菌具有抗性的植物的方法，所述方法包括用至少一個本發(fā)明編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未受所述重組DNA構建體轉化過的植物比較時，對至少一種真菌的抗性提高情況。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸，所述多核苷酸編碼調節(jié)三萜途徑至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發(fā)明的多核苷酸以及編碼途徑中前兩個步驟的酶的核苷酸序列，所述酶為環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶P-香樹素合酶(Sadl基因的產物；HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:13431-13436)和/或細胞色素P450酶CYP51H10(由Sad2基因編碼；QiX.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:18848-18853)。本發(fā)明也涉及生產具有改變水平的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的植物的方法，所述方法包括用至少一種權利要求5所述的編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的量比較時，步驟(b)的轉基因植物的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達水平改變。本發(fā)明也涉及用于生產具有改變的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括用至少一個本發(fā)明編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平變化。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼調節(jié)三萜途徑中至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發(fā)明的多核苷酸(?；D移酶、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶)、Sadl和Sad2。本發(fā)明也涉及用于生產具有提高的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平提高。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸，所述多核苷酸編碼調節(jié)三萜途徑中至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發(fā)明的多核苷酸(?；D移酶、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶)、Sadl和Sad2。本發(fā)明也涉及用于生產具有降低的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括用至少一個本發(fā)明編碼三萜途徑第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化植物細胞生長；并評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平降低。重組構建體還可包含至少一個第二多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼調節(jié)三萜途徑中至少一個第二種酶表達的多肽，期望該多核苷酸包括但不限于本發(fā)明的多核苷酸(?；D移酶、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶)、Sadl和Sad2。本發(fā)明也包括來自本發(fā)明轉基因植物的谷物。附圖簡述和序列列表根據(jù)以下的詳細描述和附圖以及序列清單，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細描述和附圖以及序列清單形成本申請的一部分。圖1圖示了P-香樹素和燕麥根皂苷A-1的結構，說明必然發(fā)生了多個修飾以從前者衍生出后者。圖2圖示了一個317kb的基因組DNA序列，該序列包含五個來自黑燕麥的預測的生物合成酶的基因(P-香樹素合酶(Sadl)、細胞色素P450CYP51H10(Sad2)、t、絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPLl、甲基轉移酶AsMTl和葡糖基轉移酶AsGT2。圖3對五個預測的生物合成酶的Northern印跡分析(P-香樹素合酶(SAD1)、細胞色素P450CYP51H10(SAD2)、絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPLl、甲基轉移酶AsMTl、葡糖基轉移酶AsGT2和GAPDH對照)，所述酶位于燕麥的根芽、葉和花組織中。序列描述概要說明了后附的序列列表。此序列列表中以單個字母表示核苷酸，以單獨的3字母表示氨基酸，如NucleicAcidsResearch13:3021-3030(1985)和BiochemicalJournal219(2):345-373(1984)所描述的IUPAC-IUB標準中所規(guī)定的。SEQIDNO:l是編碼來自黑燕麥(AsSCPLl)的絲氨酸羧肽酶樣多肽的cDNA核苷酸序列。SEQIDNO:2是衍生自SEQIDNO:1中顯示的cDNA片段或SEQIDNO:7中顯示的基因組片段的AsSCPLl氨基酸序列。SEQIDNO:3是編碼來自黑燕麥(AsMTl)的?；谆D移酶的cDNA核苷酸序列。SEQIDNO:4是衍生自SEQIDNO:3中顯示的cDNA片段或SEQIDNO:8中顯示的基因組片段的AsMTl氨基酸序列。SEQIDNO:5是編碼來自黑燕麥(AsGT2)的葡糖基轉移酶的cDNA核苷酸序列。SEQIDNO:6是衍生自SEQIDNO:5中顯示的cDNA片段或SEQIDNO:9中顯示的基因組片段的AsGT2氨基酸序列。SEQIDNO:7是編碼AsSCPLl多肽的基因組片段的核苷酸序列。SEQIDNO:8是編碼AsMTl的基因組片段的核苷酸序列。SEQIDNO:9是編碼AsGT2的基因組片段的核苷酸序列。發(fā)明詳述本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容均全文以引用方式并入本文。如本文所用的并在所附的權利要求書中的單數(shù)形式"一個"和"所述"包括復數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，"一株植物"的涵義包括多株此類植物，"一個細胞"的涵義包括一個或多個細胞及其本領域的技術人員已知的等同物，等等。在此公開的上下文中使用了許多術語和縮寫。給出了如下定義。"開放閱讀框"縮寫為ORF。"聚合酶鏈反應"縮寫為PCR。代謝途徑或生物合成途徑在生物化學意義上可以認為是發(fā)生于細胞內由酶催化的一系列化學反應，用以實現(xiàn)待細胞使用的或待細胞貯存的代謝產物的形成，或啟動另一代謝途徑(因而稱作流量產生步驟)。很多此類途徑都很精細，并涉及對起始物質的逐步修飾以使之形成具有期望的精確化學結構的產物。本文所用的"核酸"意指多核苷酸，并包括單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基聚合物。核酸也可以包括片段和經修飾的核苷酸。因此，術語"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段"可互換使用，并且是作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)可以用如下它們的單字母名稱指代"A"表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別針對RNA或DNA)，"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，"U"表示尿苷酸，"T"表示脫氧胸苷酸，"R"表示嘌呤(A或G)，"Y"表示嘧啶(C或T)，"K"表示G或T，"H"表示A或C或T，"I"表示肌苷，"N"表示任何核苷酸。術語"分離的"多核苷酸是一種已經被大體上分開或從其中天然產生多核苷酸的生物中通過常規(guī)的核酸純化方法純化的其它多核苷酸，即，其它染色體和染色體外的DNA及RNA。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。本發(fā)明的分離多核苷酸可包括全部或部分分離多核苷酸，例如包含選自以下核苷酸序列的多核苷酸SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8禾PSEQIDNO:9或此類核苷酸序列的全長互補序列。三萜系化合物皂苷經由類異戊二烯途徑，通過環(huán)化2，3-環(huán)氧角鯊烯形成五環(huán)三萜系化合物，主要是齊墩果烷(e-香樹素)或達瑪烷骨架合成。三萜系化合物主鏈隨后經受多種修飾，包括氧化、?；⒓谆?、糖基化和其它取代，所述修飾由細胞色素P450依賴型單氧酶、糖基轉移酶、?；D移酶、甲基轉移酶和其它酶介導。三萜，也稱為三萜系化合物，包括但不限于皂苷和甾醇。"皂苷"指植物中天然積累的環(huán)化三鵬的配醣綴合物。環(huán)化三鵬包括但不限于羊毛甾醇、環(huán)阿屯醇、P_香豐對素、a_香豐對素、習習扇豆醇、isomultiflorenol、禾口thalianol。"三萜皂苷"指環(huán)化三萜的配糖綴合物，除了那些來源于羊毛甾醇或環(huán)阿屯醇之外的三萜。"甾族皂苷"指來源于羊毛甾醇或環(huán)阿屯醇配醣綴合物。皂草精醇是經由體外酸水解獲取的三萜皂苷，對它們的測量為從中提取皂苷的組織中存在的三萜皂苷的量提供了一個相對值。三萜皂苷的水平可通過測量造成皂草精醇進行測定。皂草精醇的測量值直接關聯(lián)于三萜皂苷的水平。皂草精醇是經由體外酸水解獲取的三萜皂苷，對它們的測量為從中提取皂苷的組織中存在的三萜皂苷的量提供了一個相對值，該值直接關聯(lián)于三萜皂苷的量。三萜皂苷水平可使用本領域已知的技術進行測量。例如，可使用具有光散射檢測器的HPLC-MS或HPLC進行測量(參見例如Rupasinghe，H.P.等人，(2003)，J.Agri.FoodChem.51:5888-5894)。作為另外一種選擇，可使用具有UV檢測器的HPLC進行測量(HubertJ等人，(2005)，J.Agric.FoodChem.53:3923-3930)。其它方法包括使用GC-FAB。(參見例如Gee等人，(1993)，JSciFoodAgric.63:201-209)。其它方法涉及使用薄層色譜法(TLC)結合密度計量學分離皂苷(參見例如01eszekWA.(2002)J.Chromatogr.A967:147-162.;GurfinkelDM，和RaoAV(2002)J.Agric.FoodChem.50:426-430。使用其它方法測量三萜皂苷也是可能的。例如，使用多種免疫測定方法(例如放射性免疫測定或ELISA)也是合適的(WangCC，PrasainJK，和BarnesS.(2002)J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.LifeSci.777:3-28，AhamedA等人，(2003)，Biochem.Biophys.Res.Commun.302:587-592)。"提高的三萜皂苷水平，"對于本發(fā)明而言指三萜皂苷水平高于那些存在于相同物種的非轉化植物中的三萜皂苷水平，水平提高是由于轉化了本發(fā)明的核酸片段。例如，"提高的三萜皂苷水平，"可以指三萜皂苷水平高于那些存在于相同物種植物中的三萜皂苷水平，該植物不具有本發(fā)明的包含編碼環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶的多核苷酸的重組DNA分子。"提高的三鵬阜昔水平"可以是提高至少100卯m，250卯m，500卯m，750卯m，1000卯m，1250ppm，1500卯m，3000卯m，6000，或任何它們的整數(shù)。"改變的水平"或"改變的表達"指轉基因生物中產生的基因產物的量或比例不同于正常生物或非轉化生物。"改變的三萜皂苷水平，"對于本發(fā)明而言指三萜皂苷水平的量或比例不同于那些存在于相同物種的沒有轉化本發(fā)明的核酸片段的非轉化植物中的三萜皂苷水平。"降低的三萜皂苷水平，"對于本發(fā)明而言指三萜皂苷水平低于那些存在于相同物種的沒有轉化本發(fā)明的核酸片段的非轉化植物中的三萜皂苷水平。術語"具有相當功能的亞片段"和"功能上相當?shù)膩喥?在本文中可互換使用。這些術語是指分離的核酸片段的一個部分或亞序列，其中無論所述片段或亞片段是否編碼有活性的酶，其都保留著改變基因表達或導致某種表型的能力。例如，所述片段或亞片段可以被用于設計嵌合基因，以在轉化后的植物中產生所期望的表型?？梢酝ㄟ^將核酸片段或亞片段以相對于植物啟動子序列有義或反義的方向與所屬啟動子序列連接，從而設計出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亞片段無論是否編碼有活性的酶均可。術語"保守結構域"或"基序"指進化上相關的蛋白質的比對序列中在特定位置保守的一組氨基酸。雖然同源蛋白質之間在其它位置的氨基酸可以發(fā)生變化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示對蛋白質的結構、穩(wěn)定性或活性來說是必需的氨基酸。因為它們可通過它們在蛋白質同源物家族的比對序列中的高度保守來鑒定，所以它們可用作識別標記或"簽名"來確定具有新的測定序列的蛋白質是否屬于以前鑒定的蛋白質家族。術語"同源性"、"同源的"、"大體上類似的"和"大體上對應的"在本文中可互換使用。它們指其中一個或多個核苷酸堿基的變化不會影響核酸片段介導基因表達或產生某種表型的能力的核酸片段。這些術語也指本發(fā)明的核酸片段的修飾(例如缺失或插入一個或多個核苷酸)，相對于初始的未經修飾的核酸片段，基本上不會改變所得核酸片段的功能特性。因此，正如本領域技術人員應該理解的，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。此外，技術人員認識到，本發(fā)明所涵蓋的大體上類似的核苷酸序列也由它們在中等嚴格條件(如0.5XSSC，O.1%SDS，6(TC)下，與本文所示例的序列雜交的能力，或雜交至本文所公開的核苷酸序列的任何部分以及雜交至與本文所公開的任何核苷酸序列功能相當?shù)男蛄械哪芰λ薅?。可以調節(jié)嚴格性條件以篩選中度相似的片段例如來自遠緣生物的同源序列，到篩選高度相似的片段例如從近緣生物復制功能性酶的基因。雜交后的洗滌確定嚴格性條件。術語"選擇性雜交"包括指在嚴格雜交條件下，核酸序列與特定核酸靶序列以比其與非靶核酸序列的雜交更高的可檢測程度(例如至少2倍于背景)雜交，并指基本排除了非靶核酸。選擇性雜交的序列通常彼此具有約至少80%的序列同一性，或90%的序列同一性，最多并包括100%的序列同一性(即完全互補)。術語"嚴格條件"或"嚴格雜交條件"包括指探針將選擇性雜交至其靶序列的條件。嚴格條件是序列依賴性的并將因不同的環(huán)境而異。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒定與探針100%互補的靶序列(同源探測)。作為另一種選擇，可調節(jié)嚴格條件以允許序列中的一些錯配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少于約1000個核苷酸，任選長度少于500個核苷酸。通常，嚴格條件將是如下那些條件在pH7.0至8.3下鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且對于短探針(例如10至50個核苷酸)溫度為至少約3(TC，而對于長的探針(例如多于50個核苷酸)溫度為至少約6(TC。嚴格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。示例性的低嚴格條件包括在37t:于含有30至35X甲酰胺、1MNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，以及在50至55。C用IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M擰檬酸三鈉)洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37"于40至45%甲酰胺、謹NaCl、l%SDS中雜交，以及在55至6(TC下用0.5X至IXSSC洗滌。示例性的高嚴格條件包括在37t:于50X甲酰胺、lMNaCl、lXSDS中雜交，以及在60至65t:用0.IXSSC洗滌。特異性通常取決于雜交后洗滌，最后的洗滌溶液的離子強度和溫度是關鍵因素。對于DNA-DNA雜交體，L可以用Meinkoth等人，Anal.Biochem.138:267-284(1984):Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-O.61(%form)-500/L;其中M是單價陽離子的體積摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以堿基對表示的雜交體的長度。L是(在確定的離子強度和pH下)50X的互補耙序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。每出現(xiàn)1%的錯配，Tm降低約rc;因此，可調節(jié)Tm雜交和/或洗滌條件以與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低l(TC。通常，在確定的離子強度和pH下，嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列的熔解溫度(TJ低約5t:。然而，極嚴格條件可采用在比熔解溫度(TJ低1、2、3或4t:的溫度下雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可采用在比熔解溫度(Tm)低6、7、8、9或1(TC的溫度下雜交和/或洗滌；低嚴格條件可采用在比熔解溫度(Tm)低11、12、13、14、15或2(TC溫度下雜交和/或洗滌。利用所述等式、雜交和洗滌組合物以及理想的Tm，本領域技術人員將會理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化已經在本質上得以描述。如果所需的錯配程度導致Tm低于45t:(水溶液)或32t:(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC的濃度以便能使用更高的溫度。對核酸雜交的詳盡指導可在以下文獻中找到Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第2章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays，，，Elsevier,NewYork(1993);以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章，Ausubel等人編車茸，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)。雜交和/或洗滌條件可進行至少10、30、60、90、120或240分鐘。在核酸或多肽序列上下文中的"序列同一性"或"同一性"是指兩序列中的核酸堿基或氨基酸殘基當在指定比較窗口中比對最大匹配時是相同的。因此，"序列一致性百分比"是指通過在一個比對窗口上比較兩段最大化匹配的序列所決定的值，其中在所述比對窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分與(不包含附加或缺失)的參考序列相比可以包含附加或缺失(即間隙)，以獲得兩段序列之間的最大匹配。所述百分比的計算方法是，統(tǒng)計相同的核酸堿基或氨基酸殘基在兩段序列中同時出現(xiàn)的位點的數(shù)量以得到匹配位點數(shù)，將此匹配位點數(shù)除以比對窗口中的總位點數(shù)，再將結果乘以IOO，從而得到序列一致性百分比。序列一致性百分比的可用的例子包括但不限于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和95%，或者從50%至100%的任意整數(shù)百分比。上述一致性可以利用本文所述的任意程序來確定。序列對比和百分比同一性或類似性可以用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來確定，這些方法包括(但不限于)LASERGENE生物信息計算包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAligTM程序。在本專利申請案的上下文中應當理解，使用序列分析軟件進行分析時，除非另外指明，否則分析結果將基于所參考程序的"默認值"。在此所用的"默認值"是指在首次初始化軟件時軟件最初加載的任何值或參數(shù)集。"ClustalV比對方法"對應于稱為ClustalV(在Higgins和Sharp,CABI0S，5:151-153(1989);Higgins，D.G.等人(1992)Comput.Appl.Biosci.8:189-191)，并存在于LASERGENE生物信息學計算軟件包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAlign程序中。對于多重比對，默認值對應于缺口罰分(GAPPENALTY)=10和缺口長度罰分(GAPLENGTHPENALTY)=10。用Clustal方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默認參數(shù)為KTUPLE=1、空位罰分=3、窗口(WINDOW)=5禾PDIAGONALSSAVED=5。而對于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE=2，空位罰分=5，窗口=4和DIAGONALSSAVED=4。用ClustalV程序比對序列后，可通過查看同一程序中的"序列距離"表來獲得"百分比同一性"。"BLASTN比對方法"是由國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)提供的用以采用默認參數(shù)比較核苷酸序列的算法。本領域的技術人員非常清楚，多種程度的序列同一性可用于從其他物種中鑒定多肽，其中這類多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的實例包括但不限于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%、或50%至100%之間的任何整數(shù)百分比。實際上，50%至100%之間的任何整數(shù)氨基酸同一性可用于描述本發(fā)明，諸如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。此分離核苷酸片段的任何全長或部分互補的序列也是有用的。"密碼子簡并性"指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下發(fā)生變化的遺傳密碼的趨異度。因此，本發(fā)明涉及任何包含編碼所有或主要部分的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列編碼如SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、和SEQIDN0:6示出的AsSCPLl、AsMTl和AsGT2蛋白。技術人員熟知由特定宿主細胞使用指定給定氨基酸的核苷酸密碼子表現(xiàn)出的"密碼子偏倚"。因此，當合成多核苷酸用于改善宿主細胞中的特定基因表達時，希望設計該多核苷酸使得其密碼子使用頻率接近宿主細胞使用的優(yōu)選密碼子的頻率。如本文所用的，"合成核酸片段"可由使用本領域技術人員已知的方法化學合成的寡核苷酸構件裝配而成。將這些構件相連接并進行退火以形成更大的核酸片段，然后可將其酶催化進行裝配以構建完整的所需核酸片段。與核酸片段有關的"化學合成"指在體外對組分核苷酸進行裝配?？梢圆捎猛晟平⒌姆椒▉硗瓿珊怂崞蔚氖止せ瘜W合成，或者可使用許多種可商業(yè)獲得的機器中的一種來完成自動化學合成。因此，基于最優(yōu)化核苷酸序列以反映宿主細胞的密碼子偏倚性，可以定制核酸片段用以最優(yōu)化基因表達。如果密碼子使用偏向于宿主偏好的那些密碼子，則技術人員會理解成功的基因表達的可能性。優(yōu)選的密碼子的確定可基于對來源于宿主細胞的基因(其中序列信息可獲得)的檢測。"基因"是指能夠表達特定蛋白質的核酸片段，其包括編碼序列前的調控序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調控序列(3'非編碼序列)。"天然基因"是指天然存在的具有其自己的調控序列的基因。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源于不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。"外來基因"指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，它通過基因轉移導入宿主生物。外來基因可以包含插入到非天然生物體內的天然基因，或嵌合基因。"轉基因"是通過轉化方法導入基因組內的基因。在應用于植物細胞時，術語"基因組"不僅包括在細胞核內發(fā)現(xiàn)的染色體DNA，并且還包括在細胞的亞細胞成分(例如線粒體、質體)內發(fā)現(xiàn)的細胞器DNA。"經密碼子最優(yōu)化的基因"是其密碼子使用頻率經設計用以模仿宿主細胞優(yōu)選的密碼子使用頻率的基因。"等位基因"是染色體上占據(jù)給定位點的基因的幾種供選擇替代形式中的一種。當染色體上給定位點處存在的所有等位基因相同時，植物在該位點是純合子。如果染色體上給定位點處存在的等位基因不同的話，植物在該位點是雜合子。"編碼序列"指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"調控序列"指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，并且影響相關編碼序列的轉錄、RNA14加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調控序列可包括，但不限于啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖環(huán)結構。"啟動子"指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。啟動子序列由近側和較遠端上游元件組成，后者經常指增強子。因此，"增強子"是能剌激啟動子活性的DNA序列，它可以是啟動子的天然元件，或插入以增強啟動子水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以整個源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領域內的技術人員應當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應不同的環(huán)境條件而引導基因的表達。還應認識到，由于在大多數(shù)情況下還不能完全確定調控序列的確切范圍，一些變型的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細胞型中表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。目前不斷在發(fā)現(xiàn)可用于植物細胞中的不同類型的新啟動子；在以下文獻中可以發(fā)現(xiàn)多個實例0kamuro，J.K.andGoldberg,R.B.編輯的BiochemistryofPlants15:1-82(1989)。"翻譯前導序列"指位于基因啟動子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導序列存在于翻譯起始序列的經完全加工后的mRNA上游。翻譯前導序列可影響mRNA的初級轉錄過程、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。已經描述了翻譯前導序列的實例(Turner,R.和Foster,G.D.，Mol.Biotechnol.3:225-236(1995))。"3'非編碼序列"，"轉錄終止子"或"終止序列"是指位于編碼序列下游并且包括能夠影響mRNA加工或基因表達的多腺苷酸化識別序列和其他序列編碼調節(jié)信號的DNA序列。多腺苷酸化信號通常表征為影響多腺苷酸片添加到mRNA前體的3'末端。Ingelbrecht，I.L.等人例示了不同3'非編碼序列的用途PlantCell1:671-680(1989)。"RNA轉錄物"指由RNA聚合酶催化的DNA序列的轉錄所產生的產物。當RNA轉錄物與DNA序列拷貝完全互補時，它指初級轉錄物。當RNA轉錄物是來源于轉錄后加工的初級轉錄物的RNA序列時，它指成熟的RNA。"信使RNA"或"mRNA"指無內含子并且可以由細胞翻譯成蛋白質的RNA。"cDNA"指與mRNA模板互補并用反轉錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段轉化成雙鏈。"有義"RNA指包含mRNA并且能在細胞內或體外翻譯成蛋白質的RNA轉錄物。"反義RNA"指與全部或部分靶初級轉錄物或mRNA互補，并阻止靶基因表達的RNA(美國專利5，107，065)。反義RNA可以與特定基因轉錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子、或編碼序列互補。"功能性RNA"指反義RNA、核酶RNA或其它不能翻譯但是對細胞過程有影響作用的RNA。術語"互補的"和"反向互補的"對mRNA轉錄來說可互換使用，并且用以定義信使反義RNA。術語"可操作地連接"指單個核酸片段上的核酸序列的關聯(lián)，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的調控。例如，當啟動子能夠調節(jié)編碼序列的表達(即，該編碼序列受到該啟動子的轉錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義的取向可操作地連接至調控序列。在另一個例子中，本發(fā)明的互補RNA區(qū)域，無論直接或間接連接、5'端與目標mRNA或3'端與目標mRNA連接、或者位于目標mRNA內、或者第一互補區(qū)域以5'端而其互補體以3'端與目標mRNA連接，均可構成可用的連接。本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)。轉化方法為本領域的技術人員所熟知，并描述于下文。"PCR"或"聚合酶鏈反應"是用于合成大量的特定DNA片段的技術，其包括一系列重復的循環(huán)(PerkinElmerCetusInstruments,Norwalk，CT)。典型地，雙鏈DNA被熱變性，兩種與目標片段的3'端區(qū)域互補的引物在較低溫度下與之退火，然后在中間溫度下得到延伸。一組的上述三個連續(xù)的步驟被稱為一個"循環(huán)"。術語"重組"指例如通過化學合成或者通過用基因工程技術操縱分離的核酸片段來實現(xiàn)的兩個原本分離的序列片段的人工組合。術語"質粒"、"載體"和"盒"指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA片段的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進入一種獨特構建體中，該獨特構建體能夠將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列與相應的3'末端非翻譯序列一起引入細胞中。"轉化盒"指含有外來基因并且除了該外來基因外還含有有利于轉化特定宿主細胞轉化的元件的特定載體。"表達盒"是指包含外來基因，并具有能令所述基因在宿主中增強表達的所述基因以外的元件的特定載體(即指可將核酸序列或片段移入其中的不連續(xù)的核酸片段)。術語"重組構建體"、"表達構建體"、"嵌合構建體"、"構建體"和"重組DNA構建體"本文可互換使用。重組構建體包括人造的核酸片段組合，例如天然條件下不一起存在的調控序列和編碼序列。例如嵌合構造可包括源于不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。此類構建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉化宿主細胞的方法，該宿主細胞是本領域的技術人員所熟知的。例如可以使用質粒載體。技術人員熟知為了成功地轉化、篩選和繁殖包括本發(fā)明任何分離的核酸片段的宿主細胞，必須存在于載體上的遺傳元件。技術人員還將認識到，不同的獨立轉化事件將導致不同水平和模式的表達(Jones等人，EMBOJ.，4:2411-2418(1985);DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86(1989))，因此，必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達的Northern印跡分析、蛋白表達的免疫印跡分析或表型分析等完成。本文所用術語"表達"是指功能性終產物(例如，mRNA或蛋白質(既可以是前體也可以是成熟形式))的生產。術語"導入"是指將核酸(例如表達構建體)或蛋白提供至細胞中。導入包括指將核酸整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸可以整合進細胞的基因組內，以及包括指將核酸或蛋白暫時提供給細胞。導入包括指穩(wěn)定的或暫時性的轉化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組DNA構建體/表達構建體)插入細胞內的情況下的"導入"意指"轉染"或"轉化"或"轉導"，并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可以整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內、轉變成自主的復制子或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。"成熟"蛋白質指經翻譯后加工的多肽(即已經去除了存在于初始翻譯產物中的任何前肽或肽原的多肽)。"前體"蛋白質指mRNA的初級翻譯產物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于)細胞內定位信號。"信號肽"是一種與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導向分泌器官體系的氨基酸序列(Chrispeels，M.(1991)Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42:21-53)。如果將所述蛋白導向液泡，可另外加上液泡靶向信號(同上)，或者如果將所述蛋白導向內質網，可加上內質網駐留信號(同上)。如果將蛋白導向細胞核，將移除任何存在的信號肽并用以核定位信號替代(Raikhel，N.(1992)PlantPhys.100:1627-1632)。"葉綠體轉運肽"是與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導向葉綠體或在其中制備蛋白的細胞中存在的其它質體類型。"葉綠體轉運序列"指編碼葉綠體轉運肽的核苷酸序列。"穩(wěn)定轉化"指將核酸片段轉入宿主生物的基因組以產生穩(wěn)定的遺傳特性，該基因組包括核基因組和細胞器基因組。相反"瞬時轉化"指將核酸片段轉入宿主生物的核中或包含DNA的細胞器中，在無整合或無穩(wěn)定的遺傳特性的情況下引起基因表達。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為"轉基因"生物體。如本文所用的"轉基因"是指其基因組內含有異源多核苷酸的植物或細胞。優(yōu)選的是，異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進基因組中，使得該多核苷酸能傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可以單獨地或作為表達構建體的部分整合進基因組中。本文所用的轉基因包括因異源核酸存在而已經改變了基因型的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括初始進行此類改變的轉基因以及從初始的轉基因通過有性雜交或無性繁殖產生的那些轉基因。如本文所用的術語"轉基因"不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。術語"抑制"指當與植物中天然酶的可檢測的酶活性水平比較時，轉基因植物中可檢測的酶活性水平的降低。植物中天然酶的酶活性水平本文稱為"野生型"活性。術語"抑制"包括降低、減少、下調、減弱、抑制、消除和阻止。該降低可能是由于降低了天然mRNA翻譯成天然酶的水平。也可能是由于天然DNA轉錄成mRNA的量降低和/或天然mRNA的降解加快。術語"天然酶"指所需細胞中天然產生的酶。植物中的酶抑制可通過本領域已知的多種方法完成，包括以下方法。"共抑制"是指產生能抑制相同的或充分相似的天然基因表達的有義RNA轉錄本(美國專利5，231，020)。此前，已通過著眼于以有義方向過表達與內源mRNA具有同源性的核酸序列(其導致與過表達的序列具有同源性的所有RNA減少)設計出了植物中的共抑制構建體(參見Vaucheret等人，1998，PlantJ.，16:651-659;以及Gura，2000，Nature404:804-808)。"反義抑制"指產生能夠抑制靶蛋白表達的反義RNA轉錄物?？蓪⒅参锊《拘蛄杏糜谝龑薽RNA編碼序列的抑制(于1998年8月20日公開的PCT專利公開WO98/36083)。已經描述了"發(fā)夾"結構以互補方向整合mRNA編碼序列的全部或部分，導致已表達的RNA形成潛在的"莖-環(huán)"結構(于1999年10月21日公開的PCT專利公開W099/53050)。在這種情況下，莖由對應相對于啟動子以有義或反義方向插入的相關基因的多核苷酸形成，并且環(huán)由一些相關基因的多核苷酸形成，在構建體中該多核苷酸不具有互補序列。這增加了獲得的轉基因植物中的共抑制或沉默頻率。關于發(fā)夾抑制的綜述，參見17Wesley,S.V.等人，2003，MethodsinMolecularBiology,PlantFunctionalGenomics:MethodsandProtocols236:273-286。其中莖由至少30個來自待抑制基因的核苷酸形成而環(huán)由任意的核苷酸序列形成的構建體也已經有效地用于抑制(于1999年12月2日公開的WO99/61632)。使用聚_T和聚_A序列產生莖-環(huán)結構中的莖已經有所描述(于2002年1月3日公開的WO02/00894)。然而另一種變型涉及使用合成的重復序列來促進莖_環(huán)結構中的莖的形成。用這種重組DNA片段產生的轉基因生物體顯示由形成莖環(huán)結構的核苷酸片段編碼的多核苷酸的水平降低，如于2002年1月3日公開的PCT專利公開W002/00904中所述。已經描述了產生dsRNA構建體的用途。在這些構建體中共啟動子引導誘導基因抑制的基因特異性有義和反義RNA的轉錄(參見例如Shi，H.等人(2000)RNA6:1069-1076;Bastin，P.等人(2000)J.CellSci.113:3321-3328;Giordano，E.等人(2002)Genetics160:637-648;LaCount，D.J.和Donelson，J.E.美國專利申請20020182223，公布于2002年12月5日；Tran，N.等人(2003)BMCBiotechnol.3:21;和申請人的美國臨時申請60/578，404，提交于2004年6月9日)。用于酶抑制的其它方法包括但不限于使用可形成催化RNA或可具有核酶活性的多核苷酸(美國專利公開4，987，071，公布于1991年1月22日)，以及小RNA(也稱為miRNA)干涉(Javier等人(2003)Nature425:257-263)。用于抑制的多核苷酸片段序列與需被抑制的基因中存在的多核苷酸片段序列并非100%相同。例如，使用來源于編碼a亞基(美國專利公開6，362，399)的基因部分的多核苷酸已經成功抑制了所有大豆種子貯藏蛋白P-大豆伴球蛋白的亞基。P-大豆伴球蛋白是一種異質糖蛋白，由三個高負電亞基(鑒定為a、a'和的多樣化組合組成。編碼a和a'亞基的多核苷酸序列彼此約85%相同，然而編碼P亞基的多核苷酸序列與a和a'亞基分別為約75%至約80%相同。因此，與需抑制的耙多核苷酸區(qū)域至少約75%相同的多核苷酸已經顯示對抑制所需靶有效。所述多核苷酸可以與所需靶序列至少約80%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，或約100%相同。天然基因"能夠抑制表達的部分"指分離的核酸片段的一個部分或亞片段，其中無論所述片段或亞片段是否可以被翻譯成有活性的酶，其都保留著改變基因表達或導致某種表型的能力。例如，所述片段或亞片段可以被用于設計嵌合基因或重組DNA片段，以在轉化后的植物中產生所期望的表型?？梢酝ㄟ^將核酸片段或亞片段以相對于植物啟動子序列有義或反義的方向與所屬啟動子序列連接，從而設計出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亞片段無論是否翻譯成有活性的酶均可?？蓪⒅亟MDNA片段設計成包含能夠促進莖-環(huán)結構形成的核酸片段。在莖-環(huán)結構中環(huán)或莖包含一部分需被抑制的基因。核酸片段應具有至少約20個鄰接核苷酸的延伸部分，該延伸部分與需被抑制的基因相同。鄰接核苷酸的延伸部分可以是任何數(shù)目，從至少約20，或約32，至需被抑制的整個基因的大小。術語"植物"包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細胞，種子以及同一植株的子代。植物細胞包括但不限于得自下列物質的細胞種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。"子代"包括植物的任何后續(xù)世代。"對至少一種真菌有抗性的植物"指包含本發(fā)明的重組DNA構建體的植物，當用真菌感染該植物時，相對于無本發(fā)明的重組DNA構建體的植物，它能抗感染或在更大程度上忍受感染，導致?lián)p害減少、健康程度增加以及產量少損失或不損失。真菌通常是病原體。"病原體"或"真菌病原體"指在不包括本發(fā)明重組DNA構建體的條件下將引起植物疾病的真菌。包含本發(fā)明的重組DNA構建體的轉基因植物通常是比無本發(fā)明重組DNA構建體的相同物種植物對至少一種真菌更具有抗性的植物。禾論表汰盡、表汰盒禾口謝本、,靴啟動子是引導植物細胞機制從啟動子的鄰接編碼序列下游(3')產生RNA的DNA序列。所述啟動子區(qū)域影響著基因的RNA轉錄物合成的速率、合成時的發(fā)育階段和細胞類型。所述RNA轉錄物被加工為mRNA，后者作為用于將RNA序列翻譯為所編碼多肽的氨基酸序列的模板。5'端非翻譯前導序列是mRNA上位于蛋白質編碼區(qū)域上游的區(qū)域，其可能對mRNA翻譯的起始和進行發(fā)揮作用。3'轉錄終止/多聚腺苷酸化信號是位于蛋白質編碼區(qū)域下游的非翻譯區(qū)域，其在植物細胞中的作用是導致RNA轉錄的終止和多聚腺苷酸向RNA3'端的添加。用于驅動編碼序列表達的啟動子的來源并不重要，只要它具有足夠的轉錄活性以通過在適當?shù)臅r間、在所期望的宿主組織內表達所期望的核酸片段的可翻譯的mRNA，從而達到本發(fā)明的目的即可。異種的或非異種的(即內源的)啟動子均可用于實施本發(fā)明。例如，適當?shù)膯幼影ǖ幌抻赑大豆伴球蛋白啟動子的a引發(fā)亞單位、庫尼茲(Kimitz)胰蛋白酶抑制劑3啟動子、膜聯(lián)蛋白啟動子、大豆球蛋白Gyl啟動子、e大豆伴球蛋白啟動子的P亞單位、P34/GlyBdm30K啟動子、白蛋白啟動子、LegAl啟動子和LegA2啟動子。上述膜聯(lián)蛋白或P34啟動子描述于PCT專利公布W004/071178(公布于2004年8月26日)。上述膜聯(lián)蛋白啟動子的活性水平與任何已知的強啟動子相當，所述強啟動子如(1)CaMV35S啟動子(Atanassova等人，PlantMol.Biol.37:275-285(1998);BattrawandHall，PlantMol.Biol.15:527-538(1990);Holtorf等人，PlantMol.Biol.29:637-646(1995)Jefferson等人，EMB0J.6:3901-3907(1987);Wilmink等人，PlantMol.Biol.28:949-955(1995));(2)擬南芥油質蛋白(oleosin)啟動子(Plant等人，PlantMol.Biol.25:193-205(1994);Li，TexasA&MUniversityPh.D.dissertation,pp.107-128(1997));(3)擬南芥泛素延伸蛋白啟動子(Callis等人，JBiol.Chem.265(21):12486-93(1990));(4)番茄泛素基因啟動子(Rollfinke等人，Gene.211(2):267-76(1998));(5)大豆熱激蛋白啟動子(Schoff1等人，MolGenGenet.217(2-3):246-53(1989));以及(6)玉米H3組蛋白基因啟動子(Atanassova等人，PlantMolBiol.37(2):275-85(1989))。上述膜聯(lián)蛋白啟動子的另一有用特性是其在發(fā)育種子中的表達譜。上述膜聯(lián)蛋白啟動子在早期(授粉后10天以內)的發(fā)育中種子中最為活躍，而在隨后的時期基本保持沉默。上述膜聯(lián)蛋白啟動子的表達譜與許多種子特異性啟動子的都不同，后者如通常在發(fā)育后期表現(xiàn)出最高活性的種子貯藏蛋白啟動子(Chen等人，Dev.Genet.10:112-122(1989);Ellerstrom等人，PlantMol.Biol.32:1019-1027(1996);Keddie等人，PlantMol.Biol.24:327-340(1994);Plant等人，(同上);Li，(同上))。上述膜聯(lián)蛋白啟動子具有更加常規(guī)的表達譜，不過仍與其他已知的種子特異性啟動子不同。因此，當希望在早期發(fā)育階段過表達或抑制一個基因時，上述膜聯(lián)蛋白啟動子是一個很有吸引力的選擇。例如，可能希望過表達一個調控早期胚胎發(fā)育的基因或一個在種子成熟之前參與代謝的基因。在鑒定出適合表達編碼序列的適當啟動子之后，利用為本領域的技術人員所熟知的傳統(tǒng)方法，將所述啟動子以有義方向進行可操作地連接。本文所用的標準的重組DNA和分子克隆技術為本領域所熟知，并且Sambrook，J.等人在MolecularCloning:ALaboratoryManual;第二片反；ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,1989(以下簡禾爾"Sambrook等人，1989")或Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston,R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith,J.A.andStruhl，K.，編車茸，；在CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSons:NewYork，1990(以下簡稱"Ausubel等人，1990")中有更加詳盡的描述。在構建了重組構建體之后，可以通過為本領域的普通技術人員所熟知的方法(例如轉染、轉化和電穿孔)，將其導入植物細胞。也可將本發(fā)明的重組構建體導入一種植物細胞；或者也可將每一重組構建體導入至不同的植物細胞。如前所述，在植物細胞中的表達方式可以是暫時性的也可以是穩(wěn)定的。植物部分包括分化和未分化的組織，包括但不限于下列部分根、莖、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織和多種形式的細胞和培養(yǎng)物(例如單個細胞、原生質體、胚和愈傷組織)。植物組織可存在于植株或植物器官、組織或細胞培養(yǎng)物中。術語"植物器官"是指構成植株的形態(tài)和功能不同部分的植物組織或組織群。術語"基因組"是指(l)存在于生物體的每一個細胞或者病毒或細胞器中的全套遺傳物質(基因和非編碼序列)；和/或(2)作為(單倍體)單位從一個親本遺傳的全套染色體。用于轉化雙子葉植物(主要利用根癌農桿菌)并獲得轉基因植物的方法，已與其他方法一起公布于下列文獻棉花(美國專利5，004，863;美國專利5，159，135);大豆(美國專利5，569，834;美國專利5，416，011);用于蕓苔屬植物(Brassica)的那些(美國專利5,463，174);花生(Cheng等人，PlantCellR印.15:653-657(1996);McKently等人PlantCellR印.14:699-703(1995));番木瓜果(Ling，K.等人Bio/technology9:752-758(1991));以及豌豆(Grant等人PlantCellR印.15:254-258(1995))。對植物轉化的其他常用方法的綜述參見Newell，C.A.(Mol.Biotechnol.16:53-65(2000))。這些轉化方法之一利用了發(fā)根土壤桿菌(T印fler，M.andCasse-Delbart，F(xiàn).Microbiol.Sci.4:24-28(1987))。已公布的利用直接輸送DNA進行的大豆轉化，有利用PEG融合(PCT專利公布WO92/17598)、利用電穿孔(Chowrira，G.M.等人，Mol.Biotechnol.3:17-23(1995);Christou，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84:3962-3966(1987))、利用顯微注射和利用基因槍轟擊(McCabe，D.E.等人，Bio/Technology6:923(1988);Christou等人，PlantPhysiol.87:671-674(1988))進行的。存在多種用于從植物組織再生植物的方法。再生的具體方法將取決于起始植物組織以及待再生的具體植物物種。從單植物原生質體轉化體或從多種經轉化的外植體再生、發(fā)育和培育植物是本領域所熟知的(Weissbach和Weissbach(編輯)，載于MethodsforPlantMolecularBiology,(Eds.)，Academic:SanDiego，CA(1988))。該再生和生長方法通常包括如下步驟選擇轉化的細胞和培養(yǎng)這些單獨化的細胞通過胚發(fā)育的通常階段以及通過生根小植株階段。轉基因胚以及種子以類似的方式再生。隨后將所得的轉基因的生根小苗種植在諸如土壤之類的合適植物生長培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物?；蛘?，將得自再生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反，將來自這些重要品系的植物用于給再生植物授粉。利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發(fā)明的轉基因植物。除以上所討論的程序以外，專業(yè)人員亦熟悉描述了用于下列目的的特定條件和程序的標準源資料大分子的構建、操作和分離(例如DNA分子、質粒等等)；重組DNA片段和重組表達體的構建；以及克隆的篩選和分離。例如參見Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al，ColdSpringHarbor:NY(1989);Maliga等人，MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarbor:NY(1995);Birren等人，GenomeAnalysis:DetectingGenes，第1巻，ColdSpringHarbor:NY(1998);Birren等人，GenomeAnalysis:AnalyzingDNA，第2巻，ColdSpringHarbor:NY(1998);PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual，編車茸，Clark，Springer:NY(1997)。本發(fā)明涉及編碼絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的分離多核苷酸。如本文所用，"多核苷酸"指編碼新絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的多核苷酸，所述酶涉及植物中P_香樹素衍生的三萜或具有改變修改形式的三萜的生物合成。這些分離自黑燕麥的酶稱為AsSCPLl(絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶)、AsMTl(甲基轉移酶)和AsGT2(葡糖基轉移酶)。Sad7突變體不能產生燕麥根皂苷，也不能積累在正_氨茴酸甲酯(燕麥根皂苷A-1和B-1)或苯甲酸鹽(燕麥根皂苷A-2和B-2)酰基位點具有羥基的三鵬配醣(QiX等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:8233)。因此，它們不發(fā)生三鵬?；?。已經鑒定了四個具有Sad7表型的突變體(表l)。它們中的每一個都具有對本發(fā)明的多核苷酸有損害，將導致多核苷酸不能表達編碼功能蛋白的功能mRNA。這些數(shù)據(jù)與本文提供的生物化學數(shù)據(jù)一起表明本發(fā)明非突變的多核苷酸編碼來自黑燕麥的(ASCPL1)絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶，該酶負責三萜主鏈的?；?，而該?；^程在Sad7突變體中不發(fā)生。公開了編碼AsSCPLl的cDNA基因組片段(SEQIDNO:1和SEQIDNO:7)。表1:表征Sad7突變體。顯示的發(fā)牛改變的堿某位置(上標第2列)某于突變體DNA序列與SEQIDNO:1的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>Sad9基因產物與苯基丙酸類生物合成中涉及的甲基轉移酶具有同源性，包括在葉片中響應病原體襲擊和UV剌激誘導的大麥甲基轉移酶(ChristensenA等人，1998，PlantMol.Biol.36:219)。因為該甲基轉移酶是燕麥根皂苷合成所需的，它的作用可能是甲基化燕麥根皂苷A-l和B-l的鄰氨基苯甲酸鹽部分(圖1)。已經鑒定了四個具有Sad9表型的突變體(表2)。它們中的每一個都具有對本發(fā)明的多核苷酸有損害，將導致多核苷酸不能表達編碼功能蛋白的功能mRNA。這些數(shù)據(jù)與本文提供的生物化學數(shù)據(jù)一起表明本發(fā)明非突變的多核苷酸編碼來自黑燕麥的(AsMTl)甲基轉移酶，該酶負責甲基化燕麥根皂苷A-1和B-l的鄰氨基苯甲酸鹽部分。公開了編碼AsMTl的cDNA基因組片段(SEQIDN0:3和SEQIDNO:8)。表2:Sad9突變體表ffi。H示的發(fā)牛改變的堿某份置(卜.標第2列)某于突變體DNA序列與SEQIDNO:3的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>SadlO葡糖基轉移酶與糖化水楊酸和其它苯甲酸衍生物的酶具有同源性。公開了編碼來自黑燕麥(AsGT2)的葡糖基轉移的cDNA和基因組片段(SEQIDNO:5和SEQIDNO:9)。編碼負責多種谷物中三萜合成的酶的基因鑒定將允許它們的操縱。三萜合成操縱將引起三萜皂苷水平或結構的改變。本發(fā)明的核酸片段可用于分離cDNA和編碼來自相同或其他微生物物種的同源蛋白的基因。使用序列依賴性規(guī)程分離同源基因是本領域熟知的。序列依賴型規(guī)程的實例包括但不限于核酸雜交方法、以及DNA和RNA擴增方法例如核酸擴增技術的各種應用(例如，聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應)。例如，編碼其它酰基轉移酶(具體地講那些絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶)、葡糖基轉移酶或甲基轉移酶的基因，可以以cDNA或基因組DNA的形式直接分離，所述分離使用本領域技術人員熟知的方法，通過使用全部或部分本發(fā)明核酸片段作DNA雜交探針以篩選來自任何所需植物的文庫?？梢栽O計并通過本領域已知的方法，基于本發(fā)明的還是序列合成特異性寡核苷酸探針(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor:NY(1989))。而且，整個序列可直接用于通過熟練技術人員已知的方法，例如隨機引物DNA標記、切口平移或末端標記技術，來合成DNA探針，或使用可獲得的體外轉錄體系來合成RNA探針。另外，可設計特異性引物并將其用于擴增部分或全長的本發(fā)明序列。所得的擴增產物可在擴增反應過程中直接標記或在擴增反應后標記，并用作探針來在合適的嚴格條件下分離全長的cDNA或基因組片段。此外，可以將本發(fā)明核酸片段的兩個短片段在聚合酶鏈反應規(guī)程中用于從DNA或RNA擴增編碼同源基因的更長的核酸片段。聚合酶鏈反應也可以用克隆的核酸片段的文庫進行，其中一個引物的序列源自本發(fā)明的核酸片段，而另一個引物的序列利用編碼植物基因的mRNA前體的3'端的多腺苷酸片的存在。備選地，第二個引物序列可以基于來源于克隆載體的序列。例如，技術人員可以按照RACE規(guī)程(Frohman等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85:8998-9002)，通過用PCR擴增在轉錄物內單個位點與3'或5'端之間的區(qū)域的拷貝來產生cDNA。以3'和5'方向取向的引物可用本發(fā)明的序列設計。使用可商業(yè)獲得的3'RACE或5'RACE體系(BRL)，可以分離特異性的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A86:5673-5677;Loh等人，1989，Science243:217-220)?？山M合使用通過3'和5'RACE程序生成的產物以生成全長cDNA(FrohmanandMartin,1989，Techniques1:165)。本發(fā)明的核苷酸序列和其衍生氨基酸序列的可用性有利于免疫篩選cDNA表達文庫?？梢院铣杀景l(fā)明氨基酸序列的合成肽代表部分。可以使用這些肽免疫動物以產生多克隆或單克隆抗體，所述抗體具有對包含所述氨基酸序列的肽或蛋白的特異性。然后可將這些抗體用于篩選cDNA表達文庫以分離受關注的全長cDNA克隆(Lerner，1984，Adv.Immunol.36:1_34;S咖brook)?？梢詷嫿ò景l(fā)明的分離多核苷酸的質粒載體。質粒載體的選擇取決于將用于轉化宿主細胞的方法。技術人員熟知為了成功地轉化、篩選和繁殖包含嵌合基因的宿主細胞，必須存在于質粒載體上的遺傳元件。技術人員還將認識到，不同的獨立轉化事件將導致不同水平和模式的表達(Jones等人，1985，EMBOJ.，4:2411-2418;DeAlmeida等人，1989，Mol.Gen.Genetics218:78-86)，因此，可能必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達的Northern印跡分析、蛋白表達的Western分析或表型分析完成。就一些應用而言將本發(fā)明多肽導入不同的細胞區(qū)室或促進它們從細胞中的分泌可能是有用的。因此設想可將本發(fā)明的重組DNA構建體進一步進行補充，這通過改變編碼合適的細胞內靶信號的編碼序列來進行，如轉運信號(Keegstra，1989，Cell56:247-253)、具有或不具有內質網駐留信號的信號序列(Chrispeels，1991，Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42:21-53)、或已經移除或未移除已有耙信號的核定位信號(Raikhel，N.，1992，PlantPhys.100:1627-1632)。當引用的參考給出這些信號中每個信號的實例時，所述列表是不完全的，將來可能發(fā)現(xiàn)更多的靶信號。例如嵌合絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達分別導致與未轉化宿主細胞中產生的水平相比，在轉化宿主細胞中產生的所編碼的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶蛋白水平變化。包含本發(fā)明多核苷酸的轉基因植物或植物部分在異源啟動子的控制下也導致植物具有改變的三萜水平，所述多核苷酸例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、和SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、和SEQIDNO:9。植物可選自單子葉植物和雙子葉植物。單子葉植物包括但不限于玉米、燕麥、稻、小麥、大麥、棕櫚等。雙子葉植物包括但不限于擬南芥、大豆、含油種子蕓苔、花生、向日葵、紅花、棉花、煙草、番茄、馬鈴薯、可可豆等。植物部分包括但不限于例如種子和谷物。因此，可將本發(fā)明的分離多核苷酸結合到能夠導入并在宿主細胞中復制的重組構建體中。因此，本發(fā)明還涉及用于轉化細胞的方法，所述方法包括用本發(fā)明重組構建體轉化細胞以及選擇那些用本發(fā)明其中一種重組構建體轉化過的細胞。還關注用于生產轉化植物的方法，所述方法包括用本發(fā)明的任何多核苷酸轉化植物細胞以及從轉化過的植物細胞再生植物。可使用本發(fā)明的核酸片段產生轉基因植物，轉基因植物中本發(fā)明的?；D移酶、葡糖基轉移酶或甲基轉移酶的水平高于正常植物，或它們在正常情況下不產生這些酶的細胞類型或發(fā)育階段中存在。這將有改變那些細胞中三萜生產的效應。據(jù)信任選地與編碼負責皂苷生物合成途徑中其它步驟的酶的多核苷酸組合的本發(fā)明多核苷酸的超表達提高對至少一種真菌的抗性。本發(fā)明的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、葡糖基轉移酶或甲基轉移酶的超表達可通過以下步驟完成首先構建重組DNA構建體，其中編碼區(qū)被可操作地連接至一個啟動子，該啟動子能夠引導三萜途徑的第一種酶(如本發(fā)明的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、葡糖基轉移酶或甲基轉移酶)在所需組織和所需發(fā)育階段中的表達。重組DNA構建體可包含來源于相同基因的啟動子序列和翻譯前導序列。也可提供編碼轉錄終止信號的3'非編碼序列。上述重組DNA構建體也可包含一種或多種促進基因表達的內含子。為了提高三萜途徑的流量，可將上述能夠引導絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶表達的重組DNA構建體結合到轉基因植物中。此外，可構建包含本發(fā)明基因的重組構建體，其中除了可操作地連接至能夠引導三萜途徑第一種酶表達的啟動子的編碼區(qū)之外，重組構建體還包含至少一個另外的編碼區(qū)，該編碼區(qū)可操作地連接至能夠引導本發(fā)明至少一個第二種酶表達的啟動子。期望分離自黑燕麥的本發(fā)明基因組合的實例包括但不限于AsSCPLl+AsMTl;AsSCPLl+AsGT2;AsGT2+AsMTl和AsSCPLl+AsMTl+AsGT2。也可通過組合在轉基因植物中的上述重組構建體和編碼途徑中前兩個步驟的酶的構建體獲得提高的途徑通量，所述途徑中前兩個步驟的酶是環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶P-香樹素合酶(Sadl基因的產物；HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:13431-13436)和/或細胞色素P450酶CYP51H10(由Sad2基因編碼；QiX.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:18848-18853)。以前已經描述了用于超表達這兩個基因的構建體(Osbourn等人，2007年3月6日，US，7，186，884B2;0sbourn等人，US2006-0112448A1)。此外，可構建包含本發(fā)明基因的重組構建體，其中除了可操作地連接至能夠引導三萜途徑第一種酶表達的啟動子的編碼區(qū)之外，重組構建體還包含至少一個另外的編碼區(qū)，該編碼區(qū)可操作地連接至能夠引導三萜途徑至少一個第二種酶表達的啟動子。期望分離自黑燕麥的本發(fā)明基因和來自三萜途徑的其它基因的組合實例包括但不限于AsSCPLl+Sadl;AsMTl+Sadl;AsGT2+Sadl;AsSCPLl+Sad2;AsMTl+Sad2;AsGT2+Sad2;AsSCPLl+AsMTl;AsSCPLl+AsGT2;AsGT2+AsMTl;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2+Sadl;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2+Sad2;AsSCPLl+Sadl+Sad2;AsMTl+Sadl+Sad2;AsGT2+Sad1+Sad2;AsSCPL1+AsMT1+Sad1+Sad2;AsSCPLl+AsGT2+Sadl+Sad2;AsMTl+AsGT2+Sadl+Sad2;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2+Sadl+Sad2;AsSCPLl+AsMTl+Sadl;AsSCPL1+AsGT2+Sad1;AsGT2+AsMT1+Sad1;AsSCPLl+AsMTl+Sad2;AsSCPLl+AsGT2+Sad2;禾口AsGT2+AsMTl+Sad2;也可期望減少或消除植物中本發(fā)明的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達用于一些應用。抑制本發(fā)明多核苷酸可導致植物產生更少的皂苷，這繼而可改善風味。為了達到此目的，可構建設計用于共抑制此類酶的重組DNA構建體，該構建通過將編碼本發(fā)明的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的子序列上。作為另外一種選擇，可構建設計用于表達全部或部分本發(fā)明核酸片段的反義RNA的嵌合基因，該構建通過將基因或基因片段反向連接到植物啟動子序列上?？山浻赊D化將共抑制或反義嵌合基因導入植物中，其中減少或消除了相應內源基因的表達。也可制備導致形成莖-環(huán)結構的嵌合核酸片段的構建體，其中本發(fā)明的多核苷酸部分是莖或環(huán)或結構。使用編碼本發(fā)明的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的核苷酸序列的至少一部分制備將以RNAi形式抑制其表達的構建體也是可能的?？蓪⑸衔奶岬降娜魏沃亟MDNA構建體導入細胞中以消除植物中本發(fā)明的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達。此外，此類構建體能與包含環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶，P-香樹素合酶片段的重組構建體組合(Sadl基因的產物；(HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:13431—13436)和/或細胞色素P450酶CYP51H10(由Sad2基因編碼；QiX.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:18848-18853)以抑制途徑中的所有步驟。期望分離自黑燕麥的本發(fā)明基因和來自三萜途徑的其它基因(可進行組合以改變或降低三萜皂苷的水平)的組合實例包括但不限于AsSCPLl+Sadl;AsMTl+Sadl;AsGT2+Sadl;AsSCPLl+Sad2;AsMTl+Sad2;AsGT2+Sad2;AsSCPLl+AsMTl;AsSCPLl+AsGT2;AsGT2+AsMTl;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2+Sadl;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2+Sad2;AsSCPLl+Sadl+Sad2;AsMTl+Sadl+Sad2;AsGT2+Sad1+Sad2;AsSCPL1+AsMT1+Sad1+Sad2;AsSCPLl+AsGT2+Sadl+Sad2;AsMTl+AsGT2+Sadl+Sad2;AsSCPLl+AsMTl+AsGT2+Sadl+Sad2;AsSCPLl+AsMTl+Sadl;AsSCPL1+AsGT2+Sad1;AsGT2+AsMT1+Sad1;AsSCPLl+AsMTl+Sad2;AsSCPLl+AsGT2+Sad2;禾口AsGT2+AsMTl+Sad2;在某些實施方案中，本實施方案的核酸序列可以與受關注的多核苷酸序列的任何組合堆疊以產生具有所需表型的植物，所述序列可以是轉基因的或非轉基因的。例如，所述實施方案的多核苷酸可以與該實施方案的任何其它多核苷酸或其它基因進行堆疊。生成的組合也可包括受關注的多核苷酸的多個拷貝中的任何一個。所述實施方案的多核苷酸也可與任何其它基因或基因組合發(fā)生堆疊以產生具有多種所需特性的植物，包括但不限于動物飼料所需的特性如高油基因(例如美國專利公開6，232，529);平衡氨基酸(例如硫素(美國專利公開5，990，389;5，885，801;5，885，802;和5，703，409);大麥高賴氨酸(Williamson等人，(1987)，Eur.J.Biochem.165:99-106;和W098/20122);和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人，(1986)，J.Biol.Chem.261:6279;Kirihara等人，(1988)，Gene71:359;和Musumura等人，(1989)，PlantMol.Biol.12:123));提高的消化性(例如修飾的貯藏蛋白質(美國專利申請序列號10/053，410，提交于2001年11月7日)；和硫氧還蛋白(美國專利申請序列號10/005，429，提交于2001年12月3日))，上述公開以引用方式并入本文。所述實施方案的多核苷酸也能與抗昆蟲、疾病或除草劑所期望的特性堆疊(例如蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白質(美國專利公開5，366，892;5，747，450;5，737，514;5723，756;5，593，881;Geiser等人(1986)Gene48:109);凝集素(VanDamme等人(1994)PlantMol.Biol.24:825);伏馬菌素脫毒(fumonisindetoxification)基因(美國專利公開5,792,931);無毒性和抗病基因(Jones等人(1994)Science266:789;Martin等人(1993)Science262:1432;Mindrinos等人(1994)Cel178:1089);導致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體如S4和/或Hra突變體(Lee等人，(1988)EMBOJ.7(5):1241-1248)，抗谷氨酰胺合酶抑制劑性如草胺膦或basta(例如bar基因；DeBlock等人(1987)EMBOJ.6:2513-2518);賦予HPPD抑制除草劑抗性的HPPD基因，所述除草劑如甲基磺草酮或異噁唑草酮(Matringe等人，(2005)，PestManagementScience61:269-276;Dufo翻antel等人，(2007)PlantBiotech.J.5:118-133;也參見W01997049816)，賦予PPO抑制除草劑抗性的基因(Li和Nicholl，(2005)PestManagmentScience61:277-285);合成生長素抗性基因(美國專利申請2005/014737和Herman等人，(2005)，J.Biol.Chem.280:24759-24767)，和草甘膦抗性(印sps基因、gat基因如那些公開于美國專利公開申請公布US2004/0082770、W002/36782和W003/092360中的基因))；和過程或過程產物所期望的特性如高油(例如美國專利公開6，232，529);改性油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利公開5，952，544;W094/11516));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉支鏈化酶(SBE)和淀粉去支鏈化酶(SDBE));以及聚合物生物塑料(例如美國專利公開5.602，321;13-酮硫解酶、聚羥基丁酯合酶、和乙酰乙酰-CoA還原酶(Schubert等人(1988)J.Bacterid.170:5837-5847)，有利于表達聚羥基鏈烷酸酯(PHAs))，其公開以引用方式并入本文。也可以組合所述實施方案的多核苷酸與提供農學特征的多核苷酸，所述農學特征如雄性不育(例如參見美國專利公開5.583，210)、秸稈強度、開花時間、產量提高、或轉化技術特性如細胞周期調節(jié)或基因靶(例如W099/61619;W000/17364;W099/25821)，其公開以引用方式并入本文?？赏ㄟ^任何方法產生這些堆疊的組合，包括但不限于通過任何常規(guī)方法或TopCross⑧方法、或基因轉化雜交育種植物。如果所述特性通過遺傳轉化植物堆疊，則受關注的多核苷酸序列可在任何時間以任何順序進行組合。例如，可將包括一種或多種所需特性的轉基因植物用作靶，通過后續(xù)的轉化導入更多特性?？梢杂霉厕D化規(guī)程將特性與受關注的多核苷酸同時導入，所述多核苷酸由轉化盒的任何組合提供。例如，加入將導入兩個序列，可將兩個序列包含在分離的轉化盒中(反式)或包含在相同轉化盒中(順式)。可通過相同啟動子或不同啟動子促進序列表達。在某些實例中，可能期望導入將抑制受關注的多核苷酸表達的轉化盒。這可以與其它抑制盒或超表達盒的任何組合組合使用以在植物中生成所需特性組合。進一步認識到可使用位點特異性重組體系在所需基因組位點堆疊多核苷酸序列。參見例如W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，它們均以引用方式并入本文。本發(fā)明的實施方案可以有效的抗多種植物真菌病原體。可使用上述導致產生更高三萜水平皂苷的重組構建體產生抗至少一種真菌的植物。主要作物的一些特異性真菌病原體包括但不限于以下菌種^S:菜豆炭腐病菌、立枯絲核菌、油菜菌核病菌、尖孢鐮孢菌、豆莢雕腐病和莖枯病菌(Phomopsissojae)、大豆北方莖潰瘍病菌、白絹菌、大豆紫斑病菌、大豆灰斑病菌、黑線炭疽菌(Colletotichumtruncatum)、巴西橡膠棒孢霉落葉病菌、大豆褐紋病菌、葉點霉菌、鏈格孢菌、大豆白粉病菌、半裸鐮刀菌、大豆莖褐腐病菌、黑果病菌甘氨酸、大豆銹菌、鑭素對鐮刀菌:低芥酸菜籽:甘藍黑斑病菌、低酸菜籽油黑脛病菌、立枯絲核菌、油菜菌核病菌、油菜環(huán)斑病菌、粉紅鐮刀菌、鏈格孢菌;皿苜蓿莖點霉菌、苜蓿尾孢、苜蓿假盤菌、苜蓿纖毛菌L、尖孢鐮孢菌、苜蓿黃萎病菌、葡柄霉菌、苜蓿葡柄霉菌、苜蓿炭疽病菌、苜蓿小光殼菌、苜蓿銹病菌、苜蓿菌核病菌、苜蓿殼多孢葉斑菌、苜蓿匍柄霉菌、苜蓿黃斑病菌；M:小麥條黑粉菌、小麥黑胚病菌鏈格孢、小麥黑霉病菌、小麥鐮刀菌、黃色鐮刀菌、小麥散黑粉病菌、小麥殼二孢、麥類條斑病菌、禾生炭疽菌、小麥白粉病菌、桿銹菌、隱匿柄銹菌、條銹菌、小麥褐斑病菌、穎枯病菌、葉枯病菌、燕麥殼針孢、小麥基腐病菌、立枯絲核菌、禾谷絲核菌、小麥全蝕病菌、小麥根腐病菌、黑麥麥角菌、黑麥草腥黑粉菌、小麥腥黑穗病菌、小麥散黑粉病菌、小麥印度腥黑穗病菌、立枯絲核菌:向日葵:霍爾斯單軸霉、油菜菌核病菌、向日葵殼針孢、向日葵褐腐病菌、向日葵黑斑病菌、百日草鏈格孢菌、草莓灰霉病菌、向日葵莖點霉黑莖病菌、菜豆殼球孢菌、二孢白粉菌、米根霉、少根根霉、匍枝根霉、向日葵柄銹菌、大麗輪枝菌、頂頭孢霉菌；皿粱炭疽病菌(Glomerellagraminicola)、玉蜀黍殼色單隔孢菌(Diplodiamaydis)、玉米頂腐串珠鐮刀菌、內生性輪狀鐮刀霉、禾谷鐮刀菌(Gibberellazeae)、黃曲霉、玉米小斑病菌、T(玉米小斑病菌)、玉米圓斑病菌I、1I&III(Cochlioboluscarbo皿m)、玉米大斑病菌I、1I&III、梗蠕形菌、米褐斑病菌、玉米黃葉枯病菌、玉米眼斑病菌、高梁尾孢、玉米黑粉菌、玉米柄銹菌、多堆柄銹菌、菜豆殼球孢菌、草酸青霉、稻交鏈孢霉、禾黑芽枝霉、新月彎孢菌、不等彎孢、玉米彎孢葉斑病菌、綠色木霉、玉米堅韌黑粉菌、玉米干腐病菌、玉米瘋頂病菌、高糧林黑穗菌、玉米銹病菌、麥類條斑病菌、頂頭孢霉；皿大斑病菌、高粱紫斑病菌、高粱膠尾孢菌、高粱粗斑殼二孢、高梁銹菌、菜豆殼球孢菌、高粱黑蔥花霉根腐病菌、串珠鐮刀菌、鏈格孢菌、為蜀黍生離蠕孢菌、雀麥長蠕孢、新月彎孢菌、高粱莖點霉、高粱座枝孢、高梁生座枝孢、高粱黑痣菌、高粱絲黑穗病菌(Sphacelothecareiliana)、高粱散黑穗病菌、粱堅孢堆黑粉菌、高粱麥角菌、立枯絲核菌、枝頂孢霉、黑果病菌(Colletotrichum)(C.sublineolum)、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮孢菌；等等?？墒褂帽景l(fā)明的核酸序列進行多種基于核酸擴增的基因和物理繪圖方法。實例包括但不限于等位基因特異性擴增(Kazazian，H.H.jr，1989，J.Lab.Clin.Med.11:95-96)、PCR擴增片段的多態(tài)性分析(CAPS;Sheffield，V.C.，等人，1993，Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren，U.，等人，1988，Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(Sokolov，B.P.，1990，NucleicAcidRes.18:3671)、輻射雜種作圖(Walter,M.A.等人，1994，Nat.Genet.7:22-28)、熒光原位雜交(FISH;Svitashev，S.K.和Somers，D.A.，2002，PlantCellTissueOrganCult.69:205-214)、以及H即py繪圖(Dear，P.H.和Cook，P.R.，1989，NucleicAcidRes.17:6795-6807)。就這些方法而言，將核酸片段序列用于設計并制備引物對用于擴增反應或引物延伸反應。此類引物的設計是本領域的技術人員熟知的。在使用基于PCR的基因繪圖的方法中，必須鑒定在對應于本發(fā)明核酸序列的區(qū)域中的繪圖雜交親本間的DNA序列差異。然而這一般對所有繪圖方法來說是不必要的。盡管不希望受任何理論或操作理論的約束，本領域的技術人員相信改變的三萜水平具有不同的效應。在通常會遭受真菌病原體感染的植物部分中提高的三萜(如燕麥根皂苷)水平可賦予植物對至少一些此類病原體的抗性，保護植物并因此提高其在真菌脅迫環(huán)境中的產量。來源于具有高三萜水平的植物的食物被認為具有降低膽固醇的效應，然而三萜水平降低據(jù)信會使得食物具有更好的風味。因此，生長過程中具有改變水平的AsSCPLl、AsMTl和/或AsGT2的植物可有助于生產更有營養(yǎng)的和/或風味更好的食物。因此，本發(fā)明也包括來自本發(fā)明轉基因植物的谷物。27實施例本發(fā)明將在下面的實施例中進一步限定，其中所有份數(shù)和百分比是以重量計并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應該理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實施例，本領域的技術人員能確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，能夠對本發(fā)明做出多種改變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在屬于附加的權利要求書的范圍內。一般方法實施例中使用的標準重組DNA技術和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中有所描述(1)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.禾口Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis);(2)T.J.Silhavy，M丄Ben薩禾口LW.E卿ist，ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984);禾口(3)Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出片反(1987)。適用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法是本領域熟知的。適用于下面實施例的技術可在ManualofMethodsforGe證alBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood,NoelR.Krieg禾卩G.BriggsPhillips編輯)，AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.(1994));或ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第2片反，SinauerAssociates:Sunderland，MA(1989)的描述中找到。用于微生物細胞的生長和維持的所有試劑、限制性內切酶和材料均獲自AldrichChemicals(Milwaukee,WI)、DIFC0Laboratories(Detroit,MI)、GIBC0/BRL(Gaithersburg，MD)或SigmaChemicalCompany(St.Louis，M0)，除非另夕卜說明。—般的分子克隆根據(jù)標準方法(Sambrook等人，同上)來完成。DNA序列是在ABI自動測序儀上采用染料終止劑技術(美國專利5，366，860;EP272，007)使用載體和插入片段特異性引物的組合來產生的。序列編輯是在Sequencher(GeneCodesCorporation,A皿Arbor，MI)中進行的。所有序列在兩個方向上覆蓋至少兩次?；蛐蛄械谋容^是使用DNASTAR軟件(DNAStar,Inc.)完成。縮寫的含義如下"sec"表示秒，"min"表示分鐘，"h"表示小時，"d"表示天，"iiL"表示微升，"mL"表示毫升，"L"表示升，"yM"表示微摩爾濃度，"mM"表示毫摩爾濃度，"M"表示摩爾濃度，"mmol"表示毫摩爾，"iimole"表示微摩爾，"g"表示克，"yg"表示微克，"ng"表示納克，"U"表示單位，"bp"表示堿基對而"kB"表示千堿基對。實施例1分離絲氨酸羧肽酶樣蛋白(AsSCPLl)、甲某轉移酶(AsMTl)和葡糖某轉移酶(AsGT2)的基因組和cDNA片段編碼受絲氨酸羧肽酶樣蛋白(AsSCPLl)、甲基轉移酶(AsMTl)和葡糖基轉移酶(AsGT2)影響的基因的基因組多核苷酸片段分離自BAC文庫，該文庫來源于黑燕麥登錄號S75基因組DNA和從燕麥中如下制備的cDNA文庫。BAC文庫從黑燕麥登錄號S75基因組DNA中構建((QiX.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A103:18848-18853)。DNA探針來源于Sadl(0sbourn等人，2007年3月6日，US，7，186，884B2)和Sad2(Osbourn等人，US2006-0112448A1)，該探針用于篩選完整BAC文庫。構建跨越一個用于燕麥根皂苷生物合成的基因簇(QiX.等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:8233-8238)的BAC重疊群。BAC指紋和BAC末端序列分析使得我們能夠裝配一個重疊群，該重疊群由BAC克隆462F14、460D15和409010組成?？寺?60D15包含Sadl和Sad2(QiX.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A103:18848-18853);克隆462F14在最靠近Sad2的一側具有約70kb與460D15的重疊區(qū)域，然而克隆409010與克隆460D15在最靠近Sadl的一側重疊約35kb。使用409010的末端序列作為探針，鑒定另一個BAC克隆341P21。BAC指紋和PCR分析確認克隆409010的另一端與克隆341P21重疊約40kb。預測完整重疊群的長度為365kb。燕麥根mRNA的分離和相應的cDNA文庫的構建描述于HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:13431-13436。在EcoRI/XhoI位點將cDNA插入序列克隆到pGADT7載體中(ClonTechLab，Inc.)。將總計36，864個克隆儲存在96384孔微板中。將完整的燕麥根cDNA文庫分格置于兩個過濾器上用于雜交。通過NotI消化分離來自BAC克隆409010和341P21的插入序列DNA，并將其用作探針以篩選cDNA文庫。鑒定了總計60個陽性克隆并將這些克隆的插入序列進行測序。測序使用ABIPRISMBig-DyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(AppliedBiosystems)進行。從52個克隆中獲取cDNA序列。除了5個特殊序列之外，把剩余的47個cDNA插入序列分成四類基因。對它們進行進一步分析以鑒定最長的cDNA克隆并隨后鑒定四類中每一類的全長cDNA。第一類代表Sadl的cDNA，因此確認BAC重疊群實際上不跨越包含此基因的基因簇。預測來自第二類的全長cDNA編碼絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPLl。該基因的核苷酸序列顯示于SEQIDNO:1中。SEQIDNO:1的核苷酸56至1534衍生的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:2中。核苷酸1535至1537代表一個終止密碼子。第三類cDNA序列對應于預測的甲基轉移酶，AsMTl。該基因的核苷酸序列顯示于SEQIDNO:3中。SEQIDNO:3的核苷酸13至1074衍生的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:4中。核苷酸1075至1077代表一個終止密碼子。第四類cDNA序列對應于一個預測的葡糖基轉移酶家族1，AsGT2。通過對燕麥根推定葡糖基轉移酶EST(refSadlpatent)的序列分析獲取全長cDNA。該基因的核苷酸序列顯示于SEQIDNO:5。SEQIDNO:5的核苷酸66至1475的衍生氨基酸序列顯示于SEQIDNO:6。核苷酸1458至1460代表一個終止密碼子。為了獲取上述基因的基因組序列，通過標準BAC鳥槍測序法對來自重疊群的BAC克隆462F14、460D15、409010禾P341P21進行測序。獲取了約317kb的BAC重疊群，該重疊群包含五個預測的生物合成酶的基因(P-香樹素合酶(Sadl)、細胞色素P450CYP51H10(Sad2)、絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPLl、甲基轉移酶AsMTl和葡糖基轉移酶AsGT2)(圖2)。廣泛的序列注釋未揭示更多的開放閱讀框。Northern印跡法和RT-PCR分析表明BAC重疊群中的所有五個基因在根中優(yōu)先表達(圖3)。因為燕麥根皂苷在燕麥根部29合成并積聚，并且Sadl和Sad2在根部優(yōu)先表達，其它的三個基因AsSCPLl、AsMTl和AsGT2也可能涉及燕麥根皂苷的生物合成?；蚪MDNA序列和cDNA序列的比較提供了絲氨酸羧肽酶樣蛋白(AsSCPLl)、甲基轉移酶(AsMTl)和葡糖基轉移酶(AsGT2)的三個基因的預測啟動子和基因組序列。編碼AsSCPLl、AsMTl和AsGT2的基因組多核苷酸片段和預測的3_kb啟動子序列分別顯示于SEQIDN0:7、SEQIDNO:8禾PSEQIDNo:9。實施例2分離并表ffiSad7燕耒突變體用疊氮鈉進行誘變二倍體燕麥(黑燕麥)的種子，使來自單個M1植物的M2種子發(fā)芽并評估根部熒光以進行初篩選，鑒定皂苷缺乏或Sad燕麥突變體。候選燕麥根皂苷缺乏突變體基于減少的根部熒光進行鑒定，并通過TLC和HPLC分析來自純合M3幼苗的甲醇根提取物進行確認。牛成突變體基本上按照所述方法用疊氮鈉誘變二倍體燕麥(黑燕麥)的種子(登錄號S75，來自InstituteofGrasslandsandEnvironmentalResearch,Aberystwyth,Wales,UK)(Rines，H.W.，1985，Env.Exp.Bot.，25:7-17)。簡而言之，如下進行誘變。將種子預先浸泡在用橡膠塞子密封的錐形瓶中，每顆種子使用O.5mL水，在軌道平臺振蕩器中以120個循環(huán)每分鐘振蕩。在預浸泡4小時后倒出水。制備在O.1M磷酸鈉中的10mM疊氮鈉溶液，pH3.2，并將其立即加到種子中。在如上進行振蕩1小時后，倒出誘變溶液并用水沖洗種子5至6次，其中最后三次水沖洗時間延長至超過30分鐘。將沖洗后的種子排干水分，鋪展于通風櫥里的紙上至其干燥。使來自單個Ml植物的M2種子發(fā)芽并如下文所示評估根部熒光。主要的燕麥根皂苷燕麥根皂苷A-l包含N-甲基鄰氨基苯甲酸，因此主要引起燕麥幼苗根部的亮藍熒光(OsbournA.E.等人，1994，Physiol.Mol.PlantPathol.45:457-467)。燕麥根皂苷A-1可通過UV光進行檢測，這使得可將根部熒光用作初篩選以鑒定皂苷缺乏(Sad)燕麥突變體。使單個M2家族的種子發(fā)芽并評估其根部熒光。在初步篩選中，在篩選代表1，289個M2家族的幼苗后，鑒定了十個具有減少熒光的獨立突變體，這已被P即adopoulouK.等人報道過(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:12923-1928)。后續(xù)的突變體篩選鑒定了另外82個基于減少的根部熒光進行分離的獨立燕麥根皂苷缺乏突變體。生物化學表征按照所述方法分析最初的十個突變體的根提取物(P即adopoulouK.等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:12923-1928)。簡而言之，使M3種子在濕濾紙上發(fā)芽2天，收獲每個品系的20株幼苗的根部末端0.5cm部分，并在甲醇中提取。制備三份來自M3幼苗的粗制甲醇根提取物用于HPLC分析，在HichromNucleosil5C18反相柱(4.5X250mm)上，在等度條件下，在75%甲醇中(流量為lmL/min)，直接分析100iiL等分試樣，檢測波長為225nm。通過與那些已知濃度的標準品比較峰區(qū)域，定量了四種燕麥根皂苷。將TLC分析的提取物干燥、重懸于lmL水中，并施用于S印PakC18反相柱(Waters,Milford，MA)，該柱已經預設條件為10mL甲醇后接10mL蒸餾水。在用75%甲醇洗脫后，將樣本干燥、重懸于i5yL100^甲醇中，施用于TLC板，并使用氯仿甲醇水(13:6:i;v:v:v)分離。燕麥根皂苷A-1和B-1以及其它熒光組分在302nm處UV激發(fā)下顯像。然后用對甲氧基苯甲醛/硫酸/乙酸(1:i:48，v:v:v)噴灑tlc板并在13(rc下烘烤5分鐘以檢測所有四種皂苷。來源于M3或F3幼苗的根提取物在至少7種情況下進行比較，結果基本上相同。Sad突變體的某閔分析雜交測試在Sad突變體和野生型A之間進行。測定黑燕麥的皂苷缺乏表型是否由于單一突變。對來自突變體間雜交的F2代的分析鑒定了在最初IO個突變品系中的至少4個互補基團。將這些位點命名為Sadl至Sad4(P即adopoulouK.等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:12923-1928)。對最初10個突變體品系的進一步分析測定了另外4個位點，將其命名為Sad5至Sad8(QiX.等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:8233-8238)。在Sad5、Sad6、Sad7和Sad8突變體中進行對在燕麥根皂苷生物合成(AsSCPLl、AsMTl和AsGT2)中包含的3個新基因的DNA序列分析。在AsSCPLl中從C至T的單個核苷酸變化分別在突變體#587(Sad7)和突變體恥16(最初命名為Sad5)中的第137個氨基酸上引起從絲氨酸至苯基丙氨酸的變化，在#376(Sad7)中的第79個氨基酸上引起從脯氨酸至亮氨酸的變化(表1)。在AsSCPLl中已經發(fā)生點突變的新突變體#19.1也通過篩選另外82個Sad突變體的基因組DNA進行分離，所述突變體通過擴展基于減少的根部熒光的篩選(如上所述)進行鑒定，并使用SurveyorMutationDetectionKit(Transgenomic)進行進一步分析。通過PCR擴增靶cDNA。將來自兩個突變品系的擴增產物混合。根據(jù)制造商的說明書(TransgenomicCatNo.706025)進行異源雙鏈核酸分子形成及亞序列程序用于突變體檢測。突變體#19.1包含一個點突變，預測該點突變引起第463個氨基酸從蘇氨酸至異亮氨酸的變化。在Sad5、Sad6、Sad7或Sad8突變體的AsMTl和AsGT2基因中不存在核苷酸變化。用突變體#19.1、恥16和#376進行的等位性測試表明所有三個突變體對應于一個單一位點，Sad7。這些數(shù)據(jù)證明突變體恥16(它最初稱為Sad5)對應于位點Sad7。這些結果清楚的表明Sad7對應于絲氨酸羧肽酶樣蛋白AsSCPLl。AsSCPLl對于將?；?在熒光燕麥根皂苷A-l和B-l情況下為N-甲基鄰氨基苯甲酸，在非熒光燕麥根皂苷A-2和B-2情況下為苯甲酸)加入到燕麥根皂苷的三萜骨架來說是必需的。實施例3分離并表征Sad9燕壽突變體最初的突變體#616、#825、#376和#1243(P即adopoulou等人1999.PNAS9612923-1928)在AsMTl和AsGT2基因中不包含任何核苷酸變化。將序列分析擴展到82個新Sad突變體，所述突變體如實施例2所述進行分離。將三個突變體M3品系(#195、#961和#1310)鑒定為在AsMTl基因中具有點突變(表2)。在集合中的任何突變體在AsGT2基因中未鑒定出突變。DNA序列分析證實在三個突變體(#195、#961和#1310)中的編碼序列中發(fā)生一個單核苷酸變化。預測這些核苷酸變化中的每一個都將引起一個氨基酸變化(表2)。這三個突變體的根缺乏與燕麥根皂苷A-1相關的亮藍熒光，在UV激發(fā)下呈暗紫熒光。將些突變體稱為"紫色突變體"。將一個紫色更強的突變體S841使用基于TLC的方法(表2)從82個新Sad突變體中鑒定出來。如下文所述進行紫色突變體的代謝物分析。截取來自每個品系的十個根尖(長度為0.5cm)，并將它們浸泡在500ul75%MeOH中，浸泡時間介于一小時至過夜之間。在離心后將上清液轉移至新管中，干燥并將提取物重懸于20ul100^MeOH中。將十ul樣本加到一個TLC板上，并且所述TLC在ChCl3:MeOH:dH20(13:6:lvol/vol/vol)中顯影。TLC板在UV激發(fā)下進行檢查。包括#841的所有紫色突變體在TLC板上具有清楚的紫色斑點。#841的序列分析證實在此突變體的編碼區(qū)發(fā)生從C至T的單核苷酸變化。預測此變化引起在氨基酸333處的丙氨酸變成纈氨酸(參見表1)。將紫色突變體彼此雜交(#195X#1310，#961X#1310，#195X#961)用于等位性測試。通過序列分析在F1雜交體中的兩個突變體等位基因，確認了異質接合體。所有F1植物保留了"紫色根"表型。這些結果指示三個紫色突變體是在相同基因tic位點處的突變等位基因，現(xiàn)在定義為Sad9?；驍?shù)據(jù)、RNA表達數(shù)據(jù)(圖3)和代謝物分析指示Sad9對應于AsMTl，即在燕麥中的燕麥根皂苷生物合成中需要的甲基轉移酶。此甲基轉移酶的功能可能是甲基化在熒光燕麥根皂苷A-l和B-l上的鄰氨基苯甲酸基。實施例4表ffiSad細奮鐘白勺繊雜繊在燕麥根皂苷基因簇中，在跨越Sad基因簇的BAC重疊群中的5個五基因中的4個已經顯示直接涉及燕麥根皂苷生物合成途徑(Osbourn等人，2007年3月6日，US，7，186，884B2;Osbourn等人，US2006-0112448A1和實施例2和3)。然而，甚至鑒定了其它四個基因的多個突變等位基因，AsGT2的突變體仍不在我們擴展的92個減少根部熒光突變體的集合中。假如AsGT2是添加一個/多個糖到燕麥根皂苷三糖部分上所必需的，AsGT2的功能損失不引起減少的根部熒光表型，因為加入熒光基團(N-甲基鄰氨基苯甲酸)不可能受到影響。其它可能性是具有功能性冗余或AsGT2突變是致死的。作為另外一種選擇，AsGT2可催化酰基葡萄糖中間體的形成，該中間體用于AsSCPLl介導的酰基化。因此證明了AsGT2的生物化學功能。為了測試AsGT2的功能，將AsGT2cDNA克隆到NovagenpET-19b表達載體中并在大腸桿菌中表達如下將包含所述表達構建體的大腸桿菌細胞接種到LB瓊脂上，該LB瓊脂補充了34iig/mL氯霉素，50yg/mL羧芐西林，2.5mM甜菜堿和0.6M山梨醇。表達細胞在37攝氏度生長過夜。為了表達蛋白，使用固體培養(yǎng)基上的細胞接種到十個具有50mL補充了上述成分的液體培養(yǎng)基的250mL燒瓶中。培養(yǎng)物在37攝氏度振蕩培養(yǎng)0D6。。的大約0.6。然后在加入終濃度為0.lmM的IPTG誘導劑前將培養(yǎng)物轉移到16攝氏度振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)30分鐘。然后在16攝氏度振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)物過夜。通過在4攝氏度、在7，000Xg離心10分鐘收獲誘導細胞。將細胞沉淀物重懸于5至10mL具有Roche無EDTA蛋白酶抑制劑(每50mL1片)的溶解-結合緩沖液中(300mMNaCl，50mM磷鈉，20mM咪唑，5%甘油，pH7.8)。使用Frenchpress溶解細胞兩次，始終在冰冷條件下進行。將溶解產物在4攝氏度、在10，OOOg離心45分鐘。在注射用于流速為0.5mL/分鐘的FPLC前用0.2ym注射器-過濾器過濾上清液。使用預先±真充的lmLHiTrap螯合HP柱(Amersham)和FPLC體系進行FPLC。純化柱按照制造商的推薦使用O.1MNi(^充滿。在樣本注射前使用溶解-結合緩沖液預平衡柱。在注射后，所述柱在用Elution緩沖液B(300mMNaCl，50mM磷酸鈉緩沖液，700mM咪唑，5%甘油，pH8.0)的梯度程序之前用溶解_結合緩沖液洗滌30分鐘至1小時。表3:從HiTrao熬合HP樣中洗脫,蛋白的條件<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>冰上收集lmL的洗脫片段，20mL用于在10%PAGE體系上顯影結果。受關注的片段在4攝氏度合并并透析過夜，使用50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5，具有50%甘油和2mMMgCl2。等分試樣在液氮中迅速冷凍并在-80攝氏度下儲存。利用復合物受體底物的放射性檢測分析法被用于檢測具有純底物或濃縮底物的低水平活性。該檢測分析法包含4mL"C-UDP-葡萄糖，25mL50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.6，在DMSO中的O.25mL100mM受體底物，5mL透析過的蛋白制備物，和3mL10mMDTT。反應在28攝氏度，輕柔振蕩條件下進行2.5小時，然后加入50mL氯仿甲醇(2:1)終止反應。用氯仿甲醇再抽提含水相三次，并合并溶劑相。在60攝氏度下干燥提取物并將其重懸在40mL氯仿甲醇中。也干燥含水相并重懸于水中。將15mL提取物載入硅膠TLC板中，用氯仿甲醇水(13:6:i)對標準品進行層析。受試的受體底物是13-香樹素-阿拉伯糖苷、苯甲酸和水楊酸。受試的糖供體是D-葡萄糖和L-阿拉伯糖。為了確認通過放射性檢測分析法顯影的產物的化學結構，開發(fā)了一種非放射性的LC-MS檢測分析法。此檢測分析法包括10mL20mMUDP-葡萄糖或UDP-阿拉伯糖，60mL50mM磷酸鉀，pH7.6，2mL1M1%(312，在DMSO中的4mL100mM受體底物(或8mL合成底物，DMSO僅作對照物)，20mL蛋白制品，10mLlOOmMDTT。反應在28度輕柔振蕩培養(yǎng)3.5小時。通過加入100%甲醇終止反應，然后在50攝氏度從反應中蒸發(fā)甲醇，并通過LC/MS/MS使用反相層析樣本(10y1)進行分析，使用100X2mm3iiLunaC18(2)柱(Phenomenex)，在250iiL.min—、3(TC，以如下甲醇+0.1%甲酸對水+0.1%甲酸梯度運行表4:用于反相色譜法的甲醇梯度。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>通過UV(214nm，帶寬9nm，光譜范圍200至600nm)和電噴霧MS進行檢查，在分開的運行周期中以正離子或負離子模式。噴霧室條件為50單位鞘氣，無aux/掃描，5.2kV的正離子噴霧電壓，5.0kV的負離子模式電壓，毛細管溫度325t:。數(shù)據(jù)依賴性的MS2的第二掃描事件通過在5.Oamu的分離寬度處的俘獲和35%碰撞能量處的破碎來進行。結果如圖4所示。A"+"表示活性。表5:AsGT2對苯甲酸和水楊酸鹽底物的活件。苯曱酸水楊酸鹽L-AraD-GluL-AraD-GluAsG丁2++++++++++由于與層析和檢測相關的技術問題，AsGT2對P-香樹素-阿拉伯糖苷的活性的檢測分析是非決定性的。然而，苯甲酸和水楊酸的結果清楚的表明AsGT2對底物具有葡糖基轉移酶功能，所述底物具有環(huán)結構，類似于P-香樹素。結合所述事實，類似于途徑中的其它酶，AsGT2僅在根部表達并且所述基因位于燕麥根皂苷生物合成基因簇中，這些結果表明此基因編碼燕麥根皂苷合成所需的葡糖基轉移酶。實施例5在其它物種中表汰AsSCPLl的重組DNA構建體下文是重組DNA構建體的實施例，可使用它們在單子葉植物或雙子葉植物物種中表達AsSCPLl，使用玉米或大豆作為實施例。使用組成型啟動子，本領域的技術人員將會知道，取決于靶病原體或其它考慮因素，靶向啟動子如那些在本文中更早描述的實施例中的啟動子，由于所述植物材料的特殊終用途，可以是相同的或甚至更有效的或優(yōu)選的。取決于物種和物種中存在的酶活性，可包括來自生物合成途徑中的其它基因以提高表達水平。在下文實施例中使用以下用于包含不同組分的核酸片段的縮寫"RB"和"LB"對應于T-DNA的右邊界和左邊界。"CAMV35SENH"是花椰菜花葉病毒35S啟動子的啟動子區(qū)域，它提高與其連接的啟動子的表達水平(BenfeyP.N.等人，1990，EMBOJ.9:1685-1696)。"UBIPRO"是玉米泛素基因的啟動子，已對其進行過描述(Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18:675-689)。"UBI5'UTR"是相同玉米泛素基因的5'前導區(qū)域。"UBIINTR0N1"是相同泛素基因的內含子。包含此內含子已經證明可提高表達水平。"ATTR1"是在Gateway克隆體系手冊中描述的重組位點(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)。"CCDB"是在Gateway克隆體系手冊中描述的細菌陰性選擇性標記。"ATTR2"是在Gateway克隆體系手冊中描述的重組位點。"PINII"是來自馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因的轉錄終止基因。"CAMV35SPR0"是花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子，它是植物中常用的組成型啟動子(OdellJ.T.等人，1985，Nature313:810-812)。"ADH1INTR0N1"是玉米ADH1基因的內含子。包含此內含子已經證明能提高表達水平(LuehrsenK.R.和WalbotV.，1991，Mol.Gen.Genet.225:81-93)。"BAR"是常用作玉米轉化選擇性標記的抗除草劑性基因。"SCP1"是用于植物的合成組成型啟動子，它描述于美國專利公開6，072，050中。"OMEGA5'UTR"是煙草花葉病毒基因的5'前導區(qū)域，已經證明它的使用能夠提高翻譯水平(Gallie等人，1989，MolecularBiologyofRNA，編輯Cech(Liss，NewYork)，第237-256頁)。"SPCl"是提供壯觀霉素抗性的多肽的編碼區(qū)域，它允許細菌選擇Svab，Z.和Maliga，P.，1991，Mol.Gen.Genet.228:316-319。"ColEl0RI"是大腸桿菌中的功能性DNA復制起點。約糾表汰棘物A成細白術封本從實施例1中所述的克隆中分別獲取包含AsSCPLl的開放閱讀框的片段。用導致開放閱讀框側面接有獨特限制性位點的引物進行PCR擴增，所述限制性位點使得它們能定向克隆到這些經修飾的GatewayTMEntryVector(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)的獨特限制性位點中。在將所述片段連接到GatewayEntryVector后，"入門載體"由ATTLl-AsSCPLl-ATTL2組成，并包含用于細菌選擇的卡那霉素抗性。ATTLl和ATTL2是在InvitrogenGateway克隆體系(Carlsbad,California,USA)中提供的重組位點。玉米重組DNA構建體1:E35S-UBI-AsSCPLl-PINII此構建體能用于在玉米中單獨表達AsSCPLl基因。將AsSCPLl入門載體用于GatewayLR與Gateway經修飾的土壤桿菌載體主鏈(從pSBl修飾得到)的反應(Komari，T.等人，1996，PlantJ.10:165-174)，這通過在cos位點加入以下組分RB-CAMV35SENH-UBIPR0-UBI5'UTR-UBIINTR0N1-ATTR1-CCDB-ATTR2-PINII+CAMV35SENH-CAMV35SPR0-ADH1INTRONl-BAR-PINII-LB-SPC-ColEl0RI。在此Gateway反應中，ATTLl和ATTL2與ATTR1和ATTR2重組，因此將AsSCPLl基因轉移到目的載體中替代CCDB，CCDB對大腸桿菌來說是有毒性的，并使得能夠如Gateway手冊(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)中所述篩選成功的克隆。此所得構建體包含一個T-DNA，它將被轉移到植物基因組中并包含RB-CAMV35SENH-UBIPRO-UBI5'UTR-UBIINTRONl-ATTBl-AsSCPLl-ATTB2-PINII+CAMV35SENH-CAMV35SPR0-ADH1INTR0N1-BAR-PINII-LB。在RB和LB之間的區(qū)域外核苷酸序列描述于Kormai，T.等人，opcit.，除了SPC和ColEl組分之外。將此構建體電穿孔進入LBA4404根癌土壤桿菌細胞中并用于轉化實驗如那些在下文實施例8中所述的實驗。在大豆中表達皂苷生物合成基因的構建體如上所述通過PCR擴增獲取AsSCPLl開放閱讀框用于玉米構建體。大豆重組DNA構建體1:SCPl-O'-AsSCPLl-PINII此構建體能用于在雙子葉中單獨表達AsSCPLl基因。在將一個包含AsSCPLl開放閱讀框的多核苷酸連接到包含SCPlPRO-"5'UTR-獨特限制性位點，相同于那些側接的AsSCPLl-PINII位點的載體中之后，線性化質粒用于轟擊并從凝膠中提取所需DNA35條帶。此過程也移除編碼用于細菌選擇的氨芐青霉素抗性的核苷酸。此片段包含SCP1PRO-"5'UTR-AsSCPLl-PINII并用于如下文實施例9所述的大豆轉化。實施例6在其它物種中表汰AsMTl的重組DNA構建體下文是重組DNA構建體的實施例，可使用它們在單子葉植物或雙子葉植物物種中表達AsMTl，使用玉米或大豆作為實施例。使用組成型啟動子，本領域的技術人員將會知道，取決于靶病原體或其它考慮因素，靶向啟動子如那些在本文中更早描述的實施例中的啟動子，由于所述植物材料的特殊終用途，可以是相同的或甚至更有效的或優(yōu)選的。取決于物種和物種中存在的酶活性，可包括來自生物合成途徑中的其它基因以提高表達水平。在下文實施例中使用以下用于包含不同組分的核酸片段的縮寫"RB"和"LB"對應于T-DNA的右邊界和左邊界。"CAMV35SENH"是花椰菜花葉病毒35S啟動子的啟動子區(qū)域，它提高與其連接的啟動子的表達水平(BenfeyP.N.，等人，1990，EMBOJ.9:1685-1696)。"UBIPRO"是玉米泛素基因的啟動子，已對其進行過描述(Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18:675-689)。"UBI5'UTR"是相同玉米泛素基因的5'前導區(qū)域。"UBIINTR0N1"是相同泛素基因的內含子。包含此內含子已經證明可提高表達水平。"ATTRl"是在Gateway克隆體系手冊中描述的重組位點(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)。"CCDB"是在Gateway克隆體系手冊中描述的細菌陰性選擇性標記。"ATTR2"是在Gateway克隆體系手冊中描述的重組位點。"PINII"是來自馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因的轉錄終止基因。"CAMV35SPR0"是花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子，它是植物中常用的組成型啟動子(OdellJ.T.等人，1985，Nature313:810-812)。"ADH1INTR0N1"是玉米ADH1基因的內含子。包含此內含子已經證明能提高表達水平(LuehrsenK.R.和WalbotV.，1991，Mol.Gen.Genet.225:81-93)。"BAR"是常用作玉米轉化選擇性標記的抗除草劑性基因。"SCP1"是用于植物的合成組成型啟動子，它描述于美國專利公開6，072，050中。"OMEGA5'UTR"是煙草花葉病毒基因的5'前導區(qū)域，已經證明它的使用能夠提高翻譯水平(Gallie等人，1989，MolecularBiologyofRNA，編輯Cech(Liss，NewYork)，第237-256頁)。"SPCl"是提供壯觀霉素抗性的多肽的編碼區(qū)域，它允許細菌選擇Svab，Z.和Maliga，P.，1991，Mol.Gen.Genet.228:316-319。"ColElORI"是大腸桿菌中的功能性DNA復制起點。在玉米中表達皂苷生物合成基因的構建體從實施例1中所述的克隆中分別獲取包含AsMTl的開放閱讀框的片段。用導致開放閱讀框側面接有獨特限制性位點的引物進行PCR擴增，所述限制性位點使得它們能定向克隆到這些經修飾的GatewayTMEntryVector(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)的獨特限制性位點中。在將所述片段連接到GatewayEntryVector后，"入門載體"由ATTLl-AsMTl-ATTL2組成，并包含用于細菌選擇的卡那霉素抗性。ATTL1和ATTL2是在InvitrogenGateway克隆體系(Carlsbad,California,USA)中提供的重組位點。玉米重組DNA構建體1:E35S-UBI-AsMTl-PINII此構建體能用于在玉米中單獨表達AsMTl基因。將AsMTl入門載體用于GatewayLR與Gateway經修飾的土壤桿菌載體主鏈(從pSBl修飾得到)的反應(Komari，T.等人，1996，PlantJ.10:165-174)，這通過在cos位點加入以下組分RB_CAMV35SENH-UBIPR0-UBI5'UTR-UBIINTR0N1-ATTR1-CCDB-ATTR2-PINII+CAMV35SENH-CAMV35SPR0-ADH1INTR0N1-BAR-PINII-LB-SPC-ColEl0RI。在此Gateway反應中，ATTL1和ATTL2與ATTR1和ATTR2重組，因此將AsMTl基因轉移到目的載體中替代CCDB，CCDB對大腸桿菌來說是有毒性的，并使得能夠如Gateway手冊(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)中所述篩選成功的克隆。此所得構建體包含一個T-DNA，它將被轉移到植物基因組中并包含RB-CAMV35SENH-UBIPRO-UBI5'UTR-UBIINTR0Nl-ATTBl-AsMTl-ATTB2-PINII+CAMV35SENH-CAMV35SPR0-ADH1INTR0N1-BAR-PINII-LB。在RB和LB之間的區(qū)域外核苷酸序列描述于Kormai，T.等人，opcit.，除了SPC和ColEl組分之外。將此構建體電穿孔進入LBA4404根癌土壤桿菌細胞中并用于轉化實驗如那些在下文實施例8中所述的實驗。社豆喊汰棘物A成細白術封本如上所述通過PCR擴增獲取AsMTl開放閱讀框用于玉米構建體。大豆重組DNA構建體1:SCPl-O'-AsMTl-PINII此構建體能用于在雙子葉植物中單獨表達AsMTl基因。在將一個包含AsMTl開放閱讀框的多核苷酸連接到包含SCPlPRO-"5'UTR-獨特限制性位點，相同于那些側接的AsMTl-PINII位點的載體中之后，線性化質粒用于轟擊并從凝膠中提取所需DNA條帶。此過程也移除編碼用于細菌選擇的氨芐青霉素抗性的核苷酸。此片段包含SCPlPRO-"5'UTR-AsMTl-PINII并用于如下文實施例9所述的大豆轉化。實施例7在其它物種中表達AsGS2的重組DNA構建體下文是重組DNA構建體的實施例，可使用它們在單子葉植物或雙子葉植物物種中表達AsGS2，使用玉米或大豆作為實施例。使用組成型啟動子，本領域的技術人員將會知道，取決于靶病原體或其它考慮因素，靶向啟動子如那些在本文中更早描述的實施例中的啟動子，由于所述植物材料的特殊終用途，可以是相同的或甚至更有效的或優(yōu)選的。取決于物種和物種中存在的酶活性，可包括來自生物合成途徑中的其它基因以提高表達水平。在下文實施例中使用以下用于包含不同組分的核酸片段的縮寫"RB"和"LB"對應于T-DNA的右邊界和左邊界。"CAMV35SENH"是花椰菜花葉病毒35S啟動子的啟動子區(qū)域，它提高與其連接的啟動子的表達水平(BenfeyP.N.，等人，1990，EMBOJ.9:1685-1696)。"UBIPRO"是玉米泛素基因的啟動子，已對其進行過描述(Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18:675-689)。"UBI5'UTR"是相同玉米泛素基因的5'前導區(qū)域。"UBIINTR0N1"是相同泛素基因的內含子。包含此內含子已經證明可提高表達水37平。"ATTRl"是在Gateway克隆體系手冊中描述的重組位點(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)。"CCDB"是在Gateway克隆體系手冊中描述的細菌陰性選擇性標記。"ATTR2"是在Gateway克隆體系手冊中描述的重組位點。"PINII"是來自馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因的轉錄終止基因。"CAMV35SPR0"是花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子，它是植物中常用的組成型啟動子(OdellJ.T.等人，1985，Nature313:810-812)。"ADH1INTR0N1"是玉米ADH1基因的內含子。包含此內含子已經證明能提高表達水平(LuehrsenK.R.和WalbotV.，1991，Mol.Gen.Genet.225:81-93)。"BAR"是常用作玉米轉化選擇性標記的抗除草劑性基因。"SCPl"是用于植物的合成組成型啟動子，它描述于美國專利公開6，072，050中。"OMEGA5'UTR"是煙草花葉病毒基因的5'前導區(qū)域，已經證明它的使用能夠提高翻譯水平(Gallie等人，1989，MolecularBiologyofRNA，編輯Cech(Liss，NewYork)，第237-256頁)。"SPCl"是提供壯觀霉素抗性的多肽的編碼區(qū)域，它允許細菌選擇Svab，Z.和Maliga，P.，1991，Mol.Gen.Genet.228:316-319。"ColEl0RI"是大腸桿菌中的功能性DNA復制起點。約糾表汰棘物A成細白術封本從實施例1中所述的克隆中分別獲取包含AsGS2的開放閱讀框的片段。用導致開放閱讀框側面接有獨特限制性位點的引物進行PCR擴增，所述限制性位點使得它們能定向克隆到這些經修飾的GatewayEntryVector(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)的獨特限制性位點中。在將所述片段連接到GatewayEntryVector后，"入門載體"由ATTLl-AsGS2-ATTL2組成，并包含用于細菌選擇的卡那霉素抗性。ATTL1和ATTL2是在InvitrogenGateway克隆體系(Carlsbad,California,USA)中提供的重組位點。玉米暈組DNA構建體1:E35S-UBI-AsGS2-PINII此構建體能用于在玉米中單獨表達AsGS2基因。將AsGS2入門載體用于GatewayLR與Gateway經修飾的土壤桿菌載體主鏈(從pSBl修飾得到)的反應(Komari，T.等人，1996，PlantJ.10:165-174)，這通過在cos位點加入以下組分RB_CAMV35SENH-UBIPR0-UBI5'UTR-UBIINTR0N1-ATTR1-CCDB-ATTR2-PINII+CAMV35SENH-CAMV35SPR0-ADH1INTRONl-BAR-PINII-LB-SPC-ColEl0RI。在此Gateway反應中，ATTL1和ATTL2與ATTR1和ATTR2重組，因此將AsGS2基因轉移到目的載體中替代CCDB，CCDB對大腸桿菌來說是有毒性的，并使得能夠如Gateway手冊(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)中所述篩選成功的克隆。此所得構建體包含一個T-DNA，它將被轉移到植物基因組中并包含RB-CAMV35SENH-UBIPR0-UBI5'UTR-UBIINTR0Nl-ATTBl-AsGS2-ATTB2-PINII+CAMV35SENH-CAMV35SPR0-ADH1INTR0N1-BAR-PINII-LB。在RB和LB之間的區(qū)域外核苷酸序列描述于Kormai，T.等人，opcit.，除了SPC和ColEl組分之外。將此構建體電穿孔進入LBA4404根癌土壤桿菌細胞中并用于轉化實驗如那些在下文實施例8中所述的實驗。在大豆中表達皂苷生物合成基因的構建體如上所述通過PCR擴增獲取AsGS2開放閱讀框用于玉米構建體。大豆重組DNA構建體1:SCPl-O'-AsGS2_PINII此構建體能用于在雙子葉植物中單獨表達AsGS2基因。在將一個包含AsGS2開放閱讀框的多核苷酸連接到包含SCPlPRO-"5'UTR-獨特限制性位點，相同于那些側接的AsGS2-PINII位點的載體中之后，線性化質粒用于轟擊并從凝膠中提取所需DNA條帶。此過程也移除編碼用于細菌選擇的氨芐青霉素抗性的核苷酸。此片段包含SCPlPRO-"5'UTR-AsGS2-PINII并用于如下文實施例9所述的大豆轉化。實施例8十蕭齡別勺干細靴和轉某因棺物的再牛在實施例5至7中制備的重組DNA構建體可用于制備如下的轉基因玉米植物。可使用Zhao(美國專利公開5，981，840，以及PCT專利公布W098/32326)的方法，用如實施例5-7中所述的任何多核苷酸構建體轉化玉米。簡而言之，從玉米中分離未成熟胚芽并使胚芽接觸土壤桿菌懸浮液，其中所述細菌能夠將多核苷酸構建體轉移到至少一個未成熟胚芽的至少一個細胞中(步驟l:感染步驟)。在此步驟中將未成熟胚芽浸入土壤桿菌懸浮液中用于啟動接種。胚芽與土壤桿菌共培養(yǎng)一段時間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。在感染步驟后，未成熟胚芽在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。緊接著此共培養(yǎng)時期，進行任選的"休眠"步驟。在此休眠步驟中，胚芽培養(yǎng)在存在至少一種已知抗生素以抑制土壤桿菌生長，同時不加入植物轉化體選擇劑的環(huán)境中進行(步驟3:休眠步驟)。將未成熟胚芽培養(yǎng)在具有抗生素但無選擇劑的固體培養(yǎng)基上，用于消除土壤桿菌以及受感染細胞的休眠階段。接下來，將接種胚芽在包含選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并回收生長的經轉化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。愈傷組織然后在植物中再生(步驟5:再生步驟)，并且在選擇培養(yǎng)基中生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以再生所述植物。實施例9:用大豆表汰載體轉化大豆體細胞胚培養(yǎng)物并再生大豆植物在實施例5至7中制備的重組DNA構建體可用于制備如下的轉基因大豆植物。培養(yǎng)條件:將大豆胚芽發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(cv.Jack)培養(yǎng)于35mL液體SB196培養(yǎng)基(參見下文)，培養(yǎng)條件為150rpm搖床培養(yǎng)、26t:和按16:8小時晝/夜光周期以60-85yE/m2/s光強用白色冷光熒光燈照射。每7天至兩周通過接種大約35mg組織到35mL新鮮液體SB196中對培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)(優(yōu)選的傳代培養(yǎng)間隔為每隔7天)。大豆胚芽發(fā)生懸浮培養(yǎng)物用大豆表達質粒轉化，所有轉化均使用DuPontBiolisticPDS1000/HE儀(氦氣改型)，通過粒子槍轟擊(Klein等人，Nature327:70(1987))方法進行。大豆胚胎牛成懸ff培養(yǎng)物的i秀導:大豆培養(yǎng)物每月啟動兩次，在每次啟動之間間隔5至7天。在種植后45至55天內采集可用大豆植物的帶未成熟種籽的豆莢。從豆莢中移除種籽并置于無菌magenta盒中。大豆種籽通過在5%次氯酸鈉溶液與1滴象牙皂(即，95mL高壓釜蒸餾水加5mL次氯酸鈉和1滴皂，充分混合)中搖動15分鐘進行無菌處理。種籽使用2個1升瓶的無菌蒸餾水漂洗，將那些小于4mm的種籽置于單個顯微鏡載片上。切下種籽的小末端，并將子葉擠出種籽殼。將子葉轉移到包含SB1培養(yǎng)基(每板25至30個子葉)的板中。用纖維帶將平板打包并在溫度26t:，冷白熒光燈光周期16:8小時晝/夜，光照強度60至80iiE/m2/s下培養(yǎng)八周，4周后更換培養(yǎng)基。在SB1培養(yǎng)基上接種后，切下第二個胚芽并將其放入SB196液體培養(yǎng)基7天。用于轟擊的DNA的準備:完整質?；虬荜P注基因和選擇性標記基因的DNA質粒片段被用于轟擊。通過凝膠分離消化過的質粒獲取來自大豆表達質粒的片段，本文描述了所述質粒的構建。在各種情況下，100iig質粒DNA被用于下文所述的0.5mL特定酶混合物。質粒用Ascl(100單位)在NEBuffer4(20mMTris乙酸，10mM乙酸鎂，50mM乙酸鉀，lmM二硫蘇糖醇，pH7.9)，100iig/mLBSA，和5mMP-巰基乙醇中，在37。C下消化1.5小時。所得DNA片段通過凝膠電泳在1%的SeaPlaqueGTG瓊月旨糖上(BioWhitakerMolecularApplications)分離，并從瓊脂糖凝膠上切下包含基因盒的DNA片段。使用GELase消化酶，按照制造商的規(guī)程從瓊脂糖中純化DNA。將包含3mg金粉(3mg金)的無菌蒸餾水的50yL等分試樣加入30yL10ng/yLDNA溶液(如本文所述制備的DNA片段)，25iiL5MCaCl2，和20yL0.1M亞精胺中。將混合物在渦旋振蕩器3檔搖動3分鐘并在臺式離心機中旋轉10秒。移除上清液，然后用400iiL100%乙醇洗滌并進行另一次簡單離心。移除400iiL乙醇，并將離心沉淀重懸于40iiL的100%乙醇中。將五iiLDNA懸浮液分配到BiolisticPDS1000/HE儀盤的每個浮動盤中。每5iiL等分試樣每次轟擊(例如每盤)包含大約0.375mg金。組織制備和用DNA轟擊:將大約150至200mg的七天齡胚芽發(fā)生懸浮培養(yǎng)物置于一個空的無菌60X15mm培養(yǎng)皿中，并用塑料網覆蓋該培養(yǎng)皿。將室排空至真空度為27至28英寸汞柱，每個平板的組織轟擊一或兩發(fā)，將膜破裂壓力設為1100PSI。將組織放置在距離保留/停止篩網大約3.5英寸處。轉化胚的選擇:使用氯磺隆選擇轉化過的胚芽(當使用乙酰乳酸合酶(ALS)基因作為選擇性標記時)。在轟擊后，將組織置于新制SB196培養(yǎng)基中并如上所述進行培養(yǎng)。轟擊后六至八天，將SB196更換為包含100ng/mL氯磺隆的新鮮SB196培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基每周更新。選擇后四至六周，觀察到從未轉化的壞死胚芽發(fā)生簇中生長出綠色轉化組織。將綠色組織分離，接種至多孔板，以產生新的、克隆繁殖的轉化的胚胎生成懸浮培養(yǎng)物。胚胎的成熟:將來自生產轉化的轉化過的胚芽發(fā)生簇在多孔板中如上所述培養(yǎng)四至六周，培養(yǎng)在26t:下，在SB196中，在冷白熒光(Phillips冷白EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)燈泡(40瓦特)下以16:8小時的光周期以及90至120yE/m2s的光照強度進行。一段時間后，將胚芽簇移到固體瓊脂培養(yǎng)基、SB166中培養(yǎng)一至兩周，然后傳代培養(yǎng)到SB103培養(yǎng)基中3至4周，得到成熟胚芽。在板上、SB103中成熟后，將單個胚芽從簇中移除、干燥并篩選所需表型。此類表型可以是但不限于改變的皂苷水平或改變的對至少一種真菌的抗性水平。當需要的時，從下文所述的一些事件中獲取植物。,千燥織，:成熟的單個胚芽通過置于空的小培養(yǎng)皿(60X15mm)中大約四至七天進行脫水。平皿用纖維帶(創(chuàng)造出一個低濕度室)密封。將脫水胚芽植入SB71-4培養(yǎng)基，使其在與上述培養(yǎng)條件相同的條件下發(fā)芽生長。從發(fā)芽培養(yǎng)基中取出發(fā)芽的苗并用水徹底沖洗，然后將其植入24孔托盤中的Redi-Earth中，用透明塑料罩覆蓋。一至二周后移除塑料罩，再硬化植株一周。如果幼苗看上去堅硬，則將它們移植到Redi-Earth的10英寸盆中，每盆最多3株幼苗。在十至十六周后，收獲成熟種子，磨碎并用于所需表型分析。i咅絲配方SB196-FNLite液體增殖培養(yǎng)某(毎升)MSFeEDTA-100x儲備液110mLMS硫酸鹽-lOOx儲備液210mLFNLite卣化物-lOOx儲備液310mLFNLiteP，B，Mo-100x儲備液410mLB5維生素(lmL/L)1.OmL2，4-D(終濃度lOmg/L)1.OmL■32.83g(NH4)2S040.463g天冬酰胺l.Og蔗糖(1%)10gpH5.8FNLite儲備液4渚備液編號1MSFeEDTAlOOx儲備液Na2EDTA*FeS04-7H20*首先添加，攪拌溶解于深色瓶中l(wèi)OOOmL500mL3.724g1.862g2.784g1.392g2MS疏酸鹽lOOx儲備液MgS04-7H20MnS04畫H20ZnS04-7H20CuS〇4-5H2〇37.0g1.69g0.86g0.0025g18.5g0.845g0.43g0細25gFNLite卣化物lOOx儲備液CaCl2-2H2030.Og15.OgKI0.083g0.0715gCoCl2-6H200.0025g0駕25g4FNLiteP,B,MolOOx儲備液KH2P04H3B〇3Na2Mo〇4-2H20SB1固體培養(yǎng)某(毎升)1個包裝的MS鹽(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)lmLB5維生素1000X儲備液31.5g葡萄糖2mL2，4-D(20mg/L終濃度)pH5.78gTC瓊脂SB199固體培養(yǎng)某(毎升)1個包裝的MS鹽(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)lmLB5維生素1000X儲備液30g蔗糖4ml2，4-D(終濃度40mg/L)pH7.018.5g0.62g0.025g9.25g0.31g0.0125g2g固化劑SB166固體培養(yǎng)某(毎升)1個包裝的MS鹽(Gibco/服L-Cat.No.11117-066)lmLB5維生素1000X儲備液60g麥芽糖750mgMgCl2六水合物5g活性炭pH5.72g固化劑(gelrite)SB103固體培養(yǎng)某(毎升)1個包裝的MS鹽(Gibco/服L-Cat.No.11117-066)lmLB5維生素1000X儲備液60g麥芽糖750mgMgC12六水合物pH5.72g固化劑(gelrite)SB71-4固體培養(yǎng)某(毎升)1瓶Gamborg'sB5鹽w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat.No.21153-036)pH5.75gTC瓊脂2,4-D儲備液PhytotechCat.No.D295預配液-濃度lmg/mLB5維牛素儲備液(毎l(fā)OOmL)分裝保存于-20。C10g肌醇lOOmg煙酸lOOmg鹽酸吡哆醇lg硫胺素若溶解不夠迅速，可將溶液用熱攪拌器加以微熱。SB228-大豆組織分化和成熟培養(yǎng)甚(SHaM)(每升)DDIH20600mLFN-LiteMacroSalts，用于SHaM10XlOOmLMSMicroSaltslOOOxlmLMSFeEDTA100x10mLCaCl100x6.82mLB5維生素lOOOxlmLL-甲硫氨酸0.149g蔗糖30g山梨醇30g43調整體積至900mLpH5.8高壓滅菌加入到冷卻培養(yǎng)基中(《30°C):*谷氨酰胺(終濃度30mM)4%110mL*注意加入谷氨酰胺后，終體積將變?yōu)?010mL。由于谷氨酰胺降解相當迅速，它優(yōu)選在使用培養(yǎng)基前現(xiàn)加-2周過期；不含谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基可存放更長時間。用干SHAM的FN-liteMacro10X-儲備液#1(毎升)(朋4)2S04(硫酸銨)4.63gK冊3(硝酸鉀)28.3gMgS04*7H20(硫酸鎂七水合物)3.7gKH2P04(磷酸二氫鉀)1.85g加水至終體積高壓滅菌MSMicro1000X-儲備液#2(毎1升)H3B03(硼酸)6.2gMnS04*H20(硫酸錳一水合物)16.9gZnS04*7H20(硫酸鋅七水合物)8.6gNa2Mo04*2H20(鉬酸鈉二水合物)0.25gCuS04*5H20(硫酸銅五水合物)0.025gCoCl2*6H20(氯化鈷六水合物)0.025gKI(碘化鉀)0.8300g加水至終體積高壓滅菌FeEDTA100X-儲備液#3(每升)Na2EDTA*(EDTA鈉)3.73gFeS04*7H20(硫酸鐵七水合物)2.78g*在加入鐵離子前EDTA必須完全溶解。加水至終體積此溶液對光敏感。盛裝的瓶子應以鋁箔包裹以避光。高壓滅菌Ca10(^-儲備液#4(每升)CaCl2*2H20(氯化f丐二水合物)44g加水至終體積高壓滅菌B5維生素1000X-儲備液#5(每升)硫胺素*HC110g煙酸lg吡眵素*HC1lg培養(yǎng)基在谷氨酰胺加44肌肌醇(CH8579)100g加水至終體積冷凍保存4%谷氨酰胺-儲備液恥(毎升)將DDI水加熱到30°C900mLL-谷氨酰胺40g邊攪拌邊逐漸加入并施以微熱。不超過35t:。加水至終體積過濾除菌冷凍保存**注意儲備液在3rc熱解凍，水浴以完全溶解晶體。氯,石黃斷雄夜Img/mL在0.01N氫氧化銨中權利要求分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)編碼絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列當與SEQIDNO2比較時，基于ClustalV比對方法具有至少95％的序列同一性；或(b)編碼甲基轉移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列當與SEQIDNO4比較時，基于ClustalV比對方法具有至少95％的序列同一性；或(c)編碼葡糖基轉移酶的核苷酸序列，所述葡糖基轉移酶的氨基酸序列當與SEQIDNO6比較時，基于ClustalV比對方法具有至少95％的序列同一性；或(d)包含(a)、(b)或(c)的全長互補序列的核苷酸序列。2.權利要求l的多核苷酸，其中所述絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶多肽包含SEQIDNO:2，所述甲基轉移酶多肽包含SEQIDNO:4，所述葡糖基轉移酶多肽包含SEQIDNO:6。3.權利要求1的多核苷酸，其中所述編碼絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶的核苷酸序列包含SEQIDNO:1或7中的一種，所述編碼甲基轉移酶的核苷酸序列包含SEQIDNO:3或8中的一種，所述編碼葡糖基轉移酶的核苷酸序列包含SEQIDNO:5或9中的一種。4.包含權利要求1的多核苷酸的載體。5.重組DNA構建體，所述構建體包含權利要求1的編碼三萜途徑的第一種酶的多核苷酸的至少一部分，所述部分可操作地連接至少一種調控序列。6.權利要求5的重組DNA構建體，所述構建體還包含至少第二多核苷酸的至少一部分，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽。7.用于轉化細胞的方法，所述方法包括用權利要求5或權利要求6的重組DNA構建體轉化細胞。8.包含權利要求5的重組DNA構建體的轉化過的細胞。9.用于生產轉基因植物的方法，所述方法包括用權利要求5或權利要求6的重組DNA構建體轉化植物細胞并從所述轉化過的植物細胞再生轉基因植物。10.轉化過的植物，所述植物包含權利要求5或權利要求6的重組DNA構建體。11.包含權利要求5或權利要求6的重組DNA構建體的種子。12.包含權利要求5的重組DNA構建體的分離宿主細胞。13.權利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自酵母細胞、細菌細胞和植物細胞。14.包含權利要求5或權利要求6的重組DNA構建體的轉基因植物，其中所述調控序列是異源啟動子，所述植物當與具有野生型三萜水平的植物比較時，具有改變的三萜水平。15.權利要求14的植物，其中所述三萜是來源于P-香樹素的皂苷，并且所述水平提高。16.權利要求14的植物，其中所述三萜是來源于P-香樹素的皂苷，并且所述水平降低。17.權利要求14的植物，其中所述植物選自單子葉植物和雙子葉植物。18.權利要求17的植物，其中所述單子葉植物選自小麥、燕麥、稻、和玉米。19.權利要求17的植物，其中所述雙子葉植物是大豆。20.改變植物細胞中多肽表達水平的方法，所述方法包括a)用來自權利要求1的分離多核苷酸的至少一部分的核酸片段轉化植物組織，其中所述多核苷酸能夠改變天然絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達；b)將所述植物組織再生成轉基因植物；以及c)評估當與具有對應的天然絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的野生型表達水平的植物比較時，所述轉基因植物的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的表達水平改變。21.生產對至少一種真菌具有抗性的植物的方法，所述方法包括a.用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；b.在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及c.評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未受所述重組DNA構建體轉化過的植物比較時，對至少一種真菌的抗性提高。22.權利要求21的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽。23.權利要求21的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P_香樹素合酶和CYP51H10的酶。24.生產具有改變水平的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的植物的方法，所述方法包括a)用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；b)在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及c)評估當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的量比較時，步驟(b)的轉基因植物的絲氨酸羧肽酶樣?；D移酶、甲基轉移酶、或葡糖基轉移酶的水平改變。25.權利要求24的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸的至少一部分，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽。26.權利要求24的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼選自P-香樹素合酶和CYP51H10的酶。27.用于生產具有改變的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括1.用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；2.在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及3.評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平改變。28.權利要求27的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸的至少一部分，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽。29.權利要求27的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼選自P-香樹素合酶和CYP51H10的酶。30.用于生產具有提高的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括d)用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；e)在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及f)評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平提高。31.權利要求30的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶的表達的多肽。32.權利要求30的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自P_香樹素合酶和CYP51H10的酶。33.用于生產具有降低的三萜皂苷水平的植物的方法，所述方法包括a)用至少一種權利要求5的編碼三萜途徑的第一種酶的重組DNA構建體轉化植物細胞；b)在促進轉基因植物再生的條件下使來自步驟(a)的轉化過的植物細胞生長；以及c)評估步驟(b)的轉基因植物當與相同物種的未用所述重組DNA構建體轉化過的植物中的三萜皂苷量比較時的三萜皂苷水平降低。34.權利要求33的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少第二多核苷酸的至少一部分，所述第二多核苷酸編碼調控三萜途徑中至少第二種酶表達的多肽。35.權利要求33的方法，其中所述重組DNA構建體還包含至少一種多核苷酸的至少一部分，所述多核苷酸編碼選自P-香樹素合酶和CYP51H10的酶。全文摘要本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼由羧肽酶類蛋白、甲基轉移酶和葡糖基轉移酶組成的酶，所述酶涉及植物和種子中的β-香樹素衍生的三萜的生物合成。本發(fā)明也涉及重組DNA構建體的構建，所述構建體包含全部或部分本發(fā)明的分離多核苷酸，所述多核苷酸以有義或反義方向可操作地連接至少一個調控序列。文檔編號A01H5/00GK101796182SQ200780053491公開日2010年8月4日申請日期2007年6月25日優(yōu)先權日2007年6月25日發(fā)明者A·奧斯伯恩,X·齊申請人:植物生物科學有限公司