專利名稱：：櫛孔扇貝g-型溶菌酶基因多態(tài)性標(biāo)記篩選及其輔助育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中的貝類分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，是一種能在貝類抗病品種培育中應(yīng)用的貝類抗病相關(guān)基因標(biāo)記及其輔助育種方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)的扇貝養(yǎng)殖業(yè)在經(jīng)過(guò)最初階段的蓬勃發(fā)展以后，逐漸暴露出了許多亟待解決的問(wèn)題。長(zhǎng)期的近親繁育、累代養(yǎng)殖導(dǎo)致了近交衰退，使得櫛孔扇貝生長(zhǎng)緩慢、抗逆性降低。再加上病害肆虐、環(huán)境惡化等因素，扇貝養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)常發(fā)生大規(guī)模死亡事件，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，加快育種核心前沿技術(shù)的研究和抗逆優(yōu)良品種的選育己成為保障扇貝養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。但由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)貝類抗病機(jī)理及抗病功能基因的研究較少，缺乏抗病相關(guān)的分子標(biāo)記，導(dǎo)致貝類抗病品種培育的研究進(jìn)展緩慢，很大程度上制約了扇貝養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定、健康和可持續(xù)發(fā)展。貝類機(jī)體免疫防御反應(yīng)分為細(xì)胞免疫和體液免疫。參與體液免疫的因子很多，溶菌酶是其中十分重要的一員。溶菌酶是一類具有殺菌作用和免疫功能的效應(yīng)分子，在機(jī)體的天然免疫中發(fā)揮重要作用(ChengandRodrick,1975)。自1999年報(bào)道了第一種貝類溶菌酶基因序列后，先后從冰島扇貝、貽貝、美洲牡蠣和櫛孔扇貝等貝類中獲得了溶菌酶基因的全長(zhǎng)序列。研究表明，溶菌酶具有廣譜的抗菌效應(yīng)，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，能改善和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和消化功能(Biggaretal.,1977);并在溶菌過(guò)程中形成一個(gè)水解體系，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體的免疫防御(ChengandRodrick，1975;Chengetal.,1975)。研究還發(fā)現(xiàn)，溶菌酶能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用形成復(fù)合物，使侵入體內(nèi)的病毒失活。此外，溶菌酶可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)體其它免疫因子的合成與分泌，協(xié)同其它免疫因子(抗菌肽等)進(jìn)行免疫防御(Chalketal.，1994;Patrzykatetal.，2001)。對(duì)于缺少特異性免疫的無(wú)脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)，溶菌酶是其免疫體系中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)(Lee,2000;Sotelo-Mundo,2003);而對(duì)于水生無(wú)脊椎動(dòng)物而言，由于其生存環(huán)境中富含各種各樣的潛在病原，溶菌酶的免疫防御功能就顯得尤為重要。目前研究表明，在魚(yú)類、昆蟲(chóng)等多種物種中溶菌酶表達(dá)水平的升高與免疫力的增強(qiáng)密切相關(guān)(CaipangCM,2007;ChengAC,2008)，但其多態(tài)性與貝類抗病力強(qiáng)弱之間的關(guān)系研究仍未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的是篩選出櫛孔扇貝抗病相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記，建立相應(yīng)的櫛孔扇貝分子標(biāo)記輔,助育種方法，為梓孔扇貝抗病品種培育提供基因標(biāo)記和技術(shù)方法。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容為一、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，包括1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克隆；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選；4、攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩査；二、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記輔助育種方法。一、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，包括1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克??；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選；4、攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩查。1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克隆參照分子克隆所述方法從櫛孔扇貝閉殼肌中提取總DNA;根據(jù)已知的G-型溶菌酶基因序列在其啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物，克隆得到一段762堿基的DNA序列，連入T載體后進(jìn)行測(cè)序，獲得其核苷酸序列。2、抗病群體和敏感群體的制備采用人工感染途徑獲得抗病群體和敏感群體；即從不同海區(qū)和養(yǎng)殖場(chǎng)收集扇貝個(gè)體之后，用病原菌浸泡感染，根據(jù)死亡時(shí)間判斷對(duì)病原菌感染抵抗能力，將扇貝分為抗病群體和敏感群體。3、抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選對(duì)5個(gè)個(gè)體的IO個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了10處多態(tài)性位點(diǎn)；PCR擴(kuò)增42個(gè)敏感個(gè)體和40個(gè)抗病個(gè)體的G-型溶菌酶啟動(dòng)區(qū)序列后，針對(duì)-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G轉(zhuǎn)換分別選用TaqI和HapII對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，各發(fā)現(xiàn)兩種基因型，-754II，-754ID，-391M和-391AG;其中-754ID和_754II個(gè)體在抗病群體和敏感群體中出現(xiàn)的頻率無(wú)顯著差異,而-391AA個(gè)體在敏感群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于抗病群體，-391AG個(gè)體在抗病群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體。因此，-391AA被認(rèn)為是疾病敏感相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記，而-391AG被認(rèn)為是抗病相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記。4、攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩査取櫛孔扇貝全血lu1作為模版，PCR擴(kuò)增G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)序列，用H印II對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳分型后，參照?qǐng)D譜3-B選擇-391AG個(gè)體作為抗病個(gè)體。二、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記輔助育種方法以在抗病群體中高頻出現(xiàn)的G-型溶菌酶基因型作為抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記。將攜帶這種抗病基因標(biāo)記的櫛孔扇貝進(jìn)行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)序列，研究其多態(tài)性；同時(shí)進(jìn)行病原微生物感染實(shí)驗(yàn)，研究抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的遺傳規(guī)律及其與櫛孔扇貝抗病力的關(guān)系，從中篩選出既含有抗病G-型溶菌酶基因標(biāo)記，抗病力又顯著提高的貝苗進(jìn)行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。本發(fā)明與已有技術(shù)相比其特點(diǎn)為本發(fā)明采用功能基因組技術(shù)，以櫛孔扇貝為材料首次發(fā)掘了我國(guó)養(yǎng)殖貝類抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，初步建立了櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記輔助育種技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便快捷、選育效率高、周期短等特點(diǎn)，為貝類抗病品種的培育開(kāi)辟了新的分子育種技術(shù)途徑，對(duì)養(yǎng)殖貝類抗病品種的選育具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。圖l:櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列圖2:櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)圖3:櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因不同基因型的酶切圖譜圖4:櫛孔扇貝抗病群體及敏感群體中G-型溶菌酶不同基因型的分布頻率以及相應(yīng)的卡方檢驗(yàn)具體實(shí)施例方式下面以櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選及其輔助育種技術(shù)的建立為例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。一、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，包括1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克??；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選；4、攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩査。1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克隆參照分子克隆所述方法從梓孔扇貝閉殼肌中提取總DNA;根據(jù)已知的G-型溶菌酶基因序列在啟動(dòng)區(qū)設(shè)計(jì)引物CFLyspl(5'-GCTGAGTAGACTGGAACAAGCGGMTGA-3')和CFLysp2(5'-MGACGAGTGAAGGCCGGGGAGTAGGT-3')，克隆得到一段762堿基的DNA序列，連入T載體后進(jìn)行測(cè)序，獲得其核苷酸序列(圖l)。2、抗病群體和敏感群體的制備采用人工感染途徑獲得抗病群體和敏感群體；即從不同海區(qū)和養(yǎng)殖場(chǎng)收集扇貝個(gè)體，用鰻弧菌浸泡感染，根據(jù)死亡時(shí)間判斷扇貝對(duì)鰻弧菌感染的抵抗能力，將扇貝分為抗病群體和敏感群體。3、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選對(duì)5個(gè)個(gè)體的10個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了10處多態(tài)性位點(diǎn)(圖2);PCR擴(kuò)增42個(gè)敏感個(gè)體和40個(gè)抗病個(gè)體的G-型溶菌酶啟動(dòng)區(qū)序列后，針對(duì)-754TATCTCGATCAGG插入/缺失及-391A/G分別選用TaqI和HapII對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。對(duì)于-754插入型等位基因，TaqI酶切后會(huì)產(chǎn)生大小分別為36,37,43，80，147,419bp的6個(gè)片段，而對(duì)于-754缺失型等位基因則會(huì)產(chǎn)生大小分別為43，60,80，147,419bp的5個(gè)片段。用HapII酶切之后，-391A型等位基因產(chǎn)生長(zhǎng)度為16,79，102，565bp的4個(gè)片段，而-391G型等位基因則產(chǎn)生長(zhǎng)度為16,79,102，240,325bp的5個(gè)片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)鄉(xiāng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，在這兩處位點(diǎn)各發(fā)現(xiàn)兩種基因型，-754II，-754ID,-391AA和-391AG(圖3)。抗病群體和敏感群體中不同基因型出現(xiàn)的頻率見(jiàn)圖4。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析后發(fā)現(xiàn)，-754ID和-75411個(gè)體在抗病群體和敏感群體中出現(xiàn)的頻率無(wú)顯著差異，而-391AA個(gè)體在敏感群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于抗病群體，-391AG個(gè)體在抗病群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體(表l)。因此，-391M被認(rèn)為是疾病敏感相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記，而-391AG被認(rèn)為是抗病相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記。表1:梓孔扇貝G-型溶菌酶不同基因型在抗病群體和敏感群體中分布頻率的卡方檢驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4、攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩査:取櫛孔扇貝全血1H1作為模版，以CFLyspl和CFLysp2為引物PCR擴(kuò)增G-型溶菌酶啟動(dòng)區(qū)序列，用HapII對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳分型后，參照?qǐng)D譜3-B選擇-391AG個(gè)體作為抗病個(gè)體。二、櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記輔助育種方法以在抗病群體中高頻出現(xiàn)的G-型溶菌酶基因型-391AG作為抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記。將攜帶這種抗病相關(guān)基因標(biāo)記的櫛孔扇貝進(jìn)行繁殖，培育后代，克隆獲得后代中的G-型溶菌酶基因，研究其多態(tài)性；同時(shí)進(jìn)行病原微生物感染實(shí)驗(yàn)，研究抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的遺傳規(guī)律及其與扇貝抗病力的關(guān)系，從中篩選出既含有抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，抗病力又提高的貝苗，進(jìn)行多代繁殖和培育后即可建立抗病優(yōu)良品種。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所<120〉櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因多態(tài)性標(biāo)記篩選及其輔助育種方法<140>〈141〉2008-04-02<薩1〈170〉Patentlnversion3.2<210>1<211>762<212>腿<213>梓孔扇貝(Chlamysfarreri)〈400>1gctgagtagactggaacsagcggeiatgaagtstctcgatc3gggat8c33sacscagtgc60cttgccgtgactcgaacccggaactcttctgtcacatgcttagcgtcctaccattcgact120agcgcacattgagctagtcattttattgaaaatctgtcttaggtacataattaagttaag180tttatttctggatcaggactattaaaaaacagacctctataccagactccaataaataca240aaataaataataaagttctttgagtaccccttacattaatctgttttgggatgtttgtat300ctctatgtgcttctgcatatggatctgtacgtaactttttgttaggtttttaccactact360tgttttcatttacagctagttacgagttaaatgcatgctagtccgggcaaacaggagtta420ttccccctcgcaatatcaaacctcttttcatttaaattatgaagttaagttattgagatt480tattaacccctgtgatggttgaatEitgaaataaatatgaaat犯atgcatttgtcgaata540tcacattggcttatgtggaagttaaactaaattscgtatatattatcataatttcacgat600tatgc犯tgatttttgtgtttcctgacagtagtgaataatgaccggacacgt朋gcaatei660caattcgtgactgaccaaactcgaccttagtgtaaataattctaaatataaatatttatc720tgtctaagataagagacctactccccggccttcactcgtctt76權(quán)利要求1、一種櫛孔扇貝抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，其特征在于它的技術(shù)內(nèi)容包括以下四個(gè)方面1)櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克??；2)抗病群體和敏感群體的制備；3)抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選；4)攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩查。1)櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克隆參照分子克隆所述方法從櫛孔扇貝閉殼肌中提取總DNA；根據(jù)已知的G-型溶菌酶基因序列在其啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物，克隆得到一段762個(gè)堿基的DNA序列，連入T載體后進(jìn)行測(cè)序，獲得其核苷酸序列。2)抗病群體和敏感群體的制備采用人工感染的方法獲得抗病群體和敏感群體；即從不同海區(qū)和養(yǎng)殖場(chǎng)收集櫛孔扇貝個(gè)體，用病原菌浸泡感染，根據(jù)死亡時(shí)間判斷扇貝對(duì)病原菌感染抵抗能力，將扇貝分為抗病群體和敏感群體。3)抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選對(duì)來(lái)自5個(gè)個(gè)體的10個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了10處多態(tài)性位點(diǎn)；PCR擴(kuò)增42個(gè)敏感個(gè)體和40個(gè)抗病個(gè)體的G-型溶菌酶啟動(dòng)區(qū)序列后，針對(duì)-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G轉(zhuǎn)換分別選用TaqI和HapII對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，各發(fā)現(xiàn)兩種基因型，-754II，-754ID，-391AA和-391AG；其中-754ID和-754II個(gè)體在抗病群體和敏感群體中出現(xiàn)的頻率無(wú)顯著差別，而-391AA個(gè)體在敏感群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于抗病群體，-391AG個(gè)體在抗病群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體。因此，將-391AA作為疾病敏感相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記，而將-391AG作為抗病相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記。4)攜帶抗病相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩查取櫛孔扇貝個(gè)體全血1μl作為模版，PCR擴(kuò)增G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)序列，用HapII對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳分型后，選擇-391AG個(gè)體作為抗病個(gè)體。2、一種G-型溶菌酶基因輔助育種方法，其特征為以在抗病群體中高頻出現(xiàn)的G-型溶菌酶基因型作為抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記；將攜帶這種抗病相關(guān)基因標(biāo)記的櫛孔扇貝進(jìn)行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)序列，研究其多態(tài)性；同時(shí)進(jìn)行病原微生物感染實(shí)驗(yàn)，研究抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的遺傳規(guī)律及其與梓孔扇貝抗病力的關(guān)系，從中篩選出既帶有抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記，抗病力又顯著提高的貝苗進(jìn)行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。全文摘要本發(fā)明是一種櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因多態(tài)性標(biāo)記篩選及其輔助育種方法，屬于水產(chǎn)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中的貝類分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，其主要內(nèi)容包括櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動(dòng)區(qū)部分序列的克隆，抗病和敏感群體的制備，抗病相關(guān)G-型溶菌酶基因標(biāo)記的篩選，抗病個(gè)體的快速篩查以及基因標(biāo)記輔助育種技術(shù)的建立。本發(fā)明克隆了櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因的啟動(dòng)區(qū)序列，并篩選了其多態(tài)性位點(diǎn)。其中-391AG個(gè)體在抗病群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體，因此，以-391AG作為櫛孔扇貝抗病相關(guān)的G-型溶菌酶基因標(biāo)記，建立了抗病相關(guān)基因標(biāo)記輔助育種方法。本發(fā)明具有針對(duì)性強(qiáng)、選育效率高、操作簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，適用于貝類抗病相關(guān)標(biāo)記的篩選和抗病優(yōu)良品種的選育。文檔編號(hào)A01K67/00GK101255477SQ200810015048公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2008年4月2日優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日發(fā)明者宋林生,凌李,趙建民申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所