專利名稱：玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥ARGOS同源的基因ZmAl1及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥^及GOS同源的基因Z""〃 及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米是我國(guó)重要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，玉米單株籽粒數(shù)和粒重與玉米產(chǎn) 量關(guān)系重大，經(jīng)典遺傳學(xué)和育種學(xué)將以上兩個(gè)指標(biāo)歸結(jié)為微效多基因控制的 數(shù)量性狀。長(zhǎng)期以來(lái)，經(jīng)典遺傳學(xué)和育種學(xué)將以上兩個(gè)指標(biāo)歸結(jié)為微效多基 因控制的數(shù)量性狀(QT)。育種學(xué)家因此努力通過(guò)雜交手段集中較多的數(shù)量性 狀座位(QTLs),來(lái)達(dá)到增加玉米產(chǎn)量性狀的目的。
隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代遺傳學(xué)和分子育種學(xué)已逐漸被 應(yīng)用于作物產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改良。育種學(xué)家希望對(duì)傳統(tǒng)作物QTLs的分子標(biāo) 記和定位，來(lái)逐漸接近并最終找到與性狀相關(guān)性最大的座位或候選基因，或 稱之為主效基因，進(jìn)而通過(guò)基因工程等農(nóng)業(yè)生物技術(shù)手段改良作物，以縮短 育種周期，加速獲得新種質(zhì)或品種。
轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)被認(rèn)為是未來(lái)玉米育種的主要發(fā)展趨勢(shì)和方向，轉(zhuǎn)基因 玉米已成為僅次于大豆的第二大轉(zhuǎn)基因作物。美國(guó)轉(zhuǎn)基因玉米面積己由1996 年占玉米總種植面積的4%增至2005年的50%左右，生物科技應(yīng)用于美國(guó)玉 米生產(chǎn)不僅大幅度提高了玉米產(chǎn)量，而且還降低了殺蟲劑和除草劑的用量。 我國(guó)的玉米育種工作者也利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)胗衩撰@得了高蛋白
高賴氨酸含量的優(yōu)質(zhì)玉米，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
模式生物擬南芥、水稻、苜蓿等基因組序列的破譯，為利用作物自身的 基因而不引進(jìn)外源性基因以對(duì)產(chǎn)量品質(zhì)等進(jìn)行改良，繼而研制生物安全性高 的"綠色遺傳改造食品"提供了強(qiáng)有力的平臺(tái)。通常采用的技術(shù)路線，其一 是直接利用模式植物的某些功能基因，把它們移植到需改良目的作物中，這
比用病毒或其他微生物的基因要安全得多；其二是以模式植物為參照系，參 照其基因位點(diǎn)，利用各種分子標(biāo)記和比較基因組學(xué)手段，在目的作物中找到 相應(yīng)基因(如抗病蟲害或高產(chǎn))，"就地取材"的改造作物。
植物體的器官大小是構(gòu)成植物生物產(chǎn)量的重要因素，植物器官的增大或 減小往往導(dǎo)致植物體生物產(chǎn)量產(chǎn)生相應(yīng)的增減。不僅植物的生物產(chǎn)量是農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)關(guān)注的首要目標(biāo)，而且植物特定器官的增大也是園藝花卉等產(chǎn)業(yè)關(guān)心的 重要性狀。
越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物體器官的大小由細(xì)胞增殖引起的細(xì)胞數(shù)量變 化和細(xì)胞生長(zhǎng)引起的細(xì)胞體積的變化所決定。雖然植物體存在著內(nèi)在的發(fā)育 機(jī)制調(diào)節(jié)著細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞體積的動(dòng)態(tài)平衡并以此嚴(yán)格的控制著植物器官的 體積，但許多研究也顯示細(xì)胞數(shù)目的變化是影響植物器官大小的關(guān)鍵因素， 體積較大的器官往往含有更多的細(xì)胞，對(duì)突變體W,vve/戸妙和^朋to"c^ 的研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目的增減導(dǎo)致了器官的體積發(fā)生了相應(yīng)變化。
植物器官由起源于頂端或側(cè)生分生組織的器官原基發(fā)育而來(lái)，器官的生 長(zhǎng)、細(xì)胞數(shù)目的增多依賴于器官內(nèi)部分生組織細(xì)胞持續(xù)交互的分裂，因此植 物器官細(xì)胞分生能力顯得尤為關(guān)鍵。擬南芥^AT基因編碼一個(gè)Ap2結(jié)構(gòu)域的 轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)維持D類細(xì)胞周期蛋白表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞的持續(xù)分裂能力，
過(guò)量表達(dá)^vr基因?qū)е录?xì)胞的增殖和器官的增大。新近的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥 器官大小控制基因^及GOS基因是一個(gè)作用于^vr上游的植物所特有的基因，
參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并影響器官的發(fā)育。過(guò)量表達(dá)擬南芥^ GOS基因 可以導(dǎo)致^Vr基因和D類細(xì)胞周期蛋白Q^/3;/基因的轉(zhuǎn)錄水平提高和表達(dá) 時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力。相應(yīng)的，過(guò)量表達(dá)^i G05基因的擬
南芥植株表現(xiàn)出了因細(xì)胞數(shù)目增多而導(dǎo)致的器官增大，其鮮重相對(duì)于對(duì)照植
株增加50%~120°/。，植株角果內(nèi)種子數(shù)目比對(duì)照植株增加20%以上，這種表 型與人們所關(guān)心的作物產(chǎn)量性狀密切相關(guān)。
WGOS基因?yàn)橹参锼赜胁H在模式植物擬南芥中克隆得到，GeneBank
中基因組數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)僅有類似的水稻基因組序列，玉米中是否也有類似的同源
序列還是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從玉米(Zea ma")中分離得到與擬南芥(^ra/)!V/c;p^ Aa/^加) 器官大小控制基因^ GOS同源基因的全編碼區(qū)cDNA，并命名為ZmJ丄7( 巡^s4及GOS^汰e^"e丄)基因。構(gòu)建正義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化 擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株側(cè)生器官較之對(duì)照明顯增大。該基因可用于作物轉(zhuǎn)基因 育種，提高作物生物產(chǎn)量。
本發(fā)明Z^4丄7基因的全長(zhǎng)cDNA為539 bp (SEQ ID NO.l),其中開放 閱讀框部分為318 bp,由此推得具有105個(gè)氨基酸的一段序列(SEQ ID N0.2)， 將此氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，表明與已發(fā)表的擬南芥ARGOS 蛋白以及水稻基因組序列中推導(dǎo)的同源蛋白相比，氨基酸同源性分別為 31.90%和64.29%,并具有類似的富含亮氨酸和脯氨酸結(jié)構(gòu)域(見附圖1), 表明本發(fā)明克隆得到了玉米內(nèi)編碼ARGOS基因的同源基因。
利用過(guò)量表達(dá)策略，將本發(fā)明ZmJ丄/基因轉(zhuǎn)化擬南芥，將篩選出的轉(zhuǎn)基 因植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型植株同時(shí)種植。結(jié)果顯示，與野生型植株相比， 轉(zhuǎn)基因植株側(cè)生器官(如葉片)明顯增大，表明轉(zhuǎn)基因植株具有較高生物產(chǎn) 量(見附圖4-6)。
本發(fā)明從玉米中分離出編碼擬南芥^ G05同源基因的Zm^〃基因，這 在國(guó)內(nèi)外尚屬首例。該基因過(guò)量表達(dá)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥的生物產(chǎn)量較未轉(zhuǎn) 基因的顯著提高。玉米作為重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，該基因在玉米或其 它植物中表達(dá)，將會(huì)提高其生物產(chǎn)量，從而提高其產(chǎn)量，具有非常重要的經(jīng) 濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1擬南芥及水稻ARGOS氨基酸序列和玉米中由ZmJZJ基因推斷的氨 基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果。其中相同的氨基酸殘基用涂黑表示。Genebank的 登記號(hào)及其物種的來(lái)源如下^4及GOS(擬南芥，AY305869), OW及GOS(水 稻，DQ641272)。
圖2半定量法表示玉米ZmAll基因在生長(zhǎng)15天玉米根、莖、葉中的表達(dá) 情況。
圖3半定量法表示擬南芥野生型對(duì)照與轉(zhuǎn)ZmAll基因擬南芥株系(M4-3 和M2-9，過(guò)量表達(dá)ZmAll)的Zm^/基因表達(dá)情況。
圖4相同條件下生長(zhǎng)2個(gè)月的轉(zhuǎn)ZmAll基因擬南芥株系(M4-3和M2-9， 過(guò)量表達(dá)ZmAll)與野生型擬南芥對(duì)照的長(zhǎng)勢(shì)對(duì)比。
圖5相同條件下轉(zhuǎn)ZmAll基因擬南芥株系(M4-3和M2-9,過(guò)量表達(dá) ZmAll)與野生型擬南芥對(duì)照的果莢大小對(duì)比。
圖6轉(zhuǎn)ZmAll基因擬南芥株系(M4-3和M2-9，過(guò)量表達(dá)ZmAll與野 生型擬南芥對(duì)照的千粒重對(duì)比。
具體實(shí)施例方式
一、玉米中與擬南芥^^05>同源的基因2附^//的克隆
(1) RNA的提取釆用CTAB法或RNAkit提取總RNA。
(2) DNA第一條鏈的合成取ling總RNA，加入5 X反應(yīng)緩沖液4 pl， 10 mM脫氧核糖核酸(dNTP) 2|iil，核糖核酸酶抑制劑(40-200u/^il) 0.5^1， 引物oligodT(l fig/inl)1 ^U，反轉(zhuǎn)錄酶(10u/|iil) 2|iil， 42。C條件下反應(yīng)60分 鐘，然后在85。C條件下，放置IO分鐘，終止反應(yīng)。
(3) PCR反應(yīng):
根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)擴(kuò)增玉米中與擬南芥/A尺GOS同源的基因的引物 如下
正向引物5'-TTCACATTACACTCATGACT誦3' 正向引物5'國(guó)TTCGACCACCCGAGCTCAGAT-3'
PCR體系與條件如下
反應(yīng)體系
10 x反應(yīng)緩沖液 5^1
脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4^1
正向引物(5|iM) 4^a
反向引物(5pM) 4^1
模板cDNA 4 pl
T叫DNA聚合酶 0.5 |il
加水至總體積 50PCR反應(yīng)條件為94。C3分鐘；然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C 1分鐘，56。C 1分鐘，72°C1分鐘，共28個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸IO分鐘。
(4) 基因克隆取2iilPCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體進(jìn)行連接，操作步 驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T easy and pGEM-T easy Vector system說(shuō)明書進(jìn) 行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot菌株，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代P-D-半乳糖苷)的含氨芐青霉素(100 pg/ml)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培 養(yǎng)。
(5) 質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。
(6) 序列測(cè)定本工作由大連寶生物工程公司進(jìn)行。
(7) 3'和5'序列的分離按Clontech公司的SMARTRACEcDNA Amplification Kit說(shuō)明書進(jìn)行。
(8) 同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與Genebank中的序列進(jìn) 行比較。
二、玉米ZmJ/7的表達(dá)載體的構(gòu)建。
(1)根據(jù)分離出的與擬南芥^ GOS同源的玉米基因Z""/7的核苷酸序 列，設(shè)計(jì)引物
正向引物5'-GAGTCGACTTCACATTACACTCATGACT -3' 反向弓I物I 5'-TGTCTAGATtcgACCACCCGAGCTCAGAT-3' 以根的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。 PCR體系與條件如下 反應(yīng)體系
10 x反應(yīng)緩沖液 5 pi
脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4^1
正向引物(5fxM) 4|ul
反向引物(5pM) 4^1
模板cDNA 4 pi
Taq DNA聚合酶 0.5 |il
加水至總體積 50 |ul
PCR反應(yīng)條件為94。C3分鐘；然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C 1分鐘，56°C 1分鐘，72°C1分鐘，共28個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸IO分鐘。 可獲得SEQ ID NO. 1所示全長(zhǎng)為539 bp的cDNA序列。
(2) 取2pl PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體進(jìn)行連接，操作步驟按Promega公 司產(chǎn)品pGEM-T easy and pGEM-T easy Vector system說(shuō)明書進(jìn)行。然后轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5a菌株，在表面涂X-gal (5-溴-4-氯-3-卩引哚-P-D-半乳糖苷)和IPTG
(異丙基硫代p-D-半乳糖苷)的含氨芐青霉素(100(ig/ml)的LB平板上生長(zhǎng) 過(guò)夜。挑取白色單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。然后堿法提取質(zhì)粒 DNA，進(jìn)行序列測(cè)定。
(3) 用効al和Sa/I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T easy載體上切下， 與相同酶酶切的pBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ot細(xì)胞，然后在含氨芐青霉素 的LB固體平板上培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。
(4) 將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，所用菌株為GV3101。 三、轉(zhuǎn)基因植物生物產(chǎn)量分析。
(1)種植擬南芥。
(2) 挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50 ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，28 。C振蕩培養(yǎng)。
(3) 離心收集菌體，沉淀用滲透培養(yǎng)基(5%蔗糖，0.1MMgCl2， 0.5% Silwet L-77 )懸浮，菌液00600值在0.8左右。
(4) 將擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡5分鐘。
(5) 收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(lxMS鹽，1%蔗糖，pH5.7， 0.8%瓊脂， 卡那霉素30pg/ml)上篩選，得到抗性植株。
(6) 將T3代純合株系種子種于培養(yǎng)室，2月后觀察生長(zhǎng)狀況。結(jié)果見附圖4。
核苷酸序列表
<110〉山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心
〈120〉玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥ARG0S同源的基因ZmAll及應(yīng)用 〈160〉 6
〈210〉 1 〈211〉 539 〈212>腿
〈213〉玉米(Zea mays)
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (139)...(453) 〈400〉 1
tttcgaccac ccgagctcag atctgattac aaaacgttca gaaaacacaa ggcgttctca 60
caccgccttt cacttcttgc ttactttggc aaccactcac tgcgactggt ctccacctcc 120
acctacacca aagaacac atg gca age cga tct age gcg atg gaa gga ggg
171
Met Ala Ser Arg Ser Ser Ala Met Glu Gly Gly 1 5 10
gcg gca ata caa agg agg aat gcc gtg aag egg cat ctg cag cag cgt
219
Ala Ala lie Gin Arg Arg Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gin Gin Arg 15 20 25cag cag gag gcg gat ttc etc gac aag aag gtc ate gcg tec acc tac
267
Gin Gin Glu Ala Asp Phe Leu Asp Lys Lys Val lie Ala Ser Thr Tyr 30 35 40
ttc age ate ggg gcg ttc etc gtg etc gcc tgc etc acc gtc teg ctg
315
Phe Ser lie Gly Ala Phe Leu Val Leu Ala Cys Leu Thr Val Ser Leu 45 50 55
ctg ata ctg ccg ctg gtg ctg cct ccc ctg ccg ccg ccg ccg teg ctg
363
Leu lie Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu 60 65 70 75
ctg ttg tgg ctg ccg gtc tgc ctg etc gtc ttg ctg gtt gta ctg gcc
411
Leu Leu Trp Leu Pro Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala 80 85 90
ttc atg cct aca gat gtg cgc age atg gcc tec tct tac ctg taaatag
460
Phe Met Pro Thr Asp Val Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu 95 100 105
ataaataggt ettggecaga ttttctgtgt tttgcagctg caggattcgt cctaagacga 520
gtcatgagtg taatgtgaa
539
〈210〉 2 〈211〉 105 〈212〉 PRT
〈213〉玉米(Zea mays) 〈220〉
〈221〉 S皿LAR 〈222〉 (1)…(105) 〈400〉 2
Met Ala Ser Arg Ser Ser Ala Met Glu Gly Gly Ala Ala lie Gin Arg 1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gin Gin Arg Gin Gin Glu Ala Asp 20 25 30
Phe Leu Asp Lys Lys Val lie Ala Ser Thr Tyr Phe Ser lie Gly Ala 35 40 45
Phe Leu Vai Leu Ala Cys Leu Thr Val Ser Leu Leu lie Leu Pro Leu 50 55 60
Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Trp Leu Pro 65 70 75 80
Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro Thr Asp 85 90 95
Val Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu 100 105
〈210〉 3 〈211〉 20 〈212〉 DNA
〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)擴(kuò)增玉米(Zea mays)中與擬南芥(Arabidopsis
thaliana) ARG0S同源的基因的正向引物 〈400〉 3
ttcacattac actcatgact 20
〈210〉 4 〈211〉 29 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)擴(kuò)增玉米(Zea mays)中與擬南芥(Arabidopsis
thaliana) ARG0S同源的基因的反向引物 〈400〉 4
ttcgaccacc cgagctcagat 21
〈210〉 5 〈211〉 28 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增與擬南芥(Arabidopsis thaliana)
ARGOS同源的玉米(Zea mays) ZmAll基因的正向引物 〈400〉 5
gagtcgactt cacattacac tcatgact 28
〈210〉 6 〈211〉 29 〈212〉瞧 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增與擬南芥(Arabidopsis thaliana)
ARG0S同源的玉米(Zea mays) ZmAll基因的反向引物 〈400〉 6
tgtctsgatt cgaccacccg agctcagat 29
權(quán)利要求
1.玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥ARGOS同源的基因ZmA11，其特征在于，該ZmAL1基因的全長(zhǎng)cDNA為539bp的序列，其中開放閱讀框部分為318bp，SEQ ID NO.1。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥^W^5"同源的 基因Z/al^，其特征在于，由Z/a4〃基因的全長(zhǎng)cDNA SEQ ID NO. 1推得具有 105個(gè)氨基酸的一段序列，SEQ ID NO. 2，將此氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn) 行檢索，表明與已發(fā)表的擬南芥ARGOS蛋白以及水稻基因組序列中推導(dǎo)的同 源蛋白相比，氨基酸同源性分別為31.90%和64.29%，并具有類似的富含亮氨 酸和脯氨酸結(jié)構(gòu)域。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥^^6^同源的 基因Z/^7厶其特征在于，在玉米或其它植物中表達(dá)該基因，將會(huì)提高其生物 產(chǎn)量，從而提高總產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了玉米中調(diào)節(jié)器官大小的與擬南芥ARGOS同源的基因ZmAl1及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。首次從玉米中分離得到擬南芥器官大小控制基因ARGOS同源基因的全編碼區(qū)cDNA，并命名為ZmAL1(Zea mays ARGOS Like gene 1)基因。構(gòu)建正義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株側(cè)生器官較之對(duì)照明顯增大。該基因可用于作物轉(zhuǎn)基因育種，提高作物生物產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01H1/00GK101368182SQ20081001713
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者孟靜靜, 徐平麗, 李新國(guó), 畢玉平, 趙晉平, 峰 郭 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心