專利名稱：利用胚挽救獲得三倍體葡萄及倍性早期鑒定的育種技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)，特別是涉及利用胚挽救培養(yǎng)獲得三倍體葡 萄雜交幼苗，對(duì)所得雜種后代進(jìn)行系統(tǒng)而全面的倍性早期鑒定的高效育種 技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多倍體育種是培育果樹新品種的重要途徑，其優(yōu)越性在于所表現(xiàn)出的 生長(zhǎng)旺盛、枝粗、葉厚、果大、產(chǎn)量高及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，而多倍體產(chǎn)生 途徑有自然芽變、人工化學(xué)誘變、人工有性雜交、胚乳培養(yǎng)及花藥培養(yǎng)等。 其中利用二倍體品種與四倍體之間進(jìn)行雜交應(yīng)用最廣，己在西瓜、香蕉、 柑桔中取得成果，獲得了三倍體無(wú)籽果。葡萄作為全球性第二大水果，其 無(wú)核品種一直是當(dāng)前國(guó)際消費(fèi)的重要方向，而獲得大粒無(wú)核葡萄新品種長(zhǎng) 期以來(lái)備受育種學(xué)家的重視。三倍體葡萄除具有多倍體植株的諸多優(yōu)越性 外，其果實(shí)無(wú)核或少核，因此三倍體葡萄育種開拓了培育大粒無(wú)核葡萄品 種的新途徑。據(jù)研究報(bào)道，日本己育成三倍體無(wú)核葡萄品種尾玲、戴拉王、 蜜無(wú)核、甲斐美嶺、夏黑，我國(guó)已育成三倍體無(wú)核早紅，并在生產(chǎn)上開始 推廣。
三倍體葡萄品種可通過(guò)二倍體和四倍體品種間雜交、自然雜交、三倍 體品種的芽變、胚乳培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)等多種途徑產(chǎn)生，但實(shí)際上，最有效 的途徑仍然是利用二倍體和四倍體直接雜交。但是二倍體和四倍體雜交的 最大障礙是親和力差，座果率低，雜種胚早期敗育或胚乳解體，獲得三倍體雜交種子生活力低，很難獲得雜交后代。利用胚挽救技術(shù)，可阻止三倍 體雜交幼胚的早期敗育，形成三倍體植株。
從上個(gè)世紀(jì)以來(lái)，經(jīng)過(guò)胚珠培養(yǎng)，日本學(xué)者山下裕之利用有核葡萄的
四倍體和二倍體雜交，獲得了三倍體植株(《園藝學(xué)會(huì)雜志》1993， 62 (2): 249-255)，其后李世誠(chéng)(《上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》1998， 14 (4): 13-17)、 潘春云(《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》1998， 29 (3): 299-302)、徐海英(《果樹 學(xué)報(bào)》2001， 18 (6): 317-320)、郭印山(《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》2005， 36 (5) : 606-608)等也采用胚挽救技術(shù)，克服了葡萄二倍體與四倍體常 規(guī)育種中雜交胚早期敗育、育種效率低的障礙，成功的育成了三倍體雜種 幼苗，但少有系統(tǒng)的對(duì)所得雜交幼苗進(jìn)行全面倍性檢測(cè)，缺少完整高效的 育種體系。
通常多倍體鑒定的方法有植物性狀鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、分子生物學(xué) 鑒定等方法，而葡萄多倍體多采用顯微鏡下染色體數(shù)目鑒定，也有利用流 式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定，染色體計(jì)數(shù)法直觀有效，但材料僅限于莖尖和根尖， 且操作復(fù)雜。流式細(xì)胞儀是對(duì)待測(cè)植株DNA含量進(jìn)行鑒定，在短時(shí)間內(nèi)可 檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，能保證獲得生物體細(xì)胞的群體特征，測(cè)量快速，結(jié) 果可靠，但僅能提供半定量的測(cè)量結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)今三倍體葡萄育種現(xiàn)狀以及各種多倍體鑒 定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，利用胚挽救培養(yǎng)獲得三倍體葡萄雜種幼苗，結(jié)合流式細(xì) 胞術(shù)、去壁低滲法染色體計(jì)數(shù)，對(duì)所得雜種后代進(jìn)行系統(tǒng)而全面的倍性早 期鑒定，提高三倍體葡萄的育種效率。
本發(fā)明的實(shí)施步驟如下
a.葡萄育種田間雜交采取花粉，在四倍體品種父本開花前1天或開花初期，采下發(fā)育正常 的花序，除去頂部約三分之一的部分，摘下花冠及花藥后用紗網(wǎng)篩過(guò)后， 在日光燈下烘千至花藥裂開，再次篩后倒入研缽中，研磨至粉狀，裝入處
理干凈的小瓶，封口，放在裝有無(wú)水CaCl2的干燥器中，4。C低溫保存；
去雄授粉，選擇歐洲無(wú)核葡萄品種母本樹上發(fā)育一致的花序若干，開花前
3-4天進(jìn)行人工去雄，之后立即用清水噴灑花序，并套袋和掛牌標(biāo)記，當(dāng) 柱頭上開始分泌水滴狀粘液時(shí)，用脫脂棉蘸取花粉進(jìn)行人工授粉，連續(xù)授 粉3次，每天l次；
b. 胚挽救培養(yǎng)及成苗
雜交去雄授粉40-55天后，剝?nèi)‰s交果穗中的胚珠進(jìn)行胚挽救培養(yǎng)， 將果穗洗凈后置超凈工作臺(tái)上，75%乙醇浸泡約lmin，無(wú)菌水沖洗3-5次， 再用0. 1%升汞消毒6min，無(wú)菌水沖洗3-5次，切開果粒取出胚珠接種于 內(nèi)裝40ml培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，每瓶接種10-20粒，胚珠培養(yǎng)基采用 B5為基本培養(yǎng)基，附加0. 1-1. Omg/LBA 、 1, 5-2. 5mg/LIAA 、 0. 25-0.75mg/LGA3、 6%蔗糖、0.6%瓊脂、0. 1%活性炭;培養(yǎng)8周后，在無(wú)菌條 件下剝?nèi)÷闩呓臃N于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，以WP為基本培養(yǎng)基，附加O.l-0.5mg/LIBA、 2%蔗糖、0. 6%瓊脂、0. 1%活性炭；繼續(xù)培養(yǎng)10-15天，轉(zhuǎn)移 至成苗培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加O.l-0.3mg/LIBA、 2%蔗糖、0. 6%瓊脂、0. 1%活性炭，在成苗培養(yǎng)基中長(zhǎng)出葉片 后可進(jìn)行后繼的倍性鑒定，培養(yǎng)條件為溫度25'C土2"，光照每天16h， 光強(qiáng)度20001ux;
c. 流式細(xì)胞儀對(duì)葡萄雜種后代進(jìn)行半定量分析
經(jīng)胚挽救培養(yǎng)獲得的雜交后代倍性的初步鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定 其DNA含量，取l-2片幼嫩的葉片或少量愈傷組織放入培養(yǎng)皿中，加入0.5-1.0ml的DNA提取液服-A，用刀片切碎后靜置處理2-5min后，將樣 品通過(guò)3(^m的Partec CelltricsTM微孔膜過(guò)濾到測(cè)試管中，再加入2ml 染色液HR-B，隨即將樣品上樣于Partec流式細(xì)胞儀，DNA的含量分布圖 由流式細(xì)胞儀自動(dòng)生成，其中，先將父母本品種所產(chǎn)生的分析峰在橫軸上 的熒光值FL設(shè)定，固定參數(shù)，再依次對(duì)雜交幼苗的熒光值迸行測(cè)定；
d. 通過(guò)去壁低滲法染色體計(jì)數(shù)對(duì)所得的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行鑒定
在超凈工作臺(tái)上取雜交試管苗的根尖或莖尖后，立即投入飽和的對(duì)二 氯苯溶液中常溫下處理2h-3h;去除處理液，用蒸餾水沖洗數(shù)遍后注入新 配制的甲醇冰乙酸=3:1的固定液，常溫下處理3h-5h;去除固定液，用 蒸餾水沖洗干凈，加入3.5%的纖維素酶和果膠酶1:1的混合酶液，酶液 和材料的比例為30:1，在37。C恒溫下酶解20-30min;蒸餾水沖洗后在 卡寶品紅染色液中染色30min -3h;取一小塊材料放在經(jīng)70%乙醇浸泡的 載玻片上，滴上一滴卡寶品紅染色液，用鑷子搗碎后蓋上蓋玻片，然后按 壓住一角用木制小棒均勻敲打蓋玻片，至材料分散成霧狀，最后用吸水紙 吸去多余的染色液，酒精燈上干燥后用0LMPUS-BX51型顯微數(shù)碼攝影系統(tǒng) 照相；
e. 胚挽救幼苗的煉苗移栽
春季選擇壯苗4-5條根，根長(zhǎng)3-5 cm， 4_5片葉，莖稈粗壯，基部無(wú)愈 傷組織，強(qiáng)光鍛煉l周；將幼苗用無(wú)菌水沖洗后移栽到滅好菌的珍珠巖 草炭=1: l混勻的基質(zhì)中，培養(yǎng)室煉苗，在幼苗上罩塑料杯，每5-10天澆 灌1000倍的多菌靈和1/8MS營(yíng)養(yǎng)液，并及時(shí)除去發(fā)霉的葉片和莖桿，溫室 溫度控制在18-25。C，相對(duì)濕度60-70%,光照強(qiáng)度500-10001ux;待移栽出 的幼苗長(zhǎng)出新根和新葉，在春季地溫升高至18-23'C時(shí)移至大田，移栽后 立即搭遮蔭網(wǎng)并灌足定根水，逐漸揭開遮蔭網(wǎng)，并及時(shí)澆水和防病蟲。采用本發(fā)明的方法，對(duì)雜交組合紅寶石無(wú)核x藤稔、愛(ài)莫無(wú)核x黑奧
林進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果胚萌發(fā)率可分別達(dá)到23. 1%、 22. 2%，成苗率則分 別達(dá)到87.5%、 75%,因此，通過(guò)本發(fā)明得到了更多的雜交后代，提高了 育種效率，加速了三倍體葡萄品種的選育進(jìn)程。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的操作方法
a.葡萄育種田間雜交的步驟如下
a. l在開花初期，采下藤稔、黑奧林發(fā)育正常的花序，除去頂部約 三分之一的部分，摘下花冠及花藥后用紗網(wǎng)篩過(guò)后，在日光燈下烘干至花 藥裂開，再次篩后倒入研缽中，研磨粉狀，裝入處理干凈的小瓶，封口， 放在裝有無(wú)水CaCl2的干燥器中，4 °C低溫保存；
a. 2開花前3天，選擇母本品種紅寶石無(wú)核、愛(ài)莫無(wú)核的樹體上發(fā) 育一致的花序10穗，進(jìn)行人工去雄，之后立即用清水噴灑花序，并套袋 和掛牌標(biāo)記，當(dāng)柱頭上開始分泌水滴狀粘液時(shí)，用脫脂棉蘸取花粉進(jìn)行人 工授粉，連續(xù)授粉3次，每天l次；
b. 胚挽救培養(yǎng)及成苗的步驟是如下
b. l分別于授粉后48d、 47d采取雜交組合紅寶石無(wú)核X藤稔、愛(ài)莫 無(wú)核X黑奧林的果穗進(jìn)行離體培養(yǎng)，將果穗洗凈后置超凈工作臺(tái)上，75% 乙醇浸泡約lmin，無(wú)菌水沖洗3次，再用O. 1%升汞消毒6min，無(wú)菌水 沖洗3次，切開果粒取出胚珠接種于內(nèi)裝40ml培養(yǎng)基的100ml三角瓶中， 每瓶接種10粒，胚珠培養(yǎng)基采用B5為基本培養(yǎng)基，附加0.5mg/LBA、 2.0mg/LIAA、 0. 5mg/LGA3、 6%蔗糖、0. 6%瓊脂、0. 1%活性炭;培養(yǎng)8周后， 在無(wú)菌條件下剝?nèi)÷闩呓臃N于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，以WP為基本培養(yǎng)基，附加O. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1%活性炭；繼續(xù)培養(yǎng)兩周，轉(zhuǎn) 移至成苗培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加 0. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1%活性炭，在成苗培養(yǎng)基中長(zhǎng)出 葉片后可進(jìn)行后繼的倍性鑒定，培養(yǎng)條件為溫度25'C土2'C，光照每天 16h，光強(qiáng)度20001ux;
C.利用流式細(xì)胞儀對(duì)葡萄雜種后代進(jìn)行半定量分析
c. 1經(jīng)胚挽救培養(yǎng)獲得的雜交后代，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其DNA含 量，初步鑒定其倍性，取雜交組合紅寶石無(wú)核X藤稔、愛(ài)莫無(wú)核X黑奧林 所得幼苗的1-2片幼嫩的葉片或少量愈傷組織放入培養(yǎng)皿中，加入1. Oml 的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后靜置處理3min后，將樣品通過(guò)30^irn 的Partec CelltricsTM微孔膜過(guò)濾到測(cè)試管中，再加入2ml染色液HR-B， 隨即將樣品上樣于Partec流式細(xì)胞儀，DNA的含量分布圖由流式細(xì)胞儀 自動(dòng)生成，其中，先將父母本品種所產(chǎn)生的分析峰在橫軸上的熒光值FL 設(shè)定，固定參數(shù)，再依次對(duì)雜交幼苗的熒光值進(jìn)行測(cè)定；
d. 對(duì)所得雜交幼苗實(shí)施去壁低滲法染色體計(jì)數(shù)
d. l配制所用試劑，3.5%混合酶液稱取纖維素酶、果膠酶各0.7g， 加入20ml蒸餾水，4'C冰箱內(nèi)保存；預(yù)處理液稱取5g對(duì)二氯苯飽結(jié)晶 放入棕色試劑瓶中，加入100ml己加溫至45i:的蒸餾水，振蕩5min，靜 置冷卻后室溫存放；固定液冰乙酸與甲醇的體積比=1:3;卡寶品紅染色 液先配成三種原液，原液A: 3g堿性品紅溶于100ml 70%酒精中，原液 B:取原液A10ml加入到90ml5。/。石炭酸水溶液中，原液C:取原液B55ml， 加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林，其中原液A和原液C可長(zhǎng)期保存，原液 B限兩周內(nèi)使用，再取原液C20ml，加45%冰醋酸90ml，再加山梨醇1. 8g， 配成20%濃度的卡寶品紅染色液，放置兩周后使用；d. 2在超凈工作臺(tái)上取雜交試管苗的根尖或莖尖后，立即投入飽和
的對(duì)二氯苯溶液中常溫下處理2h;
d. 3去除處理液，用蒸餾水沖洗數(shù)遍后注入新配制的甲醇冰乙酸
=3:1的固定液，常溫下處理4h;
d. 4去除固定液，用蒸餾水沖洗干凈，加入3.5%的纖維素酶和果膠 酶混合酶液，酶液和材料的比例為30:1，在37。C恒溫下酶解30min;
d. 5蒸餾水沖洗后在卡寶品紅染色液中染色lh;
d. 6取一小塊材料放在經(jīng)70%乙醇浸泡的載玻片上，滴上一滴卡寶品 紅染色液，用鑷子搗碎后蓋上蓋玻片，然后按壓住一角用木制小棒均勻敲 打蓋玻片，至材料分散成霧狀，最后用吸水紙吸去多余的染色液，酒精燈 上干燥后用0LMPUS-BX51型顯微數(shù)碼攝影系統(tǒng)照相。
e. 進(jìn)行胚挽救幼苗的煉苗移栽
e. l次年3月中下旬選擇壯苗4-5條根，根長(zhǎng)3-5 cm， 4-5片葉， 莖稈粗壯，基部無(wú)愈傷組織，強(qiáng)光鍛煉l周后，將幼苗用無(wú)菌水沖洗后移 栽到滅好菌的珍珠巖草炭=1: l混勻的基質(zhì)中，培養(yǎng)室煉苗，在幼苗 上罩塑料杯用以保濕，
e. 2每周澆灌1000倍的多菌靈和1/8MS營(yíng)養(yǎng)液，并及時(shí)除去發(fā)霉的 葉片和莖桿，溫室溫度控制在22"，相對(duì)濕度60°/。，光照強(qiáng)度10001ux，
e. 3待移栽出的幼苗長(zhǎng)出新根和新葉，在春季地溫升高至2"C時(shí)移至 大田，移栽后立即搭遮蔭網(wǎng)并灌足定根水，逐漸揭開遮蔭網(wǎng)，并及時(shí)澆水 和防病蟲。
權(quán)利要求
1. 利用胚挽救獲得三倍體葡萄及倍性早期鑒定的育種技術(shù)，其特征是按以下步驟進(jìn)行1.a葡萄育種田間雜交采取花粉，在四倍體品種父本開花前1天或開花初期，采下發(fā)育正常的花序，除去頂部約三分之一的部分，摘下花冠及花藥后用紗網(wǎng)篩過(guò)后，在日光燈下烘干至花藥裂開，再次篩后倒入研缽中，研磨至粉狀，裝入處理干凈的小瓶，封口，放在裝有無(wú)水CaCl2的干燥器中，4℃低溫保存；去雄授粉，選擇歐洲無(wú)核葡萄品種母本樹上發(fā)育一致的花序若干，開花前3-4天進(jìn)行人工去雄，之后立即用清水噴灑花序，并套袋和掛牌標(biāo)記，當(dāng)柱頭上開始分泌水滴狀粘液時(shí)，用脫脂棉蘸取花粉進(jìn)行人工授粉，連續(xù)授粉3次，每天1次；1.b胚挽救培養(yǎng)及成苗雜交去雄授粉40-55天后，剝?nèi)‰s交果穗中的胚珠進(jìn)行胚挽救培養(yǎng)，將果穗洗凈后置超凈工作臺(tái)上，75％乙醇浸泡約1min，無(wú)菌水沖洗3-5次，再用0.1％升汞消毒6min，無(wú)菌水沖洗3-5次，切開果粒取出胚珠接種于內(nèi)裝40ml培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，每瓶接種10-20粒，胚珠培養(yǎng)基采用B5為基本培養(yǎng)基，附加0.1-1.0mg/LBA、1.5-2.5mg/LIAA、0.25-0.75mg/LGA3、6％蔗糖、0.6％瓊脂、0.1％活性炭；培養(yǎng)8周后，在無(wú)菌條件下剝?nèi)÷闩呓臃N于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，以WP為基本培養(yǎng)基，附加0.1-0.5mg/LIBA、2％蔗糖、0.6％瓊脂、0.1％活性炭；繼續(xù)培養(yǎng)10-15天，轉(zhuǎn)移至成苗培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加0.1-0.3mg/LIBA、2％蔗糖、0.6％瓊脂、0.1％活性炭，在成苗培養(yǎng)基中長(zhǎng)出葉片后可進(jìn)行后繼的倍性鑒定，培養(yǎng)條件為溫度25℃±2℃，光照每天16h，光強(qiáng)度2000lux；1.c流式細(xì)胞儀對(duì)葡萄雜種后代進(jìn)行半定量分析經(jīng)胚挽救培養(yǎng)獲得的雜交后代倍性的初步鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其DNA含量，取1-2片幼嫩的葉片或少量愈傷組織放入培養(yǎng)皿中，加入0.5-1.0ml的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后靜置處理2-5min后，將樣品通過(guò)30μm的Partec CelltricsTM微孔膜過(guò)濾到測(cè)試管中，再加入2ml染色液HR-B，隨即將樣品上樣于Partec流式細(xì)胞儀，DNA的含量分布圖由流式細(xì)胞儀自動(dòng)生成，其中，先將父母本品種所產(chǎn)生的分析峰在橫軸上的熒光值FL設(shè)定，固定參數(shù)，再依次對(duì)雜交幼苗的熒光值進(jìn)行測(cè)定；1.d通過(guò)去壁低滲法染色體計(jì)數(shù)對(duì)所得的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行鑒定在超凈工作臺(tái)上取雜交試管苗的根尖或莖尖后，立即投入飽和的對(duì)二氯苯溶液中常溫下處理2h-3h；去除處理液，用蒸餾水沖洗數(shù)遍后注入新配制的甲醇∶冰乙酸＝3∶1的固定液，常溫下處理3h-5h；去除固定液，用蒸餾水沖洗干凈，加入3.5％的纖維素酶和果膠酶1∶1的混合酶液，酶液和材料的比例為30∶1，在37℃恒溫下酶解20-30min；蒸餾水沖洗后在卡寶品紅染色液中染色30min-3h；取一小塊材料放在經(jīng)70％乙醇浸泡的載玻片上，滴上一滴卡寶品紅染色液，用鑷子搗碎后蓋上蓋玻片，然后按壓住一角用木制小棒均勻敲打蓋玻片，至材料分散成霧狀，最后用吸水紙吸去多余的染色液，酒精燈上干燥后用OLMPUS-BX51型顯微數(shù)碼攝影系統(tǒng)照相；1.e胚挽救幼苗的煉苗移栽春季選擇壯苗4-5條根，根長(zhǎng)3-5cm，4-5片葉，莖稈粗壯，基部無(wú)愈傷組織，強(qiáng)光鍛煉1周；將幼苗用無(wú)菌水沖洗后移栽到滅好菌的珍珠巖∶草炭＝1∶1混勻的基質(zhì)中，培養(yǎng)室煉苗，在幼苗上罩塑料杯，每5-10天澆灌1000倍的多菌靈和1/8MS營(yíng)養(yǎng)液，并及時(shí)除去發(fā)霉的葉片和莖桿，溫室溫度控制在18-25℃，相對(duì)濕度60-70％，光照強(qiáng)度500-1000lux；待移栽出的幼苗長(zhǎng)出新根和新葉，在春季地溫升高至18-23℃時(shí)移至大田，移栽后立即搭遮蔭網(wǎng)并灌足定根水，逐漸揭開遮蔭網(wǎng)，并及時(shí)澆水和防病蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用胚挽救獲得三倍體葡萄及倍性早 期鑒定的育種技術(shù)，其特征是具體操作方法如下2.a葡萄育種田間雜交2.a. l在開花初期，采下藤稔、黑奧林發(fā)育正常的花序，除去頂 部約三分之一的部分，摘下花冠及花藥后用紗網(wǎng)篩過(guò)后，在日光燈下 烘干至花藥裂開，再次篩后倒入研缽中，研磨粉狀，裝入處理干凈的 小瓶，封口，放在裝有無(wú)水CaCl2的干燥器中，4。C低溫保存；2.&2開花前3天，選擇母本品種紅寶石無(wú)核、愛(ài)莫無(wú)核的樹體 上發(fā)育一致的花序10穗，進(jìn)行人工去雄，之后立即用清水噴灑花序， 并套袋和掛牌標(biāo)記，當(dāng)柱頭上開始分泌水滴狀粘液時(shí)，用脫脂棉蘸取 花粉進(jìn)行人工授粉，連續(xù)授粉3次，每天1次；2.b胚挽救培養(yǎng)及成苗2. b. 1分別于授粉后48d、 47d采取雜交組合紅寶石無(wú)核X藤稔、 愛(ài)莫無(wú)核X黑奧林的果穗進(jìn)行離體培養(yǎng)，將果穗洗凈后置超凈工作臺(tái) 上，75%乙醇浸泡約lmin，無(wú)菌水沖洗3次，再用0. 1%升汞消毒6min，無(wú)菌水沖洗3次，切開果粒取出胚珠接種于內(nèi)裝40ml培養(yǎng)基的100ml 三角瓶中，每瓶接種10粒，胚珠培養(yǎng)基采用B5為基本培養(yǎng)基，附加 0. 5mg/LBA、 2. Omg/LIAA、 0. 5mg/LGA3、 6%蔗糖、0. 6%瓊脂、0. 1%活 性炭；培養(yǎng)8周后，在無(wú)菌條件下剝?nèi)÷闩呓臃N于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中， 以WP為基本培養(yǎng)基，附加0. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1% 活性炭；繼續(xù)培養(yǎng)兩周，轉(zhuǎn)移至成苗培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加0. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1%活性 炭，在成苗培養(yǎng)基中長(zhǎng)出葉片后可進(jìn)行后繼的倍性鑒定，培養(yǎng)條件為-溫度25。C土2X:，光照每天16h，光強(qiáng)度20001ux;2. c利用流式細(xì)胞儀對(duì)葡萄雜種后代進(jìn)行半定量分析經(jīng)胚挽救培養(yǎng)獲得的雜交后代，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其DNA含 量，來(lái)初步鑒定其倍性，取雜交組合紅寶石無(wú)核X藤稔、愛(ài)莫無(wú)核X 黑奧林所得幼苗的1-2片幼嫩的葉片或少量愈傷組織放入培養(yǎng)皿中， 加入1. Oml的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后靜置處理3min后，將 樣品通過(guò)30nm的Partec CelltricsTM微孔膜過(guò)濾到測(cè)試管中，再加 入2ml染色液HR-B，隨即將樣品上樣于Partec流式細(xì)胞儀，DNA的 含量分布圖由流式細(xì)胞儀自動(dòng)生成，其中，先將父母本品種所產(chǎn)生的 分析峰在橫軸上的熒光值FL設(shè)定，固定參數(shù)，再依次對(duì)雜交幼苗的 熒光值進(jìn)行測(cè)定；2. d對(duì)所得雜交幼苗實(shí)施去壁低滲法染色體計(jì)數(shù)2.d. l配制所用試劑，3.5%混合酶液稱取纖維素酶、果膠酶各 0.7g，加入20ml蒸餾水，4。C冰箱內(nèi)保存；預(yù)處理液稱取5g對(duì)二 氯苯飽結(jié)晶放入棕色試劑瓶中，加入100ml己加溫至45"C的蒸餾水， 振蕩5min，靜置冷卻后室溫存放；固定液冰乙酸與甲醇的體積比=1:3;卡寶品紅染色液先配成三種原液，原液A: 3g堿性品紅溶于100ml 70%酒精中，原液B:取原液A 10ml加入到90ml 5%石炭酸水 溶液中，原液C:取原液B55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林， 其中原液A和原液C可長(zhǎng)期保存，原液B限兩周內(nèi)使用，再取原液C 20ml，加45%冰醋酸90ml，再加山梨醇1.8 g，配成20%濃度的卡 寶品紅染色液，放置兩周后使用；2. d. 2在超凈工作臺(tái)上取雜交試管苗的根尖或莖尖后，立即投入 飽和的對(duì)二氯苯溶液中常溫下處理2h;2.d.3去除處理液，用蒸餾水沖洗數(shù)遍后注入新配制的甲醇冰 乙酸=3:1的固定液，常溫下處理4h;2. d.4去除固定液，用蒸餾水沖洗干凈，加入3.5%的纖維素酶 和果膠酶混合酶液，酶液和材料的比例為30:1，在37"C恒溫下酶解 30min;2.(1.5蒸餾水沖洗后在卡寶品紅染色液中染色lh;2. d. 6取一小塊材料放在經(jīng)70%乙醇浸泡的載玻片上，滴上一滴 卡寶品紅染色液，用鑷子搗碎后蓋上蓋玻片，然后按壓住一角用木制 小棒均勻敲打蓋玻片，至材料分散成霧狀，最后用吸水紙吸去多余的 染色液，酒精燈上干燥后用0LMPUS-BX51型顯微數(shù)碼攝影系統(tǒng)照相。2. e進(jìn)行胚挽救幼苗的煉苗移栽2. e. 1次年3月中下旬選擇壯苗4-5條根，根長(zhǎng)3-5 cm， 4_5片 葉，莖稈粗壯，基部無(wú)愈傷組織，強(qiáng)光鍛煉l周后，將幼苗用無(wú)菌水 沖洗后移栽到滅好菌的珍珠巖草炭二l: l混勻的基質(zhì)中，培養(yǎng)室 煉苗，在幼苗上罩塑料杯用以保濕，2. e. 2每周澆灌1000倍的多菌靈和1/8MS營(yíng)養(yǎng)液，并及時(shí)除去 發(fā)霉的葉片和莖桿，溫室溫度控制在22"C，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng) 度10001ux，2. e. 3待移栽出的幼苗長(zhǎng)出新根和新葉，在春季地溫升高至2°C 時(shí)移至大田，移栽后立即搭遮蔭網(wǎng)并灌足定根水，逐漸揭開遮蔭網(wǎng)， 并及時(shí)澆水和防病蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用胚挽救獲得三倍體葡萄及倍性早期鑒定的育種技術(shù)，其目的就是采用胚挽救技術(shù)培育三倍體葡萄，克服葡萄二倍體與四倍體常規(guī)育種雜交胚早期敗育的缺陷，獲得雜種幼苗，再結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、去壁低滲法染色體計(jì)數(shù)對(duì)所得雜種后代進(jìn)行倍性的早期鑒定，提高三倍體葡萄的育種效率，加速了三倍體葡萄品種的選育進(jìn)程，將為培育大粒無(wú)核葡萄品種開創(chuàng)廣闊的前景。
文檔編號(hào)A01N3/00GK101283669SQ20081001827
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者唐冬梅, 張宗勤, 張朝紅, 王躍進(jìn), 艷 石 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)