專利名稱：利用反義rna技術(shù)提高百合花耐衰老能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高耐衰老能力的方法，特別是一種 利用反義RNA技術(shù)提高百合花耐衰老能力的方法。
背景技術(shù)：
百合屬植物(Lilium spp.)諸多種及品種總稱為"百合"。百合科 (Liliaceae)植物為多年生露地鱗莖花丼。野生種或人工培育的品種繁多，種質(zhì) 資源遺傳變異十分豐富。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界百合屬植物共有100多種(文獻(xiàn) 記錄130種)。中國(guó)是百合屬植物的自然分布中心之一，據(jù)文獻(xiàn)記載原產(chǎn)中國(guó)百 合屬植物約55個(gè)種。其中有36個(gè)種、18個(gè)變種為中國(guó)所特有。屬內(nèi)許多種花 朵碩大、花色艷麗多彩、花姿百態(tài)、芳香怡人，具有較高的觀賞價(jià)值。百合作為 高檔的鮮切花商品之一，在世界各地廣為栽培，在世界鮮切花市場(chǎng)中占有十分重 要的地位。但是，與其它鮮切花一樣，百合切花離體后隨著花朵的開放也伴隨著 快速衰老，延長(zhǎng)百合花朵的瓶插壽命、從分子水平研究百合花朵衰老的機(jī)理并開 展調(diào)控研究具有重要意義。研究表明，乙烯是導(dǎo)致許多鮮切花衰老的重要激素之 一，百合為乙烯釋放型花卉，花朵開放時(shí)，伴隨著乙烯釋放而衰老(黃森，王飛， 劉雅莉，百合花朵不同發(fā)育期乙烯釋放量與膜脂過氧化作用的研究.西北植物學(xué) 報(bào)，1999(6): 143-147)。在外源乙烯處理下，百合切花的壽命縮短了。這些研 究表明，乙烯是導(dǎo)致百合衰老和切花壽命縮短的主要原因之一。ACC氧化酶 (l-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, AC0)， 又禾爾乙稀合成,，是 植物乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化乙烯合成的最后一步(即催化ACC生成乙 烯)。應(yīng)用ACC氧化酶基因的反義RNA技術(shù)，可望有效抑制乙烯生物合成，從 而延長(zhǎng)切花植物的瓶插時(shí)間。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Savin和Graham將ACC氧化酶(ACQ)基因的反義RNA載體轉(zhuǎn)化康乃馨，使轉(zhuǎn)基因康乃馨花的壽命大大提高(Savin KW, Graham MW, Antisense ACC oxidase RNA delays carnation petal senescence. HortScience, 1995. 30(5): 970-972)。該技術(shù)說明ACC氧化酶基因的反義RNA 技術(shù)在延長(zhǎng)花卉壽命方面具有很大的應(yīng)用前景。然而到目前為止，還沒有采用 ACC氧化酶基因的反義RNA技術(shù)延長(zhǎng)百合花壽命的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用反義RNA技術(shù)提 高百合花耐衰老能力的方法。本發(fā)明涉及的關(guān)鍵酶基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn) 化、分子檢測(cè)、衰老測(cè)定用于本發(fā)明，為利用基因工程技術(shù)培育百合花壽命延長(zhǎng) 的品種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的從百合中克隆Liaco基因的反義片段， 構(gòu)建含Liaco反義基因antiLlaco的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將 antiLlaco基因轉(zhuǎn)入百合并再生出植株，PCR檢測(cè)外源目的基因antiLlaco的整 合情況，衰老試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的耐衰老性，最終獲得百合花壽命延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基 因百合植株。
本發(fā)明包括如下具體步驟
(1) 采用基因克隆方法獲得百合Liaco基因的反義片段；
(2) 把Liaco反義基因antiLlaco可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成 含antiLlaco的植物表達(dá)載體；
(3) 將含antiLlaco基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化 百合的含antiLlaco基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
(4) 利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百 合植株；
(5) 對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因百合植株進(jìn)行衰老測(cè)定，最終獲得百合花壽命提高的 轉(zhuǎn)基因百合植株。
所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株是指，分別設(shè)計(jì)合成Liaco反義基因 antiLlaco的檢測(cè)引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即 為轉(zhuǎn)基因百合植株。本發(fā)明的利用百合ACC氧化酶(L1AC0)的反義基因antiLlaco轉(zhuǎn)化百合， 從而提高百合花耐衰老能力的方法采用基因工程方法，將百合Liaco反義基因 antiLlaco導(dǎo)入百合植株中，然后通過衰老測(cè)定最終獲得百合花壽命延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基 因百合植株，結(jié)果表明，在反義基因antiLlaco轉(zhuǎn)化的百合植株的百合花壽命同 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，延長(zhǎng)了50%以上。
本發(fā)明中所涉及的根癌農(nóng)桿菌菌株為市場(chǎng)上公開出售的菌株EHA105，從澳 大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號(hào)為Gambar 1。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提 下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不 限于下述的實(shí)施例。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
采用基因克隆方法獲得百合Liaco基因的反義片段
1. 百合總RNA的提取
取少量麝香百合"雪皇后'，(Xilium longiflorum Thunb <Snow Q匿n，) 花瓣組織，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1 mL TRIzol (TRIzol Reagents, GIBCO BRL， USA)的1. 5 mL Eppendorf管中，充分振蕩后，于室溫 下放置5 min，加200叱氯仿，用力振蕩15 sec，室溫放置2-3 min后，于4 。C、 12， 000g離心15 min;將上清液(約600 I4J吸入干凈的1. 5 mL Eppendorf 管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4'C、 12， 000g 離心10 min;棄上清，加1 mL 75%乙醇清洗，振蕩后，于4°C、 7， 500g離心5 min; 室溫干燥15-20 min后溶于適量(30-50 PL) RNAase-free水中；用甲醛變性 膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。
2. 百合Liaco反義基因antiLlaco的克隆
將所獲的百合總RNA通過畫LV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA， NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中公布的百合Liaco基因的全長(zhǎng)cDNA序列(NCBI Genbank上的 登錄號(hào)為EU249333))，設(shè)計(jì)出作為L(zhǎng)iaco基因反義序列的百合Liaco基因編碼 區(qū)核心片段(394bp，序列表中的序列1)的上下游引物，并在上游引物(TP13F1， 5， - AGATCT CCGTCACCTCCCCACCTCCAAC -3'，引入了 BglII酶切位點(diǎn))和下游引 物(TP13R1， 5， -CCATGG GACCTCAAGCTGATCACCGAGG -3，，引入了 Ncol酶切位 點(diǎn))上分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以第一鏈cDNA為 模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。DNA序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司 采用3730自動(dòng)測(cè)序儀完成。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與預(yù)計(jì)的百合Liaco 基因編碼區(qū)核心片段(序列表中的序列) 一致。
本實(shí)施例采用基因克隆方法從百合中獲得序列正確的Liaco基因編碼區(qū)核 心片段(作為L(zhǎng)iaco反義基因an也laco)，為通過轉(zhuǎn)Liaco反義基因ant化laco 提高百合花壽命提供了一個(gè)重要基因。
實(shí)施例2
把Liaco反義基因antiLlaco可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含 antiLlaco的植物表達(dá)載體
以pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將實(shí)施例1中Liaco反義基因(antiLlaco) 插入pCAMBIA1304載體的CaMV35S啟動(dòng)子和gfp基因之間。具體地，使用 Bglll/Ncol雙酶切PMD18-T+antiLlaco和pCAMBIA1304，然后回收antiLlaco 和pCAMBIA1304大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn) 證。所構(gòu)建的含 antiLlaco 基因的植物表達(dá)載體 CAMBIA1304: :p35S-antiLlaco-nos中含有潮霉素抗性基因hpt，在遺傳轉(zhuǎn)化再生 的過程中可以用潮霉素進(jìn)行篩選，另外還含有g(shù)fp和gus兩個(gè)報(bào)告基因，有利于 遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果的快速檢測(cè)。
本實(shí)施例將百合反義基因(antiLlaco)可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列， 形成含百合反義基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過基因工程策略來提 高百合花耐衰老性的研究中。
實(shí)施例3
將含antiLlaco基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化百合的含antiLlaco基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株
將實(shí)施例2中含antiLlaco基因的植物表達(dá)載體CAMBIA1304 : : p35S-antiLlaco-nos轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場(chǎng)有公開出售的生物材料，可 以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號(hào)為Gambar 1)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié) 果表明，含antiLlaco基因植物表達(dá)載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。
本實(shí)施例獲得了含antiLlaco基因的植物表達(dá)載體CAMBIA1304 :: p35S-antiLlaco-nos 的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 ( CAMBIA1304 :: p35S-antiLlaco-nos)，該菌株可用于通過轉(zhuǎn)基因策略來提高百合耐衰老能力的 研究中。
實(shí)施例4
利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植
株
1. 外植體的預(yù)培養(yǎng)
將麝香百合(Lilium longiflorum Thunb) "Snow Queen"的鱗莖用75%乙醇 浸泡O. 5min，再用20% NaClO浸泡20 min，無菌水沖洗3_4次，用無菌吸水紙 吸干表面水分，將鱗片切成0.5cm2的小塊接種于誘導(dǎo)分化固體培養(yǎng)基[MS
(Murashige and Skoog， 1962) + 1 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA + 0. 1 mg/L 2， 4-D + 30 g/L蔗糖+ 2.6 g/L植物凝膠，pH值為5. 8]中，25°C、 12h/12h
(light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得百合無菌苗。待苗長(zhǎng)至7cm左右后，剪取無 菌苗葉片外植體(0.5 cm2)用于轉(zhuǎn)化。
2. 農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到含活化好的所述含antiLlaco基因植物表達(dá)載 體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2 MS + 1 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA +AS 100 Wnol/L)中，輕搖10-15 min后，將外植體用無菌紙吸干多余菌液接至 共培養(yǎng)基上，于28'C暗培養(yǎng)3天。
3. 抗性再生植株的篩選
將所述的共培養(yǎng)3天的百合外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS + 0. 5 mg/L 6-BA + 1 mg/L IAA + 4 mg/L Hygromicin + 250 mg/L Cb)上于25。C、 16h/8h光照培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Hyg抗性芽。將生 長(zhǎng)良好的抗性芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS + 2 mg/L Hyg + Cb 125 mg/L)上 培養(yǎng)至生根，從而獲得Hyg抗性再生百合植株。 4.轉(zhuǎn)基因百合植株的PCR檢測(cè)
根據(jù)植物表達(dá)載體CAMBIA1304: :p35S-antiLlaco-nos中CaMV35S啟動(dòng)子序 列和目的基因antiLlaco序列分別設(shè)計(jì)正向引物(35SF1 ， 5 ， -ATCCCACTATCCTTCGCAAGACC-3 ，) 和反向引物 (antiLlacoRl ， 5 ， -GACCTCAAGCTGATCACCGAGG-3')對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的 PCR特異引物，能擴(kuò)增出467 bp的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化百合基因組DNA 為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。
本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化百合的含 antiLlaco基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株 轉(zhuǎn)化百合，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株。
實(shí)施例5
對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因百合植株進(jìn)行衰老測(cè)定，最終獲得百合花壽命提高的轉(zhuǎn)基 因百合植株
將轉(zhuǎn)基因百合和非轉(zhuǎn)基因百合植株移栽到溫室的盆缽中種植，在百合開花 后，將帶有約30厘米長(zhǎng)莖桿的花剪下，插入盛有500mL蒸餾水的lOOOmL三角瓶 中，置于常溫(25°C)下培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因百合花于10天后花瓣開始 凋零脫落，而轉(zhuǎn)基因百合花于14天后仍然花瓣完整，17天后花瓣才開始脫落。
上述實(shí)施例采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得了含ACC氧化酶反義基因antiLlaco的的 轉(zhuǎn)基因百合植株。結(jié)果表明，含antiLlaco基因的轉(zhuǎn)基因百合花的壽命同非轉(zhuǎn) 基因?qū)φ障啾龋娱L(zhǎng)了 50%以上，說明ACC氧化酶基因的反義RNA技術(shù)是提高 百合花耐衰老能力的有效方法。序列表
〈110〉上海交通大學(xué)
〈120〉利用反義RNA技術(shù)提高百合耐衰老能力的方法 〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3. 4 〈210〉 1 〈211〉 394 〈212〉 DNA
〈213〉 百合(Lilium) 〈400〉 1
1 CCGTCACCTC CCCACCTCCA ACATGGAGGA GATCCCCGAT CTCACCGATG AGTACCGGGA 61 GACGATGAGG GAGTTCGTCA AGAGGCTGGG AGAGCTAGCG GACCAGCTTC TCGACCTGCTl
21 GTGTGAGAAC CTGGGGTTGG AGAAAGGGTA TTTGAAGAAG GCCTTTAGCG GGACGAAGGG18
1 GCTGACCTTC GGAACCAAGG TTAGCAACTA TCCGCCCTCC CCGAAGCCGG AGCTGATCAA241 GGGCCTTCGT GCACACACCG ACGCTGGCGG CCTCATCCTT CTGTTTCAGG ACGACAAGGT301
GAGCGGCCTC CAGCTGCTCA AGGATGGAGA GTGGGTGGAC GTCCCTCCTA TGCATCACTC361 C
ATCGTCATC AACCTCGGTG ATCAGCTTGA GGTC
權(quán)利要求
1.一種利用反義RNA技術(shù)提高百合花耐衰老能力的方法，其特征在于，從百合中克隆Liaco基因的反義片段，構(gòu)建含Liaco反義基因antiLlaco的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將antiLlaco基因轉(zhuǎn)入百合并再生出植株，PCR檢測(cè)外源目的基因antiLlaco的整合情況，衰老試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的耐衰老性，最終獲得百合花壽命延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因百合植株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用反義RNA技術(shù)提高百合花耐衰老能力的方 法，其特征是，包括如下具體步驟(1) 采用基因克隆方法獲得百合Liaco基因的反義片段；(2) 把Liaco反義基因antiLlaco可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成 含antiLlaco的植物表達(dá)載體；(3) 將含antiLlaco基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化 百合的含antiLlaco基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4) 利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百 合植株；(5) 對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因百合植株進(jìn)行衰老測(cè)定，最終獲得百合花壽命提高的 轉(zhuǎn)基因百合植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用反義RNA技術(shù)提高百合花耐衰老能力的方法， 其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株是指分別設(shè)計(jì)合成Liaco反義 基因antiLlaco的檢測(cè)引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株 系即為轉(zhuǎn)基因百合植株。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的利用反義RNA技術(shù)提高百合花耐衰老能力的方法。本發(fā)明從百合中克隆Liaco基因的反義片段，構(gòu)建含Liaco反義基因antiLlaco的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將antiLlaco基因轉(zhuǎn)入百合并再生出植株，PCR檢測(cè)外源目的基因antiLlaco的整合情況，衰老試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的耐衰老性，最終獲得百合花壽命延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因百合植株。本發(fā)明提供了一種提高百合花壽命的方法，對(duì)于培育百合花壽命提高的百合新品種具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101302518SQ20081003957
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者唐東芹, 唐克軒, 月 王, 許潔婷 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)