專利名稱：一種花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子序列，含有該啟動(dòng)子的重組核酸序列、構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)，及其驅(qū)動(dòng)功能基因在植物花藥內(nèi)特異性表達(dá)的用途。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢(shì)的利用是提高作物產(chǎn)量和改良作物品質(zhì)的重要途徑之一。近年來在利用基因工程手段培育植物雄性不育系方面已有不少成功的報(bào)道。而花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子是構(gòu)建雄性不育的重要元件，目前已報(bào)告的用于雄性不育表達(dá)載體構(gòu)建的雄性器官特異表達(dá)啟動(dòng)子多為來自煙草或擬南芥等雙子葉的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子大都難以在單子葉農(nóng)作物中表達(dá)。
RA8基因啟動(dòng)子是目前分離的少數(shù)幾個(gè)水稻花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子之一，它不僅在花藥絨氈層表達(dá)，而且在內(nèi)層和連接處都有表達(dá)，除此外RA8在絨氈層降解后，在花粉囊仍然有表達(dá)，RA8基因可以歸為花藥晚期表達(dá)基因。目前報(bào)道的RA8基因啟動(dòng)子較少，加強(qiáng)RA8基因啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用對(duì)利用基因工程創(chuàng)制水稻、小麥等單子葉未本科作物新型雄性不育系材料將有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的序列如下本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含有上述啟動(dòng)子的重組核酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含有上述重組核酸序列的構(gòu)建體。本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種含有上述構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了上述啟動(dòng)子、含有該啟動(dòng)子的重組核酸序列、構(gòu)建體或表達(dá)系統(tǒng)在驅(qū)動(dòng)功能基因在植物花藥中特異表達(dá)的用途。
在本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書中使用的以下術(shù)語具有如下的含義
"變體"是指對(duì)一個(gè)目的DNA序列進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)堿基的任何取代、變異、修飾、
替換、缺失或者添加所產(chǎn)生的序列，該序列仍然表現(xiàn)出類似于所述目的DNA序列的活性。"片段"是指基本DNA序列的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，其仍然具有類似于基本DNA序列的活性。
本發(fā)明人根據(jù)水稻花藥特異表達(dá)iL48基因序列設(shè)計(jì)引物，從水稻(Oo^^W/^L.)品種日本晴中克隆得到水稻花藥特異表達(dá)基因啟動(dòng)子序列7*2，該序列為基因翻譯起始位點(diǎn)上游828 bp的片段，具有啟動(dòng)子特征序列TATA盒TATAAATA和真核生物啟動(dòng)子特征序列CAAT框。利用該啟動(dòng)子與報(bào)告基因GFP構(gòu)建植物表達(dá)載體pl304-mp，采用基因槍法轉(zhuǎn)化煙草花藥、葉片和柱頭。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果表明，T^2啟動(dòng)子在花藥中有明顯的表達(dá)，而在花藥以外的其他組織和器官，如在轉(zhuǎn)化的葉片和柱頭中沒有表達(dá)。因此，T^2是一個(gè)花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子，并且可以在煙草花藥中有效表達(dá)，花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子可用于植物基因工程領(lǐng)域。


圖1為花藥特異啟動(dòng)子Tsp2擴(kuò)增結(jié)果，其中M為DL2000marker， 1為以水稻日本晴為模板的PCR產(chǎn)物，2為空白模板對(duì)照；圖2為Tsp2-GFP表達(dá)載體構(gòu)建；
圖3為含有Tsp2啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)化煙草花藥GFP瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果；圖4為未轉(zhuǎn)化的煙草花藥對(duì)照；
圖5為含有Tsp2啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)化煙草葉片GFP瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果；圖6為含有Tsp2啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)化煙草柱頭GFP瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:rsp2啟動(dòng)子的克隆
1. 基因組DNA的提取采用CTAB法提取水稻品種日本晴基因組DNA。
2. 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增7^2啟動(dòng)子
取約100ng基因組DNA作為模板，以引物raup (5 ' -AGCAATGGCGTGCAGGGAGTTTGATA-3')禾卩radn (5 ' -GGGAGGAGCTGGAAGGAGAAGATGGA-3 ')為引物，進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。具體體系和反應(yīng)條件如下
iox反應(yīng)緩沖液5uL
25mM MgCl24"
10mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)1"
raup OOu M)2uL
radn (10uM)2uL
模板
Taq DNA聚合酶0.5 UL
總體積50 PL
PCR反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94'C變性1分鐘，50'C復(fù)性l分鐘，72'C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C終延伸8分鐘。
3. 片段的克隆取1 " LPCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按TaKaRa公司產(chǎn)品pMD18-T vector試劑盒說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，在含有氨芐青霉素U00ug/PL)的LB培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)過夜，挑取抗性菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
4. 質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行PCR鑒定和酶切分析。
5. 序列測(cè)定由重慶醫(yī)科大學(xué)感染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。PCR擴(kuò)增得到800bp左右的特異性片段(見圖l)，序列分析結(jié)果表明，該序列具有SEQ IDN0:1的特征。該片段長(zhǎng)828bp，在726 bp處有啟動(dòng)子的特征序列TATA盒TATAAATA，在828 bp后為起始密碼子ATG，與已知W8基因一致。此外，該序列還具有真核生物啟動(dòng)子的特征序列CAAT框。實(shí)施例2:表達(dá)載體的構(gòu)建
1.根據(jù)上述序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建植物表達(dá)載體的引物
正向引物ragup: 5'-GCCGGTACCGCTACTAGGCGTTCG-3'
反向引物ragdn: 5'-GCCAGATCTGGGAGGAGCTGGAA-3'其中上游有《;wl酶切位點(diǎn)，下游有Sg/II酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。
以含有Z^2啟動(dòng)子的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)體系和程序同實(shí) 施例1 。
2. 取1 y L PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按TaKaRa公司產(chǎn)品 pMD18-T vector試劑盒說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，在含有氨芐 青霉素(100ug/uL)的LB培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)過夜，挑取抗性菌落，在LB液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行PCR鑒定和酶切分析。
3. 用AT/wI和兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將啟動(dòng)子從pMD18-T載體上切下，與相同酶酶 切下CaMV35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1304連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)胞，然后在卡那青 霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析，將重組陽性 克隆命名為pl304-rap (見圖2)。
實(shí)施例3:含有T印2啟動(dòng)子的表達(dá)載體基因槍法轉(zhuǎn)化煙草
1. 采集煙草葉片和花蕾，剝離花藥，用70%的乙醇將受體表面消毒，將葉片切成小 塊，將花藥切成2 3段，在無菌條件下，將樣品置于不含激素MS固體培養(yǎng)基上，樣品集 中在3cn^面積內(nèi)。
2. 微彈載體的制備、質(zhì)粒包被以及基因槍具體操作按BioRad公司Biolistic Partical Delivery System (PDS-1000/He)的說明書進(jìn)行，可裂膜壓力為1100Pa，耙材料至可裂膜距離 為9cm，按每槍8uL(質(zhì)粒和金粉)混合液轉(zhuǎn)化樣品，每皿轟擊2次。
實(shí)施例4: 7ip2啟動(dòng)子的活性檢測(cè)
1. 基因槍轟擊后的煙草花藥、葉片和柱頭繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
2. 于熒光體式鏡下，選取488nm的藍(lán)光激發(fā)，觀察轉(zhuǎn)化后組織和對(duì)照組織中GFP的 表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)絨氈層有綠色熒光的表達(dá)，而花藥其它部位及葉片未見綠色熒光表達(dá)(見 圖3、 4、 5、 6)。SEQUENCE LISTING
〈110〉中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所
〈120〉 一種花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子及其用途
<130〉說明書
〈160〉 5
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 828
〈212〉 腿
〈213〉 0ryza sativa
〈400〉 1
agc犯tggcgtgcagggagtttgatactttgatgcactag ctagctactaggcgttcgtt60
ccatgtcgctctcactgccgtgcg犯atgtgccatgattcctgcatgcatcatcgccaag120
attatattcctcacctttttttttcctattggtcctagttgtctggtttg180
gcsggtgctgagaagctagctggtgsg組tttgaag犯tttgagtttta240
gttcatttttccagattxtastttttataatttaggt^aaagctggact300
gtttgggagcttctgtcagccggagattctgcagctgctagaagcttccc360
cctagttgtactccagctgatcgattcactctattttatatgcaccttgc420
tctctagctt3tca肌cgtagccaagacttgaBttttaaagcttaaattgattttgatgt480
tcttttcatcgtaattcacttaccgacctt3gtCggC3tttgaattttta540
ttagagctgattttgatttttttttcagcggaatttattttcacgtatgtaasagtttta600
ccta/taaattattaattttcagcggagt犯gcattagtgttatgggttataatcatctgg660
tatgctt冊(cè)aatctctttacttggacttagttgggac犯ttgctaatgcattctcgtgcc720
ceitctctataaatacggcctgctagctttgctcttgkatctgcacacaagaactagctgc780
aaagtcctcaaggcg謀ggcctccatcttctccttccagctcctccc828
〈210〉 2
〈211〉 26
〈212〉 ■
<213〉 Oryza sativa
〈400〉 2
agc組ggcgtgcagggagtttgata26
〈210〉 3
<211〉 26
<212> DNA
〈213〉 Oryza sativa
〈400〉 3
gg犯ggsg冊(cè)gatgga26
〈210〉 4
<211> 24
〈212〉 廳
〈213〉 Oryza sativa
〈400〉 4
gccggtaccgctactaggcgttcg24
〈210〉 5
〈211〉 23
<212〉 DNA
〈213〉 Oryza sativa
〈400〉 5
gccagatctgg犯2權(quán)利要求
1.一種花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其功能等價(jià)物、變體或者片段，具有如下所示DNA序列的一部分AGCAATGGCGTGCAGGGAGTTTGATACTTTGATGCACTAGCTAGCTACTAGGCGTTCGTTCCATGTCGCTCTCACTGCCGTGCGAAATGTGCCATGATTCCTGCATGCATCATCGCCAAGATTATATTCCTCACCTTTTTTTTTCCTATTGGTCCTAGTTGTCTGGTTTGGGAGGTTAAAATTATGAAAAGCAGGTGCTGAGAAGCTAGCTGGTGAGAATTTTGAAGAATTTGAGTTTTAGTTCATTTTTCCAGATTCTACAAATTACAGATTTTTATAATTTAGGTAAAAAGCTGGACTGTTTGGGAGCTTCTGTCAGCCGGAGATTCTGTGAGAAGCTGCAGCTGCTAGAAGCTTCCCCAAACAGACCCCTAGTTGTACTCCAGCTGATCGATTCACTCTATTTTATATGCACCTTGCTCTCTAGCTTATCAAACGTAGCCAAGACTTGAATTTTAAAGCTTAAATTGATTTTGATGTTCTTTTCATCGTAATTCACTTACCGACCTTAGTCGGCATTTGAATTTTTAAAAATAATTTTTAGAGCTGATTTTGATTTTTTTTTCAGCGGAATTTATTTTCACGTATGTAAAAGTTTTACCTATAAATTATTAATTTTCAGCGGAGTAAGCATTAGTGTTATGGGTTATAATCATCTGGTATGCTTAAAATCTCTTTACTTGGACTTAGTTGGGACAATTGCTAATGCATTCTCGTGCCCATCTCTATAAATACGGCCTGCTAGCTTTGCTCTTGKATCTGCACACAAGAACTAGCTGCAAAGTCCTCAAGGCGAACGGCCTCCATCTTCTCCTTCCAGCTCCTCCC。
2.權(quán)^!J要求1所述的花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其功能等價(jià)物、變體或者片段，具有如下 所示DNA序列CCC。
3. —種重組核酸序列，其含有權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子或其功能等價(jià)物、變體或者 片段。
4. 權(quán)利要求3所述的重組核酸序列，含有至少一種功能基因。
5. 權(quán)利要求4所述的重組核酸序列，其中的功能基因?yàn)榭共∠x基因、抗逆性基因、核酸 結(jié)合蛋白基因、抗除草劑基因。
6. —種表達(dá)系統(tǒng)，其含有權(quán)利要求3或4或5中任一項(xiàng)重組核酸序列。
7. 權(quán)利要求1或2所述的花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其功能等價(jià)物、變體或者片段在驅(qū)動(dòng) 功能基因在植物花藥內(nèi)特異表達(dá)的用途。
8. 權(quán)利要求7所述的花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子的用途，其特征是所述的功能基因?yàn)榭共∠x 基因或抗逆性基因或核酸結(jié)合蛋白基因或抗除草劑基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。提供了一種植物花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子序列，含有該啟動(dòng)子的重組核酸序列、構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)，所述啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)功能基因在植物花藥內(nèi)特異性表達(dá)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101591661SQ200810044450
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者余懋群, 張金輝, 潘志芬, 鄧光兵, 海 龍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所