專利名稱：：水稻抗病相關(guān)基因OsDR9及其在改良水稻抗病性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因CW)i^的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。CW)i^基因是水稻抗病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子。抑制C^Z)/^基因的功能可以顯著增強(qiáng)水稻抵抗病害的能力。
背景技術(shù)：
：植物在生長(zhǎng)的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(1)抗病(主效)基因，又稱/(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，抗病基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996;Baker等，1997;Jia等，2000;Dangl和Jones，2001;Nimchuk等，2001)。抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用這類基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害一稻瘟病的抗病基因也只有大約40個(gè)；目前還沒有發(fā)現(xiàn)抵抗水稻胡麻葉斑病的抗病基因；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了?？共∠嚓P(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)、阻止信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少。因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Schenk等，2000;Zhou等，2002;Chu等，2004)或者通過篩選抗性發(fā)生改變的突變體發(fā)掘新的抗病相關(guān)基因。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)己有報(bào)道，大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。但是，水稻中雖然鑒定了很多抗病相關(guān)基因(Zhou等，2002;Chu等，2004)，這些基因在水稻抗病反應(yīng)中的作用機(jī)理、以及單個(gè)抗病相關(guān)基因是否會(huì)引起水稻抗病表型的改變都不清楚。水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。因此，了解病害的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來的損失。分離克隆抗病相關(guān)基因是利用這類基因改良植物抗病性的前提。通過農(nóng)桿菌的T-DNA插入標(biāo)簽的方法大規(guī)模分離功能基因(包括抗病相關(guān)基因)是一個(gè)行之有效的方法(Wu等，2003;Yuan等，2007)。T-DNA插入被認(rèn)為是一個(gè)隨機(jī)的事件，因而只要有足夠多的遺傳轉(zhuǎn)化植株就可以獲得飽和水稻基因組的突變體材料，即使基因組內(nèi)每個(gè)基因都可能有相應(yīng)的T-DNA標(biāo)簽插入(Aziprozi等，1997;Krysan等，1999)。本發(fā)明研究人員所在的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了約含129,000個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株的水稻T-DNA插入突變體庫(Wu等，2003;Zhang等，2006),通過篩選這些突變體可以發(fā)掘大量可以用于改良水稻的抗病相關(guān)基因。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過抑制作為抗病反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子的抗病相關(guān)基因的功能進(jìn)行水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從水稻T-DNA插入突變體中分離克隆一個(gè)抗病相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，這個(gè)基因被命名為Oy￡)i9(Ojzasa/z'vadefenseresponsive9)。本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含C^Di9基因的DNA片段，該基因負(fù)調(diào)控水稻對(duì)由稻瘟病菌(Afog"a;w汰egr&ea)引起的稻瘟病(blast)和由胡麻葉斑病菌(5^>o/anio^/zae)引起的胡麻葉斑病(Cochliobolusmiyabeanus)的抗病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQIDNO:1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQIDNO:1所示的DNA序歹U，或者其功能相當(dāng)于SEQIDNO:1所示序列的亞片段。對(duì)其序列進(jìn)行分析表明它是一個(gè)編碼功能未知蛋白的水稻新基因。抑制序列表SEQIDNO:1所示序列的表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病和胡麻葉斑病的抗性?？梢圆捎靡呀?jīng)克隆的OyZW^基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerasechainreaction)技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的6W)/9基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。本發(fā)明為增強(qiáng)水稻對(duì)真菌性病害的抗性提供了一種新的方法。這種方法是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制CW^9基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻對(duì)病原菌的抗性。采用這類轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能達(dá)到的。在本發(fā)明的實(shí)施例部分，申請(qǐng)人闡述了OsD及9基因的分離、功能驗(yàn)證和應(yīng)用過程以及該基因的特點(diǎn)。序列表SEQIDNo丄本發(fā)明分離克隆的OyZ)i^基因的序列和它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因Qs￡iW以及驗(yàn)證OsD/^基因功能的流程圖。圖2.水稻類病斑突變體02Z15AM37具有粳稻品種中花15的遺傳背景。突變體02Z15AM37和中花15的葉片取于水稻抽穗期。突變體02Z15AM37葉片上的黃褐色斑塊是類病斑。圖3.水稻類病斑突變體02Z15AM37的T2代家系和野生型對(duì)照中花15的田間抗性鑒定。"陰性植株"是從02Z15AM37的T2代家系中分離的不攜帶T-DNA插入片段的植株。(A)突變體02Z15AM37在湖北遠(yuǎn)安縣稻瘟病高發(fā)地區(qū)田間自然感染稻瘟病結(jié)果。C039是稻瘟病感病對(duì)照。(B)突變體02Z15AM37在湖北武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻實(shí)驗(yàn)基地大田自然感染胡麻葉斑病結(jié)果。圖4.(9sZ)/^基因的結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位點(diǎn)。黑色長(zhǎng)方框表示OyDi9基因的編碼區(qū)，陰影線長(zhǎng)方框表示了5'非翻譯區(qū)和3，非翻譯區(qū)，方框之間的線條表示內(nèi)含子，數(shù)值表示各個(gè)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)。"ATG"和"TAG"分別是翻譯起始密碼和終止密碼。箭頭代表進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析中所用PCR引物位置。T-DNA插入在ATG前方216bp的位置。箭頭a，b，c分別表示用來驗(yàn)證類病斑和T-DNA插入共分離的引物；a表示在T-DNA插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，b表示在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)的引物，c表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物。箭頭1、2、3、4、5、6、7、8分別表示用來驗(yàn)證ayDM基因結(jié)構(gòu)的PCR引物SPL19RTF5、SPL19RTR5、SPL19RTF4、SPL19RTR4、SPL19RTF3、SPL19RTR3、SPL19RTF6、SPL19RTR6。圖5.突變體02Z15AM37的Tl代植株T-DNA插入和類病斑表型共分離檢測(cè)。"+"表示植株形成假病斑，"一"表示植株沒有假病斑，中花15是野生型對(duì)照。圖6.突變體02Z15AM37中QsDi9基因不表達(dá)與出現(xiàn)類病斑相關(guān)。泳道1、2、3、4、5的樣品分別是野生型中花15的愈傷、突變體02Z15AM37的愈傷、中花15的葉子、突變體的葉子、突變體葉子。圖7.CW)i9基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證用遺傳轉(zhuǎn)化載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖中圖7A是pCAMBIA2301載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖7B是重組質(zhì)粒載體D中的水稻DNA插入位點(diǎn)示意圖。黑色長(zhǎng)方框表示OsD/9基因，C^Di9基因左側(cè)的粗線條表示5'非翻譯區(qū)上游的DNA序列(包含QyDi9基因的啟動(dòng)子)，QyZ)及9基因右側(cè)的粗線條表示3'非翻譯區(qū)下游的DNA序列，數(shù)值表示各個(gè)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)。RB和LB分別表示T-DNA的右邊界和左邊界。"Gt/S"表示葡糖醛酸酶基因。表示抗卡那霉素基因。圖8.OyD/^基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證。(A)遺傳轉(zhuǎn)化陰性植株(Cl)和陽性植株(C2)葉片表型。葉片取于抽穗期。(B)RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中CW)/W基因的表達(dá)。Cl是遺傳轉(zhuǎn)化陰性植株，C2、C5、C7、C10是遺傳轉(zhuǎn)化陽性植株，CK為中花15(野生型對(duì)照)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆QsZ)i^基因以及互補(bǔ)驗(yàn)證OyD及9基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例一鑒定水稻抗病的類病斑突變體和分離鑒定突變基因1.鑒定類病斑突變體病原侵染植物后通常在侵染部位導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，形成病斑(lesion)(Agrios，1988)。類病斑(lesionmimic)是在沒有病原侵染情況下形成類似病原侵染的病斑。研究證明，因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致水稻植株形成類病斑的某些基因可能是抗病相關(guān)基因(Yamanouchi等，2002;Zeng等，2004;Mori等，2007;Yuan等，2007)。因此，在水稻突變體庫中檢測(cè)形成類病斑的植株，有助于鑒定新的抗病相關(guān)基因。本發(fā)明所在單位華中農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)建了約含129,000個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株的水稻T-DNA插入突變體庫(Wu等，2003;Zhang等，2006)，為鑒定類病斑的突變體奠定了基礎(chǔ)。這些水稻突變體的創(chuàng)建采用了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，使不同突變體材料的基因組中攜帶隨機(jī)插入的由農(nóng)桿菌T-DNA作為邊界序列的外源DNA;這段外源DNA如果插入到某一基因內(nèi)或基因的調(diào)控序列(如啟動(dòng)子)內(nèi)，則基因功能喪失或表達(dá)量發(fā)生改變，植株由此可能產(chǎn)生肉眼可見的表型改變(Wu等，2003)。本發(fā)明研究人員通過觀察大田種植的水稻T-DNA插入突變體庫的突變體植株(Wu等，2003;Zhang等，2006),發(fā)現(xiàn)一個(gè)Tl代遺傳轉(zhuǎn)化家系中的部分植株上形成了肉眼可見的類病斑，其編號(hào)為02Z15AM37[水稻突變體數(shù)據(jù)庫RMD(RiceMutantDatabase,http://rmd.ncDgr.cn;Zhang等，2006)]。該突變體具有粳稻品種中花15的遺傳背景，在田間正常種植條件下從五葉期開始在葉片上自發(fā)產(chǎn)黃褐色的類病斑。其類病斑的黃褐色斑點(diǎn)大小不一，斑點(diǎn)周圍還有淺黃色的暈圈(圖2、圖3)。2.類病斑與插入的T-DNA序列共分離本發(fā)明所在單位的研究人員采用TAIL-PCR的方法(Liu等，1995)分離了水稻T-DNA插入突變體庫中部分突變體材料的T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的水稻基因組序列，即側(cè)翼序列(Wu等，2003;Zhang等，2007)，并將這些側(cè)翼序列收集在水稻突變體數(shù)據(jù)庫RMD(RiceMutantDatabase,http:〃rmd.ncpgr.cn)中；任何數(shù)據(jù)庫使用者可以通過檢索突變體的編號(hào)，査看目標(biāo)突變體是否有T-DNA插入位點(diǎn)的水稻基因組側(cè)翼序列(Zhang等，2006)。通過檢索RDM數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)突變體02Z15AM37具有94bp的側(cè)翼序列(序列表SEQIDNO:1中的122—215bp)。以這條94bp序列作模板，用BLAST方法檢索公共核苷酸數(shù)據(jù)庫(Altschul等，1997)，發(fā)現(xiàn)公共核苷酸數(shù)據(jù)庫中來自水稻品種日本晴的一條位于水稻4號(hào)染色體、長(zhǎng)147,254bp序列(核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)注冊(cè)號(hào)AL662948)的一段序列(第124,809至124,902bp處)與這條側(cè)翼序列的同源性達(dá)到96%(E分析發(fā)現(xiàn)，在突變體02Z15AM37中T-DNA插入在一個(gè)基因(本發(fā)明命名為OyDi^)的編碼區(qū)前端的5'非翻譯區(qū)中(圖4)，這個(gè)T-DNA的插入可能對(duì)其后面基因的表達(dá)產(chǎn)生影響(詳細(xì)內(nèi)容見實(shí)施例二)。為了確定突變體02Z15AM37類病斑的形成是否因?yàn)門-DNA插入在4號(hào)染色體的這個(gè)位點(diǎn)，本發(fā)明研究人員根據(jù)與02Z15AM37的側(cè)翼序列同源的AL662948的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)位于T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的PCR引物(圖4):引物a(5'-TGGAGAACCTTCTATGCCAATT-3，)和引物b(5'-GGAGCACGGCACGATGAG-3，)；另夕卜，根據(jù)T-DNA序列設(shè)計(jì)了PCR引物c(5'-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGGCAT-3'，圖4)(Wu等，2003;Zhang等，2007)。利用這三條引物，采用常規(guī)PCR方法(Wu等，2003;Zhang等，2007)分析突變體02Z15AM37類病斑是否與T-DNA插入共分離。這一分析的基本原理是在02Z15AM37的純合突變體(一對(duì)同源染色體中都有T-DNA的插入)植株中，由于插入的T-DNA片段大約14kb(Wu等，2003)，利用引物a和引物b、采用常規(guī)PCR方法無法擴(kuò)增如此大的DNA片段，而用引物a和引物c可以擴(kuò)增一段大小己知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段；在雜合突變體(一對(duì)同源染色體中只有一條染色體中有T-DNA插入)植株中，用引物a和引物b可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組的DNA片段，用引物a和引物c也可以擴(kuò)增一段大小己知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段；在02Z15AM37的陰性(家系中分離出的沒有T-DNA插入的)植株中，用引物a和引物b可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組DNA片段，但是用引物a和引物c不能夠擴(kuò)增DNA片段。本發(fā)明對(duì)10株02Z15AM37家系的Tl植株進(jìn)行了上述PCR分析。結(jié)果顯示其中7株形成了類病斑的植株是純合突變體，3株沒有類病斑的植株中有2株是陰性植株，1株是雜合突變體(圖5)。這些結(jié)果說明02Z15AM37家系中類病斑的形成與T-DNA插入在一對(duì)同源染色體上共分離。將Tl代植株的種子種植得到T2代植株，進(jìn)一步分析T2代植株的類病斑表型是否與T-DNA插入共分離。分析發(fā)現(xiàn)來源于純合T1植株的T2后代不再分離，表型一致；而來源于雜合T1植株的T2后突代出現(xiàn)3:1的表型分離，其中大約1/4的植株出現(xiàn)類病斑，而大約3/4的植株沒有類病斑。使用上述同樣的方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明T-DNA插入在一對(duì)同源染色體上與類病斑表型共分離。由此證明，這個(gè)突變體02Z15AM37是由于T-DNA插入造成的單位點(diǎn)隱性突變。因此，我們可以根據(jù)02Z15AM37家系的植株是否形成類病斑確定純合T-DNA插入突變體。3.突變體02Z15AM37對(duì)水稻病原真菌的抗性增強(qiáng)稻瘟病由真菌一稻瘟病菌引起，是水稻的三大重要病害之一。在湖北省遠(yuǎn)安縣的稻瘟病自然發(fā)病圃中種植02Z15AM37的T2代純合植株。發(fā)現(xiàn)與對(duì)應(yīng)于02Z15AM37的野生型水稻品種中花15和高感稻瘟病的對(duì)照品種C039相比，所有具有類病斑的02Z15AM37植株高抗稻瘟病，它們的葉片上僅有及少數(shù)由稻瘟病菌侵染所至的點(diǎn)狀病斑；而所有不形成類病斑的02Z15AM37植株(T2代植株中分離出的不攜帶T-DNA插入片段的植株)、中花15和C039公共植株高感稻瘟病，它們的葉片上形成大量黑褐色的病斑，有的葉片部位許多病斑連接成片(圖3A)。胡麻葉斑病也是由真菌引發(fā)的水稻病害。目前還未見有關(guān)抗胡麻葉斑病的水稻抗性基因的報(bào)道。本發(fā)明研究人員在武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻實(shí)驗(yàn)基地的大田種植02Z15AM37的T2代純合植株時(shí)，發(fā)現(xiàn)中花15和所有不形成類病斑的02Z15AM37植株(T2代植株中分離出的不攜帶T-DNA插入片段的植株)都感染了胡麻葉斑病，它們的葉片上出現(xiàn)典型的點(diǎn)狀黑色病斑(圖3B);而所有形成類病斑的02Z15AM37植株都抗胡麻葉斑病。實(shí)施例二確定O^)及9基因結(jié)構(gòu)以及類病斑與0^)及9基因表達(dá)的關(guān)系1.Os/)及9基因結(jié)構(gòu)分析禾廿用GENSCAN(http:〃genes.mitedu/GENSCAN.html)、GeneFinder(http:〃genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml)、GeneFeatureSearches(http:〃dot.imgen.bem.tmc.edu:9331/)、GeneMark(http:〃genemark.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)等多個(gè)基因結(jié)豐勾的預(yù)測(cè)軟件和BLAST分析方法(Altschul等，1997)，分析預(yù)測(cè)來源于水稻品種日本晴的一條基因組序列AL662948(實(shí)施例一中的第2節(jié))中與突變體02Z15AM37的側(cè)翼序列同源的序列以及兩側(cè)的序列的結(jié)構(gòu)特征。分析結(jié)果顯示，在突變體02Z15AM37中，T-DNA插入在一個(gè)預(yù)測(cè)的基因內(nèi)，本發(fā)明將這個(gè)基因命名為OyDi9(0;;加^^wdefenseresponsive9)。本發(fā)明研究人員根據(jù)預(yù)測(cè)的基因的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了8條PCR弓|物SPL19RTF5(5，-CCACCGTCCTGTCTCGCTCTT-3，)、SPL19RTR5(5，-TCTTCCTCCTCGGGCTCCTC-3，)、SPL19RTF4(5，陽GAGGAGCCCGAGGAGGAAGA-3，)、SPL19RTR4(5'-GCAGGCAGGCGGTGAAT-3，)、SPL19RTF3(5，-ACGACCGAGACCTTCTTGTAT-3，)、SPL19RTR3(5，-AGGAAATGGGCCATGCTA-3，)、SPL19RTF6(5，-CGTGCCGTGCTCCACGCT-3')、SPL19RTR6(5'-GGATCAATTCTGAACATCAGATCA-3，)(圖4)。采用PCR和反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR方法，通過比較C^Di^基因的基因組序列和cDNA序列驗(yàn)證該基因的5'末端非翻譯區(qū)(untranslatedregion,5'-UTR)序列、3'末端非翻譯區(qū)(3'-UTR)序列和內(nèi)含子剪切位點(diǎn)。具體分析方法如下采用TRIzolReagent(購自美國Invitrogen公司)，根據(jù)公司提供的使用說明書從粳稻品種中花15中抽提總RNA;將1~5pg上法得到的總RNA用DNaseI(Invitrogen,美國)處理30分鐘以去除基因組DNA污染，然后參照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)15寡聚引物和SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶(購自美國Invitrogen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用上述PCR引物擴(kuò)增cDNA。用美國AppliedBiosystems公司的測(cè)序試劑盒，以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國AppliedBiosystems公司)對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。序列拼接后得到一長(zhǎng)1709bp的cDNA序列。這條1709bp序列對(duì)應(yīng)于序列表SEQIDNO:l所示序列的1—881、882—1147、3364—3424、4064—4151、4225—4637bp處，它包括完整的(^Di9基因的編碼序列。對(duì)照比較OsDi9的基因組序列和cDNA序列，OyZ)i9基因全長(zhǎng)4637bp，由4個(gè)外顯子組成，分別位于序列表SEQIDNO:1所示序列的1—1147、3364—3424、4064—4151、4225一4637bp處；其編碼序列位于第一個(gè)外顯子中，位于序列表SEQIDNO:1所示序列的339—878bp處(圖4)。OyZ)i^基因的5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)338bp，位于序列表SEQIDNO:1所示序列的1至338bp處；在突變體02Z15AM37中，T-DNA插入在5'非翻譯區(qū)的第122位核苷酸后(即T-DNA插入在序列表SEQIDNO:1所示序列的122和123bp之間)。OsDi9基因的3'非翻譯區(qū)長(zhǎng)828bp，被3個(gè)內(nèi)含子隔斷，分別位于序列表SEQIDNO:1所示序列的882—1147、3364—3424、4064—4151、4225—4637bp處(圖4)。OsDi9基因編碼一個(gè)由180個(gè)氨基酸組成的未知功能的新蛋白。2.類病斑與Os"及9基因不表達(dá)相關(guān)為了進(jìn)一步驗(yàn)證是C^Z)i9基因的缺失引起了突變表型，本發(fā)明研究人員同時(shí)也驗(yàn)證了OyZ)i9基因在突變體02Z15AM37和野生型植株中花15中的表達(dá)差異。總RNA的抽提釆用TRIzolReagent(購自美國Invitrogen公司)，操作方法按公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。將1~5昭上法得到的總RNA用DNaseI(Invitrogen，美國)處理30分鐘以去除基因組DNA污染，然后參照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)15寡聚引物和SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR技術(shù)中用的引物是AM37F2(5'-GCATCTGACCCTGGCTGTGT-3')禾口AM37R2(5,-AACCAGTCCAATTAATCAGGAAATG-3，)。肌動(dòng)蛋白(actin)PCR引物序列是actinF(5'曙TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3，)和actinR(5'-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3，)。T-DNA插入在C^Z)i9基因5'UTR區(qū)，應(yīng)該導(dǎo)致OyDi9基因不能表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，野生型中花15的愈傷和葉片組織中OsDi9基因表達(dá)正常，而突變體02Z15AM37的愈傷和葉片組織中沒有檢測(cè)到Oy"i^基因的表達(dá)，說明ay"i^基因的表達(dá)缺失和突變體類病斑表型相關(guān)。實(shí)施例三0S2)及9基因的功能互補(bǔ)驗(yàn)證本發(fā)明研究人員采用遺傳轉(zhuǎn)化方法將包含OyDi9基因及其自身啟動(dòng)子的DNA片段導(dǎo)入突變體02Z15AM37中。所用遺傳轉(zhuǎn)化載體是pCAMBIA2301(圖7A)。pCAMBIA2301載體是國際上常用的植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004)的系列載體，由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈(zèng)。遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用常規(guī)重組質(zhì)粒構(gòu)建方法(Sambrook和Russell，2001)。主要步驟是采用限制性內(nèi)切酶消化的方法，將包含有OyDi9基因的水稻品種日本晴的BAC克隆OSJNBa0060B20用限制性內(nèi)切酶五coRI和力al進(jìn)行酶切，獲得包含有OyZ)W基因和它自身啟動(dòng)子的10.5kb片段；同時(shí)，用&oRI和力al酶切遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2301;酶切完畢，用氯仿:異戊醇(24:1體積比)混和液抽提、純化酶切產(chǎn)物。然后用去磷酸化酶Alk對(duì)純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理。用包含OyD/^基因的酶切片段和去磷酸化的載體做連接反應(yīng)。通過酶切和PCR篩選陽性克隆。對(duì)篩選到的陽性克隆用轉(zhuǎn)化載體上的特異PCR引物P2301F(5,-TCACTCATTAGGCACCCC-3，)禾卩P2301R(5，-CCTCTTCGCTATTACGC-3，)引物進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化片段的正確性。獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為D(見圖7B)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994)將D導(dǎo)入類病斑突變體02Z15AM37。本發(fā)明共獲得獨(dú)立遺傳轉(zhuǎn)化水稻植株11株，其中6株轉(zhuǎn)化植株沒有類病斑(圖8A)。用RT-PCR方法(PCR引物是QyDi9基因的特異引物AM37F2和AM37R2)分析轉(zhuǎn)基因植株中OsDi9基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表型恢復(fù)的植株(沒有類病斑)中CWM9基因的表達(dá)也得到了恢復(fù)(圖8B)。進(jìn)一步說明C^Di9基因的突變引起了類病斑表型。這些結(jié)果說明基因的編碼產(chǎn)物是水稻抗病反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，抑制Oy/)/9基因表達(dá)可增強(qiáng)水稻對(duì)真菌病害的抗病性。參考文獻(xiàn)AgriosGN(1988)PlantPathology,3rdEd.AcademicPressInc.,SanDiegoUSA.AltschulSF,MaddenTL,SchafferAA,ZhangJ,ZhangZ,MillerW,LipmanDJ(1991)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.25:3389-3402.AzpirozLR,FeldmannKA(1997)T-DNAinsertionmutagenesisiny4raZnWo/757J:goningbackandforth.TrendsGenet.13:152-156.BakerB,ZambryskiP,StaskawiczB,Dinesh-KumarSP(1997)Signalinginplant-microbeinteractions.Science276:726-733.ChuZ,OuyangY，ZhangJ,YangH,WangS(2004)Genome-wideanalysisofdefense-responsivegenesinbacterialblightresistanceofricemediatedbytherecessiveigeneMol.Genet.Genomics271:111-120.DanglJL,JonesJDG(2001)Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection.Nature411:826-833.HieiY,OhtaS,KomariT,KumashiroT(1994)Efficienttransformationofrice(Oyzasa"vaL.)mediatedby爿gra6a"m',andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ.6:271-282.JiaY,McAdamsSA,BryanGT，HersheyHP,ValentB(2000)Directinteractionofresistancegeneandavirulencegeneproductsconfersriceblastresistance.EmboJournal19:4004-4014.KauffmanHE,ReddyAPK,HsiehSPY,MercaSD(1973)AnimprovedtechniqueforevaluatingresistanceofricevarietiestoXanthomonasoryzae.PlantDis.Rep.57:537-541.KrysanPJ，YoungJC,andSussmanMR(1999)T-DNAasaninsertionalmutagenin爿ra&V/o;血PlantCell11:2283-2290.LinYJ，ZhangQ(2005)Optimisingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice.PlantCellRep23:540-547.LiuYG,WhittierRF(1995)ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomewalking.Genomics25:674-681.McGinnisK,ChandlerV,ConeK,KaepplerH,Ka卿lerS,KerschenA，PikaardC,RichardsE，SidorenkoL,SmithT，SpringerN，WulanT(2005)Transgene-inducedRNAinterferenceasatoolforplantfunctionalgenomics.MethodsEnzymol392:1-24.MoriM,TomitaC,SugimotoK,HasegawaM，HayashiN,DubouzetJG,OchiaiH,SekimotoH，HirochikaH，KikuchiS(2007)IsolationandmolecularcharacterizationofaSpottedleaf18mutantbymodifiedactivation-tagginginrice.PlantMolBiol.63:847-860.NakaiK，KanehisaM(1991)Expertsystemforpredictingproteinlocalizationsitesingram-negativebacteria.Proteins11:95-110.NimchukZ，RohmerL，ChangJH，DanglJL(2001)Knowingthedancerfromthedance:R-geneproductsandtheirinteractionswithotherproteinsfromhostandpathogen.Currentopinioninplantbiology4:288-294,SambrookJ,RussellDW(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork.SchenkPM，KazanK,WilsonI,AndersonJP,RichmondT，SomervilleSG,MannersJM(2000)CoordinatedplantdefenseresponsesinArabidopsisrevealedbymicroarrayanalysis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica97:11655-11660.SmithNA，SinghSP，WangMB,StoutjesdijkPA，GreenAG,WaterhousePM(2000)Geneexpression-Totalsilencingbyintron-splicedhairpinRNAs.Nature407:319-320.TangXY,FrederickRD，ZhouJM，HaltermanDA，JiaYL，MartinGB(1996)InitiationofplantdiseaseresistancebyphysicalinteractionofAvrPtoandPtokinase.Science(NewYork,N.Y274:2060-2063.SunX，CaoY,YangZ，XuC,LiX,WangS,ZhangQ(2004)Za26,ageneconferringresistancetoXanthomonasoryzaepv.oryzaeinrice，encodingaLRRreceptorkinase-likeprotein.PlantJ.37:517-527.WuC,UX,YuanW,ChenG,KilianA,LiJ,XuC,LiX,ZhouDX,WangS，ZhangQ(2003)Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.Plant丄35:418-427.YamanouchiU，YanoM，LinH,AshikariM,YamadaK(2002)Aricespottedleafgene,Spl7，encodesaheatstresstranscriptionfactorprotein.ProcNatlAcadSci.99:7530-7535.YuanB,ShenX,LiX，XuC，WangS(2007)Mitogen-activatedproteinkinaseOsMPK6negativelyregulatesricediseaseresistancetobacterialpathogens.Planta226:953-960.ZengLR,QuS,BordeosA，YangC,BaraoidanM,YanH,XieQ,NahmBH,LeungH,WangGL(2004)Spottedleafll,anegativeregulatorofplantcelldeathanddefense,encodesaU-box/armadillorepeatproteinendowedwithE3ubiquitinligaseactivity.PlantCell16:2795-2808.ZhangJ，F(xiàn)engQ,JinC,QiuD，ZhangL，XieK,YuanD,HanB,ZhangQ，WangS(2005)Featuresoftheexpressedsequencesrevealedbyalarge-scaleanalysisofESTsfromanormalizedcDNAlibraryoftheeliteindicaricecultivarMinghui63.PlantJ.42:772-780.ZhangJ,GuoD，ChangY,YouC,LiX，DaiX,WengQ,ZhangJ,ChenGLiX,LiuH,HanB，ZhangQ,WuC(2007)Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.PlantJ49:947-959.ZhangJ,LiC，WuC,XiongL,ChenGZhangQ，WangS(2006)RMD:aricemutantdatabaseforfunctionalanalysisofthericegenome.Nucl.AcidsRes.34:D745-D748.ZhouB,PengKM,ChuZH,WangSP,ZhangQF(2002)Thedefense-responsivegenesshowingenhancedandrepressedexpressionafterpathogeninfectioninrice(Oryz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技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及包含水稻抗病相關(guān)基因OsDR9的DNA片段的分離克隆和功能驗(yàn)證。通過抑制水稻中OsDR9基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病和胡麻葉斑病的抗性，證明OsDR9基因在水稻抗真菌病害反應(yīng)中是負(fù)調(diào)控因子，可以通過抑制OsDR9基因表達(dá)培育抗病水稻品種。文檔編號(hào)A01H5/00GK101250535SQ20081004723公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月7日優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日發(fā)明者丁新華,王石平申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)