專利名稱：水稻葉片衰老特異性啟動(dòng)子的鑒定及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程和水稻分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一個(gè)葉片衰老特異誘導(dǎo)表達(dá)的水稻啟 動(dòng)子的克隆及其在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是人類最重要的糧食作物之一。雖然目前雜交稻的推廣暫時(shí)解決了人類的糧食危機(jī)，但是目前生 產(chǎn)上廣泛使用的一些優(yōu)良雜交稻組合存在著一個(gè)重要的缺陷生育后期葉片易早衰，導(dǎo)致光合能力降低， 庫大源不足，造成結(jié)實(shí)率低、充實(shí)度不良的問題。葉片是植物進(jìn)行光合作用，吸收水和C02產(chǎn)生能量的重 要場所，也是植物體合成氨基酸、抗氧化劑、各種營養(yǎng)物質(zhì)的工廠。 一旦葉片衰老，其光合能力將顯著下 降，因而作物的產(chǎn)量很大程度上受到葉片衰老的影響。如果在生殖生長中后期，葉片能夠保持較長時(shí)間的 健康持綠狀態(tài)，能盡量持久地保持光合能力，并且增強(qiáng)它在籽粒充實(shí)期間的營養(yǎng)物質(zhì)輸出能力，改善籽粒 充實(shí)度，提高產(chǎn)量有重耍的意義。
植物6身細(xì)胞核基W如何調(diào)控衰老進(jìn)程，其中的分子機(jī)制尚不明確。傳統(tǒng)的方法往葉片上噴灑激素如 細(xì)胞分裂素，或是在作物結(jié)實(shí)期適當(dāng)追加氣肥，都可一定程度的延緩衰老。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在培育 持綠性水稻的策略中，采用分子遺傳調(diào)控的手段來延緩葉片衰老是一條經(jīng)濟(jì)有效且保護(hù)環(huán)境的措施。這主 要是基于激素生理學(xué)，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因手段，增強(qiáng)細(xì)胞分裂素在植物體內(nèi)表達(dá)來延緩衰老。細(xì)胞分裂素是植物 衰老調(diào)節(jié)研究最多的一種天然激素。細(xì)胞分裂素調(diào)控植物細(xì)胞分裂和分化，控制植物生長發(fā)育的多種進(jìn)程，
多:和芽的生長、營養(yǎng)信號(hào)的傳導(dǎo)、增加作物產(chǎn)量等。細(xì)胞分裂素能夠抑制核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、 蛋白酶等的活性，能延緩核酸、蛋白質(zhì)、葉綠體等的降解并且促使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向應(yīng)用部位移動(dòng)。異戊二烯合
成酶基丙/iT編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素合成的關(guān)鍵限速酶，利用從根癌農(nóng)桿菌中分離的//T基因，人們在葉片 抗衰老基因工程研究中開展了大量的工作，培育了一些持綠性植物(Smigocki, Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene. Plant Mol Biol, 1991, 16: 105-115i Li等,Genome-wide transcription analyses in rice using tiling microarrays. Nat Genet, 2006, 38: 124-129; Gan and Amasino, Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 1995， 270: 1966-1967; McKenzie, Controlled Cytokinin Production in Transgenic Tobacco Using a Copper-Inducible Promoter. Plant Physiol, 1998, 116: 969-977; Lin等,Cultivating rice with delaying leaf- senescence by PsAGn-ipt g^ne transformation. Acta Bot Sin, 2002, 44: 1333-1338; Cha.ng《f, Overproduction of Cytokinins in Petunia Flowers Transformed with Psagi2-IPT Delays CorollaSenescence and Decreases Sensitivity to Ethylene. Plant Physiol, 2003， 132: 2174-2183; Huynh 。， Regulation of flooding tolerance of SAG 12: ipt Arabidopsis plants by cytokinin. J Exp Bot, 2005, 56: 1397-1407 ;Calderini等，Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformed with the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG 12. Plant Cell Reports, 2007, 26: 611-615)。 在這些研究中，早期利用的是表達(dá)量比較高的組成型啟動(dòng)子，如CaMV35S啟動(dòng)于或玉求Ubiquitin啟動(dòng)子， 結(jié)果顯示組成型過量表達(dá)/尸r的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為細(xì)胞分裂素含量增加，葉片衰老延遲，同時(shí)植株的生 長發(fā)育形態(tài)也發(fā)生了許多不正常的變化，如葉片變小、葉型變圓，頂端優(yōu)勢喪失，不能形成根或形成的根 不能伸長鄰，后來利用熱激啟動(dòng)子Phsp70和銅誘導(dǎo)型特異后動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)芽和葉片數(shù)都明 顯增多。直到利用擬南芥衰老特異基因&4GU的啟動(dòng)子表達(dá)IPT轉(zhuǎn)化煙草，取得了比較理想的效果，轉(zhuǎn)基 因煙草葉片和花的衰老明顯延遲，開花數(shù)提高60%，種子產(chǎn)量提高50%，生物學(xué)產(chǎn)量提高40%。轉(zhuǎn)化擬 南芥、矮牽牛等同樣達(dá)到延緩衰老的效果，開花數(shù)目亦有所增加，并且抗?jié)?、抗旱性有所增?qiáng)。但是該體 系在水稻這個(gè)禾本科植物中的應(yīng)用受到物種差異的影響，只起到了持綠的效果，沒有增加光合產(chǎn)物。找到 一個(gè)水稻來源的啟動(dòng)子在特定時(shí)期特定組織中高效特異的表達(dá)細(xì)胞分裂素將對培育持綠性高產(chǎn)水稻具有 重要作用和意義。
計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展給生物信息學(xué)的研究注入新的活力，大量數(shù)據(jù)庫的建立為啟動(dòng)子的預(yù)測及鑒 定帶來方便，2008年建立了最新的真核啟動(dòng)子的數(shù)據(jù)庫(Yamamoto and Obokata，卯db: a plant promoter database. Nucleic Acids Res, 2008, 36: D977-981)?？寺?dòng)子并通過報(bào)告基因來定性或定量的分析啟動(dòng)子 活性的技術(shù)很成熟。人們己經(jīng)成功分離并驗(yàn)證了大量組成型或特異型表達(dá)的啟動(dòng)子，通過缺失分析、酵母 單雜交、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)等技術(shù)鑒定了啟動(dòng)子DNA上反式作用蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，探明一 批對組織或時(shí)空表達(dá)起調(diào)控作用的順式作用元件(Khodakovskaya等，Enhanced cold tolerance in transgenic tobacco expressing a chloroplast w -3 fatty acid desaturase gene under the control of a cold-inducible promoter. Planta, 2006， 223: 1090-1100; Cai等,Identification of novel pathogen-responsive cis-elements and their binding proteins in the promoter of OsWRKY13， a gene regulating rice disease resistance. Plant Cell Environ, 2008, 31: 86-96; Hua等,Analysis of rice genes induced by striped stemborer (Chilo suppressalis) attack identified a promoter fragment highly specifically responsive to insect feeding. Plant Mol Biol， 2007, 65: 519-530; Saha等, Characterization of vascular-specific RSsl and rolC promoters for their utilization in engineering plants to develop resistance against hemipteran insect pests. Planta, 2007, 226: 429-442 )。本發(fā)明就是利用有關(guān)分子生物 學(xué)方法，從水稻日本晴BAC文庫中克隆得到一個(gè)葉片衰老特異誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，將該啟動(dòng)子基因融合 報(bào)告基因Gt/S導(dǎo)入水稻植株中，驗(yàn)證其表達(dá)模式，鑒定特異性表達(dá)區(qū)段；構(gòu)建該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)IPT基因的 表達(dá)系統(tǒng)，篩選純合轉(zhuǎn)基因家系，證實(shí)表達(dá)該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因家系具有持綠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從水稻日本晴BAC文庫中分離并鑒定出具有葉片衰老特異 性的啟動(dòng)子，并將這些啟動(dòng)子用于水稻的基因工程改良，最終目的是提高水稻單產(chǎn)。為了便于利用，我們
創(chuàng)建了 PSAG39、 PsAG39-刷。和PSAG39493這3個(gè)包含了核心特異性區(qū)但總長度不同的啟動(dòng)子。將這些啟動(dòng)子構(gòu) 建的融合基因?qū)胨荆瑥亩@得改良的持綠性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
從水稻日本晴BAC文庫(Feng等，Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320)中鑒定和克隆得到的葉片衰老特異表達(dá)的啟動(dòng)子，申請人將其命名為PSAG39、 PSAG39.16。0和 PSA(B9,。所述的啟動(dòng)子PSAC539序列，它是序列表SEQ ID NO: l所示的序列。該啟動(dòng)子序列具有以下特 征通過利用該啟動(dòng)子所構(gòu)建的PSAC39-GC/S載體驅(qū)動(dòng)Gf/S報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng) 子在成熟的水稻葉片中有一定的表達(dá)，隨著葉片衰老程度加深其表達(dá)量逐步變強(qiáng)，當(dāng)葉片衰老程度到達(dá)晚 期時(shí)表達(dá)活性達(dá)到頂點(diǎn)；用衰老誘導(dǎo)劑脫落酸(ABA)處理30分鐘后，該啟動(dòng)子表達(dá)量明顯上升，在2 小時(shí)達(dá)到最高峰；該啟動(dòng)子在葉、莖、根、花、穎殼及未成熟種子的種皮、愈傷組織中表達(dá)，而在成熟種
子及胚乳中不表達(dá)。利用啟動(dòng)子PsAG39驅(qū)動(dòng)ffr基因在轉(zhuǎn)基因家系中表達(dá)，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)？^(339-//)^表達(dá)
系統(tǒng)的陽性轉(zhuǎn)基因水稻的葉片持綠性變化，發(fā)現(xiàn)持綠性增強(qiáng)，且這個(gè)表型與外源基因/iT的表達(dá)量是共分
離的。所述的啟動(dòng)子PsAG39-腦序列，它是序列表SEQIDNO: 3所示的序列，是由啟動(dòng)子PsAG39截短的核
心區(qū)1600 bp的序列。所述的啟動(dòng)子PsAG39493序歹lJ，它是序列表SEQIDNO: 3所示的序列，是由PSAG39-1600
核心區(qū)進(jìn)一步截?cái)嗟?93bp的序列。這兩個(gè)區(qū)段不僅具有獨(dú)立的啟動(dòng)基因表達(dá)的功能，而且在衰老的葉片
中表達(dá)模式與PsACB9相同。
本發(fā)明的具體步驟是
首先用特異性引物以PCR的方法從日本晴BAC克隆OSJNBa0052021上擴(kuò)增得到一個(gè)被命名為PSAa39
的啟動(dòng)子候選片段，將該啟動(dòng)子PsAC39候選片段與報(bào)告基因GC/S編碼序列構(gòu)建成融合基因并裝載到雙元 Ti載體上，裝配成Psao39-GC 載體，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將候選片段構(gòu)建的報(bào)告基因轉(zhuǎn)入 水稻受體中，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過組織化學(xué)染色及Northern blot分析，考察該啟動(dòng)子在葉片發(fā)育各時(shí)期 的表達(dá)變化，進(jìn)而驗(yàn)證和克隆該啟動(dòng)子。檢測結(jié)果表明在成熟的水稻葉片中有一定的表達(dá)，隨著葉片衰 老程度加深其表達(dá)量逐步變強(qiáng)，當(dāng)葉片衰老程度到達(dá)晚期時(shí)表達(dá)活性達(dá)到頂點(diǎn)；用衰老誘導(dǎo)劑脫落酸處理 30分鐘后，該啟動(dòng)子表達(dá)量明顯上升，在2小吋達(dá)到最高峰；該啟動(dòng)子在葉、莖、根、花、穎殼及未成熟 種子的種皮、愈傷組織中表達(dá)，在成熟種子及胚乳中不表達(dá)(如圖5a、圖5b和圖9所示)。采用片段缺失 的方法，我們構(gòu)建了 7個(gè)來源于PSA039的5'端缺失片段連接GC/S表達(dá)載體，分析這7個(gè)片段的衰老特異
性表達(dá)情況，結(jié)果顯示來源于該啟動(dòng)子的兩個(gè)區(qū)段PsA咖n6QQ和PSAG^柳不僅具有獨(dú)立的啟動(dòng)基因表達(dá)
的功能，而且在衰老的葉片中表達(dá)量比在綠色成熟葉片中明顯增強(qiáng)。然后用/iT基因替換掉PSACJ39-G[/S 載體上的GM，裝配成？^(339-//71載體，同樣用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將候選片段構(gòu)建的報(bào)告基因轉(zhuǎn) 入水稻受體中，獲得轉(zhuǎn)基因植株；繁殖并篩選了單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因純合家系，通過RT-PCR方法檢測/iT 在轉(zhuǎn)基因家系中是表達(dá)的，并且陽性轉(zhuǎn)基因純合家系的葉片持綠性增強(qiáng)。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 本發(fā)明鑒定了葉片衰老特異性表達(dá)的啟動(dòng)子PsA(B9及核心結(jié)構(gòu)，為基因工程和分子育種提供了新的 特異表達(dá)的啟動(dòng)子資源。
(2) 本發(fā)明可以直接應(yīng)用于水稻衰老特異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子的鑒定和克隆。
(3) 本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子PSAG39、 PsACB9-w。0和PSACJ39.493構(gòu)建抗衰老相關(guān)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提 高植物的抗衰老性，受體植物包括水稻及其他作物例如玉米、小麥、棉花、油菜或番茄等。


序列表SEQIDNO: 1，公開了本發(fā)明克隆的的包括S4G39基因5'端部分編碼序列的水稻葉片衰老特 異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO: 3是從所述的SEQ ID NO: 1核苷酸序列的克隆得到的作為另一個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)用的 核苷酸序列，長度為1637bp。
序列表SEQIDNO: 5是從所述的SEQIDNO: 1核苷酸序列的克隆得到的作為另一個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)用的 核苷酸序列，長度為494bp。
圖l:顯示的是X4G39基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件。陰影顯示的是基本啟動(dòng)子元件序列；雙下劃線序 列為擴(kuò)增基因啟動(dòng)子所用的引物序列；單下劃線序列為預(yù)測的5L4G^基因翻譯起始位點(diǎn)；預(yù)測的 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)加文本框表示，此處的堿基編號(hào)為+l;在其上游的序列編號(hào)為負(fù)，在其下游的序列編號(hào)為正；
翻譯起始位點(diǎn)ATG用陰影加文本框表示。
圖2:表示雙元載體pCAMBIA1301結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3:表示構(gòu)建好的以pCAMBIA1301為骨架的表達(dá)載體。圖中a顯示融合GC/S的表達(dá)載體(也代表
了 PSA,-湖Q或PSAG39493融合GKS的表達(dá)載體，這兩個(gè)啟動(dòng)子酶切位點(diǎn)與載體上的相對位置與PSAG39完全相同)；b顯示PsAG39融合/尸r的表達(dá)載體。PsAG39為啟動(dòng)子序列；￡C0RI、 Sg/II為將PSAG39導(dǎo)入
pCAMBIA1301時(shí)所用的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)；Sg/H 、fo氾I1為將/尸r導(dǎo)入PsA咖-GC/S所用的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)； LB、 RB分別為pCAMBIA1301中T-DNA的左邊界和右邊界；F聲為潮霉素抗性篩選基因；為報(bào)告基 因GDS (P-葡萄糖苷酸酶)；NospolyA為胭脂堿合成酶基因多聚腺苷酸序列。
圖4:顯示的是PsAG39-Gf/S轉(zhuǎn)基因植株中外源片斷的拷貝數(shù)情況。圖中M表示LECoT14 I ; 1 12 表示轉(zhuǎn)基因植株；CK表示野生型植株。
圖5:顯示的是GUS隨著葉片衰老的表達(dá)變化情況和野生型植株中基因受到ABA誘導(dǎo)的表達(dá)
情況。圖中FL表示成熟的完全伸展葉片；ES表示葉綠素含量達(dá)90n/。的早期衰老葉片；Sl表示葉綠素含 量達(dá)70%的早期衰老葉片；S2表示葉綠素含量達(dá)60y。的中期衰老葉片；S3表示葉綠素含量達(dá)40%的晚期 衰老葉片；CK表示ABA處理O分鐘的野生型葉片對照。
圖6:顯示Gf/S在全長啟動(dòng)子和7個(gè)缺失啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)情況。圖中y表示綠色成熟葉片； s表示葉綠素含量大約40"/o的晚期衰老葉片；p39表示轉(zhuǎn)PsAG39-GW的轉(zhuǎn)基因植株；f06、 f2、 f5、 f7、 f10、 fl3、 fl6依次表示的是左引物位置為-62、 -239、 -493、 -719、 -1100、 -1300、 -1600構(gòu)建融合基因的轉(zhuǎn)基因 植株。
圖7:顯示RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因T2代純合植株/iT基因表達(dá)量。圖中y表示綠色成熟葉片；s表示葉 綠素含量大約40%的晚期衰老葉片；ZH11表示野生型中花11對照；ZT1-1、 ZT2-1和ZT3-1分別表示3 個(gè)轉(zhuǎn)PsAG39-ffr中花11的陽性純合株系。
圖8: 3船39-/73『轉(zhuǎn)基因植株的持綠性檢測。圖中a表示PsAG39-7/T轉(zhuǎn)中花11植株抽穗后葉片存活 數(shù)目統(tǒng)計(jì)；b表示PsAG39-ff7轉(zhuǎn)中花11植株抽穗后倒三葉的持綠度。ZT1-1、 ZT2-1和ZT3-1分別表示3 個(gè)轉(zhuǎn)PsAG3;r/尸r中花11的陽性純合株系;ZT1隱2、 ZT2-2、 ZT3-2分別表示ZT1-1、 ZT2-1和ZT3-1所對應(yīng) 的來自于同一個(gè)TO代單株的轉(zhuǎn)基因純合陰性株系。
圖9:顯示在轉(zhuǎn)基因水稻不同組織中GUS組織染色情況(至少考察15株轉(zhuǎn)基因植株)。圖中a表示
葉片；b表示根；C表示莖桿；d表示花；e表示穎殼；f表示種皮；g表示種子；h表示愈傷組織。
圖10: 3^39-/7^轉(zhuǎn)基因株系ZT1-1和ZT1-2的單株在結(jié)實(shí)期的田間表型，左圖是ZTl-2，右圖是ZT1-1 。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:啟動(dòng)子PsAG39候選片段的獲得
利用生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)軟件BlastP (Gish等，Identification of protein coding regions by database similarity search. Nature Genet. 1993, 3: 266-272)搜索擬南芥葉片衰老特異性蛋白 SAG12在水稻基因組的最高同源序列，發(fā)現(xiàn)其位于日本晴第4染色體的BAC克隆上，克隆號(hào)為 OSJNBa0052021,該同源基因編碼的蛋白質(zhì)在NCBI上的登陸號(hào)是CAD40026，我們將之對應(yīng)的基因命名 為&4G39，它編碼半胱氨酸蛋白酶，與SAG12的蛋白質(zhì)同源性高達(dá)56。/。。利用植物啟動(dòng)子預(yù)測軟件TSSP (http:〃www.softbeny.com/beny.phtol topic=case—studyjlants)預(yù)測出的啟動(dòng)子序列位于ATG上游
2.1Kb,將其命名為PsA咖(見圖1)。
實(shí)施例2: PsACi39啟動(dòng)子候選片段和缺失片斷的轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
(1)從曰本晴BAC文庫(Feng等，Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320) 中挑取克隆OSJNBa0052021，活化培養(yǎng)后抽取其質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)表1的引物，通過PCR擴(kuò)增全長啟動(dòng) 子以及一系列5'缺失片段。PCR反應(yīng)條件94°C 5min， 94°C lmin， 58°C lmin, 72。C 2min， 30個(gè)循環(huán)， 72'C 7min。 7個(gè)5'缺失片段與全長啟動(dòng)子共用同一個(gè)右引物，它們的左引物在染色體上與基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)
的相對位置是-62、 -239、 -493、 -719、 -1100、 -1300、 -1600,根據(jù)其相對位置分別命名為PSAG39-62、 PSAG39-239、
PsAG39-柳、PSAG39-719、 PsAG39管腦、PsAG39-畫、PsAG39-l,'在每條左引物5'端都引入J CoRI酶切位點(diǎn)，右引 物5'端引入Sg/II酶切位點(diǎn)。
(2) 收集PCR產(chǎn)物，加入1/10體積的NaAC (3M， pH 5.2)和2倍體積95%乙醇，沉淀DNA;用75% 的乙醇洗滌沉淀，沉淀自然風(fēng)干后加超純水溶解。純化產(chǎn)物經(jīng)用&oRI/fig/II酶切。然后用UNIQ-10柱式 DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))回收。同樣&0111/6《/11處理 pCAMBIA1301，切除啟動(dòng)gitf基因表達(dá)的35S啟動(dòng)子，將回收產(chǎn)物構(gòu)建到酶切后的植物雙元Ti質(zhì)粒載體 pCAMBIA1301 (該載體商購自CAMBIA公司公開使用的載體，載體含有Gt/S報(bào)告基因)的多克隆位點(diǎn) 上，使報(bào)告基因GK9在啟動(dòng)子候選片段的直接控制下表達(dá)。
(3) 將上述構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿堿型的根癌農(nóng)桿菌￡^^05菌株(該菌株商購自CAMBIA公司公開使 用的農(nóng)桿菌菌株)，構(gòu)成轉(zhuǎn)化菌株。將構(gòu)建好的Ti質(zhì)粒載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法(林擁軍等，農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的牡丹江8號(hào)高效轉(zhuǎn)基因體系的建立，作物學(xué)報(bào)，2002， 28 (3 ): 294-300)轉(zhuǎn)化水稻品種"中花11"。
(4) 以質(zhì)粒psg516 (Gan等,Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science. 1995， 270: 1986-1987)為模板，設(shè)計(jì)引物p39ipt-F (5'- cggaattcagatctategatotgcgtctaattttcgg隱3')和p39ipt-R
(5'- aggtaaccctaatacattccgaatggatgac-3')擴(kuò)增/iT基因，在左引物5'端引入￡g/II酶切位點(diǎn)，右引物5'端 引入SWEII酶切位點(diǎn)(以下劃線指出)，收集PCR產(chǎn)物，以上述同樣的方法純化回收后酶切，連接到 PsAG39-GKS載體中，構(gòu)建成載體？狄( 39-//^(圖21))。隨后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株￡/^4705，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方 法(林擁軍等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的牡丹江8號(hào)高效轉(zhuǎn)基因體系的建立，作物學(xué)報(bào)，2002, 28 (3 ): 294-300)轉(zhuǎn) 化水稻品種"中花ll"(來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所商業(yè)經(jīng)營品種)。PCR反應(yīng)條件94°C 5min, 94 。C lmin， 55°C lmin， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)，72°C 7min。 實(shí)施例3:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要參照本申請人華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的"農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化操作手冊"所示的方法(林擁軍等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的牡丹江8號(hào)高效轉(zhuǎn)基因體系的建立， 作物學(xué)報(bào)，2002, 28 (3 ): 294-300)。轉(zhuǎn)化受體為水稻品種"中花ll"的成熟種子所誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組 織。經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選得到具有潮霉素抗性的愈傷，再經(jīng)過分化、生根、練苗和移栽，得 到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述
(1) 試劑和溶液縮寫
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine， 6-芐基腺嘌呤)； CN (Carbenicillin，羧節(jié)青霉素)；KT (Kinetin，激動(dòng)素)；NAA (Napthalene acetic acid，萘乙酸)； IAA (Indole-3-acetic acid,卩引哚乙酸)；2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2,4-二氯苯氧乙酸)； AS (Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate， tK角率酪蛋白)；HN (Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6max (N6大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量元素成分溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10x)配制) 硝酸鉀(KN03) 28.3 g
磷酸二氫鉀(KH2P04) 4.0 g
硫酸銨((NH4)2S04) 4.63 g
硫酸鎂(MgS04'7H20) 1.85 g
氯化鈣(CaCl2.2H20) 1.66 g
將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000 ml。
2) N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制 碘化鉀(KI) 0.08 g
硼酸(H3B03) 0.16 g
硫酸錳(MnS04'4H20) 0.44 g
硫酸鋅(ZnS04'7H20) 0.15 g
將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至IOOO ml。
3) 鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)
將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA-2H20)禾口2.78克FeSCU 7&0分別溶解，混合并用蒸餾 水定容至1000ml，至7(TC溫浴2小時(shí)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 4) 維生素貯存液(按照100X濃縮液配制) 煙酸(Nicotinic acid) 0.1 g 維生素Bl (Thiamine HC1) 0.1 g 維生素B6 (PyridoxineHCl) 0.1 g 甘氨酸(Glycine) 0.2 g 肌醇(Inositol) 10 g 加蒸餾水定容至1000ml， 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(按照10X濃縮液配制) 硝酸銨(NH4N03) 16.5 g 硝酸鉀 19.0 g 磷酸二氫鉀 1.7 g 硫酸鎂 3.7 g 氯化鈣 4.4 g 將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。
6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(按照IOOX濃縮液配制) 硫酸錳(MnS04'4H20) 2.23 g 硫酸鋅(ZnS04'7H20) 0.86g 硼酸(H3B03) 0.62 g 碘化鉀(KI) 0.083 g 鉬酸鈉(Na2Mo04'2H20) 0.025 g 硫酸銅(CuS04'5H20) 0.0025 g 氯化鈷(CoCl2. 6H20) 0.0025g 將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至IOOO ml。
7) 2，4-D貯存液(lmg/ml)的配制
稱取2，4-D100mg，用lmllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml,于室溫下保存。
8) 6-BA貯存液(lmg/ml)的配制
稱取6-BA100mg，用lmllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100
ml，室溫保存。
9) 萘乙酸(NAA) jC存液(lmg/ml)的配制
稱取NAA100mg，用lmllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml， 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 10) 嗎l哚乙酸(IAA ) Jfc存液(lmg/ml)的配制
稱取IAA 100 mg，用l ml 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml, 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 11) 葡萄糖貯存液(0.5g/ml)的配制
稱取葡萄糖125 g，然后用蒸餾水溶解定容至250m1,滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> 12) AS貯存液的配制
稱取AS 0.392 g ，加入DMSO10ml溶解，分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 13) 1N氫氧化鉀貯存液
稱取氫氧化鉀5.6 g,用蒸餾7JC溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方 1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max母液(取己經(jīng)制備好的10X濃縮液，下同) IOO毫升
N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升 Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升
維生素貯存液(取己經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
2,4-D貯存液(取上述制備好的) 2.5毫升
脯氨酸(Proline) 0.3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如12rC下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的
滅菌方法相同)。 2)繼代培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA忙存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
2,4-D貯存液 2.0毫升
脯氨酸 0.5克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至卯O毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
3) 預(yù)培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12.5毫升
N6mix母液(100X) L25毫升
Fe2+EDTA忙存液(100X) 2.5毫升
維生素IC存液(100X) 2.5毫升
2,4-D貯存液 0.75毫升
CH 0.15克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升 /皿)。
4) 共培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12.5 ml
N6mix母液(100X) 1.25ml
Fe2+EDTA Jt存液(100X) 2.5 ml
維生素貯存液(100X) 2.5 ml
2,4-D lt存液 0.75 ml
CH 0.2 g
蔗糖 5 g
瓊脂粉 1.75 g
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/ 每皿)。
5) 懸浮培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 5毫升
N6mix母液(100X) 0.5毫升
Fe2+EDTA C存液(100X) 0.5毫升
維生素貯存液(100X) l毫升
2，4-D貯存液 0.2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。 使用前加入l毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。
6) 選擇培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 25毫升
N6mix母液(100X) 2.5毫升
Fe2+EDTA lt存液(100X) 2.5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2，4-D貯存液
Q.625毫升
蔗糖 瓊脂粉
0.15克
7.5克
1.75克
加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升)分裝倒入培養(yǎng)皿 中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基 羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7) 預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 25毫升 N6mix母液(100X) 2.5毫升 Fe2+EDTA忙存液(100X) 2.5毫升 維生素貯存液(100X) 2.5毫升 6-BA貯存液 0.5毫升 KT忙存液 0.5毫升 NAA IC存液 50微升 IAA貯存液 50微升 CH 0.15克 蔗糖 7.5克 瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 毫升/皿)。
8) 分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升 N6mix母液(100X) IO毫升 Fe2+EDTA貯存液(100X) IO毫升 維生素貯存液(100X) IO毫升 6-BA貯存液 2毫升 KT貯存液 2毫升 NAA貯存液 0.2毫升 IAA貯存液 0.2毫升 CH l克 蔗糖 30克 Phytagel 3克 加蒸餾水至900毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
9) 生根培養(yǎng)基
MSmax母液(10X) 50毫升
MSmix母液(100X) Fe2+EDTA IC存液(100X) 維生素貯存液(100X) 蔗糖 Phytagel
5毫升
5毫升
5毫升
20克
3克
加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟 3.1愈傷誘導(dǎo)
1) 將成熟的中花ll水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15%氯化汞(HgCl2) 種子表面消毒15分鐘；
2) 用滅菌水洗種子4-5次；
3) 將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
4) 將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士rC。 3.2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。 3.3預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。 3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)
1) 在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌Effi4W5 (該菌株來自CAMBIA 公司公開使用的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28'C;
2) 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28。C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。 3.5農(nóng)桿菌侵染
1) 將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；
2) 調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD, 0.8-1.0;
3) 將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20。C。 3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
2) 浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；
3) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。 3.7分化
1) 將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；
2) 轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照(1500-2000Lux)下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26。C。
1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；
然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照(1500-2000Lux)下培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)溫度26'C。
3.8生根
3. 9移栽
洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤。 實(shí)施例4:利用Southern blot確定外源片段是否整合到水稻染色體組上，同時(shí)鑒定插入片斷的拷貝數(shù)。
取轉(zhuǎn)基因植株綠色幼嫩葉片抽提總DNA轉(zhuǎn)膜，以Gf/S基因序列為探針進(jìn)行Southern雜交，大樣的總 DNA提取采用CTAB法(Rogers and Bendich, Extraction of DNAfrom milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol Biol, 1985， 5: 69-76)，轉(zhuǎn)膜、Southern雜交參照Zhou等的方法(Zhou 等,The defense responsive genes showing enhanced and repressed expression after pathogen infection in rice (Oryza sativa L). 2002, Science China (Series C), 45: 449-467)。 Southern雜交所用的探針是雙元載體 pCAMBIA1301骨架上的潮霉素基因的部分序列，擴(kuò)增這段探針的引物是hpt-F(5'-atttgtgtacgcccgacagt-3') 和hpt-R (5'- ggatatgtcctgcgggtaaa-3')。檢測結(jié)果如圖4所示，這13株全長啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化單株中T-DNA插 入位點(diǎn)都不一樣，說明它們發(fā)生的轉(zhuǎn)化事件都是獨(dú)立的；其中1、 3、 7、 9、 11號(hào)單株是單拷貝插入的， 對于后代分離轉(zhuǎn)基因純合株系非常有利。
實(shí)施例5: Northern blot方法分析啟動(dòng)子PSAG39的時(shí)空表達(dá)特異性和響應(yīng)ABA的情況
(1) 在中花ll分蘗期葉片生長從成熟到逐漸衰老的不同時(shí)期(FL，成熟的完全伸展葉片；ES，葉綠素含 量達(dá)90%的早期衰老葉片；Sl，葉綠素含量達(dá)70%的早期衰老葉片；S2,葉綠素含量達(dá)60%的中期衰老葉 片；S3，葉綠素含量達(dá)40%的晚期衰老葉片)取葉片抽提總RNA，采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公 司)，提取方法根據(jù)該TRIZOL試劑說明書。轉(zhuǎn)模后以GOT基因序列的特異區(qū)段為探針進(jìn)行Northern雜交， 鑒定該基因的時(shí)空表達(dá)模式(見圖5a所示)。用來擴(kuò)增GC/S探針的引物是GUS-F (5'-gggcgaacagttcctgatta -3')禾Q GUS-R (5'- cgaaatattcccgtgcactt -3')。
(2) 對野生型中花11三葉期幼苗進(jìn)行脫落酸(ABA, lOOiaM)處理5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、 l小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)的樣品取葉片抽提總RNA轉(zhuǎn)膜，以SAG39基因的特異區(qū)段序列 為探針進(jìn)行Northern雜交，鑒定該基因響應(yīng)衰老誘導(dǎo)劑脫落酸的表達(dá)情況(見圖5b所示)。用來擴(kuò)增SAG39 特異區(qū)段探針的引物是SAG39-F (5'-acaatgaggctgcccttatg-3')禾卩SAG39-R (5'-aaaggctcacttgctcatgg-3')。
(3) 以上的雜交結(jié)果顯示PsACB9啟動(dòng)子的表達(dá)量是很高的，而且在成熟葉片中也表達(dá)，當(dāng)葉片衰老程度 到達(dá)晚期時(shí)表達(dá)活性達(dá)到高峰期，證明該啟動(dòng)子確實(shí)是葉片衰老特異性表達(dá)啟動(dòng)子。同時(shí)用衰老誘導(dǎo)劑
ABA處理野生型中花11時(shí)，基因SAG39在30分鐘后表達(dá)量明顯上升，揭示該基因參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑。
實(shí)施例6: GUS組織染色法分析PSAC339在各種組織中的表達(dá)模式
分別取載體PSAG39-GOT (其核苷酸序列見序列表SEQ ID :1所示，附圖3的結(jié)構(gòu)圖所示)遺傳轉(zhuǎn)化篩 選得到的抗性愈傷組織或者轉(zhuǎn)基因植株根、葉片、葉鞘、莖桿、穎殼、花、種子切成約0.5 CM長度的適 當(dāng)大小，浸入約200y 1的GUS染液，37'C過夜，然后用75%酒精脫色，觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)。染色液的 配方參照J(rèn)efferson等報(bào)道的方法(Jefferson等，GUS fosions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J, 1987, 6: 3901-3卯7)。結(jié)果表明GK5報(bào)告基因在P39植株葉、 莖、根、花、穎殼及未成熟種子的種皮、愈傷組織中表達(dá)，在成熟種子及胚乳中不表達(dá)(圖9)，揭示該啟 動(dòng)子可以應(yīng)用于基因工程育種改良研究。
實(shí)施例7:利用一系列5'端缺失啟動(dòng)子分析控制衰老特異性的區(qū)段
取自然衰老條件下各段缺失啟動(dòng)子(來自于實(shí)施例6所示啟動(dòng)子全長的一部分，片段長度見實(shí)施例2) 轉(zhuǎn)基因植株的綠色葉片(y)和衰老葉片(s)進(jìn)行Northern雜交，檢測Gf/S的表達(dá)情況，探明啟動(dòng)子缺 失一段后對其時(shí)空特異性活性的影響，RNA的抽提和雜交方法同實(shí)施例5。如圖6所示，p39表示轉(zhuǎn)Psacb9
的轉(zhuǎn)基因植株，f06、 f2、 f5、 f7、 f10、 f13、 fl6依次表示該缺失啟動(dòng)子的左引物位置為-62、 -239、 -493、 -719、 -1100、 -1300、 -1600。雜交結(jié)果顯示f5 (即卩8旭39.493,該啟動(dòng)子的核苷酸序列見SEQ ID NO:5)和 f16 (即PsAG3W6W),該啟動(dòng)子的核苷酸序列見SEQ ID NO:3)與全長啟動(dòng)子的表達(dá)模式一致，是衰老上升 表達(dá)的，而f06、 ￡2、 f7、 f10、 f13沒有顯示衰老特異性，而且f5的表達(dá)強(qiáng)度與全長一樣都是這一系列缺 失啟動(dòng)子中最強(qiáng)的。這說明在f5下游可能存在著正向調(diào)控衰老特異性的順式作甩位點(diǎn)，而f5上游可能存 在抑制衰老特異性的位點(diǎn)，同時(shí)f5下游的-493至-239區(qū)段可能還含有一些對增強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)起作用的順 式元件。推測fl6的下游也可能存在著正向調(diào)控衰老特異性的順式作用位點(diǎn)。
實(shí)施例8:鑒定轉(zhuǎn)pSAC39-ffr家系的持綠性
(1) 篩選轉(zhuǎn)基因純合家系利用Southern雜交的方法(參照實(shí)施例4)挑出外源片段插入是單拷貝的T0 代單株，Ti代分株系種植，種子成熟收獲后，每個(gè)株系試驗(yàn)20單株，每個(gè)單株取50粒種子，去殼后消毒
(消毒方法參照實(shí)施例3)，放在含50mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上(該生根培養(yǎng)基的成分參見上述實(shí)施例 3中9)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，7天后檢查發(fā)芽情況。同時(shí)，以未轉(zhuǎn)基因的種子進(jìn)行同樣的處理作對照。理論上， 若消毒的種子在不加潮霉素的條件下具有100%的發(fā)芽活力，則在含潮霉素的生根培養(yǎng)基上，陽性純合轉(zhuǎn) 基因單株的發(fā)芽率為100%,雜合轉(zhuǎn)基因單株的發(fā)芽率為75%左右(如果該株系后代發(fā)生異常分離，則發(fā) 芽率小于75%)，陰性純合單株的發(fā)芽率為0%。因此，如果所接種的50粒種子全部發(fā)芽，則為轉(zhuǎn)基因純 合陽性植株，如果部分發(fā)芽，則為雜合植株，如果全部不發(fā)芽，則為純合陰性植株。我們篩選得到3個(gè)轉(zhuǎn) 基因純合家系，丁2代的純合陽性植株分別命名為ZT1-1、 ZT2-1、 ZT3-1，它們所對應(yīng)的來自于同一個(gè)T0 代單株的轉(zhuǎn)基因純合陰性株系命名為ZTl-2、 ZT2-2、 ZT3-2。
(2) 檢測外源基因的表達(dá)譜取轉(zhuǎn)基因植株ZT1-1、 ZT2-1、 ZT3-1的綠色葉片(y)和衰老葉片(s)抽 提總RNA， 參照Cai的方 去(Cai， Isolation and Functional Characterization the pathogen-inducible and tissue-specific expression promoters. (Dissertation for Doctoral Degree). Wuhan: HuaZhong Agriculturial University. 2006)反轉(zhuǎn)錄成為單鏈cDNA作為模板，用引物ipt-F (5'-gcctctggtgaagggtatcat-3')和ipt-R (5'-gcgatcccatgaatcaactta-3')進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，鑒定/ZT的表達(dá)量。結(jié)果顯示，//T基因在衰老混合樣品中的 表達(dá)量要高于綠葉混合樣品，證明/ZT基因確實(shí)在衰老特異性啟動(dòng)子i^c^驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，ZT1-1的表達(dá)量 最強(qiáng)，而ZT2-1次之，ZT3-1較弱(見圖7)。
(3) 在抽穗后7、 14、 21、 28、 33、 38、 43、 48、 52、 60天分別用葉綠素測定儀SPAD-502 (MinoltaCamera Co., Japan)測定轉(zhuǎn)基因植株倒三葉的葉綠素含量，驗(yàn)證葉片的持綠性發(fā)生變化；在抽穗后5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 60天統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株的存活葉片數(shù)目，驗(yàn)證葉片的存活壽命受到影響。結(jié)果顯示， 3個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性株系倒三葉的持綠度SPAD值從抽穗后20天左右開始下降，而陰性株系從抽穗后14天已 經(jīng)開始下降，且下降速度明顯快于陽性株系(圖8a);抽穗后25天陽性株系倒三葉仍是成熟綠葉，很少 衰老，而陰性株系的倒三葉部分己經(jīng)衰老甚至死亡(圖8b)。如圖10所示(左圖是ZTl-2，右圖是ZT1-1)， 抽穗后轉(zhuǎn)基因陽性株系ZT1-1的乳熟期比轉(zhuǎn)基因陰性株系ZT1-2長。結(jié)合圖7的結(jié)果說明，轉(zhuǎn)PSAG39-/iT 基因植株的持綠性表型是與外源基因的表達(dá)量共分離的；同時(shí)我們也可以得出結(jié)論轉(zhuǎn)基因植株的持綠性
增強(qiáng)確實(shí)是由/尸r基因在衰老特異性啟動(dòng)子PSA(J39驅(qū)動(dòng)下表達(dá)造成的。表l擴(kuò)增啟動(dòng)子全長和缺失片段的引物設(shè)計(jì)
載體名引物名正向引物(5'-3') 1反向引物(5'-3') 2
Vector namePrimer nameForward primer (5'-3')1Reverse primer(5'-3')2
Psag39-GUSP39-F/Rggctct股3attcate戰(zhàn)股股gg犯gc3gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga
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PsAG39-719-GUSPf7-F/Rggctct咖attccgcacatatecaccc3agcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga
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下劃線的部分代表fcoRI的酶切位點(diǎn)。 下劃線的部分代表￡g/II的酶切位點(diǎn)。 序列表
<110〉華中農(nóng)業(yè)人學(xué)
<120〉水稻葉片衰老特異性啟動(dòng)子fr<130>
<141〉2008-07-14
<歸6
<170>Patentln version 3. 1<210〉1
〈211〉2056
<212>DNA
〈213〉水稻i (0ryza sativa)<220>
<221〉gene
<222〉(1)..(2056)
<223〉
〈220〉
<221〉CDS
〈222〉(2021).. (2056)
<223〉
<220>
<221〉promoter
<222〉(1)..(2056)
<223>
<400〉1
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鑒定及應(yīng)用
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Met Ala Met Ala Lys
15
2056
<210> 2
<211〉 12
<212> PRT
<213〉 7]<稻(0ryza sativa)
<400〉 2
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<210> 3
<211> 1638
<212> DNA
<213〉 ；K稻(Oryza sativa) <220〉
<221〉 gene
<222> (1)..(1638)
<223>
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<221〉 CDS
<222>(1603).. (1638)
<223>
<400> 3
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<210〉 4
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〈213〉 水稻(0ryza sativa)
<400> 4 Met Ala Met 1
Ala Lys Ala Leu Leu Phe Ala lie Leu 5 10
<210〉 5 <211〉 494 <212〉 DNA'
<213> 水稻(Oryza sativa) <220>
<221> gene <222> (1).. (494) <223> <220>
<221> promoter <222〉(1).. (494) <223〉 <220>
<221〉 CDS
<222〉 (459).. (494)
<223〉
<400> 5
ccaatgtgcaaaactctccataggataaac acatcactct aatcctccat tacctatgat60
aaacacat t cattccgtgtgaaccacgtct catttageca cacattcacc aaggcaaatt120
tggagcactcaaattccaattttgtattca tattcccatt caacaaaccc ccacagcata180
a/tttaaaatgtaggegtctgtgttctgcag gaaacgtacg tcctatgcac aataatttat240
ttatacgcgtatatactteacggctacgca gaetgeegtt tacacagaaa cacaacatcg300
ta,cacgcaccgtat,gtgcttacataagttc gtaccactga ctatatatac caatgcatcc360
tagttccaattcaccaaaccaaaagcagag ttcacagaag cagcagcaga gcagcaacca420acagcagctg gatcacaggt cacaaagcct gatcgacc atg gcc atg gcc aag get 476
Met Ala Met Ala Lys Ala 1 5
ctg etc ttc gcc ate etc 494 Leu Leu Phe Ala lie Leu 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213〉 水稻(Oryza sativa)
<400〉 6
Met Ala Met Ala Lys Ala Leu Leu Phe Ala lie Leu 1 5 10
權(quán)利要求
1、一種葉片衰老特異性表達(dá)的啟動(dòng)子PSAG39，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2、 一種葉片衰老特異性表達(dá)的啟動(dòng)子PsAG39掘Q，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3所示。
3、 一種葉片衰老特異性表達(dá)的啟動(dòng)子PSAe39.493，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 5所示。
4、 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子PSAra9的兩個(gè)植物表達(dá)載體，該載體是pSA039-Gfys和 P歸-/尸r。
5、 權(quán)利要求2所述的啟動(dòng)子PsAG3W6。Q的兩個(gè)植物表達(dá)載體，該載體是Ps旭39-i6。。-Gt^ 禾口 PsAG39-1600-/尸 "1。
6、 權(quán)利要求3所述的啟動(dòng)子PSAC}39.493序列的兩個(gè)植物表達(dá)載體，該載體是PsAG39-493-Gf/iS禾口 PsAG39-493隱7尸『。
7、 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的啟動(dòng)子在水稻改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。從水稻中克隆到三個(gè)葉片衰老特異性誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子P_SAG39、P_SAG39-1600和P_SAG39-493，其核苷酸序列如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示；所述啟動(dòng)子在成熟水稻葉片中有一定的表達(dá)，隨著葉片衰老程度加深其表達(dá)量逐步變強(qiáng)，當(dāng)葉片衰老程度到達(dá)晚期時(shí)表達(dá)活性達(dá)到頂點(diǎn)。本發(fā)明還公開了這三個(gè)啟動(dòng)子及其相應(yīng)表達(dá)載體的制備方法，以及通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入水稻的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101358193SQ20081004873
公開日2009年2月4日 申請日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者莉 劉, 林擁軍 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)