專利名稱：：一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得馬蹄蓮單培體植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得馬蹄蓮(Zs/tet/esc/w'sset/io/w'ca)單培體植株的方法，屬花卉育種
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：馬蹄蓮(Z朋teofec/J'sset力io;^C3)為天南星科"raceae)馬蹄蓮屬(Za/^etfescAis)多年生球根花卉，是優(yōu)良的鮮切花和盆栽花卉；馬蹄蓮的傳統(tǒng)品種開(kāi)白花，但目前市場(chǎng)上該種中也有開(kāi)其它艷麗色彩花的品種，高潔皓白或色彩艷麗、形態(tài)高雅的馬蹄蓮在花卉市場(chǎng)上占有重要的地位?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用系譜法獲得馬蹄蓮遺傳穩(wěn)定純系，該方法獲得馬蹄蓮遺傳穩(wěn)定純系需6-7代(15-20年)。該方法不僅時(shí)間長(zhǎng)，而且成本高。馬蹄蓮單培體植株在遺傳育種研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值，單培體植株經(jīng)染色體加倍，只需要一個(gè)世代(2-3年)就獲得遺傳上穩(wěn)定的純系，為F1雜交一代新品種培育提供親本材料，以及為園藝性狀遺傳規(guī)律研究提供純系，與常規(guī)系譜法獲得遺傳穩(wěn)定純系需6-7代(15-20年)時(shí)間相比，通過(guò)產(chǎn)生單培體植株而獲得純系是有效加速育種材料的純化與育種進(jìn)程的一條途徑。另一方面，馬蹄蓮單培體植株是基因工程中遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體材料，也是無(wú)性系突變體篩選的理想材料，目的基因轉(zhuǎn)化的單倍體，以及產(chǎn)生突變的單倍體，經(jīng)染色體加倍后，基因型得以純合，避免了后代群體中目的基因或突變基因的分離。由于基因重組，馬蹄蓮雜交品種的小孢子群體中出現(xiàn)不同基因型個(gè)體，因此對(duì)小孢子進(jìn)行再生培養(yǎng)，是獲得不同與母體品種的新種質(zhì)的一條有效途徑。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容相同的公開(kāi)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種獲得馬蹄蓮單培體植株的方法，即通過(guò)對(duì)馬蹄蓮游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，小孢子發(fā)育為單培體植株。本發(fā)明方法的具體步驟如下a.供體馬蹄蓮材料的適宜生長(zhǎng)季節(jié)為秋、冬季節(jié)，適宜生長(zhǎng)溫度為最高氣溫25'C，最低氣溫10。C;b.進(jìn)行離體培養(yǎng)的小孢子的合適發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期；C.游離小孢子的分離和純化將馬蹄蓮的雄蕊取出，放入燒杯中用1%次氯酸鈉+0.05%Tween-20消毒10min，在消毒過(guò)程中用鑷子攪動(dòng)，以去除氣泡。消毒時(shí)間到了之后，倒出次氯酸鈉溶液，無(wú)菌水洗三次，時(shí)間分別為lmin、5min、lOmin。在滅菌好的50ml小燒杯中加入2mlNLN-13%果糖培養(yǎng)基，把花藥從上述消毒的雄蕊上取出，用注射器的活塞壓碎花藥，分離小孢子；用裝有紗布的漏斗進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液于10ml離心管中，進(jìn)行離心，1000rpm，5min，棄去上清液，在沉淀物中加10mlNLN-13%果糖培養(yǎng)基，搖勻，1000rpm，5min,重復(fù)離心二次，進(jìn)行小孢子的純化，離心完畢后，加入NLN-13。/。果糖培養(yǎng)基于離心管中，混勻，以血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0X105個(gè)/ml，然后分裝至60x15mm培養(yǎng)皿，每皿裝3ml游離小孢子懸液，用封口膜進(jìn)行封口。d.游離小孢子懸液的預(yù)處理將上述分裝的懸浮在NLN-13%果糖培養(yǎng)基的游離小孢子懸液在32。C、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)入25。C、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)5天，進(jìn)行果糖預(yù)處理。e.小孢子培養(yǎng)上述果糖預(yù)處理后，更換培養(yǎng)基為NLN-13。/。蔗糖培養(yǎng)基，在25t:、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)50天，小孢子發(fā)育形成愈傷組織。f.愈傷組織分化芽:將上述愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生芽，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為B5+蔗糖30g/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L，pH5.8，培養(yǎng)條件溫度25。C，光強(qiáng)2000Lx，光照時(shí)間16小時(shí)，培養(yǎng)30天后愈傷組織分化出芽。g.芽生根芽長(zhǎng)到高4cm時(shí)，將芽置于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基配方為MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L+瓊脂7g/L，pH到5.8，在溫度25°C，光強(qiáng)2000Lx，光照時(shí)間16小時(shí)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)20天，小苗生根，形成馬蹄蓮單倍體植株。本發(fā)明對(duì)馬蹄蓮游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，小孢子發(fā)育為單培體植株，經(jīng)染色體加倍，只需要一個(gè)世代(2-3年)就獲得遺傳上穩(wěn)定的純系，與常規(guī)系譜法獲得遺傳穩(wěn)定純系需6-7代(15-20年)時(shí)間相比，通過(guò)產(chǎn)生單培體植株而獲得純系是有效加速育種材料的純化與育種進(jìn)程的一條途徑。具體實(shí)施例方式1、供體馬蹄蓮材料的合適生長(zhǎng)條件。供體馬蹄蓮材料的適宜生長(zhǎng)季節(jié)為秋、冬季節(jié)，適宜生長(zhǎng)溫度為最高氣溫25"C，最低氣溫IO'C。如昆明地區(qū)露地栽培馬蹄蓮的合適季節(jié)為秋季(9月-ll月)。2、離體培養(yǎng)小孢子的合適發(fā)育時(shí)期?；ɡ?、花藥與小孢子的發(fā)育期存在著相關(guān)性，合適的發(fā)育期是影響游離小孢子培養(yǎng)效果，以及能否成功獲得馬蹄蓮單培體植株的重要因素。小孢子處在單核靠邊期是馬蹄蓮游離小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期，此時(shí)，花蕾的尖端微露出葉柄，花序苞片呈嫩黃色，花藥呈乳白色，對(duì)該發(fā)育期的游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)能獲得馬蹄蓮單培體植株(表l)。表1離體培養(yǎng)的小3<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>3、游離小孢子的分離和純化將馬蹄蓮的雄蕊取出，放入燒杯中用1%次氯酸鈉+0.05%Tween-20消毒10min，在消毒過(guò)程中用鑷子攪動(dòng)，以去除氣泡。消毒時(shí)間到了之后，倒出次氯酸鈉溶液，無(wú)菌水洗三次，時(shí)間分別為lrain、5min、10rain。在滅菌好的50ml小燒杯中加入2mlNLN-13%果糖培養(yǎng)基，把花藥從上述消毒的雄蕊上取出，用注射器的活塞壓碎花藥，分離小孢子；用裝有紗布的漏斗進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液于10ml離心管中，進(jìn)行離心，1000rpm，5min，棄去上清液，在沉淀物中加10mlNLN-13%果糖培養(yǎng)基，搖勻，1000rpm，5min，重復(fù)離心二次，進(jìn)行小孢子的純化，離心完畢后，加入NLN-13%果糖培養(yǎng)基于離心管中，混勻，以血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0X105個(gè)/ral，然后分裝至60x15mra培養(yǎng)皿，每皿裝3ml游離小孢子懸液，用封口膜進(jìn)行封口。4、游離小孢子懸液的預(yù)處理和小孢子培養(yǎng)將上述分裝的懸浮在NLN-13%果糖培養(yǎng)基的游離小孢子懸液在32°C、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)入25。C、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)5天，進(jìn)行果糖預(yù)處理。上述果糖預(yù)處理后，更換培養(yǎng)基為NLN-13。/。蔗糖培養(yǎng)基，在25"、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)50天，小孢子發(fā)育形成愈傷組織，每培養(yǎng)皿平均產(chǎn)生3個(gè)愈傷組織；而果糖預(yù)處理3天或14天，以及果糖培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)和蔗糖培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)的小孢子未形成愈傷組織(表2)。表2果糖預(yù)處理對(duì)小孢子發(fā)育的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注調(diào)整小孢子密度至1.0Xl()S小孢子/ml，然后分裝至60x15腿培養(yǎng)皿，3ml/培養(yǎng)皿。產(chǎn)生愈傷組織數(shù)=每培養(yǎng)皿平均產(chǎn)生愈傷組織數(shù)。5.愈傷組織分化芽與形成單倍體植株將上述愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生芽，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為B5+蔗糖30g/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L，pH5.8，培養(yǎng)條件溫度25。C，光強(qiáng)2000Lx，光照時(shí)間16小時(shí)，培養(yǎng)30天后愈傷組織分化出芽，平均每個(gè)愈傷組織分化5個(gè)芽。芽長(zhǎng)到高4cm時(shí)，將芽置于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基配方為MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L+瓊脂7g/L，pH到5.8，在溫度25。C，光強(qiáng)2000Lx，光照時(shí)間16小時(shí)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)20天，小苗生根，平均每個(gè)小苗生根10條，形成馬蹄蓮植株，其中單倍體植株的比率為58.8%，其余為染色體自然加倍形成的二倍體植株。實(shí)際應(yīng)用表明本發(fā)明的方法通過(guò)對(duì)馬蹄蓮游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得小孢子發(fā)育為單培體植株；與花藥培養(yǎng)相比，游離小孢子培養(yǎng)避免了由體細(xì)胞發(fā)育成愈傷組織和植株的可能性。權(quán)利要求1、一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得馬蹄蓮單培體植株的方法，包括游離小孢子的分離和純化、游離小孢子懸液的預(yù)處理和小孢子培養(yǎng)、愈傷組織分化芽及芽生根步驟，其特征在于a.游離小孢子懸液的預(yù)處理在NLN-13％果糖培養(yǎng)基中分離和純化小孢子，并用NLN-13％果糖培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)小孢子7天，即在32℃、黑暗條件下培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)入25℃、黑暗條件下培養(yǎng)5天，進(jìn)行果糖預(yù)處理；b.小孢子培養(yǎng)游離小孢子懸液在經(jīng)上述果糖預(yù)預(yù)處理7天后，更換培養(yǎng)基為NLN-13％蔗糖培養(yǎng)基，在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)50天，小孢子發(fā)育形成愈傷組織；c.愈傷組織分化芽將上述愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生芽，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為B5+蔗糖30g/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L，pH5.8，培養(yǎng)條件溫度25℃，光強(qiáng)2000Lx，光照時(shí)間16小時(shí)，培養(yǎng)30天后愈傷組織分化出芽。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)單培體植株的方法，屬花卉育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。本方法步驟為取小孢子處在單核靠邊期的馬蹄蓮雄蕊、消毒；機(jī)械游離小孢子，用NLN-13％果糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×10⁵小孢子/ml，然后在32℃、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)游離小孢子2天，再轉(zhuǎn)入25℃、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)5天，預(yù)培養(yǎng)后更換培養(yǎng)基為NLN-13％蔗糖培養(yǎng)基，在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，小孢子發(fā)育為愈傷組織，愈傷組織經(jīng)芽分化途徑形成單倍體植株。本方法獲得的馬蹄蓮單培體植株經(jīng)染色體加倍，只需要一個(gè)世代就獲得遺傳上穩(wěn)定的純系，通過(guò)產(chǎn)生單培體植株而獲得純系是有效加速育種材料的純化與育種進(jìn)程的一條途徑。文檔編號(hào)A01H4/00GK101385441SQ200810058979公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者張樂(lè)民,楊麗麗,王世敏,鄭思鄉(xiāng)申請(qǐng)人:云南大學(xué)