專利名稱：紫竹組織培養(yǎng)基及組培快繁方法
紫竹組織培養(yǎng)基及組培快繁方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中小徑散生竹的組織培養(yǎng)基及組培快繁方 法，尤其是紫竹的組織培養(yǎng)基及組培快繁方法。背景技術：
紫竹(戶Ar〃o^acA^/7/^ra乂又名黑竹、烏竹，禾本科竹 亞科剛竹屬，散生竹種，新桿綠色，二年生桿漸變?yōu)樽虾谏?，綠 葉青翠，姿態(tài)飄逸，具有很高的觀賞價值，又是制作家具、樂器 和工藝品的優(yōu)良材料， 一直以來靠移栽母竹或竹鞭來繁殖，速度 慢、用地多、運輸不便、成本高和受季節(jié)制約。近年，探索竹類 組織培養(yǎng)和快繁技術的有志者日益增多，各有建樹。綜合竹類組 織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀，幼嫩材料誘導出愈傷組織比誘導出再生植林容 易，取自成熟竹的外植體組織誘導成胚性組織和再生植抹，難度 更大，采自于散生成熟竹外植體組織誘導出再生植抹，相對于叢 生竹而言，更是難上加難。經(jīng)檢索和市場調查，至今未見用成熟 紫竹的外植體組織誘導出再生植抹的資料^^道和相關實物問世。
發(fā)明內容
針對至今未見成熟的散生竹尤其是紫竹外植體組織誘導成 功再生植株的現(xiàn)實狀況，本發(fā)明的任務有三 一是提供一種誘導 叢生芽的培養(yǎng)基，二是提供一種誘導生根的培養(yǎng)基，三是提供整 套紫竹組織培養(yǎng)快速繁殖方法。上述任務可通過如下措施實現(xiàn)
本紫竹組織培養(yǎng)基，分為誘導叢生芽培養(yǎng)基與誘導生根培養(yǎng) 基，都以MS為基本培養(yǎng)基，是由MS加上0. 3或1或3或10mg/L 的BA即千氨基腺嘌呤再加入0. 001或0. 01或0. 1或lmg/L的 TDZ即噻二唑苯基脲，附加占總重量0. 25°/。的水晶洋菜、3%的蔗 糖配制成誘導叢生芽培養(yǎng)基；由MS加上0. 3或1或3或lOmg/L 的BA再加入1. Omg/L的NAA即ct-奈乙酸，附加占總重量0. 25% 的水晶洋菜、3%的蔗糖配制成誘導生根培養(yǎng)基。兩培養(yǎng)基的pH 值為3或4或5或5. 7或6或7。
本紫竹組織培養(yǎng)基的優(yōu)選方案是誘導叢生芽培養(yǎng)基中BA的 加入量為3mg/L、 TDZ的加入量為0. Olmg/L;誘導生根的培養(yǎng)基 中的BA的加入量為3mg/L,兩培養(yǎng)基的pH值為5。
用本紫竹組織培養(yǎng)基進行組培快繁經(jīng)過下列步驟
(1) 外植體的采集與消毒采集溫室盆栽紫竹的春天萌發(fā) 嫩莖芽，帶回實驗室，剝去桿籜，自來水沖洗2h,在稀釋10倍 的5WaC10溶液中，真空條件下浸泡10min，用無菌水沖洗兩次， 再在相同濃度的NaCIO溶液中浸泡4min，無菌水沖洗三次后， 顯微鏡下切取長約0. 5mm的莖尖組織；
(2) 叢生芽的誘導將切得的莖尖組織接種到如權利要求 1所述的誘導叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強度2500Lux、溫度25土 2°C、光照16h/d條件下，7d后芽始萌，45d后基部生出新的叢 生芽；
(3) 不定芽增殖與快繁將上述叢生芽切下，接種于如權 利要求l所述的誘導叢生芽培養(yǎng)基中，光照強度2500Lux,光照 16h/d, 25士2。C條件下，15d后伸長，繼代培養(yǎng)，100d后增殖系 數(shù)達13倍；
(4)誘導生根與移栽將伸長后的叢生芽3-4個為一叢， 分別置于300、 1000、 3000ppm的IBA即吲咮丁酸溶液中5-15min， 再分別接種到如權利要求1所述的生根培養(yǎng)基中，光照強度 2500Lux，光照16h/d， 25士2X:條件下，20d后開始生才艮，培養(yǎng) 125d后，生根率達70-90%，取生長良好的再生植株置于馴化室， 強光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基， 種植于體積比為蛭石珍珠巖泥炭-l:l:l的基質中，單個花 盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口， 一周后棄袋移入溫室栽 種即成。
本發(fā)明的有益效果是突破了成熟的中小徑散生竹，尤其是紫 竹的莖尖外植體組織誘導出再生植抹的難題， 一改傳統(tǒng)的母竹移 栽、'竹鞭移栽的方法，節(jié)省了母竹、用地面積、培植時間和運輸 成本，且不受季節(jié)的制約，為景點用竹、大面積綠化用竹提供了 快速而充足地繁殖紫竹苗的有效途徑。
具體實施方式
本發(fā)明下面結合實施例作進一步詳述我國的竹類組織培養(yǎng) 出再生植抹，尚處于起步階段，散生竹又因其器官再生能力弱， 比叢生竹更難成功。有所成就的是以芽繁芽，未經(jīng)過脫分化的方 式實現(xiàn)，而且選用的是幼年植抹、胚等組織，未見有用成年植抹 外植體組培成再生植抹的報導，眾多竹類組培實踐者公認散生竹 種組培苗生根困難。因此，本發(fā)明的主攻方向是創(chuàng)造優(yōu)良的人工 環(huán)境，從改善紫竹的組織細胞增殖、生根條件著手，來攻克散生
竹組培難點。為此，對培養(yǎng)基房料的選用、選配，濃度、pH值、 光照、溫度做了一系列對比試驗，如在配制誘導叢生芽的培養(yǎng)基 中，采用了七種培養(yǎng)基對紫竹莖尖組織進行接種，篩選出誘導率 高達42%的培養(yǎng)基；篩選出增殖系數(shù)高達13倍的培養(yǎng)基，從而 為組織細胞的增殖提供了物質^5出。針對散生竹種組培苗生根困 難的問題，先后用300卯m、 1000ppm、 3000ppm三種不同濃度的 IBA溶液中浸泡5-15min，再接種到MS+BA 3mg/L+NAA lmg/L的 生根培養(yǎng)基中，生根率達70-90%，對比后選擇1000ppm濃度、 浸泡10min的方案。將伸長后的叢芽先在IBA中浸泡的目的是因 為紫竹是最易褐化的竹種，高濃度的IBA刺激后接種到含BA細 胞分裂素的培養(yǎng)基中，能減輕褐化程度，以增強生^L能力，因此 還需再接種到本誘導生根的培養(yǎng)基中，才實現(xiàn)90%的生根率?？?之，紫竹組培出再生植抹，是對外植體的處理條件、培養(yǎng)基、基 質等進行嚴格篩選的結果。
本紫竹培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加生長素和細胞分裂 素、水晶洋菜和蔗糖，添加量選定為占培養(yǎng)基總重量O. 25%的水 晶洋菜，3%的蔗糖，培養(yǎng)基的pH值定為5.0。再在其它成分及 添加量相同情況下，按生長素與細胞分裂素成分與添加量的不 同，配制成兩種不同誘導階段的培養(yǎng)基 一是誘導叢生芽的培養(yǎng) 基為MS+BA 3+TDZ 0. 01 (單位mg/L，下同)，二是誘導生根的培 養(yǎng)基為MS+BA 3+NAA 1。上述培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。培養(yǎng)基的 pH值卜5. 7的芽增殖效果比3、 6-7的好，最佳為5。
用紫竹的莖尖組織作外植體，進行組培快繁方法的步驟如下
(采用的各數(shù)值為最佳方案的數(shù)值，因此，可視為最佳實施例):
(1) 外植體的采集與消毒采集溫室盆栽紫竹的春天萌發(fā) 嫩莖芽，帶回實驗室，剝去桿籜，自來水沖洗2h,在稀釋10倍 的5。/。NaC10溶液中，真空條件下浸泡10min，用無菌水沖洗兩次， 再在相同濃度的NaClO溶液中浸泡4min，無菌水沖洗三次后， 顯微鏡下切取長約0. 5咖的莖尖組織；
(2) 叢生芽的誘導將切得的莖尖組織接種到如權利要求 1、 2所述的誘導叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強度2500Lux、溫度 25土2。C、光照16h/d條件下，7d后芽始萌，45d后基部生出新 的叢生芽；
(3) 不定芽增殖與快繁:將上述叢生芽切下，接種于如權 利要求l、 2所述的誘導叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強度2500Lux， 光照16h/d，25土2。C條件下，15d后伸長，繼代培養(yǎng)，100d后增 殖系數(shù)達13倍；
(4) 誘導生根與移栽將伸長后的叢生芽3-4個為一叢， 置于1000ppm的IBA即叼l味丁酸溶液中浸泡10min,再接種到如 權利要求1、 2所述的生根培養(yǎng)基中，光照強度2500Lux，光照 16h/d， 25土2。C條件下，20d后開始生根，培養(yǎng)125d后，生根 率達90%,取生長良好的再生植株置于馴化室，強光20000Lux 下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于體積比為 蛭石珍珠巖泥炭-l:l:l的基質中，每單個花盆套透明塑料 袋，該袋每二天剪一小口， 一周后棄袋移入溫室栽種即成。
在對比試驗中，將細胞分裂素BA的加入量分別選擇 0. 3mg/L、 lmg/L、 3mg/L、 10mg/L，以及加與不加生長素NAA，
進行了對比試驗。在不加NAA情況下，叢生芽i秀導率達42。/。；加 入BA為3mg/L的出現(xiàn)10個叢生芽，表現(xiàn)是佳；加入NAA后均不 出芽，因此誘導叢生芽培養(yǎng)基中不能加NAA。
對細胞分裂素TDZ的加入量對比試驗中，加入量分別為 0. 001mg/L、 0. 01mg/L、 0, lmg/L、 lmg/L,都能誘導出叢生芽， 以加入量為0. Olmg/L的芽最多，因此，綜合兩種生長素加入后 誘導效果的情況，決定誘導叢生芽培養(yǎng)基選擇最佳配比為3mg/L 的BA+O. Olmg/L的TDZ。
在誘導生根培養(yǎng)基中，選細胞分裂素BA的加入量還是 3mg/L，生長素NAA的加入量為lmg/L,浸泡用的生長素IBA濃 度選1000ppm，浸泡時間10min;培養(yǎng)基最佳pH值5. 0芽的增殖 情況最好。
其它MS、水晶洋菜、蔗糖為定值，不一一細述。 用上述諸條件的培養(yǎng)下，125天后測試，紫竹組培的叢生芽 為2-4個，芽長13-16mm，才艮長10-12cm，才艮數(shù)4才艮。
權利要求
1、一種紫竹組織培養(yǎng)基，分為誘導叢生芽培養(yǎng)基與誘導生根培養(yǎng)基，都以MS為基本培養(yǎng)基，其特征是由MS+0.3或1或3或10mg/L的BA即芐氨基腺嘌呤和0.001或0.01或0.1或1mg/L的TDZ即噻二唑苯基脲，附加占總重量0.25％的水晶洋菜、3％的蔗糖配制成誘導叢生芽培養(yǎng)基；由MS+0.3或1或3或10mg/L的BA和1.0mg/L的NAA即α-奈乙酸，附加占總重量0.25％的水晶洋菜、3％的蔗糖配制成誘導生根培養(yǎng)基。兩培養(yǎng)基的pH值為3或4或5或5.7或6或7。
2、 如權利要求1所述的紫竹組織培養(yǎng)基，其特征是所說的誘 導叢生芽培養(yǎng)基中BA的加入量為3mg/L、 TDZ的加入量為 0. Olmg/L;誘導生根的培養(yǎng)基中的BA的加入量為3mg/L，兩培養(yǎng) 基的pH值為5。
3、 如權利要求1或2所述的紫竹組織培養(yǎng)基進行組培快繁的 方法，其特征是經(jīng)過下列步驟(1) 外植體的采集與消毒采集溫室盆栽紫竹的春天萌發(fā)嫩 莖芽，帶回實驗室，剝去桿籜，自來水沖洗2h，在稀釋10倍的 S。/。NaC10溶液中，真空條件下浸泡10min，用無菌水沖洗兩次，再 在相同濃度的NaClO溶液中浸泡4min，無菌水沖洗三次后，顯微 鏡下切取長約0. 5mm的莖尖組織；(2) 叢生芽的誘導將切得的莖尖組織接種到如權利要求1 所述的誘導叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強度2500Lux、溫度25士2。C、 光照l化/d條件下，7d后芽始萌，45d后基部生出新的叢生芽； (3) 不定芽增殖與快繁將上述叢生芽切下，接種于如權利 要求1所述的誘導叢生芽培養(yǎng)基中，光照強度2500 Lux，光照 16h/d，25土2。C條件下，15d后伸長，繼代培養(yǎng)，100d后增殖系數(shù) 達13倍；(4) 誘導生根與移栽將伸長后的叢生芽3-4個為一叢，分 別置于300、 1000、 3000ppm的IBA即"引咮丁酸溶液中浸泡5-15min， 再接種到如權利要求1所述的生根培養(yǎng)基中，光照強度2500 Lux， 光照16h/d， 25士2。C條件下，20d后開始生根，培養(yǎng)125d后，生 根率達90%，取生長良好的再生植林置于馴化室，強光20000 lux 下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于體積比為蛭 石珍珠巖泥炭-l:l:l的基質中，單個花盆套透明塑料袋，該 袋每二天剪一小口， 一周后棄袋移入溫室栽種即成。
全文摘要
一種紫竹組織培養(yǎng)基，由MS+3.0mg/L的BA+0.01mg/L TDZ+占總重量0.25％的水晶洋菜、3％的蔗糖配制成誘導叢生芽培養(yǎng)基；由MS+3mg/L的BA+1mg/L的NAA，再附加占總量0.25％的水晶洋菜、3％的蔗糖配制成誘導生根培養(yǎng)基，兩培養(yǎng)基的pH值為5.0。運用上述培養(yǎng)基對紫竹組培快繁的方法按四個步驟進行外植體的采集與消毒、叢生芽的誘導、不定芽的增殖與快繁、誘導生根與移栽。采用本培養(yǎng)基與配套的組培快繁方法，叢生芽誘導率達42％，不定芽增殖系數(shù)高達13倍，生根率達90％，試管苗移栽成活率達90％左右。本發(fā)明突破了成熟散生竹組培出再生植株的難題，為紫竹的庭院與景點栽種、大面積綠化，奠定了快速而充足生產竹苗的基礎。
文檔編號A01G31/00GK101336613SQ20081006338
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月12日 優(yōu)先權日2008年8月12日
發(fā)明者偉 方, 楊海蕓, 林新春, 桂仁意, 王曉芹, 黃麗春 申請人:浙江林學院