專利名稱：：黃酮和異黃酮衍生物作為抗生物污損物質(zhì)的應(yīng)用以及防止海洋生物污損的方法和涂料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)作為抗生物污損物質(zhì)的4，,5,7三羥基異黃酮，并涉及黃酮或異黃酮衍生物的抗生物污損方面的用途。本發(fā)明所涉及生產(chǎn)抗生物污損化合物微生物為殺真菌鏈霉菌
背景技術(shù)：
：在海水浸泡中的無(wú)特殊保護(hù)的船底、碼頭、浮標(biāo)和各類水下人工設(shè)施上常常會(huì)發(fā)現(xiàn)大量的海洋生物聚集，這種現(xiàn)象一皮稱為海洋生物污損，這些棲息或附著于該表面的生物被稱為海洋污損生物。全世界有記錄的污損生物多達(dá)4000余種，主要包括一些大型藻類、雙殼類軟體動(dòng)物及藤壺。大多數(shù)污損生物的幼蟲(chóng)是浮游生活，成體是附著或固著生活的。海洋生物污損會(huì)增加船舶的阻力，改變浮標(biāo)的重量，增大近海建筑物(如石油平臺(tái))的靜力載荷和動(dòng)力載荷，堵塞海中的管道設(shè)施，影響?zhàn)B殖網(wǎng)箱的水交換，并與養(yǎng)殖貝類爭(zhēng)奪附著基和辨料，影響?zhàn)B殖品種的生長(zhǎng)發(fā)育，加速金屬的腐蝕過(guò)程，導(dǎo)致海中儀表及轉(zhuǎn)動(dòng)部件失靈，還會(huì)對(duì)聲學(xué)儀器產(chǎn)生不良影響。全世界每年因生物污損所造成的損失極其巨大。以船舶為例，海洋生物污損會(huì)提高船舶航行阻力、降低航行速度而延長(zhǎng)相同航線的貨物中轉(zhuǎn)周期；縮短船舶維修周期、提高船底除污費(fèi)用、延長(zhǎng)船舶占雞時(shí)間以及縮短有效航行時(shí)間；提高燃料消耗以及對(duì)應(yīng)的污染排放；降低船舶有效載重；加速船體腐蝕、縮短船舶使用壽命等等。因此，尋找一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的防污措施顯得尤為重要。為了防止海洋生物的附著，17世紀(jì)之前，鉛是最常用的防污材料，隨后銅取而代，到目前為止，全世界應(yīng)用最為廣泛的、使用最有效的海洋防污產(chǎn)品是有機(jī)錫化合物涂料，其中以三丁基錫(TBT)為代表。它自20世紀(jì)60年代投入市場(chǎng)以來(lái)，因良好的防污效果而倍受市場(chǎng)的青睞。自20世紀(jì)中期以來(lái)，僅美國(guó)海軍就因使用TBT而每年節(jié)約1.5億美元以上。但有機(jī)錫在發(fā)揮良好防污效果的同時(shí)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。它不僅對(duì)目標(biāo)生物有極大的毒性，對(duì)海洋環(huán)境中的非目標(biāo)生物也產(chǎn)生了不良的影響，從而對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖、捕撈以及人類的健康都構(gòu)成了巨大威脅。有關(guān)研究表明，海水中有機(jī)錫的存在會(huì)干擾牡蠣的鈣代謝，使其貝殼畸形加厚，含肉量下降，降低或喪失牡蠣的市場(chǎng)價(jià)值；引起海產(chǎn)腹足類的性畸變，即雌性個(gè)體產(chǎn)生雄性個(gè)體的特征，甚至導(dǎo)致雌性個(gè)體生殖失?。贿€會(huì)影響到魚(yú)類血液內(nèi)氧氣的運(yùn)輸，使其處于缺氧狀態(tài)，阻礙魚(yú)類的生長(zhǎng)。此外，有機(jī)錫毒物可以通過(guò)蓄積在魚(yú)類、貝類、海洋鳥(niǎo)類、海洋哺乳動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)而進(jìn)入人類的食物鏈，對(duì)人體性激素分泌及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。今天，在世界各地主要航線及港口的海水、底泥和生物體中都發(fā)現(xiàn)了高濃度的TBT，并已造成水產(chǎn)減產(chǎn)，部分物種絕跡、不育和性畸變等現(xiàn)象。有機(jī)錫化合物屬于內(nèi)分泌攪亂物質(zhì)，其高毒性在于它在海洋環(huán)境中的富集作用。研究表明，TBT在水中與懸浮顆粒結(jié)合，很難降解。TBT也是被認(rèn)為是迄今為止《1入海洋環(huán)境中毒性和危害最大的化學(xué)物質(zhì)之一。自法國(guó)1982年第一個(gè)限制TBT使用后，北美、歐洲等國(guó)家都制定了相應(yīng)的法規(guī)，限制TBT在海洋中的使用。2001年，國(guó)際海事組織(IMO)通過(guò)決議，要求從2003年1月1日起在全球范圍內(nèi)禁止在船舶上涂用含有TBT等有機(jī)錫類化合物的油漆；從2008年1月1日起，所有運(yùn)營(yíng)船舶均不得再涂有此類油漆。而替代TBT的化學(xué)產(chǎn)品如Diuron和Irgarol1051等也顯示出應(yīng)用的局限性和對(duì)牡蠣、藻類及各種水生生物的毒害作用。于是，開(kāi)展借助化學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)現(xiàn)污損生物防治的研究成為一個(gè)重要的課題，迫切需要尋找新的對(duì)環(huán)境無(wú)害的高活性抗生物污損化合物。海洋微生物是可持續(xù)性利用的生物資源，為解決目前存在的問(wèn)題提供了新的途徑。另外，由于發(fā)酵過(guò)程中人力消耗少，應(yīng)用微生物發(fā)酵更為經(jīng)濟(jì)。從海洋微生物分離鑒定出抗生物污損活性化合物，也將來(lái)可能通過(guò)更經(jīng)濟(jì)的工業(yè)規(guī)模的化學(xué)合成。另外，從這些被證明的活性化合物出發(fā)，推導(dǎo)、和篩選更高活性的分子結(jié)構(gòu)，以獲得更經(jīng)濟(jì)的高活性抗生物污損化合物。最為重要的是，本發(fā)明所涉及的化合物都是無(wú)毒化合物，不含有毒重金屬，且均為天然化合物，在海洋環(huán)境中可以迅速降解。本發(fā)明所提供的無(wú)毒化合物有抑制幼蟲(chóng)附著活性，因此具有顯著的抗生物污損活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及從海洋微生物代謝物中分離鑒定出一種無(wú)毒且具有顯著抗污損活性的化合物化合物14，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素，genistein)此化合物也可以通過(guò)其他一些技術(shù)或途徑制備，獲得滿意的抗污損活性。本發(fā)明涉及通過(guò)篩選上述化合物的結(jié)構(gòu)類似物，從植物天然產(chǎn)物中篩選出6個(gè)無(wú)毒且具有抗污損活性的化合物?；衔?:4，,5-二羥基-3，6,7，8-四甲氧基黃酮(calycopterin)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物33，,5-二羥基-3,4，,6,8-四甲氧基黃酮(紫花牡荊素，casticin).OCH,H3CC^H3COOHO化合物44，,5-二羥基-3，6,7-三曱氧基黃酮OHO化合物54',5,7-三羥基黃酮(芽菜素,apigenin)OHO化合物63，,4，,6,7-四羥基黃酮(木犀草素，luteolin)OHOHO化合物75-羥基黃酮(才艮春花素，primuletin)7本發(fā)明涉及的黃酮和異黃酮衍生物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)重要特征均含有5-OH,且C3上沒(méi)有OH和大體積基團(tuán)(如單糖或雙糖)?；衔铩１景l(fā)明提供的抗生物污損物質(zhì)，是通過(guò)生物測(cè)試指導(dǎo)的化學(xué)分離方法，從海洋微生物二級(jí)代謝物中分離鑒定出來(lái)的，或者是利用構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果從其它來(lái)源的化合物中篩選而來(lái)，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所涉及的化合物是天然無(wú)毒的抗生物污損化合物。利用所述無(wú)毒化合物所制成的抗生物污損涂料對(duì)環(huán)境是無(wú)害的。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種防止海洋生物污損的方法，其包括添加黃酮衍生物或異黃酮衍生物。優(yōu)選地，所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物是4，,5,7-三羥基異黃酮和/或其衍生物。更優(yōu)選地，所述4，,5,7-三羥基異黃酮的衍生物選自4，,5-二羥基-3,6,7,8-四曱氧基黃酮、3，,5-二羥基-3,4，,6,7-四曱氧基黃酮、4，,5-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮、4，,5,7-三羥基黃酮、3，,4，,5,7-四羥基黃酮和5-羥基黃酮。所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物優(yōu)選抑制幼蟲(chóng)附著。生物污損的涂料中的用途。優(yōu)選地，其中所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物是4，,5,7-三羥基異黃酮和/或其衍生物。更優(yōu)選地，其中所述4，,5，7-三羥基異黃酮的衍生物選自4，,5-二羥基-3,6,7,8-四曱氧基黃酮、3，,5-二羥基-3，4，,6,7-四曱氧基黃酮、4，,5-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮、4',5,7-三羥基黃酮、3，,4，,5,7-四羥基黃酮和5-羥基黃酮。所述涂料優(yōu)選抑制幼蟲(chóng)附著。本發(fā)明還制備4，,5,7-三羥基異黃酮的方法，所述方法包括發(fā)酵殺真菌鏈霉菌(5y，tom少ces/w"g/cWcw力。8本發(fā)明進(jìn)一步涉及防止海洋生物污損的涂料，其包含黃酮衍生物或異黃酮衍生物。優(yōu)選地，所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物是4，,5,7-三羥基異黃酮和/或其衍生物。更優(yōu)選地，所述4，,5,7-三羥基異黃酮的衍生物選自4，,5-二羥基-3,6,7,8-四甲氧基黃酮、3，,5-二羥基-3,4，,6,7-四曱氧基黃酮、4，,5-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮、4，,5,7-三羥基黃酮、3，,4，,5,7-四幾基黃酮和5-幾基黃酮。所述涂料優(yōu)選是一種油漆。圖1:殺真菌鏈霉菌發(fā)酵液中抗生物污損活性物質(zhì)4，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素)活性追蹤分離流程圖圖2:化合物4，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素)對(duì)紋藤壺(Sa/""twaw//2^"e)幼蟲(chóng)附著的抑制作用。圖中所示為至少3個(gè)重復(fù)樣平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。圖3:化合物4，,5,7-三輕基異黃酮(染料木素)在不同水溶液中的通過(guò)水解反應(yīng)而降解。圖中空白柱為起始濃度，灰色柱為在50°C無(wú)菌溶液中密封存放4天后的濃度，黑色柱為存放7天后的濃度。測(cè)試溶液包括pH5，7,9的20mM的醋酸緩沖液、人工海水(ASW)和過(guò)濾天然海水(FSW,0.45pm)。所示數(shù)據(jù)為至少3個(gè)重復(fù)樣平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。圖4:4',5,7-三羥基異黃酮(染料木素)及其16種的結(jié)構(gòu)類似物的分子結(jié)構(gòu)。其中結(jié)構(gòu)式上方文字注釋以F-l為例a為樣品標(biāo)號(hào)；b為化合物來(lái)源；c為化合物俗名。圖5:濃度為50昭mr1的化合物4',5,7-三羥基異黃酮(染料木素)及其16種的結(jié)構(gòu)類似物對(duì)紋藤壺幼蟲(chóng)附著的抑制作用。圖中所示為至少3個(gè)重復(fù)樣平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。所用統(tǒng)計(jì)分析方法為Student'spairedt-test(n=3)，差異顯著水平*=p<0.05，**=p<0.01。具體實(shí)施例方式A.本發(fā)明涉及的制備抗生物污損活性化合物的菌林殺真菌鏈霉菌菌林是從西太平洋(N10。50'35";W154。05'28")5000m深處的沉積物樣品中分離到的。保存在0。C的樣品運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后，在處理之前于4。C保存。殺真菌鏈霉菌菌抹采用連續(xù)稀釋法分離獲得。將約lg深海沉積物重懸在10ml人工海水中，混合均勻，取200^ig將其涂布在2216E培養(yǎng)基上；于10。C恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)，挑取形態(tài)顏色不同的菌落轉(zhuǎn)移到新的2216E平板，繼續(xù)純化分離。獲得單一菌林后，釆用分子生物學(xué)方法鑒定該沖朱細(xì)菌。16SrRNA基因通過(guò)引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，26F(5'誦AGAGTTTGATCCTGGCTCA國(guó)3')，355F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3')和反相引物1055R(5'-CACGAGCTGACGACAGCCAT-3')，1492R(5'畫(huà)GGYTACCTTGTTACGACTT-3')和1525R(5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3')(SEQIDNO:2-7)。最后用BLAST程序(NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/))進(jìn)行序列比對(duì)。測(cè)得的殺真菌鏈霉菌菌抹的16SrRNA序列代碼為SEQIDNo:1。通過(guò)該16SrRNA序列與GenBank對(duì)比，結(jié)果表明該菌株為殺真菌鏈霉菌YH04菌林(GenBankAccessionno.AY636155),相似度為99%。B.從海洋微生物分離鑒定抗生物污損活性化合物殺真菌鏈霉菌(放線細(xì)菌)接種于3L錐形培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基組成為麥芽提取物20g，酵母提取物8g，葡萄糖8g，過(guò)濾海水1.5L。在滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.8。室溫下，置于轉(zhuǎn)速110rpm的搖床上培養(yǎng)10天。獲得大約60L細(xì)菌發(fā)酵液，通過(guò)離心分離細(xì)菌體和發(fā)酵液。細(xì)菌體和發(fā)酵液用乙酸乙酯萃分別取三次，然后合并萃取液并減壓濃縮，得到8g黑褐色的油。測(cè)定粗提物的抗生物污損活性，并按照?qǐng)D1的流程分離鑒定獲得活性單體化合物。本發(fā)明的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)用核磁共振(〗HNMR,13CNMR,DEPT和COSY)確定，并用電噴霧離子化質(zhì)譜(WatersMicromassZQESI-MS，以下同)采用負(fù)離子才莫式測(cè)定分子量。質(zhì)譜條件探針電壓2.5kV;錐孔電壓18V;碎片電壓2V;探針溫度100。C;干燥氣N2溫度為300。C;干燥氣流速200立升/小時(shí)。將4，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素)溶于MeOH-H2O-曱酸(90:9.5:0.5)，用Hamilton250pm進(jìn)樣器以5微升/分鐘導(dǎo)入質(zhì)譜?；衔锏暮舜殴舱駳渥V、核磁共振碳i脊和質(zhì)^普數(shù)據(jù)ESI-MS[M國(guó)H]—m/z269.!HNMR(400固z,DMSO-d6),S8.33(IH,s,H-2),6.38(1H,d,/=2.0,H畫(huà)8),6.85(1H,d,J=8.6，H-3，，H隱5'),12.98(brs,5畫(huà)OH).13CNMR(100固z,DMSO)5153.6(d,C-2),122.1(s,C-3),179.9(s,C-4),161.8(d,C-5)，99.2(d,C國(guó)6),165.1(s,C-7),93.8(d,C-8),157.3(s,C-9),104.1(s,C-10,121(s，C-l，)，130.1(d,C-2',C-6，)，115.0(d,C-3，，C陽(yáng)5'),157.5(s,C-4')。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，經(jīng)分析得到該化合物為4，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素)。C.測(cè)定化合物的抗幼蟲(chóng)附著活性采用24孔聚苯乙烯板測(cè)定該化合物的抗幼蟲(chóng)附著活性。紋藤壺成蟲(chóng)(Darwin)采自香港(22°19，N,114°16，E)潮間帶。以角毛硅藻(C7aetoceraygrac/feSchutt)為食物，在0.22卞m過(guò)濾海水中將藤壺的無(wú)節(jié)幼體培養(yǎng)到金星幼體階段，每毫升2個(gè)幼蟲(chóng)，培養(yǎng)溫度28。C。用產(chǎn)生的金星階段幼體進(jìn)行活性試驗(yàn)。純化合物溶于二曱亞砜DMSO，然后用無(wú)菌過(guò)濾海水稀釋成不同的濃度。每個(gè)孔中加入lml測(cè)試液和15士2個(gè)成熟的紋藤壺幼蟲(chóng)，每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)樣，無(wú)菌過(guò)濾海水做空白對(duì)照。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于30。C培養(yǎng)箱中24小時(shí)。在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)附著的幼蟲(chóng)數(shù)。用SPSSVersionll數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖2所示，表明本發(fā)明的化合物在0.5昭/ml已顯示抗幼蟲(chóng)附著活性。在濃度為8貼/ml時(shí)，幼蟲(chóng)附著率只有大約10%,空白對(duì)照的幼蟲(chóng)附著率為大約90%,明顯地抑制了藤壺幼蟲(chóng)的附著。按Rittschof等(1994)的方法分析抗幼蟲(chóng)附著活性。半數(shù)抑制有效濃度(EC50)為3.0昭/ml，半數(shù)致死濃度(LC50)大于50pg/ml?；衔锏亩拘П萀CWEC5Q大于16.7，表明該化合物為無(wú)毒。有毒化合物如重金屬的毒效比接近l(Rittschof等，1992)，而無(wú)毒抗生物污損化合物的毒效比為10以上(Avelin等，1993)。D.測(cè)定化合物的可水解性按照ASTM1993的方法測(cè)定化合物的可水解性能。將化合物先溶解在DMSO溶液中成IOOO昭ml"溶液，然后加入到5種不同溶液中，最終每種溶液體積均為900ml,濃度均約為4^gmr1。這五種溶液包括pH為5、7、9的20mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液、人工海水(ASW，van，tHoff配方，460mMNaCl,10.1mMKC1,9.2mMCaCl2,35.9mMMgCl2,17.5mMMgS04,10mMTris-HCl,pH8.2)、過(guò)濾天然海水(FSW，0.45pm,pH為7.8)。每種溶液一皮平分到9只帶蓋試管。其中3支試管在配制完成后馬上測(cè)定化合物濃度，其余6支放入50黑暗保溫箱存儲(chǔ)。在第四日和第七日分別測(cè)定剩余化合物濃度。化合物濃度測(cè)定方法如下100ml溶液通過(guò)預(yù)先以甲醇-水活化后的Sep-PaktC18ENVcolumn(Waters,USA)，以2.5mlDMSO洗脫(即40倍濃縮)，洗脫液用HPLC(TheHPLC系統(tǒng)600,Waters,USA;光電二極管陣列檢測(cè)器996,Waters,USA;柱PhenomenexLuna5人CI8100A,250x4.60mm,5微米；自動(dòng)上樣器:717plus,Waters,USA);溶劑(A)50/。乙腈，以及(B)95%乙腈；流速固定流速為(A)0.53mlmin—1和(B)0.47mlmin_1)測(cè)定260nm吸收峰面積。然后將測(cè)得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算溶液中的化合物濃度，結(jié)果如圖3所示。化合物在不同水溶液中均有顯著降解，濃度在4天后已經(jīng)有明顯下降，7天后下降幅度均達(dá)25%以上，表明本發(fā)明的化合物在水環(huán)境中是可水解化合物。在正常海水pH范圍內(nèi)(7-9),本發(fā)明的化合物12僅通過(guò)水解反應(yīng)降解，已經(jīng)能達(dá)到可觀降解速度。表明本發(fā)明的化合物不會(huì)在海洋環(huán)境中富集。E.將本發(fā)明的化合物摻入油漆并進(jìn)行實(shí)地測(cè)試將本發(fā)明的化合物按照10和20%(干重)的比例加入已添有15%(體積比)二曱苯的樹(shù)脂油漆(Permoglaze,AkzoNobelDecorativeCoatings,Lancashire,UK)，密封研磨8小時(shí)以上后涂到PVC板上(10cmx10cmx0.5cm).在使用0120為參照添加物時(shí)，Cu20的添加比例也為10%干重。覆蓋有完全干燥的涂層厚度為100-150nm油漆的PVC板綁到PVC材質(zhì)的框架，此框架被放置到離水表面l-1.5m深的香港科技大學(xué)碼頭的天然海水中。在不同浸泡時(shí)間后，取出該試板，在解剖鏡下觀察附著生長(zhǎng)的藤壺?cái)?shù)量，并根據(jù)油漆面積，計(jì)算藤壺附著密度。結(jié)果如表l所示。表1:含有化合物4，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素)的油漆對(duì)紋藤壺附著生長(zhǎng)的抑制作用。表中樣品油漆中的化合物含量=100%x(化合物質(zhì)量/油漆總干重)，對(duì)照油漆中不含化合物。表中數(shù)據(jù)為附著生長(zhǎng)在油漆表面的成體藤壺的密度(單位個(gè)/cm2)，為至少4個(gè)重復(fù)樣平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。所用統(tǒng)計(jì)分析方法為Student'spairedt-test<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表l結(jié)果表明，和對(duì)照相比，藤壺附著密度在含有本發(fā)明的化合物的表面顯著性地低于對(duì)照(*,Student'spairedt-test:p<0.05)，表明本發(fā)明的化合物能有效減少藤壺在油漆表面的污損。在三個(gè)月的測(cè)試中，現(xiàn)在普遍使用的0120和本發(fā)明的化合物獲得相近的抗污損效果，而它們混合物的抗污損效果顯著地高于任一單一化合物(**,Student'spairedt-test:p<0.01),表明本發(fā)明的化合物有和其它抗污損物質(zhì)混合使用的兼容性。F.活性化合物的結(jié)構(gòu)類似物活性篩選物的結(jié)構(gòu)類似物17種(如圖4)，進(jìn)行抗污損活性測(cè)試。采用24孔聚苯乙烯板測(cè)定50嗎mr1的此17種化合物的抗幼蟲(chóng)附著活性。紋藤壺成蟲(chóng)(Darwin)釆自香港(22°19，N,114°16，E)潮間帶。以角毛硅藻(C/zaetocerasgrac/fcSchutt)為食物，在0.22inm過(guò)濾海水中將藤壺的無(wú)節(jié)幼體培養(yǎng)到金星幼體階段，每毫升2個(gè)幼蟲(chóng)，培養(yǎng)溫度28。C。用產(chǎn)生的金星階段幼體進(jìn)行活性試驗(yàn)。純化合物溶于二曱亞砜DMSO，然后用無(wú)菌過(guò)濾海水稀釋成不同的濃度。每個(gè)孔中加入lml測(cè)試液和IO士2個(gè)成熟的紋藤壺幼蟲(chóng)，每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)樣，無(wú)菌過(guò)濾海水做空白對(duì)照。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于30。C培養(yǎng)箱中24小時(shí)。在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)附著的幼蟲(chóng)數(shù)。用SPSSVersionll數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明上述濃度下，17種化合物中12種化合物有顯著抑制幼蟲(chóng)附著的能力(**,Student'spairedt-test:p<0.01)。按Rittschof等(1994)的方法，使用從50嗎ml"逐減的濃度梯度，進(jìn)一步測(cè)定上述12種有活性化合物的抗幼蟲(chóng)附著活性。結(jié)果如表2所示。表2:4，,5,7-三羥基異黃酮(染料木素)及其結(jié)構(gòu)類似物的半數(shù)有效濃度和毒效比。經(jīng)圖5中的篩選結(jié)果，未列入本表的其它5種結(jié)構(gòu)類似物的的ECso大于50嗎mr1,其毒效比不可計(jì)算。圖中所示為至少3個(gè)重復(fù)樣平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。樣品編號(hào)化合物EC50LC50/EC50F國(guó)lCalycopterin3.4±0.5〉14.7F-27-羥基-8,4'-二曱氧基異黃酮13.3土2.5>7.50<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果表明，來(lái)源于染料木(Gem;yto"wctoha)的化合物4，,5,7-三羥基異黃酮的半數(shù)抑制有效濃度(EC5Q)也是3.0pg/ml，毒效比LC5o/ECso也大于16.7,根據(jù)Avelin等，1993指出，無(wú)毒抗生物污損化合物的毒效比為10以上，表明該化合物的無(wú)毒性和抗污損活性與來(lái)源于海洋微生物殺真菌鏈霉菌相同。另外此12中結(jié)構(gòu)類似物中，六個(gè)化合物獲得的抗污損活性和無(wú)毒性與本發(fā)明的化合物相近，均為無(wú)毒的抗污損活性化合物。它們是4，,5-二羥基-3,6,7,8-四曱氧基黃酮(F-l,calycopterin)、3，,5-二羥基-3,4，,6,7-四曱氧基黃酮(F-3,紫花牡荊素)、4，,5-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮(F-4)、4，,5，7-三羥基黃酮(F-9,芽菜素)、3',4，,5,7-四羥基黃酮(F-10,木犀草素)和5-羥基黃酮(F-17,l艮春花素)。本發(fā)明中所述"有活性的染料木素結(jié)構(gòu)類似物"是指但不限于4，,5-二羥基-3,6,7,8-四曱氧黃酮(calycopterin)、3，,5-二羥基-3,4，,6,7-四曱氧基黃酮(紫花牡荊素)、4，,5-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮、4',5,7誦三羥基黃酮(芽菜素)、3，,4，,5,7-四羥基黃酮(木犀草素)和5-羥基酮(報(bào)春花素)。G.活性衍生物的制備本發(fā)明涉及的7個(gè)抗生物污損活性化合物都對(duì)動(dòng)物無(wú)毒，可作為對(duì)環(huán)境無(wú)害的抗污損活性物質(zhì)的范例，以天然化合物為前體，經(jīng)化學(xué)修飾可以提高活性，降低成本以及其他優(yōu)點(diǎn)。所可能的化學(xué)修飾包括增加和減少相應(yīng)的功能團(tuán)或基團(tuán)。但本發(fā)明所提供的黃酮或異黃酮衍生物具有以下3個(gè)特征1)均含有5-OH;2)均無(wú)3-OH;3)在C-3上均無(wú)較大基團(tuán)(如單糖和雙糖)。所以，本發(fā)明要求保護(hù)具有以上3個(gè)特征的黃酮或異黃酮衍生物的抗生物污損的功能。對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體等形式，也可合成一些衍生物如藥物前體和生物等排體。藥物前體即化合物的無(wú)活性形式，即無(wú)活性化合物在體內(nèi)代謝過(guò)程中，從母體分子消去一個(gè)或幾個(gè)保護(hù)基團(tuán)而轉(zhuǎn)化為活性化合物。生物等排性是化合物的一個(gè)原子或一組原子可以用類似的一個(gè)或一組原子替代，而活性不改變。生物等排體是合成具有與母體化合物生物活性性質(zhì)相同的新化合物。立體化學(xué)或拓樸結(jié)構(gòu)不同也可產(chǎn)生生物等排體。本發(fā)明的技術(shù)權(quán)利范圍還包括制備藥物前體、生物等排體或化合物的各種異構(gòu)體。因此本發(fā)明還包括上述化合物的所有各異構(gòu)形式和衍生物。本發(fā)明涉及的術(shù)語(yǔ)"功能衍生物"為上述化合物的藥物前體、生物等排體、以及各種異構(gòu)體，與母體化合物相比在某些方面有優(yōu)勢(shì)。可以通過(guò)各種高通量化學(xué)合成方法如通過(guò)組合化學(xué)制備功能衍生物，與高效生物活性篩選技術(shù)結(jié)合，擴(kuò)大抗生物污損活性化合物庫(kù)。本發(fā)明制備抗污涂料首選活性成分嵌入基質(zhì)的方法，但是本發(fā)明并不局限于上述實(shí)例描述的嵌入方法，其他摻入基質(zhì)的方法也屬本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。16序列表<110>香港科技大學(xué)<120>黃酮和異黃酮衍生物的制備方法及其用途<210>1<211>1425<212>DNA<213>殺真菌鏈霉菌(16SrRNA序列)<400>1GTCGAACGATGAACCGCTTTCGGGCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCGTCTGCCGCATGGTGGATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGT<210>2<211>20<212>DNA<213>引物<400>2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3AGAGTTTGATCCTGGCTCA<210>4<211>18<212>DNA<213>引物<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1.一種防止海洋生物污損的方法，其包括添加黃酮衍生物或異黃酮衍生物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物是4，,5,7-三羥基異黃酮和/或其衍生物。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述4',5,7-三羥基異黃酮的衍生物選自4，,5-二羥基-3,6,7,8-四甲氧基黃酮、3，,5-二羥基-3,4，,6,7-四甲氧基黃酮、4，,5-二羥基-3,6,7-三曱氧基黃酮、4',5,7-三羥基黃酮、3，,4，,5,7-四羥基黃酮和5-羥基黃酮。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物抑制幼蟲(chóng)附著。5.黃酮衍生物或異黃酮衍生物在制備用于防止海洋生物污損的涂料中的用途。6.權(quán)利要求5的用途，其中所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物是4，,5,7-三羥基異黃酮和/或其衍生物。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述4',5,7-三羥基異黃酮的衍生物選自4，,5-二羥基-3,6,7,8-四曱氧基黃酮、3，,5-二羥基-3,4，,6,7-四甲氧基黃酮.4，,5-二羥基-3,6,7-三曱氧基黃酮、4',5,7-三羥基黃酮、3，,4，,5,7-四羥基黃酮和5-羥基黃酮。8.權(quán)利要求5-7的用途，其中所述涂料抑制幼蟲(chóng)附著。9.一種制備4',5,7-三羥基異黃酮的方法，所述方法包括發(fā)酵殺真菌鏈霉菌(5Vre/f麵yces/w"g/cWcw力。10.—種防止海洋生物污損的涂料，其包含黃酮衍生物或異黃酮衍生物。11.權(quán)利要求10的涂料，其中所述黃酮衍生物或異黃酮衍生物是4，,5,7-三羥基異黃酮和/或其衍生物。12.權(quán)利要求11的涂料，其中所述4，,5,7-三羥基異黃酮的衍生物選自4，,5-二羥基-3,6,7,8-四甲氧基黃酮、3，,5-二輕基-3,4，,6,7-四曱氧基黃酮、4，,5-二羥基-3,6,7-三曱氧基黃酮、4，,5,7-三羥基黃酮、3，,4，,5,7-四羥基黃酮和5-羥基黃酮。13.權(quán)利要求10或11的涂料，它是一種油漆。全文摘要本發(fā)明涉及黃酮和異黃酮衍生物作為抗生物污損物質(zhì)的應(yīng)用以及防止海洋生物污損的方法和涂料。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用海洋微生物生產(chǎn)4’，5，7-三羥基異黃酮的方法，還涉及利用4’，5，7-三羥基異黃酮、4’，5-二羥基-3，6，7，8-四甲氧基黃酮、3’，5-二羥基-3，4’，6，7-四甲氧基黃酮、4’，5-二羥基-3，6，7-三甲氧基黃酮、4’，5，7-三羥基黃酮、3’，4’，5，7-四羥基黃酮和5-羥基黃酮用于防止水下結(jié)構(gòu)表面的生物污損。文檔編號(hào)A01P15/00GK101536687SQ20081008795公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2008年3月20日優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日發(fā)明者何紅平,周曉見(jiàn),穎徐,錢(qián)培元申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)