專利名稱：：一種植物花特異性啟動子及其無篩選標記轉化載體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種植物花特異性啟動子及其無篩選標記轉化載體。
背景技術：
：啟動子是基因表達調控因子中最重要的因子，它基本決定一個基因是否表達、何時表達和何處表達。按作用方式和功能，啟動子大體可以分為組成型啟動子、特異性啟動子和誘導型啟動子三大類。誘導型啟動子的特征，為該類型啟動子控制的基因在沒有誘導因子存在的條件下不表達或者只有非常低的表達，但一旦受到誘導因子的誘導，基因的表達量迅速并且大幅度增加。例如激素誘導啟動子、化學誘導啟動子、光誘導啟動子等。組成型啟動子的特點是，受其控制的結構基因的表達具有持續(xù)性，但不具有時空特異性；RNA和蛋白質表達量相對恒定，不受外界因素的誘導。例如玉米Ubiqultin啟動子和水稻Actinl啟動子。器官或組織特異性啟動子的特征，是受其控制或調節(jié)的基因表達具有明顯的時空性，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調節(jié)的特性。例如，水稻花藥特異性啟動子0sg6B、PSP1、PRP1、煙草花藥絨氈層特異性啟動子TA29、玉米花粉特異性基因啟動子Zm13、花藥特異性啟動子等等。以重組DNA和轉基因技術為核心的基因工程研究使人們利用植物的基因資源成為可能，育種周期大為縮短，為培育農作物新品種提供了新的手段，開辟了植物育種的新時代。為了快速有效地獲得轉基因植株，絕大多數(shù)植物轉化都是通過利用抗生素或抗除草劑基因作為篩選標記進行轉化細胞的篩選。轉基因植物，尤其是轉基因食品的安全性從轉基因產品一誕生便引起了爭論。人們關注的焦點在于轉基因植物是否對人類健康及生態(tài)環(huán)境帶來負面影響，他們憂慮，以抗生素為篩選標記的選擇標記基因及其產物在食用時是否有毒性或引起過敏反應；其次，它們是否可能向微生物發(fā)生水平轉移，使病原微生物增加抗性，引起抗生素失效，從而對臨床造成不利(YoderandGoldsbrough，1994;Puchta，2000;Ebinumaetal.，2001;Hohnetal.，2001)。另外，以抗除草劑作為篩選的抗性標記基因的轉基因植物擴散到環(huán)境中后是否危害其他作物的安全生產；它們是否亦會轉移到雜草中，轉變?yōu)殡y以控制的超級雜草，而對生態(tài)環(huán)境造成嚴重的破壞(YoderandGoldsbrough，1994)。正是這些憂慮阻礙了轉基因植物的商業(yè)化進程。去除篩選標記基因無疑有助于消除人們對轉基因植物的恐懼，因此，建立一種快速、高效及簡單的無標記選擇系統(tǒng)，對提高轉基因植物的安全性，加速轉基因植物產品商業(yè)化進程有著十分重要的意義。迸行無標記選擇轉基因植物的培育，目前主要采取以下幾種系統(tǒng)來去除篩選標記基因^C轉座系統(tǒng)、共轉化系統(tǒng)、同源重組系統(tǒng)、位點特異性重組系統(tǒng)。其中，所有位點特異性重組系統(tǒng)都具有兩種基本的成分重組酶及DNA識別位點。它包括噬菌體P1的Cre/7of尸系統(tǒng)(Daleand0w，1990;Odelletal.，1990;Bayleyetal.，1992;Russelletal.，1992)，酵母2n質粒的Flp/frf系統(tǒng)(Lyzniketal.，1993;LloydandDavis,1994;Sontietal.，1995;Kilbyetal.,1995;Baretal.，1996)，酵母pSRl的R/^5"系統(tǒng)(0nouchietal.，1991;O匪chietal.，1995)，噬菌體Mu的Gin/^z'x系統(tǒng)(MaeserandKahmann，1991)。位點特異性重組系統(tǒng)首先被Cregg和Madden證明可以用來刪除選擇標記(CreggandMadden,1989)。在這四種系統(tǒng)中，對Cre/7ox尸系統(tǒng)研究較多亦最為深入，它己在特定基因的刪除、基因功能的鑒定、外源基因的整合、基因捕獲及染色體工程等方面得到了有效的利用。Cre重組酶是由噬菌體Pl基因組中1029bp的一段序列編碼的蛋白質(causerecombination)，由343個氨基酸組成，分子量為38.5kD(Sternbegetal.，1986)。它不僅具有催化活性，且同限制酶相似，識別特異的DNA序列并進行特定的剪切和拼接。在水溶液中該酶以單體形式存在，其最適反應溫度為37。C，甚至在46。C仍有活性(Buchholzetal.，1996)。Cre重組酶對其底物(兩個特定的DNA序列)的識別相當靈活，圖1表示了Cre重組酶所識別的DNA序列——2otP(LocusofcrossingoverinPI)。7ox尸是一段長度為34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重復序列和一個8bp不對稱間隔區(qū)組成。這8bp間隔區(qū)是位點中唯一不對稱部位，這種非對稱性決定了7ox尸位點具有方向性，從而決定了重組的方向性。在Cre酶的介導下，Cre/Jox尸特異重組系統(tǒng)在細胞內和離體系統(tǒng)中共有3種工作方式當兩個7m尸位點方向相同時，將導致位于";r尸位點之間的DNA片段被刪除；而當兩個7ox尸位點方向相反時，則使位于7ox尸位點之間的DNA片段發(fā)生倒位；如果兩個7af尸位點不在同一分子上，比如一個質粒上帶有一個7ox尸位點，而在某個染色體上還有一個Jof尸位點，這樣在重組酶的介導下，質粒便可以定點整合到染色體中h;f尸所在的位置，即所謂的基因打靶(genetargeting)。兩個"x尸位點可以位于不同的DNA分子上，也可在同一個DNA分子上。重組底物既可以是線形DNA分子，也可以是環(huán)狀，還可以是超螺旋的DNA分子。在催化重組反應時，不需要其他蛋白質、DNA等輔助因子和額外能量的參與。僅需nmol量的Cre酶即可與7ar尸位點結合，以完成體內或體外的DNA重組(LeeandSatio，1998)。正是由于這種高效簡單的作用方式，Cre/7ox尸特異重組系統(tǒng)已成為DNA遺傳操作的有力工具。運用Cre/7o;r尸系統(tǒng)去除標記基因目前主要有以下三種策略1.再轉化，它是將攜有Cre(或"x尸)的植物表達載體轉化含有&%尸(或Cre)的轉基因植株中，通過后代分離即可獲得無標記的轉基因植株；2.雜交，將分別帶有Cre和2o;^位點的轉基因植株進行雜交，經后代分離可得到無標記轉基因植株；3.自切除，由于前兩種方法均需要通過自交分離進一步去掉重組酶基因及轉化重組酶基因所引入的另一個篩選標記，使得獲得無標記轉基因植物的過程較長，這勢必造成人力、物力的浪費，同時此系統(tǒng)也不適于無性繁殖植物，尤其是木本植物無標記轉基因植物的培育，加之C7^重組酶基因在植物中一直高水平表達會導致植物形態(tài)和產量改變(Coppoolseetal.，2003)。因此調控Cre重組酶基因在特定時間表達，即用一步法自動切除篩選標記的研究正是完善上述途徑的策略之一。目前主要利用一些誘導型啟動子來控制Cre重組酶基因在特定時間表達(Sugitaetal.，2000;Zuoetal.，2001)，如煙草花藥絨氈層特異性啟動子TA29控制Cre的表達來獲得無標記的轉基因植物，但是它在單子葉植物中去除標記基因效率不高。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種植物花特異性啟動子及其無篩選標記轉化載體。本發(fā)明提供的植物花特異性啟動子，名稱為0s45，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且能調控目的基因在植物的花器官中特異表達的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且能調控目的基因在植物的花器官中特異表達的DNA分子。所述步驟c)中的啟動子，與a)的啟動子最好有95%以上的同源性。上述植物花特異性啟動子能調控目的基因在植物的雄蕊和雌蕊中特異表達。本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有所述0s45啟動子的重組表達載體。其中，所述重組表達載體具體可為含有所述0s45啟動子的重組Cre/7ox尸系統(tǒng)植物表達載體，該重組表達載體可在單子葉植物中高效去除標記基因。所述重組Cre/7ox尸系統(tǒng)植物表達載體是含有兩個2o;r尸序列和一個Cre重組酶編碼基因和本發(fā)明的0s45啟動子的植物表達載體;所述兩個70義尸序列的方向相同，該兩個7ay尸序列間含有Cre重組酶表達盒和標記基因表達盒；所述Cre重組酶表達盒中，啟動Cre重組酶表達的啟動子是本發(fā)明的0s45啟動子。所述重組Cre/^x尸系統(tǒng)植物表達載體還含有外源目的基因的表達盒，所述外源目的基因的表達盒位于所述兩個乃i尸序列之外。其中，上述表達盒從上游至下游依次包括啟動子、目的基因和轉錄終止子。所述Cre重組酶表達盒中的目的基因是Cre重組酶編碼基因，所述標記基因表達盒中的目的基因是標記基因。含有所述0s45啟動子的表達盒或擴增所述0s45啟動子全長及其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組Cre/A^尸系統(tǒng)植物表達載體被轉入植物時，能將所述兩個2ar,序列之間的DNA片段刪除，從而去除標記基因。所述重組表達載體的出發(fā)載體為雙元載體pCAMBIA0390。所述重組表達載體具體可為如圖8所示的表達載體或將圖8所示的表達載體的GUS基因替換為所需的目的基因得到的載體或將圖8所示的表達載體的GUS基因替換為所需的目的基因并將花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子替換為所需的啟動子得到的載體。本發(fā)明所述0s45啟動子和所述重組表達載體可用于培育無篩選標記的轉基因植物。含有所述0s45啟動子的重組Cre/7ox尸系統(tǒng)植物表達載體轉入單子葉植物或雙子葉植物時，可在單子葉植物或雙子葉植物中高效去除標記基因；所述植物優(yōu)選為水稻。本發(fā)明中克隆到的水稻花特異性啟動子0^5在水稻中的時空表達模式表明0^^啟動子能啟動^/6"在水稻花器官中特異性表達，其中主要在雄蕊和雌蕊中表達，而在其它組織器官如愈傷組織、根、莖、葉中沒有表達。本發(fā)明的用^/5"作為外源目的基因的轉基因實驗證明，含有fe^^的重組Cre/7o^系統(tǒng)植物表達載體，在轉基因單子葉植物中，可以控制Cre重組酶在雌蕊6和雄蕊特異性表達，這樣可以同時得到去除篩選標記的雌、雄配子，在轉基因植物后代中便可直接篩選到無選擇標記的植物；并且0^5啟動子啟動^/5"不能在愈傷組織中表達，從而避免了在愈傷組織篩選過程中由于ft^5啟動子啟動Cre酶的表達去除了篩選標記基因而導致的得不到轉基因植株的結果。圖l為Cre重組酶所識別的DNA序列-2m尸圖2為與水稻開花相關基因的RT-PCR分析1:2-8的等比例混合、2:綠葉、3:黃葉、4:根、5:花、6:種子、7:胚、8:愈傷組織、A:S556、B:S561、C:S525、D:S025、E:S476、F:S557、G:S522、H:S488、I:S367圖3為fls，鵬Z^必在不同組織及器官中的表達l:愈傷組織、2:根、3:莖、4:葉、5:花、6:授粉后7天的花、A:^i^"5V^、B:18S腿圖4為PC財廣增&必啟動子的產物1:Marker(入DNA，」fiboRI+〃i/2dl11);2:PCR擴增Os^5"啟動子的產物圖5為植物表達載體ptts^5:1391Z的圖譜圖6為不同組織器官及不同發(fā)育時期花器官的GUS活性1:開花前14天、2:開花前7天、3:授粉期、4:授粉后7天、5:種子成熟期圖7為&^"啟動子在水稻不同組織及不同發(fā)育時期花器官中表達模式A:小花、B:雄蕊、C:雌蕊、D:未成熟種子、E:種子、F:愈傷組織、G:根、H:莖、I:葉圖8為植物表達載體p&45:MF的圖譜圖9為PCR擴增轉p&必:MF株系L代NPTII和GUS的產物1:轉pfts必:MF株系5、2:轉p&必:MF株系13、3:轉pfts必:MF株系15、4:轉pOs必:MF株系19、5:轉p&必:MF株系36、6:轉pOs^5":MF株系126、7:轉p0^5:MF株系147、8:轉p&45:MF株系246圖10為PCR鑒定以Os必控制Cre/7^尸系統(tǒng)發(fā)生剪切的模式圖圖11為L代轉pMF株系以P1及P2為引物的PCR擴增M:DL2000、1:轉p&必:MF株系5、2:轉pOs必:MF株系13、3:轉p。s必:MF株系15、4:轉pfts必:MF株系19、5:轉p&必:MF株系36、6:轉p&必:MF株系126、7:轉p&必:MF株系147、8:轉pfe必:MF株系2467圖12為Southern鑒定以fts4液制的Cre/7or尸系統(tǒng)剪切的模式圖圖13為轉pfts必:MF株系的Southern雜交圖譜M:Marker(入DNA/fcoRI^^'"dl11)、1:陰性植株、2:轉pft^5:MF株系5、3:轉p&必:MF株系13、4:轉p&^5":MF株系15、5:轉pOs^5:MF株系19、6:轉p0^5:MF株系126、7:轉p(9W5:MF株系36、8:轉p&^":MF株系147、9:轉p6^45:MF株系246具體實施例方式實施例1、水稻花特異啟動子0s45的分離及功能鑒定1水稻花特異啟動子0s45的克隆a)水稻中一些與開花相關的基因的表達分析為了能克隆到水稻花特異啟動子，通過RT-PCR對9個與水稻開花相關的轉錄因子進行了表達分析。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳的結果如圖2。RT-PCR分析結果表明，S556(Os7WCW及S561(fts湖"WW基因在水稻花中特異性的表達，而其它7個基因并沒有表現(xiàn)出花特異表達的特性。因此，對(9s順"及Os鵬Z^必基因作進一步的分析。分別取水稻(日本晴)的愈傷組織、根、莖、葉及不同發(fā)育時期(開花期、開花后7天)的花器官進行RT-PCR分析。方法如下提取水稻(日本晴)愈傷組織、根、莖、葉及不同發(fā)育時期(開花期、開花后7天)的花器官的總RNA反轉錄成cDNA。通過RT-PCR分析^細Z^45基因的表達，以水稻18SRNA作為內對照。擴增產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離。結果表明^TWC^基因的轉錄本僅在水稻的花中檢測到，而在其它組織或器官如愈傷組織、根、莖、葉和開花后7天的花器官中均未檢測到。OaM"5^5基因的轉錄本在水稻花器官(開花期、開花后7天)都能檢測到，其中在開花期表達最高，在授粉后7天其表達量開始降低，在愈傷組織、根、莖及葉中均未檢測到。0stMZ5^5基因在水稻不同組織器官的RT-PCR分析表明，^鵬"5^5基因在水稻花器官中特異性地表達(圖3)。^s鵬"5^^基因屬于v4/^家族中^^4亞家族，在水稻的小穗原基、漿片、發(fā)育的雄蕊和雌蕊原基上均有表達。6^湖/^^^基因對于水稻花芽分生組織的形成，特別是花器官的形態(tài)建成起著重要的調控作用。因此，擬克隆fl廁"5^5基因的啟動子。b)Os鵬"5^5基因啟動子的克隆根據(jù)華大基因組的水稻基因組序列，設計一對引物P1和P2，引物序列如下Pl:5'TTAAGCTTGCTGCCTTAGTTTCAGTAGA3'(劃線部分為A'/Kiin識別位點)；P2:5'AAGTCGACCGATCGATCTCCAGCTGCAA3'(劃線部分為5"a71識別位點)。以水稻日本晴基因組DNA為模板進行PCR擴增。反應程序94。C預變性5min;然后94。C變性30sec，60。C退火40sec，72。C延伸2min，共30個循環(huán)；再72。C延伸10min。將得到的PCR產物進行0.8。/。的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖4所示，得到一條約2.0kb的特異性條帶，其大小與預期相當。回收該約2.0kb的DNA片段，克隆到pMD18-T載體中，獲得pMD18-T-tt^5載體，測序，測序結果表明，從水稻(日本晴)基因組DNA中擴增到Os朋"5"必cDNA5'端上游約2.Okb序列。將Os朋Z5"必基因cDNA5'端上游2049bp的序列命名為0^5啟動子，其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi)。為了研究0^5啟動子在水稻中的表達模式，用^i"dl11和6"aJI雙酶切載體pMD18-T-fe^5"，回收約2kb片段，插入pCAMBIA1391Z(具有不帶啟動子的6Z/5"報告基因)(購自Cambia,澳大利亞，http://www.c柳bia.org/daisy/c咖bia/home.html)的/fedl11禾口6^71位點，使fe^5"啟動子與6Z^基因融合，構建得到植物表達載體p^s^^:1391Z(圖5)。用農桿菌介導法將p&^5:1391Z表達載體轉入水稻(日本晴)中，獲得10個獨立來源的轉p&45:1391Z株系，移栽大田以作下一步分析。c)6^45啟動子在水稻中的時空表達模式從轉pfe必:1391Z水稻開始孕穗到種子成熟，分別取各個轉pfe必:1391Z株系的根、莖、葉、花和種子等材料進行GUS活性定量檢測。GUS活性定量檢測按Jefferson等人的方法進行(Jeffersonetal.，1987)。GUS活性-單位時間內反應生成的MU/蛋白量(praolMUmg—^in—。。用0.2mol/L勛20)3配制lmmol/LMU(4-甲基傘型酮)，逐級稀釋為500、250、125、62.5、31.25和15.625nmol/L，以此制作標準曲線；用TecanGENios熒光分光光度計(激發(fā)光波長為365腦，發(fā)射光為455nm)測定每個樣品的熒光強度，計算反應生成的MU的量；用Tecan多功能酶標儀GeniosPro(購自瑞士TECAN集團)測定樣品中蛋白含量；蛋白含量按照Bradford等的方法進行(Bradford,1976)。結果如圖6所示，表明在轉p&45:1391Z水稻開花前14天(小穗長約5cm)，花器官中6ZK已有表達，其活性達到2266.9土78.4pmolMUmg—'min—'，明顯地高于其它器官根、莖及葉中的活性(都低于500pmo1MUnig—、irf1)，且隨著花的發(fā)育，花器官中GUS活性也逐漸升高，至開花時達到最大，達4700.8土334.5pmo1MUrag^irf1。此后隨著種子的成熟，花器官中GUS活性開始降低，到種子成熟時其活性已回落到與其它器官的活性值相當。在整個花發(fā)育時期轉pft^5:1391Z水稻的根、莖、葉中GUS活性沒有變化，基本處于本底水平。這表明了0^5啟動子能啟動6Z/5"在水稻花器官中特異性表達。圖6中的數(shù)據(jù)為10個轉pOs^":1391Z株系的平均值士標準差。同時，檢測了tt^5啟動6W5"在轉p0^5:1391Z水稻花器官中的具體表達部位。方法如下在GUS活性測定的同時定期取各轉p&必:1391Z株系的不同組織器官進行GUS組織化學染色。GUS組織化學染色按Jefferson等人的方法進行(Jeffersonetal.，1987)。結果如圖7所示，表明當小花形成時，^^已開始在其基部表達(圖7A)。在開花期，花器官中雄蕊著色較深，穎殼幾乎沒有藍色或著色非常淺；雌蕊在其基部被染成藍色，在柱頭上亦有較為淺的藍色，6^S表達量不如雄蕊高，但在其發(fā)育后期有升高的趨勢(圖7B、C)。在灌漿期，未成熟種子有部分被染成藍色，但在種子成熟時，^/5幾乎不表達(圖7D、E)。其它組織器官如愈傷組織、根、莖、葉中在各個時期均未被染成藍色(圖7F、G、H、I)。這一結果與GUS活性測定的變化趨勢基本一致，進一步說明水稻0W5啟動子能啟動OC"在水稻花器官中特異性地表達，其中主要在雄蕊和雌蕊中表達。轉p0^5:1391Z株系不同組織器官及不同發(fā)育時期花器官的GUS活性定量測定和GUS組織化學染色的結果綜合表明，0^5啟動子在水稻中是一花芽分化特異性啟動子，其中主要參與雄蕊和雌蕊分化，即在雄蕊和雌蕊中特異性表達。實施例2、含有<^^"啟動子的Cre/乃x尸系統(tǒng)重組表達載體的構建1.0W5控制下的Cre/7ox尸系統(tǒng)載體p&^5":MF的構建a)Jo義尸序列的設計及合成根據(jù)Ajf尸的序列(Guoetal.，1999)，設計一段長108bp的雙鏈DNA:OTOZ4藩<^Z4C7^7^腐7T蕩GGCGCGCCCGGGA3'，此序列由上海博亞公司合成并克隆到pMD18-T載體(購自北京萊博菲爾生物技術公司)中，得到載體pMD18-T-7m尸。該片段中含有兩個同向的7o義尸位點(序列中斜體示)，在兩個位點之間包含有^boRI和A'/7dlII識別位點(下劃線示)，在序列兩端還有J力oI及105"3/zI識別位點(下劃線示)。b)Cre〃ojf尸系統(tǒng)載體pOs必:MF的構建(1)表達載體pBinAR-邵f/J的構建酶切pCAMBIA2300(購自Cambia，澳大利亞，http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)，回收邵f77片段，將其插入到pBinAR(購自北京萊博菲爾生物技術公司)中CU55啟動子和0C5"終止子之間的&7I位點，判斷方向，使/2pt/7閱讀的方向與Cai^J5S啟動的方向一致，獲得載體pBinAR-/2/^//。(2)pBluSK-7oxP""/^iT的構建用勘WI與5"WI雙酶切pMD18-T-A;r尸，回收100bp左右的"jf尸片段，插入到pBlueScriptSK(-)(購自Stratagene公司，http://www.stratagene.com)的"aMH與6"a71位點之間，獲得pBluSK-Jor尸載體。^boRI和歷/din雙酶切pBinAR-邵"/，回收C盧(^5^-/7/力iT-ocs(約1.4kb)并將其插入pBluSK-7ar尸載體的fcoRI和歷zdIII位點之間，獲得pBluSK-Jar/^//^//載體。(3)構建pC0390-^6*首先用6)i7sl和丄咖I(兩個均為平端酶)酶切pCAMBIA0390(購自Cambia，澳大禾U亞，http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)，以去除》a/dn、^/"dn、尸WI、5^7I及6"/Z73l等一些常用的酶切位點，連接使其重新環(huán)化，得到重組載體pC0390。以fcoRI和^汪I1雙酶切pCAMBIA1304(購自Cambia,澳大利亞，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)，回收C盧K55W尸尸-6Z/5"片段，將該片段插入上述PC0390的iboRI和5"EI1位點之間，得到pC0390-6TO"載體。(4)構建pC0390-Jox戶6TO"用^cl與雙酶切載體pBluSK-7ox尸-/7/^77，回收1.8kb左右的^^/^[ai/K^-邵t/J-ocrJor尸結構，插入到pC0390-6Z^載體的5"acl與位點之間，獲得pC0390-7ox產/3pti7-6K載體。(5)構建pBluSK-(^e-"os設計兩條引物，引物序列如下5，TAGTCGACTCTAGCCTCGACATGTC3，和5，AGCTCGAGTTACTAATCGCCATCTTCC3，。以噬菌體PlDNA為模板擴增Cre重組酶11基因片段，然后克隆到pMD18-T載體(購自北京萊博菲爾生物技術公司)中并測序，用和酶切出的Cre片段，插入到pBlueScriptSK-(購自Stratagene公司，http:〃雨.stratagene.com)的5"a7I位點，獲得載體pBluSK-Cre。(6)構建pBluSK-^Ts^5"酶切載體pMD18-T-Os^后，DNA末端經Klenow部分補平(只加dATP和dGTP)，瓊脂糖凝膠電泳回收0^5啟動子，插入pBlueScriptSK-(購自stratagene公司，http:〃www.stratagene.com)的同樣經Klenow部分補平(只加dCTP和dTTP)的fe/dll位點，得到載體pBluSK-6>^5。(7)構建pC1300-酶切pCAMBIA1300(購自Cambia,澳大利亞，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/home,html)后，經Klenow補平使其平端化，重新環(huán)化以使載體的&7I位點消失，得到重組載體pC1300。,pM與6)el雙酶切pBluSK-tt^5載體，得到約2.0kb的&45啟動子片段，將該片段回收后插入到pC1300的及J&I(與&el同尾)位點之間，獲得pC1300-0^5，這樣可以用歷72dl11將61^5啟動子切出。(8)構建pC0390-7o義尸-AD"/-Cre-Gffi"用&'77dni和Sacl雙酶切pBluSK-Cre-7os，回收得到1.7kb的/7os片段，將其插入到載體pC0390-Jor尸-";^77-Gffi^的#i/dIII和&cl位點，即獲得pC0390-Jor尸-邵ti7-Cre-OZ5"載體。(9)構建p&45:MF植物表達載體歷"dIII酶切載體pC1300-Os^5;回收2kb的ft^5片段，插入到載體pC0390-70尸-/7/^//-6^-^^的歷/din位點(載體需脫磷處理)，判斷方向使(9s必啟動的方向與Cre酶表達的方向一致，這樣即可獲得由tt^5控制Cre的Cre/"x尸系統(tǒng)植物表達載體p0^5:MF(圖8)。2.無標記轉基因植物的獲得與分子驗證a)轉p&45:MF水稻的獲得及L代分析用農桿菌介導法將植物表達載體p0^5:MF轉化水稻(日本晴)，共獲得8個獨立來源的轉pOs必:MF水稻株系，移栽大田收獲L代種子。將8個轉p&必:MF水稻株系的L代種子(每個株系至少30粒種子)播在溫室中育苗，在苗期取各個轉p0^5:MF株系中每個單株的葉片進行GUS組織化學染色，GUS組織化學染色采用實施例l中的方法。GUS組織化學染色結果用以統(tǒng)計Ti代的分離比，結果見表l。表l轉p0^5:MFL代株系GUS組織化學染色<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表中可以看出，8個株系中除19、246株系明顯偏離3:1的分離比外，其它6個株系基本上符合3:1的后代遺傳分離比，說明這些株系中T-DNA插入可能為單位點插入。b)無標記轉基因植物的分子鑒定(1)PCR鑒定無標記轉基因植物首先通過擴增抗性基因服V7/鑒定無標記轉基因植物。根據(jù)//^//基因序列，設計引物1和2，引物序列如下引物1(正向序列):5'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3';引物2(反向序列):5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3'。此外，又對8個轉pft^5:MF株系同時進行了6Z/S的PCR擴增。報告基因^/W的檢測，根據(jù)其基因序列，設計引物3和4，引物序列如下引物3(正向序列)5'-GGATCCATCGCAGCGTAATGCTCT-3';引物4(反向序列)5'-TCTAGAGGTTAAAGCCGACAGCAGCA-3'。選取8個轉pOs必:MF株系中6"M表達的各個單株，提取基因組DNA作為模板。PCR反應體系為:10XBuffer2W、dNTP(1O誦ol/L)0.糾、引物(20Wnol/L)各0.214、Taq酶0.5unit、模板DNA(O.01Pg/W)1)4、H2014.總體積為20W。擴增程序94。C預變性5分鐘；94。C變性30sec，60。C退火40sec，72。C延伸90sec，共進行30個循環(huán)；最后72。C延伸10分鐘，終止反應；PCR產物進行l(wèi).2%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。結果如圖9所示，表明在5、15和126株系的^^表達的各個單株(1、3、6泳道)中均未檢測到抗性標記基因M7T/只擴增出而其它5個株系的^/S表達的各個單株同時擴增出#尸77/和^/5"基因產物。這一結果說明Cre/7oy尸系統(tǒng)在13、19、36、147和246五個株系的^^表達的各個單株中可能沒有去除篩選標記，而在5、15和126三個株系的6K5"表達的各個單株中則有可能發(fā)生了剪切。根據(jù)載體序列在兩個"x尸位點外側設計了一對引物Pl和P2(圖IO)。弓|物P1和P2序列為引物P1(正向序列)5'GCCGCTCTAGAACTAGTGGATC3';引物P2(反向序列)5'TCAGATCTACCATGGTCAAGAGTC3'。PCR反應體系為:10XBuffer2W、dNTP(10mmol/L)0.糾、引物(20^mol/L)各0.2W、Taq酶0.5unit、模板DNA(O.01PgA4)1W、H2014.6總體積為20W。擴增程序94°C預變性5分鐘；94°C變性30sec，60°C退火40sec，72°C延伸90sec，共進行30個循環(huán)；最后72"C延伸IO分鐘，終止反應；PCR產物進行1.2%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。在載體中引物Pl和P2之間的距離為6.39kb，若ft^5控制的Cre/7o^系統(tǒng)未發(fā)生剪切，用非長片段Taq酶擴增，延伸時間在不超過l分鐘的條件下，很難擴增出6.39kb的片段。若Cre/7o^系統(tǒng)發(fā)生剪切，則引物Pl和P2之間的距離為800bp左右，用一般的Taq酶，延伸時間在40秒左右便可擴增出800bp左右的片段(圖10)。結果如圖ll所示表明，在5、15和126株系的6Z^表達的各個單株(1、3、6泳道)中均擴增到800bp左右的片段，5、15和126三個株系的6Z/5"表達的各個單株中可能發(fā)生了自動剪切。(2)Southern雜交鑒定無標記轉基因植物為了進一步證明5、15和126三個株系的L代植株確實發(fā)生了抗性基因的自動剪除，以^/5"片段作為探針，對8個轉p&必:MF株系中^5"表達的各個單株的基因組DNA進行了Southern雜交。按照分子克隆的方法對轉基因水稻進行Southernblot分析。用限制性內切酶feci和酶切轉p&必:MF株系中6TO"表達的各個單株的基因組DNA。若0^5控制的Cre/7o;r尸系統(tǒng)未發(fā)生剪切，以feci和雙酶切的基因組DNA，用"(S"片段作探針雜交時，應該雜出一6.47kb的條帶；而當Cre/Zor尸系統(tǒng)自動去除了篩選標記，則雜交出來的片段應為3.3kb(圖12)。Southern雜交結果如圖13所示，表明5、15和126株系中^/5"表達的各個單株在以GUS片段作探針雜交時，僅雜出一條3kb左右的帶.(2、4、6泳道)，13、147和246株系中6Z/6"表達的各個單株(3、8和9泳道)雜出了6kb左右的條帶，此夕卜，株系19和36中^/5"表達的各個單株(5、7泳道)不僅雜出了6kb左右的條帶，同時還有一3kb左右的帶(該帶位置與2、4、6泳道中帶的位置相當)，說明Cre/Zor尸系統(tǒng)在株系19和36的0^表達的各個單株中極有可能發(fā)生了部分剪切。上面一系列的分子驗證結果表明，以tt^5啟動子控制的Cre/7ox/^統(tǒng)的8個轉p&^":MF水稻株系中有三個株系發(fā)生了完全的自動剪切，其去除篩選標記基因的效率為38%，而在另兩個株系中則發(fā)生了部分剪切，再經過一代的篩選可以從中獲得無標記轉基因植物，因此以&^e制的Cre/Zox戶系統(tǒng)發(fā)生自動剪切頻率可達60%。這與許多研究者利用Cre/7ox/^、統(tǒng)在雙子葉植物中去除標記基因的效率相當。序列表<110>中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所<120>—種植物花特異性啟動子及其無篩選標記轉化載體<130>CGGNARW81099<160〉1〈210>1〈211>2052〈212層A〈213灘屬水稻(Or，var丄ansheng)<400〉1ctgtatgttgctgccttagtttcagtagagttggttcttcatttcttttcagtgatcaaa60ttattgtttctgttcttttctgccatggtaagttcctttttttttcttcttcttcttgcc120ttcatttgagttaattacagcattgatttgtgtga^caaaattcatcataaatcagttcc180tcgcgagatcattggtctcaacatgatggtgccaagtgagaactgcagtattgtgcagtt240ttcagttttgagtctaagttgtataaacttgC3gttgg3gtattatgctctsgtattaat300ctactatcagacaagataagatcacggattaattcacccctgacctgatccatcttgtgc360acacgtcggccagcagcggaattgagcttctg印tcagatcttaggcatcgtttggaaca420gagaagtttcgaagaatttgaattaaa"ttcagtatagaatgcatgattgt■aataa^ggattgagatatcatgatttaata3ttt3ttg肌540tactccatgtaacaaacccatagtsattgtccaa^gtagatgttggg血600tacagaaaacttatgattgtacggtgatttgatgg3g卿g3gc3aagag660gcaacttgtagtgcaactcttg犯tgaat3720gaaatttcttctaaaaatgtggagcaactttttcctatcctacgaaattccttcaaatca780gtcctacataacctttccaaaat11cacaagaaatga肌taagcataccattctatcttg840tgcacacgtcccccaagtagcgaaattgagtttctaggtcagatcttgsgcctcgctgga900acggagaaattttaaagatttataaaggat11aaattaaatctagcatagaacgtagtga9603t犯ggCC3Catsggattgtgatacctgatttaataattt102016atalta^agataaggccacataggattgtgatacctgatttaataattt1020attgagtccatgaaacaaacccatggtaattgcccaaaat柳tgtttgg3tagcttag31080aaaaaaatacgtgaa^attaagattttacggtgattagttgg卿gag鄉(xiāng)ggagagacat1140a^gttgC6LtCgcaattctcaaacg^gtcgggttagattttattctagaa1200gtcctctaaaataicggacgacgaaattactttg犯tc犯tccaacaaatctac3tsgga^1260ttactctttcggactcaaactcctcaattttttcccacttaaaaatcc11cgccctaatt1320aaagttcacccgttacaaatgg卿gcgatcgagctctcaactagcctaattcaagaggt1380組ggc卿gagaagaaga^gaagccgcaatcactcctag1440tccttaca^agttctgccgccgtggtgsggccaggggcacatactttcaggcttcagccc1500accaaatggagacgccatacggcctatgctgttccaggcccaaat*tacaccggctccacc1560ccatacggcccatacatataccattcctggccca3aaccggtgggttccc1620tcggacacggcccgactcaaacac3cgc3ctctccaagtctcgagctccacgacgacgac1680tacgactatgacgatggcgc3cagggc3ggggc鄉(xiāng)c鄉(xiāng)tC3C3"tgtggtggtgaatgg1740tgatggccatccatccatccaggcgagtcgtggtaaagaagacggatgga1800Cgg3tgg3tgggcatgggcggcg3gcgstggacgcgacgcgacgcgacccatcctggttt1860cccgaaacgcgctacgctgccgagcatctagggtttcccacccggtacgaccttgccgaa1920aatggcacccactcaccatctccatccttttaatccccttcctccacctcgcttgctttc1980ttgcagtggtggtggtggtggtggtg,tctagcttggttggttggttgcagctggaga2040tcgatcgggatg205權利要求1、一種植物花特異性啟動子，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且能調控目的基因在植物的花器官中特異表達的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能調控目的基因在植物的花器官中特異表達的DNA分子。2、含有權利要求1所述的植物花特異性啟動子的重組表達載體。3、根據(jù)權利要求2所述重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為含有權利要求1所述的植物花特異性啟動子的重組Cre/乃x尸系統(tǒng)植物表達載體。4、根據(jù)權利要求2或3所述重組表達載體，其特征在于所述重組Cre/"x尸系統(tǒng)植物表達載體是含有兩個Jor尸序列、一個Cre重組酶編碼基因和權利要求1所述的植物花特異性啟動子的植物表達載體；所述兩個2o^序列的方向相同；所述兩個—知;r尸序列間含有Cre重組酶表達盒和標記基因表達盒；所述Cre重組酶表達盒中，啟動Cre重組酶表達的啟動子是權利要求1所述的植物花特異性啟動子。5、根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組Cre/^x尸系統(tǒng)植物表達載體還含有外源目的基因的表達盒；所述外源目的基因的表達盒位于所述兩個Az尸序列之外。6、根據(jù)權利要求5所述重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體的出發(fā)載體為雙元載體pCAMBIA0390。7、根據(jù)權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為如下l)或2)或3)的表達載體1)如圖8所示的表達載體；2)將圖8所示的表達載體的GUS基因替換為所需的目的基因得到的表達載體；3)將圖8所示的表達載體的GUS基因替換為所需的目的基因并將花椰菜花葉病毒35S啟動子替換為所需的啟動子得到的表達載體。8、權利要求1所述的啟動子或權利要求2-7中任一所述的重組表達載體在培育無標記轉基因植物中的應用。9、根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為水稻。10、含有權利要求1所述的植物花特異性啟動子的表達盒或擴增權利要求1所述的啟動子全長及其任意片段的引物對。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物花特異性啟動子及其無篩選標記轉化載體。該啟動子，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸組成的DNA分子；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能調控目的基因在植物的花器官中特異表達的DNA分子。本發(fā)明還公開了含有該啟動子的重組表達載體。所述重組表達載體為含有該啟動子的重組Cre/loxP系統(tǒng)植物表達載體，該重組表達載體可在培育無標記轉基因植物中應用，能在單子葉植物中高效去除標記基因。文檔編號A01H5/00GK101532020SQ20081010169公開日2009年9月16日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權日2008年3月11日發(fā)明者儲成才,白先權申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所